Стійка до гербіцидів рослина сої і спосіб її ідентифікації

Реферат: UA 114275 C2 (12) UA 114275 C2 Винахід стосується трансгенної рослини, рослинного матеріалу і насіння сої, що містять в своєму геномі специфічну трансформаційну подію EE-GM3 стійкості до гербіцидів по специфічному положенню в межах генома сої. Винахід належить також до способів та засобів для швидкої й однозначної ідентифікації цієї події в біологічних зразках. UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресні посилання на родинні заявки Дана заявка претендує на пріоритет відповідно до попередньої заявки на патент США No 61/367227, поданої 23 липня 2010 р.; попередньої заявки на патент США No 61/263690, поданої 23 листопада 2009 р.; і попередньої заявки на європейський патент No EP 09014564.0, поданої 23 листопада 2009 р., вміст кожної з яких повністю включено в даний документ за допомогою посилання. Галузь техніки Даний винахід відноситься до трансгенних рослин, рослинного матеріалу й насіння сої, що характеризується вмістом специфічної трансформаційної події, зокрема, присутністю генів, що кодують білки, що надають стійкість до гербіцидів, і що характеризуються специфічним положенням у геномі сої. Рослини сої, відповідно до винаходу, поєднують фенотип стійкості до гербіцидів з агрономічною продуктивністю, генетичною стабільністю й функціональністю в різному генетичному оточенні, еквівалентними нетрансформованій лінії сої за відсутності гербіциду(ів). Крім того, даний винахід представляє способи й набори для ідентифікації присутності рослинного матеріалу, що включає спеціалізовану трансформаційну подію EE-GM3 у біологічних зразках. Рівень техніки Фенотипічна експресія трансгена в рослинах визначається як структурою гена або генів самих по собі, так і його або їхнім положенням у геномі рослини. У той же час присутність трансгенів або "чужорідної ДНК" по різних положеннях у межах генома різними шляхами впливає на загальний фенотип рослини. Агрономічно або промислово успішне включення шляхом генетичної маніпуляції в організм рослини ознаки, що представляє інтерес із комерційної точки зору, залежно від різних факторів, може являти собою тривалу процедуру. Фактична трансформація та регенерація генетично трансформованої рослини є лише першим етапом селекції, що включає розширене дослідження генетичних характеристик, схрещування й польові випробування, в остаточному підсумку, що призводять до селекції елітної події. Важливість однозначної ідентифікації елітної події зростає у світлі обговорення нових харчових продуктів/кормів, розподілу продуктів на основі генетично модифікованих і немодифікованих організмів і ідентифікації патентованих матеріалів. В ідеалі такий спосіб ідентифікації є як швидким, так і простим, не потребуючим масштабного лабораторного устаткування. Крім того, цей спосіб має забезпечувати результати, що дозволяють однозначно визначити елітну подію без експертної інтерпретації, однак, які за необхідністю витримують експертну оцінку. Спеціалізовані інструменти для ідентифікації елітної події EE-GM3 у біологічних зразках описані в даний заявці. У даному винаході EE-GM3 ідентифікували як елітну подію з популяції трансгенних рослин сої при розробці сої культурної (Glycine max), стійкої до гербіцидів, що включає ген, що кодує стійкість до гліфосату, у комбінації з геном, що надає стійкість до інгібіторів 4гідроксифенілпіруватдіоксигенази (HPPD), кожний з яких знаходиться під контролем промотору, що забезпечує експресію в рослинній клітині. У літературі описані рослини сої, що містять ген стійкості до гербіцидів. Однак жодна з відомих публікацій не повідомляє про даний винахід. У даній галузі техніки відомо, що одержання комерційної елітної трансформаційної події стійких до гербіцидів рослин сої, що мають прийнятну агрономічну продуктивність без погіршення врожайності й достатню стійкість до гербіцидів 2 різних класів є далеко не простим завданням. У дійсності, повідомлялося, що перша подія сої (подія 40-3-2), що надійшла на ринок як стійка до гербіцидів, характеризувалося значним погіршенням урожайності в порівнянні з ізогенними або приблизно ізогенними лініями (Elmore et al. (2001) Agron. J. 93:408-412). Крім того, була виведена соя Optimum GAT (TM), що поєднувала властивості стійкості до гліфосату зі стійкістю до гербіцидів, що діють на ацетолактатсинтазу, однак розроблювачі повідомляли, що ця соя сама по собі не відповідала стандартам стійкості до гліфосату (поза комбінацією з іншою подією стійкості сої до гліфосату, наприклад, подією 40-3-2 (див., наприклад, www.bloomberg.com/apps/news?pid=newsarchive&sid=ad4L0hH9MKWE)). Суть винаходу Даний винахід відноситься до трансгенної рослини сої або її насіння, клітин і тканин, що містять стабільно інтегровану в їх геном експресійну касету, що включає ген стійкості до гербіциду, що включає послідовність, що кодує, гена 2mEPSPS і ще один ген стійкості до гербіциду, що включає послідовність, що кодує, HPPD-PF W336 (відповідно до опису в Прикладі 1.1 даної заявки і як представлено в SEQ ID No 1), стійкого до гліфосату й гербіциду-інгібітору HPDD, наприклад, ізоксафлютолу, і, за відсутності гербіциду(ів), що має агрономічну 1 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 продуктивність, практично еквівалентну продуктивності нетрансгенної ізогенної лінії. Після застосування одного або більше гербіцидів, до яких рослина має стійкість, вона демонструє агрономічний фенотип, що перевершує фенотип нетрансгенні рослини. Згідно із даним винаходом рослина сої або її насіння, клітини або тканини містять елітну подію EE-GM3. Зокрема, даний винахід відноситься до трансгенних рослин сої, їх насіння, клітин або тканин, геномна ДНК яким характеризується тим, що її аналіз відповідно до протоколу ПЦРідентифікації, як описано тут, з використанням двох праймерів до 5'- або 3'-фланкуючій ділянки EE-GM3 і чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, відповідно, виявляє фрагмент, специфічний для EE-GM3. Мішенню праймерів можуть бути 5'-фланкуюча ділянка у межах SEQ ID No: 2 і чужорідна ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, відповідно. Мішенню праймерів, наприклад, праймерів, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No: 5 і SEQ ID No: 4 або SEQ ID No: 7, відповідно, також можуть бути 3'-фланкуюча ділянка у межах SEQ ID No: 3 і чужорідна ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, відповідно, при цьому праймери виявляють фрагмент ДНК розміром від 100 до 800 п.о., наприклад, фрагмент розміром приблизно 263 п.о. або 706 п.о. Еталонне насіння, що містить елітну подію відповідно до винаходу, депоноване в NCIMB під номером доступу NCIMB 41659. Один з варіантів втілення даного винаходу представляє насіння, що містить елітну подію EE-GM3, депоновано під номером доступу NCIMB 41659 і, що виростає в рослину сої, стійку до гербіцидів, зокрема, стійку до гліфосату та/або інгібіторів HPPD, наприклад, ізоксафлютолу. Насіння, депоноване в NCIMB під номером доступу NCIMB 41659, являє собою партію насіння, що складається щонайменше приблизно на 95 % із трансгенного насіння, гомозиготних по включеній ДНК і що містить елітну подію відповідно до винаходу, які виростають у рослини, стійкі до гербіцидів, причому ці рослини є стійкими до гліфосату та/або ізоксафлютолу. Насіння або потомство насіння, одержуване або одержане з депонованого насіння (наприклад, після схрещування з іншими рослинами сої з іншим генетичним оточенням), можна висіяти й обробити зростаючі рослини гліфосатом або ізоксафлютолом, як описано тут, одержуючи рослини, стійкі до гліфосату або ізоксафлютолу, що містять елітну подію відповідно до винаходу. Даний винахід, крім того, відноситься до клітин, тканині й потомства рослини, що містить елітну подію відповідно до винаходу, що виросла із насіння, депонованого в NCIMB під номером доступу NCIMB 41659. Даний винахід, крім того, відноситься до рослин, одержуваних з (наприклад, шляхом розмноження або схрещування з) рослини сої, що містить елітну подію відповідно до винаходу (наприклад, рослини, що виросло з насіння, депонованого в NCIMB під номером доступу NCIMB 41659). Даний винахід також відноситься до рослин сої, що містять елітну подію EE-GM3. Даний винахід, крім того, відноситься до способу ідентифікації трансгенної рослини або її клітин або тканин, що містять елітну подію EE-GM3, заснованому на ідентифікації присутності характерних послідовностей ДНК або амінокислотних послідовностей, що кодуються такими послідовностями ДНК трансгенної рослини, клітин або тканин. Відповідно до кращого варіанта реалізації даного винаходу такі характерні послідовності ДНК являють собою послідовності довжиною 15 п.о. або щонайменше 15 п.о., переважно 20 п.о. або щонайменше 20 п.о., найбільш переважно 30 п.о. або більше, що містять сайти інсерції події, тобто як фрагмент вставленої чужорідної ДНК, що містить гени стійкості до гербіцидів, так і фрагмент генома сої (5'- або 3'-фланкуюча ділянка), зістиковані один з одним, що надає можливість специфічної ідентифікації елітної події. Даний винахід також відноситься до рослин, що містять елітну подію EE-GM3, як описано тут. Даний винахід, крім того, відноситься до способів ідентифікації елітної події EE-GM3 у біологічних зразках, заснованих на використанні праймерів або зондів, що специфічно розпізнають 5'- та/або 3'-фланкуючу послідовність чужорідної ДНК в EE-GM3, що включає гени стійкості до гербіцидів. Зокрема, даний винахід відноситься до способу, що включає ампліфікацію нуклеотидної послідовності, що є присутньою у біологічних зразках, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та щонайменше, двох праймерів, один із яких розпізнає 5'- або 3'-фланкуючу ділянку чужорідної ДНК в EE-GM3, що включає гени стійкості до гербіцидів, а іншої розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, переважно для одержання фрагмента ДНК розміром між 100 і 800 п.о. Праймери можуть розпізнавати послідовність у межах 5'-фланкуючої ділянки EE-GM3 (SEQ ID No 2, від положення 1 до положення 1451) або в межах 3'-фланкуючої ділянки EE-GM3 (комплементарну SEQ ID No 3, від положення 241 до положення 1408) і послідовність у межах чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіциду (комплементарну SEQ ID No 2, від положення 1452 до положення 1843, 2 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або SEQ ID No 3, від положення 1 до положення 240), відповідно. Праймер, що розпізнає 3'фланкуючу ділянку, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 5, а праймер, що розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 4 або SEQ ID Nо 7, описані тут. Даний винахід також відноситься до специфічних праймерів і специфічної ДНК, ампліфікованої за допомогою таких праймерів, як описано тут. Зокрема, даний винахід відноситься до способу ідентифікації елітної події EE-GM3 у біологічних зразках, причому цей спосіб включає ампліфікацію нуклеотидної послідовності, що присутні у біологічному зразку, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що використовує два праймера, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 4 і SEQ ID No 5, відповідно, і що призводить до одержання фрагмента ДНК, довжиною приблизно 263 п.о., або два праймера, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 5 і SEQ ID No 7, відповідно, і що призводить до одержання фрагмента ДНК, довжиною приблизно 706 п.о. Крім того, даний винахід включає рослини, що містять елітну подію EE-GM3, ідентифіковане в такий спосіб. Даний винахід, крім того, відноситься до специфічних фланкуючих послідовностей EE-GM3, описаних тут, які можна використовувати для розробки специфічних способів ідентифікації EEGM3 у біологічних зразках. Такі специфічні фланкуючі послідовності також можна використовувати в якості еталонного контрольного матеріалу при аналізах ідентифікації. А саме, даний винахід відноситься до 5'- та/або 3'-фланкуючих ділянок EE-GM3, які можна використовувати для розробки специфічних праймерів і зондів відповідно до подальшого опису тут. Крім того, як еталонний матеріал можна використовувати молекули нуклеїнових кислот, переважно довжиною приблизно 150-850 п.о., що включають послідовність, яку можна ампліфікувати за допомогою праймерів, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 7 і SEQ ID No 5 або SEQ ID No 4 і SEQ ID No 5. Даний винахід, крім того, відноситься до способів ідентифікації присутності EE-GM3 у біологічних зразках, заснованих на використанні таких специфічних праймерів або зондів. Праймери можуть включати, складатися з або головним чином складатися з нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, що обирають з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2, від нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, або комплементарного ланцюга нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3, від нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, у комбінації із праймерами, що включають, що складаються з або головним чином складаються з нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, що обирають з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2, наприклад, нуклеотидної послідовності довжиною від 17 до приблизно 200 послідовних нуклеотидів, що обирають з комплементарного ланцюга нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2, від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843, або нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3, від нуклеотида 1 до нуклеотида 240. Праймери також можуть включати зазначені нуклеотидні послідовності, розташовані безпосередньо на їх 3'-кінці, і, крім того, включати неспоріднені послідовності або послідовності, що є похідними згаданих нуклеотидних послідовностей, але що містять невідповідності. Даний винахід, крім того, відноситься до наборів для ідентифікації елітної події EE-GM3 у біологічних зразках, що включає щонайменше один праймер або зонд, що специфічно розпізнає 5'- та/або 3'-фланкуючу послідовність чужорідної ДНК в EE-GM3. Набори, відповідно до винаходу, можуть включати, крім праймера, що специфічно розпізнає 5'- або 3'-фланкуючу послідовність EE-GM3, другий праймер, що специфічно розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК в EE-GM3, що містить гени стійкості до гербіцидів, для використання відповідно до протоколу ПЦР-ідентифікації. Набори, відповідно до винаходу, можуть включати щонайменше два специфічних праймера, один із яких розпізнає послідовність у межах 5'-фланкуючої ділянки EE-GM3, а другий розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК в EE-GM3, що містить гени стійкості до гербіцидів. Праймер, що розпізнає 3'-фланкуючу ділянку, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 5, а праймер, що розпізнає трансгени або чужорідну ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, може включати нуклеотидну послідовність SEQ ID No 4 або No: 7, або будь-який інший праймер або комбінацію праймерів, описані тут. Даний винахід, крім того, відноситься до набору для ідентифікації елітної події EE-GM3 у біологічних зразках, що включає праймери для ПЦР, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 5 і SEQ ID No 4, для використання відповідно до протоколу ПЦР-ідентифікації EE-GM3, описаного тут. Даний винахід також відноситься до набору для ідентифікації елітної події EE-GM3 у 3 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біологічних зразках, що включає специфічний зонд, що включає або складається (головним чином) з послідовності, що відповідає (або комплементарної) послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності зі специфічною ділянкою EE-GM3. У кращому випадку послідовність зонда відповідає специфічній ділянці, що включає частину 5'- або 3'-фланкуючі ділянки EE-GM3. У найбільш кращому випадку специфічний зонд включає або складається (головним чином) з (або комплементарний) послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності з послідовністю, розташованою між нуклеотидами 1431-1472 SEQ ID No 2, або послідовності, що має від 80 % до 100 % ідентичності з послідовністю, розташованою між нуклеотидами 220-260 SEQ ID No 3. Відповідно до іншого аспекту даного винаходу описані послідовності ДНК включають сайт інсерції події й полінуклеотиди достатньої довжини, що відносяться як до геному сої, так і до чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів (трансгену), що забезпечує можливість їхнього використання в якості праймера або зонда для виявлення EE-GM3, і для визначення характеристик рослин, що містять подію EE-GM3. Такі послідовності можуть включати щонайменше 9 нуклеотидів геномної ДНК сої й аналогічна кількість нуклеотидів чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів, для EE-GM3 з кожної сторони сайту з'єднання, відповідно. У найбільш кращому випадку такі послідовності ДНК включають щонайменше 9 нуклеотидів геномної ДНК сої й аналогічні кількість нуклеотидів чужорідної ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів (трансгена), що примикають до сайту інсерції в SEQ ID No: 2 або SEQ ID No: 3. В одному з аспектів даного винаходу представлені рослини сої, що містять такі специфічні послідовності ДНК. Способи й набори, охоплені с даним винаходом, можна використовувати для різних цілей, наприклад, не обмежуючись цим: ідентифікації присутності або визначення (нижнього) граничного значення EE-GM3 у рослинах, рослинному матеріалі або продуктах, наприклад, не обмежуючись цим, у харчових продуктах або кормах (свіжих або оброблених), що включають або що походять з рослинного матеріалу; додатково або альтернативно способи й набори даного винаходу можна використовувати для ідентифікації трансгенного рослинного матеріалу з метою розподілу трансгенних і нетрансгенних матеріалів; додатково або альтернативно способи й набори даного винаходу можна використовувати для визначення якості (тобто процентного вмісту чистого матеріалу) рослинного матеріалу, що включає EE-GM3. Даний винахід також відноситься до 5'- та/або 3'-фланкуючих галузей EE-GM3, а також до специфічних праймерів і зондів, розроблених на основі 5'- та/або 3'-фланкуючих послідовностей EE-GM3. Даний винахід також відноситься до геномної ДНК, одержаної з рослин, що містять елітну подію EE-GM3. Таку геномну ДНК можна використовувати в якості еталонного контрольного матеріалу при аналізах ідентифікації, описаних тут. Крім того, тут представлені рослини або клітини, частини, насіння або потомство трансгенної сої, стійкої до гербіцидів, кожне з яких містить щонайменше одну елітну подію, причому зазначена елітна подія включає чужорідну ДНК, що включає: i) перший химерний ген, що включає модифікований ген epsps з Zea mays, що кодує фермент EPSPS, стійкий до гліфосату, під контролем промотору, що забезпечує експресію в рослинній клітині, і ii) другий химерний ген, що включає модифікований ген hppd з Pseudomonas fluorescens, що кодує фермент HPPD, стійкий до гербіцидів-інгібіторам, під контролем промотору, що забезпечує експресію в рослинній клітині. В одному варіанті втілення зазначена елітна подія включає нуклеотиди 1-1451 SEQ ID No 2, що примикають безпосередньо зверху до зазначеної чужорідної ДНК, і нуклеотиди 241-1408 SEQ ID No 3, що примикають безпосередньо знизу до зазначеної чужорідної ДНК. У додатковому варіанті втілення зазначену елітну подію можна одержати шляхом схрещування з рослиною сої, що виросли з еталонного насіння, що містить зазначену подію й депонованого в NCIMB під номером NCIMB 41659. У ще одному варіанті втілення геномна ДНК зазначеної рослини сої або її клітин, частин, насіння або потомства при аналізі відповідно до протоколу ідентифікації зазначеної елітної події з використанням двох праймерів, що включають нуклеотидну послідовність SEQ ID No 4 і SEQ ID No 5, відповідно, дозволяє одержати фрагмент ДНК довжиною (приблизно) 263 п.о. Крім того, тут представлений спосіб ідентифікації трансгенної рослини сої або її клітин, частин, насіння або потомства, стійких до гліфосату та/або гербіциду-інгібітору HPPD, наприклад, ізоксафлютолу, у біологічних зразках, причому зазначений спосіб включає ампліфікацію фрагмента ДНК довжиною між 100 і 500 п.о. з нуклеїнової кислоти, що присутні у біологічному зразку, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що використовує щонайменше два праймера, один із яких розпізнає 5'-фланкуючу ділянку вищевказаної елітної 4 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 події, причому зазначена 5'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 2, від нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, або 3'-фланкуючу ділянку зазначеної елітної події, причому зазначена 3'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 3, від нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, а інший із зазначених праймерів розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК, що включає нуклеотидну послідовність комплементарної ланцюга SEQ ID No 2, від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843, або нуклеотидну послідовність SEQ ID No 3, від нуклеотида 1 до нуклеотида 240. Крім того, тут представлений набір для ідентифікації трансгенної рослини сої або її клітин, частин, насіння або потомства, стійких до гліфосату та/або гербіциду-інгібітору HPPD, наприклад, ізоксафлютолу, у біологічних зразках, причому зазначений набір включає праймер, що розпізнає 5'-фланкуючу ділянку вищевказаної елітної події, причому зазначена 5'-фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 2, від нуклеотида 1 до нуклеотида 1451, або праймер, що розпізнає 3'-фланкуючу ділянку зазначеної елітної події, причому зазначена 3'фланкуюча ділянка включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 3, від нуклеотида 241 до нуклеотида 1408, і праймер, що розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК, причому зазначена чужорідна ДНК включає нуклеотидну послідовність комплементарного ланцюга SEQ ID No 2, від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843, або нуклеотидну послідовність SEQ ID No 3, від нуклеотида 1 до нуклеотида 240. В одному варіанті втілення даного винаходу чужорідна ДНК елітної події EE-GM3, як використовується тут, включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 11, від положення 1452 до положення 16638, або її комплементарний ланцюг, або включає послідовність, що має щонайменше 95, 98, 99 або 99.5 % ідентичності з нуклеотидною послідовністю SEQ ID No 11, від положення 1452 до положення 16638, або її комплементарним ланцюгом. Крім того, тут представлена рослина, рослинна клітина, тканина або насіння сої, геном яких містить молекулу нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 97, 98 або щонайменше 99 % ідентичності з нуклеотидної послідовністю SEQ ID No 11, від положення 1452 до положення 16638, або її комплементарним ланцюгом, або нуклеотидну послідовність, що має щонайменше 97, 98 або щонайменше 99 % ідентичності з SEQ ID No 11 або її комплементарним ланцюгом. Один з варіантів втілення даного винаходу представляє рослину, рослинну клітину, тканину або насіння сої, геном яких містить молекулу нуклеїнової кислоти, що гібридизує з нуклеотидною послідовністю SEQ ID No 1 або її комплементарним ланцюгом, або що гібридизує з нуклеотидною послідовністю SEQ ID No 11, від положення 1452 до положення 16638, або її комплементарним ланцюгом, або що гібридизує з нуклеотидною послідовністю SEQ ID No 11 або її комплементарним ланцюгом. Також тут представлена виділена молекула нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, щонайменше на 99 % ідентичну нуклеотидній послідовності SEQ ID No 11, від положення 1452 до положення 16638, або її комплементарного ланцюга, або нуклеотидну послідовність, щонайменше на 99 % ідентичну SEQ ID No 11 або її комплементарного ланцюга, або виділена молекула нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, що гібридизує з нуклеотидною послідовністю SEQ ID No 11, від положення 1452 до положення 16638, або її комплементарним ланцюгом, або що гібридизує з нуклеотидною послідовністю SEQ ID No 11 або її комплементарним ланцюгом. Стислий опис креслень Наведені далі Приклади, не призначені для обмеження даного винаходу в рамках конкретних описаних варіантів втілення, можна осмислювати в сполученні із Фігурами, що додаються, включеними в даний документ за допомогою посилань, на яких: Фіг. 1: Схематичне представлення взаємодії між згаданими нуклеотидними послідовностями й праймерами. чорний прямокутник: чужорідна ДНК; заштрихований прямокутник: ДНК рослинного походження; стрілка з картатим заливанням (а): химерний ген, що кодує HPPD PF W366 (композицію химерного гена див. у Таблиці 1); заштрихована стрілка (б): химерний ген, що кодує 2mEPSPS (композицію химерного гена див. у Таблиці 1); чорні стрілки: олігонуклеотидні праймери, фігури під прямокутниками означають положення нуклеотидів; (в) відноситься до комплементарного ланцюга зазначеної нуклеотидної послідовності; Примітка: схема наведена без врахування масштабу. Фіг. 2: Результати, отримані за допомогою протоколу ПЦР-ідентифікації, розробленого для EE-GM3. Послідовність завантаження гелю: Доріжка 1: Маркер молекулярної маси (леддер 100 п.о.); доріжки 2 і 3: зразки ДНК із рослин сої, що містять трансгенну подію EE-GM3; доріжки 4-7: зразки ДНК із трансгенних рослин сої, не що містять елітну подію EE-GM3, але що містять ті ж 5 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гени стійкості до гербіцидів (інші трансформаційні події); доріжка 8: зразок ДНК із сої дикого типу; доріжка 9: контроль, що не містить матрицю ДНК; доріжка 10: маркер молекулярної маси. Фіг. 3: Результати, отримані за допомогою протоколу ПЦР для оцінки зиготності, розробленого для EE-GM3. Послідовність завантаження гелю: Доріжка 1: Маркер молекулярної маси (леддер 100 п.о.); доріжки 2 і 5: зразки ДНК із рослин сої, що містять трансгенну подію EEGM3 у гомозиготній формі; доріжки 3, 8 і 9: зразки ДНК із рослин сої, що містять трансгенну подію EE-GM3 у гетерозиготній формі; доріжки 4, 6 і 7: контрольний зразок ДНК із незиготної рослини сої; доріжка 10: контроль, не що містить матрицю ДНК; доріжка 11: маркер молекулярної маси. Докладний опис кращих варіантів втілення винаходу Включення молекули рекомбінантної ДНК у геном рослини звичайно є результатом трансформації клітини або тканини. Конкретний сайт вбудовування звичайно обумовлений випадковим вбудовуванням. ДНК, включену в геном рослини в результаті трансформації рослинної клітини або тканини рекомбінантної ДНК, або "ДНК, що трансформує" і що відбувається з такої ДНК, що трансформує, тут і далі називають "чужорідною ДНК", що включає один або більше "трансгенів". Трансгени EE-GM3 являють собою гени стійкості до гліфосату й гербіциду-інгібітору HPPD. "Рослинна ДНК" у контексті даного винаходу відноситься до ДНК, що відбувається із трансформованої рослини. Рослинна ДНК звичайно знаходиться в тому ж генетичному локусі відповідної рослини дикого типу. Чужорідну ДНК можна характеризувати по положенню й конфігурації в сайті вбудовування молекули рекомбінантної ДНК у геном рослини. Сайт геному рослини, куди вбудовують рекомбінантну ДНК, також називають "сайтом інсерції" або " сайтоммішенню". Інсерція рекомбінантної ДНК в ділянку генома рослини, називану "передінерційна рослинна ДНК" може бути пов'язана з делецією рослинної ДНК, що має назву "делецією сайтумішені". "Фланкуюча ділянка" або "фланкуюча послідовність" тут відноситься до послідовності довжиною щонайменше 20 п.о., переважно щонайменше 50 п.о., і до 5000 п.о. ДНК, що відрізняється від включеної ДНК, переважно ДНК геному рослини, пов'язаною із чужорідною ДНК безпосередньо зверху або пов'язаною із чужорідною ДНК безпосередньо знизу. Результатом процедур трансформації, що призводять до випадкового вбудовування чужорідної ДНК, є одержання трансформантів з різними фланкуючими ділянками, характерними й унікальними для кожного трансформанта. Якщо рекомбінантну ДНК включають у геном рослини шляхом традиційного схрещування, сайт її інсерції в геномі рослини або її фланкуючі ділянки в загальному випадку не змінюються. "Виділена нуклеїнова кислота (послідовність)" або "виділена ДНК (послідовність)" тут відноситься до нуклеїнової кислоти або ДНК (послідовності), що більше не знаходиться в природному оточенні, з якого неї виділили, наприклад, нуклеотидної послідовності в геномі рослини або іншої бактерії-хазяїна, або нуклеотидної кислоті або ДНК у складі гібрида із ДНК або нуклеїнової кислотою з іншого джерела, наприклад, у складі химерного гена під контролем промотору, що забезпечує експресію у рослинній клітині. Подією називають (штучний) генетичний локус, що у результаті генно-інженерних маніпуляцій несе чужорідну ДНК або трансген, що включає щонайменше одну копію гена або генів, що цікавить дослідника. Типові алельні стани події являють собою наявність або відсутність чужорідної ДНК. Подію описують фенотипічно по експресії трансгена. На генетичному рівні подія є частиною генетичної композиції рослини. На молекулярному рівні подію можна описувати по рестриктазній карті (наприклад, відповідно до визначення за допомогою саузерн-блоттинга), по вверх та/або униз фланкуючих послідовностях трансгена, положенню молекулярних маркерів та/або молекулярної конфігурації трансгена. Звичайно трансформація рослини ДНК, що трансформує, що включає щонайменше один ген, що цікавить дослідника, призводить до одержання популяції трансформантів, що містить сукупність окремих подій, кожна з яких є унікальною. Подію описують по чужорідній ДНК і щонайменше одній із фланкуючих послідовностей. Елітна подія в даному описі являє собою подію, що вибирають із групи подій, отриманих шляхом трансформації однієї й тієї ж ДНК. що трансформує, на основі експресії й стабільності трансгена(ів) і його сумісності з оптимальними агрономічними характеристиками рослини, що містить цю подію. Таким чином, критерії селекції елітної події являють собою один або більше, переважно два або більше, найбільше переважно - всі критерії з наступного списку: a) присутність чужорідної ДНК не ставить під загрозу інші бажані характеристики рослини, наприклад, характеристики, що відносяться до агрономічної продуктивності або комерційної цінності; б) подія описується чітко певною молекулярною конфігурацією, що стабільно 6 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 успадковується й для якої можна розробити придатні інструменти контролю ідентичності; в) ген(и), що цікавить(ять) дослідника, демонструє(ють) коректну, адекватну й стабільну просторову й тимчасову фенотипічну експресію як у гетерозиготному (або гемизиготному), так і в гомозиготному стані події на комерційно прийнятному рівні в діапазоні умов навколишнього середовища, за яких можливо нормальне агрономічне використання рослин, що несуть зазначену подію. У кращому випадку чужорідна ДНК асоційована з положенням у геномі рослини, що дозволяє легко включати чужорідні послідовності в комерційно бажане генетичне оточення. Елітний статус події підтверджують інтрогресією елітної події в різні варіанти генетичного оточення, що мають відношення до розглянутого питання, і спостереженням відповідності одному, двом або всім вищенаведеним критеріям, наприклад, а, б та в. Таким чином, "елітна подія" відноситься до генетичного локусу, що містить чужорідну ДНК і відповідає вищеописаним критеріям. Рослина, рослинний матеріал або потомство, наприклад, насіння, можуть містити одну або більше елітних подій у складі свого генома. Розроблені інструменти для ідентифікації елітної події або рослини, або рослинного матеріалу, що містить елітну подію, або продукту, що включає рослинний матеріал, що містить елітну подію, засновані на специфічних геномних характеристиках елітної події, наприклад, специфічної рестриктазної карти ділянки генома, що містить чужорідну ДНК, молекулярних маркерах або послідовності фланкуючої(их) ділянки(ок) чужорідної ДНК. Після секвенування однієї або обох фланкуючих ділянок чужорідної ДНК можна розробити праймери й зонди, що специфічно розпізнають цю (ці) послідовність(і) у нуклеїновій кислоті (ДНК або РНК) зразка за допомогою молекулярно-біологічних методик. Наприклад, можна розробити ПЦР-методику ідентифікації елітної події в біологічних зразках (наприклад, зразках рослин, рослинного матеріалу або продуктів, що містять рослинний матеріал). Така ПЦР заснована щонайменше на двох специфічних "праймерах", один із яких розпізнає послідовність у межах 5'- або 3'-фланкуючої ділянки елітної події, а другий розпізнає послідовність у межах чужорідної ДНК. У кращому випадку праймери мають послідовність довжиною від 15 до 35 нуклеотидів, що при оптимізованих для ПЦР умовах "специфічно розпізнає" послідовність у межах 5'- або 3'-фланкуючої ділянки елітної події або чужорідної ДНК елітної події, відповідно, що призводить до ампліфікації специфічного фрагмента ("інтегрованого фрагмента" або відрізняльного амплікона) зі зразка нуклеїнової кислоти, що містить елітну подію. Це означає, що за оптимізованих для ПЦР умов відбувається ампліфікація тільки інтегрованого фрагментамішені й жодної іншої послідовності, що входить до складу генома рослини або чужорідної ДНК. ПЦР-праймери, придатні для винаходу, можуть являти собою: - олігонуклеотиди довжиною від 17 до приблизно 200 нуклеотидів, що включають на своєму 3'-кінці нуклеотидну послідовність довжиною щонайменше 17 послідовних нуклеотидів, переважно 20 послідовних нуклеотидів, що обирають із ДНК рослини в складі 5'-фланкуючої послідовності (SEQ ID No 2, від нуклеотида 1 до нуклеотида 1451) (праймери, що розпізнають 5'-фланкуючі послідовності); або - олігонуклеотиди довжиною від 17 до приблизно 200 нуклеотидів, що включають на своєму 3'-кінці нуклеотидну послідовність довжиною щонайменше 17 послідовних нуклеотидів, переважно 20 послідовних нуклеотидів, що обирають із ДНК рослини в складі 3'-фланкуючі послідовності (комплементарного ланцюга SEQ ID No 3, від нуклеотида 241 до нуклеотида 1408) (праймери, що розпізнають 3'-фланкуючі послідовності); або - олігонуклеотиди довжиною від 17 до приблизно 200 нуклеотидів, що включають на своєму 3'-кінці нуклеотидну послідовність довжиною щонайменше 17 послідовних нуклеотидів, переважно 20 послідовних нуклеотидів, що обирають із впроваджених послідовностей ДНК (комплементарного ланцюга SEQ ID No 2, від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1843) (праймери, що розпізнають чужорідну ДНК); або - олігонуклеотиди довжиною від 17 до приблизно 200 нуклеотидів, що включають нуклеотидну послідовність довжиною щонайменше 17 послідовних нуклеотидів, переважно 20 послідовних нуклеотидів, що обирають із впроваджених послідовностей ДНК (SEQ ID No 3, від нуклеотида 1 до нуклеотида 240); або - придатні олігонуклеотиди довжиною від 17 до приблизно 200 нуклеотидів, що включають нуклеотидну послідовність довжиною щонайменше 17 послідовних нуклеотидів, переважно 20 послідовних нуклеотидів, що обирають з нуклеотидної послідовності фрагмента включеній ДНК або її комплементарного ланцюга (SEQ ID No 1 або SEQ ID No 11, від нуклеотида 1452 до нуклеотида 16638). Зрозуміло, довжина праймерів може бути більше згаданих 17 послідовних нуклеотидів, і може, наприклад, становити 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 нуклеотидів і навіть більше. 7 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Праймери можуть повністю складатися з нуклеотидної послідовності, обираної зі згаданих нуклеотидних послідовностей фланкуючих послідовностей і чужорідних послідовностей ДНК. У той же час, нуклеотидна послідовність 5'-кінця праймерів (тобто поза 17 послідовних нуклеотидів, розташованих на 3'-кінці) є менш критичною. Так, 5'-послідовність праймерів може включати або складатися з нуклеотидної послідовності, обираної із фланкуючих послідовностей або чужорідної ДНК, якщо це необхідно, але може містити декілька (наприклад, 1, 2, 5 або 10) неспівпадінь. 5'-послідовність праймерів може навіть повністю бути нуклеотидною послідовністю, що не відноситься до фланкуючих послідовностей або чужорідної ДНК, наприклад, нуклеотидної послідовністю, що являє собою один або декілька сайтів розпізнавання ферментів рестрикції. Такі неспоріднені послідовності або фланкуючі послідовності ДНК із розбіжностями в кращому випадку не повинні перевищувати 100, а в більше кращому випадку - 50 або навіть 25 нуклеотидів у довжину. Крім того, придатні праймери можуть містити, складатися (головним чином) з нуклеотидної послідовності на їх 3'-кінці, що перекриває ділянку з'єднання послідовностей рослинної ДНК і послідовностей чужорідної ДНК (розташованої в положенні 1451-1452 в SEQ ID No 2 і 240-241 в SEQ ID No 3), що робить згадані 17 послідовних нуклеотидів, розташованих на 3'-кінці, похідними як чужорідної ДНК, так і послідовностей рослинного походження SEQ ID No 2 або No 3. Для фахівця буде очевидно, що правильно обрана пара праймерів для ПЦР, крім того, не повинна містити послідовностей, комплементарних одна одній. Для цілей даного винаходу "комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності, представленої в SEQ ID No: X" являє собою нуклеотидну послідовність, що є похідною представленої нуклеотидної послідовності шляхом заміщення нуклеотидів їх комплементарними нуклеотидами відповідно до правил Чаргаффа (A  T; G  C) і читання послідовності в напрямку від 5" до 3", тобто протилежно представленої нуклеотидної послідовності. Приклади придатних праймерів являють собою послідовності олігонуклеотидів SEQ ID No 5 (праймер, що розпізнає 3'-фланкуючу послідовність), SEQ ID No 4 (праймер, що розпізнає чужорідну ДНК для використання із праймерами, що розпізнають 3'-фланкуючу послідовність) або SEQ ID No 7 (праймер, що розпізнає чужорідну ДНК для використання із праймерами, що розпізнають 3'-фланкуючу послідовність). Інші приклади придатних олігонуклеотидних праймерів містять на 3'-кінці наступні послідовності або складаються (головним чином) з таких послідовностей: а. праймери, що розпізнають 5'-фланкуючу послідовність: - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 264 до нуклеотида 283 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 266 до нуклеотида 285 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1240 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 265 до нуклеотида 285 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 265 до нуклеотида 283 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1239 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1241 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1244 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1248 до нуклеотида 1267 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1250 до нуклеотида 1269 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 262 до нуклеотида 279 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 263 до нуклеотида 279 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 264 до нуклеотида 285 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 266 до нуклеотида 283 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1238 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1242 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1243 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1245 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1247 до нуклеотида 1267 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1249 до нуклеотида 1269 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1249 до нуклеотида 1267 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 263 до нуклеотида 285 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 267 до нуклеотида 283 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1242 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1243 до нуклеотида 1259 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1246 до нуклеотида 1267 8 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1246 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1248 до нуклеотида 1269 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1250 до нуклеотида 1271 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1250 до нуклеотида 1267 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1241 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1245 до нуклеотида 1267 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1247 до нуклеотида 1269 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1247 до нуклеотида 1263 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1249 до нуклеотида 1271 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1242 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1241 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1243 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1240 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1244 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1239 до нуклеотида 1261 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1245 до нуклеотида 1261 б. праймери, що розпізнають чужорідну ДНК, для використання із праймерами, що розпізнають 5'-фланкуючу послідовність: - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1751 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1735 до нуклеотида 1754 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1750 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1750 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1752 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1749 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1749 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1751 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1753 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1748 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1748 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1735 до нуклеотида 1751 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1752 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1732 до нуклеотида 1754 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1747 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1731 до нуклеотида 1753 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до нуклеотида 1746 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до нуклеотида 1745 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до нуклеотида 1747 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до нуклеотида 1744 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до нуклеотида 1748 9 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - комплементарний нуклеотида 1749 - комплементарний нуклеотида 1745 - комплементарний нуклеотида 1744 - комплементарний нуклеотида 1746 - комплементарний нуклеотида 1747 - комплементарний нуклеотида 1748 - комплементарний нуклеотида 1744 - комплементарний нуклеотида 1745 - комплементарний нуклеотида 1746 - комплементарний нуклеотида 1478 - комплементарний нуклеотида 1686 - комплементарний нуклеотида 1486 - комплементарний нуклеотида 1527 - комплементарний нуклеотида 1686 - комплементарний нуклеотида 1687 - комплементарний нуклеотида 1689 - комплементарний нуклеотида 1704 - комплементарний нуклеотида 1705 - комплементарний нуклеотида 1709 - комплементарний нуклеотида 1486 - комплементарний нуклеотида 1497 - комплементарний нуклеотида 1498 - комплементарний нуклеотида 1507 - комплементарний нуклеотида 1508 - комплементарний нуклеотида 1688 - комплементарний нуклеотида 1690 - комплементарний нуклеотида 1691 - комплементарний нуклеотида 1706 - комплементарний нуклеотида 1707 - комплементарний нуклеотида 1708 ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1727 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1726 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1726 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1726 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1726 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1726 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1724 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1724 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1724 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1461 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1508 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1667 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1467 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1672 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до 10 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - комплементарний нуклеотида 1487 - комплементарний нуклеотида 1499 - комплементарний нуклеотида 1505 - комплементарний нуклеотида 1506 - комплементарний нуклеотида 1507 - комплементарний нуклеотида 1508 - комплементарний нуклеотида1686 - комплементарний нуклеотида 1687 - комплементарний нуклеотида 1688 - комплементарний нуклеотида 1689 - комплементарний нуклеотида 1707 - комплементарний нуклеотида 1709 - комплементарний нуклеотида 1710 - комплементарний нуклеотида 1500 - комплементарний нуклеотида 1509 - комплементарний нуклеотида 1689 - комплементарний нуклеотида 1690 - комплементарний нуклеотида 1691 - комплементарний нуклеотида 1705 - комплементарний нуклеотида 1706 - комплементарний нуклеотида 1710 - комплементарний нуклеотида 1488 - комплементарний нуклеотида 1507 - комплементарний нуклеотида 1510 - комплементарний нуклеотида 1512 - комплементарний нуклеотида 1513 - комплементарний нуклеотида 1514 - комплементарний нуклеотида 1692 - комплементарний нуклеотида 1694 - комплементарний нуклеотида 1695 ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1666 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1667 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1672 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1672 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1672 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1488 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1495 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1495 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1495 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до 11 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - комплементарний нуклеотида 1696 - комплементарний нуклеотида 1703 - комплементарний нуклеотида 1704 - комплементарний нуклеотида 1711 - комплементарний нуклеотида 1488 - комплементарний нуклеотида 1506 - комплементарний нуклеотида 1511 - комплементарний нуклеотида 1690 - комплементарний нуклеотида 1697 - комплементарний нуклеотида 1709 - комплементарний нуклеотида 1487 - комплементарний нуклеотида 1508 - комплементарний нуклеотида 1511 - комплементарний нуклеотида 1512 - комплементарний нуклеотида 1687 - комплементарний нуклеотида 1688 - комплементарний нуклеотида 1692 - комплементарний нуклеотида 1693 - комплементарний нуклеотида 1707 - комплементарний нуклеотида 1490 - комплементарний нуклеотида 1491 - комплементарний нуклеотида 1501 - комплементарний нуклеотида 1509 - комплементарний нуклеотида 1515 - комплементарний нуклеотида 1691 - комплементарний нуклеотида 1694 - комплементарний нуклеотида 1698 - комплементарний нуклеотида 1489 - комплементарний нуклеотида 1689 - комплементарний нуклеотида 1708 ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1488 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1467 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1488 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1495 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1491 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1666 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1667 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1672 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1495 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1673 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1667 до ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до 12 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1688 до нуклеотида 1710 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до нуклеотида 1711 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до нуклеотида 1492 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до нуклеотида 1510 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1666 до нуклеотида 1688 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1687 до нуклеотида 1709 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до нуклеотида 1712 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1467 до нуклеотида 1488 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до нуклеотида 1490 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1488 до нуклеотида 1509 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1489 до нуклеотида 1511 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до нуклеотида 1699 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до нуклеотида 1493 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1472 до нуклеотида 1494 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до нуклеотида 1502 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1670 до нуклеотида 1692 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1469 до нуклеотида 1491 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1488 до нуклеотида 1510 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до нуклеотида 1712 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до нуклеотида 1713 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1692 до нуклеотида 1714 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1467 до нуклеотида 1489 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1678 до нуклеотида 1700 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1481 до нуклеотида 1503 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 2 від нуклеотида 1691 до нуклеотида 1713 в. праймери, що розпізнають 3'-фланкуючу послідовність: - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 847 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 849 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 846 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 848 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до 13 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотида 848 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 850 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 845 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 847 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 849 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 851 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 844 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 846 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 828 до нуклеотида 850 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 830 до нуклеотида 852 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 992 до нуклеотида 1009 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 731 до нуклеотида 752 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 795 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 731 до нуклеотида 753 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 794 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 796 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 793 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 797 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 792 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 776 до нуклеотида 798 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 733 до нуклеотида 752 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 733 до нуклеотида 753 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 733 до нуклеотида 754 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 733 до нуклеотида 755 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 838 до нуклеотида 854 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 246 до нуклеотида 263 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 838 до нуклеотида 855 - комплементарний ланцюг нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 245 до нуклеотида 264 г. праймери, що розпізнають чужорідну ДНК, для використання із праймерами, що розпізнають 3'-фланкуючу послідовність: - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 173 до нуклеотида 192 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 22 до нуклеотида 41 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 172 до нуклеотида 192 14 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 174 до нуклеотида 192 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 191 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 171 до нуклеотида 192 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 175 до нуклеотида 192 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 190 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 192 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 176 до нуклеотида 192 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 189 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 193 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 188 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 194 до нуклеотида 210 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 199 до нуклеотида 218 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 200 до нуклеотида 218 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 197 до нуклеотида 218 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 201 до нуклеотида 218 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 201 до нуклеотида 220 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 200 до нуклеотида 220 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 199 до нуклеотида 220 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 200 до нуклеотида 221 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 199 до нуклеотида 221 - нуклеотидна послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 150 до нуклеотида 172 У даному описі "нуклеотидна послідовність SEQ ID No Z від положення X до положення Y" означає нуклеотидну послідовність, що включає обидва кінцевих нуклеотида. У кращому випадку ампліфікований фрагмент має довжину між 50 і 500 нуклеотидами, наприклад, між 100 і 350 нуклеотидами. Специфічні праймери можуть мати послідовність, на 80100 % ідентичну послідовності в межах 5'- або 3'-фланкуючоїі ділянки елітної події або чужорідної ДНК елітної події, відповідно, за умови, що неспівпадіння дозволяють здійснювати специфічну ідентифікацію елітної події при використанні цих праймерів в умовах, оптимізованих для ПЦР. У той же час діапазон припустимих неспівпадінь легко визначити експериментально, і ці діапазони відомі фахівцям. Виявлення інтегрованих фрагментів можна здійснювати різними способами, наприклад, за рахунок оцінки розміру фрагментів після аналізу в гелі. Інтегровані фрагменти також можна безпосередньо секвенувати. Крім того, відомі інші способи виявлення ампліфікованих фрагментів ДНК, специфічних стосовно послідовностей. Оскільки послідовність праймерів і їх відносне розташування в геномі унікальні для елітної події, ампліфікація інтегрованого фрагмента відбувається тільки в біологічних зразках, що містять нуклеїнову кислоту елітної події. У кращому випадку при виконанні ПЦР для ідентифікації присутності EE-GM3 у невідомих зразках включають контроль із набором праймерів, при використанні яких можна ампліфікувати фрагмент у межах "гена домашнього господарства" виду рослини, що містить зазначену подію. Гени домашнього господарства являють собою гени, що експресуються в більшості типів клітин і пов'язані з метаболічною активністю, загальною для всіх клітин. У кращому випадку розмір фрагмента, ампліфікованого з гена домашнього господарства, перевищує розмір ампліфікованого інтегрованого фрагмента. Залежно від аналізованих зразків можна включати інші контролі. Стандартні протоколи ПЦР описані, наприклад, в "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999) і інших джерелах. Оптимальні умови для ПЦР, включаючи послідовність специфічних праймерів, зазначені в "Протоколі ПЦР-ідентифікації (або ідентифікації за допомогою полімеразної ланцюгової реакції)” для кожної елітної події. Разом з тим, варто розуміти, що може виникнути необхідність корекції ряду параметрів протоколу ПЦРідентифікації до умов, специфічних для лабораторії, і їхньої незначної модифікації для одержання аналогічних результатів. Наприклад, при використанні різних способів підготовки ДНК може вимагатися корекція, наприклад, використовуваної кількості праймерів, полімерази та умов гібридизації. Аналогічно вибір інших праймерів може диктувати інші оптимальні умови протоколу ПЦР-ідентифікації. Разом з тим, ці варіанти корекції очевидні для фахівців і, більш того, докладно описані в сучасних керівництвах по застосуванню ПЦР, наприклад, у зазначеному вище керівництві. Як альтернатива для ампліфікації інтегрованого фрагмента, який можна використовувати в якості "специфічного зонда" для ідентифікації EE-GM3 у біологічних зразках, можна використовувати специфічні праймери. Взаємодія нуклеїнової кислоти біологічного зразка із зондом в умовах, за яких можлива гібридизація зонда з відповідним фрагментом нуклеїнової 15 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислоти, призводить до утворення гібрида нуклеїнова кислота/зонд. Утворення цього гібрида можна виявити (наприклад, за рахунок мічення нуклеїнової кислоти або зонда), відповідно до чого утворення цього гібрида вказує на присутність EE-GM3. Такі способи ідентифікації, які засновані на гібридизації зі специфічним зондом (на твердофазному носії або в розчині), описані в спеціальній літературі. Специфічний зонд у кращому випадку являє собою послідовність, що за оптимізованих умов специфічно гібридизується з ділянкою в межах 5'- або 3'-фланкуючої ділянки елітної події, а також переважно містить безперервний із цією ділянкою фрагмент чужорідної ДНК (тут і далі називаною "специфічною областю"). У кращому випадку специфічний зонд включає послідовність довжиною від 50 до 500 п.о., переважно від 100 до 350 п.о., що щонайменше на 80 %, переважно на 80-85 %, більш переважно на 85-90 %, особливо переважно на 90-95 %, найбільше переважно на 95 %-100 %, ідентична (або комплементарна) нуклеотидній послідовності специфічної ділянки. У кращому випадку специфічний зонд включає послідовність довжиною від приблизно 15 до приблизно 100 безперервних нуклеотидів, ідентичну (або комплементарну) специфічної ділянки елітної події. Олігонуклеотиди, придатні для використання в якості ПЦР-праймерів для виявлення елітної події EE-GM3, також можна використовувати для розробки протоколу визначення статусу зіготності рослин, що містять зазначену елітну подію, на основі ПЦР. Для цієї мети сконструйовані два праймера, що розпізнають локус дикого типу до інтеграції, так що вони є мішенями друг для друга й мають сайт інсерції, розташований між праймерами. Ці праймери можуть являти собою праймери, що специфічно розпізнають 5'- і 3'-фланкуючі послідовності, що знаходяться у межах SEQ ID No 2 або 3, відповідно. Ці праймери також можуть являти собою праймери, що специфічно розпізнають 5'- або 3'-фланкуючу послідовність. У даному винаході особливо кращі праймери, що розпізнають локус дикого типу до інтеграції, являють собою праймери, що включають або складаються (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 4 і SEQ ID No 6. Цей набір праймерів разом із третім праймером, комплементарним послідовностям що трансформує ДНК (наприклад, праймер, що включає або складається (головним чином) з нуклеотидної послідовності SEQ ID No 7), дозволяє виконувати одночасну діагностичну ПЦР-ампліфікацію специфічного локусу EE-GM3, а також локусу дикого типу. Якщо рослина є гомозиготним по трансгенному локусу або відповідному локусу дикого типу, діагностична ПЦР призведе до утворення одиночного типового продукту ПЦР, що переважно має типовою довжиною, для трансгенного локусу або локусу дикого типу. Якщо рослина є гетерозиготною по трансгенному локусі, з'являться два локуси-специфічних продукту ПЦР, що відображає ампліфікацію як трансгенного локусу, так і локусу дикого типу. Крім того, використовуючи представлену тут специфічну інформацію про послідовність елітної події, можна розробити специфічні способи виявлення елітної події EE-GM3, що відрізняються від способів ампліфікації на основі ПЦР. Такі альтернативні способи виявлення включають способи виявлення посилення лінійного сигналу на основі інвазивного розщеплення конкретних нуклеотидних структур, також відомого як технологія InvaderTM (відповідно до опису, наприклад, у патентах США 5985557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6001567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage", включених у даний документ як посилання). Із цією метою послідовність-мішень гібридизують з міченим першим олігонуклеотидом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 2, від нуклеотида 1452 до нуклеотида 1469, або її комплементарний ланцюг, або зазначеним нуклеотидним зондом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 3, від нуклеотида 223 до нуклеотида 240, або її комплементарний ланцюг, а потім гібридизують із другим олігонуклеотидом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 2, від нуклеотида 1434 до нуклеотида 1451, або її комплементарний ланцюг, або зазначеним нуклеотидним зондом, що включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No 3, від нуклеотида 241 до нуклеотида 258, або її комплементарний ланцюг, причому перший і другий олігонуклеотид перекриваються щонайменше на один нуклеотид. Подвійна або потрійна структура, що утвориться при цій гібридизації, дає можливість селективного розщеплення зонда ферментом (Cleavase®) при збереженні послідовності-мішені. Після цього виконують виявлення розщепленого міченого зонда, можливо, через проміжний етап, що призводить до подальшого посилення сигналу. Термін "набір", використовуваний тут, відноситься до набору реактивів для здійснення способу відповідно до винаходу, зокрема, ідентифікації елітної події EE-GM3 у біологічних зразках або визначення статусу зіготності рослинного матеріалу, що містить EE-GM3. Зокрема, кращий варіант втілення набору, відповідно до винаходу, включає щонайменше один або два специфічних праймера, відповідно до вищенаведеного опису для ідентифікації елітної події або три специфічних праймера для визначення статусу зіготності. Необов'язково набір може ще включати будь-який інший реактив, описаний тут у протоколі ПЦР-ідентифікації. В 16 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 альтернативному випадку, згідно ще одному варіанту втілення даного винаходу, набір може включати специфічний зонд відповідно до вищенаведеного опису, що специфічно гібридизує з нуклеїновою кислотою біологічних зразків, для ідентифікації присутності EE-GM3 у них. Необов'язково набір може ще включати будь-який інший реактив (включаючи буфер для гібридизації, мітку, але не обмежуючись ними) для ідентифікації EE-GM3 у біологічних зразках з використанням специфічного зонда. Набір, відповідно до винаходу, може бути використаний, а його компоненти можуть бути специфічно адаптовані для цілей контролю якості (наприклад, чистоти партій насіння), виявлення присутності або відсутності елітної події в рослинному матеріалі, що включає рослинний матеріал або його похідні, наявні, наприклад, не обмежуючись цим, у харчових продуктах або кормах. Використовувана тут, "ідентичність послідовності" відносно нуклеотидних послідовностей (ДНК або РНК) відноситься до кількості положень, що містять ідентичні нуклеотиди, розділеному на кількість нуклеотидів у більше короткій із двох послідовностей. Вирівнювання двох нуклеотидних послідовностей здійснюють відповідно до алгоритмуУілбера й Ліпманна (Wilbur and Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80:726), використовуючи розмір вікна, рівний 20 нуклеотидам, довжину слова, рівну 4 нуклеотидам, і штраф за пропуск, рівний 4. Комп'ютерний аналіз і інтерпретацію даних про послідовність, включаючи вирівнювання послідовностей відповідно до вищенаведеного опису, можна виконати, наприклад, за допомогою програмного пакета аналізу послідовностей Genetics Computer Group (GCG, біотехнологічний центр Вісконсинського університету). Послідовності називають "істотно подібними", якщо такі послідовності мають ідентичність, що становить щонайменше приблизно 75 %, зокрема, щонайменше приблизно 80 %, більш конкретно - щонайменше приблизно 85 %, ще конкретніше - щонайменше приблизно 90 %, особливо - щонайменше приблизно 95 %, найбільшою мірою щонайменше приблизно 98 % або щонайменше приблизно 99 %. Очевидно, що якщо про послідовності РНК говорять як про істотно подібні або що мають деякий ступінь ідентичності з послідовностями ДНК, те тимідин (T) у послідовності ДНК дорівнюють до урацилу (U) у послідовності РНК. Крім того, мабуть, що згодом у послідовностях ДНК можуть виникати невеликі відмінності або мутації й що деякі неспівпадіння можуть бути припустимі для специфічних для події праймерів або зондів відповідно до винаходу, тому будь-яка послідовність ДНК, зазначена тут у будь-якому варіанті втілення даного винаходу для будь-якої 3'- або 5'-фланкуючої ДНК, або для будь-якої включеної або чужорідної ДНК, або будь-якого праймера або зонда відповідно до винаходу, також включає послідовності, істотно подібні з послідовностями, представленими тут, наприклад, послідовності, що гібридизують з або мають щонайменше 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або щонайменше 99 % ідентичність з послідовностями, наведеними для будь-якої 3'- або 5'-фланкуючої ДНК, для будь-якого праймера або зонда або для будь-якої включеної або чужорідної ДНК згідно із даним винаходом. Термін "праймер", використовуваний тут, включає будь-яку нуклеїнову кислоту, здатну бути затравкою синтезу нуклеїнової кислоти, що утвориться в процесі матричного синтезу, наприклад, ПЦР. Звичайно праймери являють собою олігонуклеотиди довжиною від 10 до 30 нуклеотидів, однак можна використовувати й більш довгі послідовності. Праймери можуть бути представлені у дволанцюговій формі, хоча кращою є одноланцюгова форма. Зонди можна використовувати в якості праймерів, однак вони призначені для зв'язування із ДНК або РНК-мішенями й не потрібні в процесі ампліфікації. Термін "розпізнавання", використовуваний тут у відношенні специфічних праймерів, відноситься до того, що специфічні праймери специфічно гібридизують з послідовністю ДНК елітної події в умовах, встановлених відповідно до способу (наприклад, в умовах відповідно до протоколу ПЦР-ідентифікації), причому специфічність визначають за допомогою позитивних і негативних контролів. Термін "що гібридизує", використовуваний тут відносно специфічних зондів, відноситься до того, що зонд зв'язується зі специфічною ділянкою нуклеотидної послідовності елітної події в умовах стандартної жорсткості. Умови стандартної жорсткості, як використовується тут, відносяться до умов гібридизації, описаних тут, або до стандартних умов гібридизації відповідно до опису в Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), що, наприклад, може включати наступні етапи: 1) іммобілізацію фрагментів геномної ДНК рослини на фільтрі, 2) попередню гібридизацію фільтра протягом 1-2 годин при 42 °C в 50 % формаміді, 5 X стандартному фосфатно-сольовому буфері з ЕДТА (SSPE), 2 X реактиві Денхардта й 0.1 % ДСН або протягом 1-2 годин при 68 °C в 6 X стандартному цитратно-сольовому буфері (SSC), 2 X реактиві Денхардта й 0.1 % ДСН, 3) 17 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 внесення міченого гібридизаційного зонда, 4) інкубування протягом 16-24 годин, 5) промивання фільтра протягом 20 хв при кімнатній температурі в 1 X SSC, 0.1 % ДСН, 6) трикратне промивання фільтра протягом 20 хв, щораз при 68 °C в 0.2 X SSC, 0.1 % ДСН, і 7) експонування фільтра протягом 24-48 годин на рентгенівську плівку при -70 °C з посилюючим екраном. Використовуваний тут, біологічний зразок являє собою зразок рослини, рослинного матеріалу або продуктів, що містять рослинний матеріал. Термін "рослина" включає тканини рослини сої культурної (Glycine max) на будь-якій стадії розвитку, а також будь-які клітини, тканини або органи, зібрані або які походять від такої рослини, включаючи будь-яке насіння, листи, стеблини, квітки, коріння, окремі клітини, гамети, культури клітин, культури тканин або протопласти, але не обмежується ними. "Рослинний матеріал", як використовується тут, відноситься до матеріалу, одержаного або що походить від рослини. Продукти, що включають рослинний матеріал, відносяться до продуктів харчування, кормів або інших продуктів, виготовлених з використанням рослинного матеріалу, або, можливо, забруднених рослинним матеріалом. Варто розуміти, що в контексті даного винаходу такі біологічні зразки перевіряють на присутність нуклеїнових кислот, специфічних для EE-GM3, припускаючи присутність нуклеїнових кислот у цих зразках. Таким чином, способи в даний заявці для ідентифікації елітної події EE-GM3 у біологічних зразках відносяться до ідентифікації нуклеїнових кислот, що включають зазначену елітну подію, у біологічних зразках. Використовуваний тут, термін "що включає" варто розуміти як позначення наявності зазначених властивостей, одиниць, етапів, реагентів або компонентів, до яких відноситься термін, що не виключає наявності або додавання одного або декількох властивостей, одиниць, етапів, компонентів або їхніх груп. Так, наприклад, нуклеїнова кислота або білок, що включають нуклеотидну або амінокислотну послідовність, можуть включати, крім фактично зазначених, додаткові нуклеотиди або амінокислоти, тобто бути частиною більшої нуклеїнової кислоти або білка. Химерний ген, що включає функціонально або структурно визначену послідовність ДНК, може включати додаткові послідовності ДНК, наприклад, послідовності промотору й термінатора транскрипції. Даний винахід також відноситься до розробки елітної події EE-GM3 у сої, до рослин, що включають цю подію, до потомства й насіння, що включають елітну подію EE-GM3 і одержані від цих рослин, і до рослинних клітин або рослинного матеріалу, що походить від рослин, що включають зазначену подію. Рослини, що включають елітну подію EE-GM3, можна одержати відповідно до опису в Прикладі 1. Даний винахід також відноситься до насіння, що містить елітну подію EE-GM3 і депоноване в NCIMB під номером NCIMB 41659 або його похідних, що містять елітну подію EE-GM3. "Похідні (насіння)”, як використано тут, відносяться до рослин, які можуть вирости з такого насіння, потомству, одержаному від схрещування або поворотного схрещування, а також до їхніх клітин, органів, частин, тканин, культур клітин, протопластів і рослинного матеріалу. Рослини сої або рослинний матеріал, що містить EE-GM3, можна ідентифікувати відповідно до Протоколу ПЦР-ідентифікації, описаного для EE-GM3 у Прикладі 2. Стисло, геномну ДНК сої, що присутня у біологічному зразку, піддають ПЦР-ампліфікації, використовуючи праймер, що специфічно розпізнає послідовність у межах 5'- або 3'-фланкуючі послідовності EE-GM3, наприклад, праймер з послідовністю SEQ ID No: 5, і праймер, що розпізнає послідовність чужорідної ДНК, наприклад, праймер з послідовністю SEQ ID No: 4. ДНК-праймери, а що ампліфікують частину ендогенної послідовності сої, використовують як позитивний контроль ПЦР-ампліфікації. Якщо при ПЦР-ампліфікації з матеріалу одержують фрагмент очікуваного розміру, те цей матеріал містить рослинний матеріал з рослини сої, що несе елітну подію EEGM3. Рослини, що несуть EE-GM3, характеризуються стійкістю до гліфосату, а також до інгібіторів HPPD, наприклад, ізоксафлютолу. Рослини, що несуть EE-GM3, за відсутності застосування гербіцидів також характеризуються агрономічними характеристиками, порівнянними з доступними для придбання сортами сої. Виявлено, що присутність чужорідної ДНК в ділянці інсерції генома рослин сої, описаних тут, надає рослинам, що містять цю подію, особливо цікаві фенотипічні й молекулярні характеристики. Один з варіантів втілення даного винаходу представляє елітну подію в рослинах сої, яку можна одержати шляхом інсерції 2 трансгенів по специфічному положенню в геномі сої, причому ця елітна подія надає таким рослинам сої стійкість до гліфосату й гербіцидів-інгібіторів HPPD, наприклад, ізоксафлютолу, і не має впливу на агрономічну продуктивність такої сої, негативно впливаючи на врожайність таких рослин сої в порівнянні з ізогенними лініями (як використовується тут, "ізогенні лінії" або "майже ізогенні лінії" являють собою лінії сої, що має таке ж саме генетичну оточення, але що не містять трансгенів, наприклад, рослини з 18 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 генетичним оточенням, аналогічним генетичному оточенню рослини, використовуваної для трансформації, або сестринські лінії, що відділяються, що втратили трансгени). Зокрема, даний винахід представляє елітну подію в рослинах сої, причому інсерція або наявність зазначеної елітної події в геномі таких рослин соїне викликає підвищену схильність до захворювань, втрати врожайності або посилення полягання таких рослин сої в порівнянні з ізогенними лініями. Отже, даний винахід представляє елітну подію в рослинах сої, що позначають як EEGM3, що призводить до одержання рослин сої, стійких до застосування гліфосата й гербіцидівінгібіторів HPPD (одночасно або окремо), і не робить негативного впливу на зазначені рослини сої в порівнянні з ізогенними лініями, причому зазначені рослини сої не мають статистично значимі неспівпадіння, що стосуються схильності захворюванням або полягання, у порівнянні з ізогенними рослинами сої. Зазначені характеристики роблять дану елітну подію дуже цікавою для контролю стійких до гліфосату бур'янистих рослин на полях сої, а також можуть використовуватися в підходах для запобігання або затримки подальшого розвитку стійкості до гліфосату на полях сої (наприклад, шляхом застосування гліфосата й ізоксафлютола, забезпечуючи застосування на поле сої гербіцидів, що володіють 2 механізмами дії). Тут також представлена рослина сої або її частина, що містить подію EE-GM3, причому типове насіння сої, що містить подія EE-GM3, депоновано в NCIMB під номером доступу 41659. Крім того, тут представлені насіння таких рослин, що містять таку подію, а також соєві продукти, виготовлені з таких насіння, що містять подію EE-GM3. Такі соєві продукти можуть являти собою або містити крупу, мелені насіння, борошно, пластівці й т.д. Зокрема, такий соєвий продукт містить нуклеїнову кислоту, що утворить амплікон, характерний або специфічний для події EE-GM3 і що включає SEQ ID No 2 або 3. Крім того, тут представлений спосіб одержання соєвого продукту, що включає одержання насіння сої, що містить подію EE-GM3, і виготовлення з них такого соєвого продукту. Крім того, тут представлена рослина сої, що являє собою потомство кожного з вищеописаних рослин сої й що містить подію EE-GM3. Крім того, тут представлений спосіб одержання рослини сої, стійкої до гербіцидів гліфосату та/або ізоксафлютолу, що включає включення в геном такої рослини події EE-GM3, зокрема, шляхом схрещування першої рослини сої, що не містить подію EE-GM3, з рослиною сої, що містить EE-GM3, і шляхом селекції потомства, стійкого до гліфосату та/або ізоксафлютолу. Крім того, тут представлена рослина, стійка до гліфосату та/або ізоксафлютолу без втрати врожайності, що має прийнятні агрономічні характеристики, що містить 2mEPSPS і білок HPPD, і здатна утворювати амплікон, характерний для події EE-GM3. Крім того, тут представлені специфічні виділені амплікони (фрагменти послідовності ДНК) самі по собі, які можна одержати за допомогою специфічних інструментів для виявлення, описаних тут, зокрема, амплікони, послідовність яких включає фрагмент ДНК, що походить з рослинної ДНК, і фрагмент ДНК, чужорідної або не відповідній такій рослині, наприклад, ДНК, включеній в геном рослини шляхом трансформації, як описано тут. Крім того, тут представлений спосіб контролю бур'янистих рослин на поле сої, що містить подію EE-GM3, або на полі, призначеному для посадки таких рослин сої, що включає обробку поля ефективною кількістю гербіциду на основі ізоксафлютола, причому такі рослини мають стійкість до такого гербіциду. Крім того, тут представлена ДНК, що включає послідовність SEQ ID No 1 або послідовність, істотно подібну з нею, і будь-яка рослина, клітина, тканина або насіння, зокрема, сої, що містить таку послідовність ДНК, наприклад, рослина, клітина, тканина або насіння, що містить EE-GM3, зокрема, ДНК, що включає 2 суміжні ділянки, що включають або складаються (головним чином) з SEQ ID No 1, або ДНК, що включає 2 суміжні ділянки, що включають або складаються з SEQ ID No 1 із замінами, делеціями або інсерціями деяких нуклеотидів, наприклад, ДНК, що включає дуплікацію SEQ ID No 1 з делецією або заміною 4, 6, 8 або 10 нуклеотидів, розташованих поблизу (наприклад, на відстані 200-500 нуклеотидів, або менш 2000 або 10000 нуклеотидів) друг від друга. В одному з варіантів втілення ці об'єкти включають ДНК SEQ ID No 11, від нуклеотида 2257 до нуклеотида 16601, у якій 2, 4, 6, 8 або 10 нуклеотидів заміщені іншими нуклеотидами, або в якій делетовані або додані 2, 4, 6, 8 або 10 нуклеотидів, або DNA SEQ ID No 11, від нуклеотида 2257 до нуклеотида 16601 SEQ ID No 11, а також ДНК SEQ ID No. 11 і будь-яку рослину, клітину, тканину або насіння, зокрема, сої, що містить кожну з таких послідовностей ДНК. Крім того, дана заявка включає рослину, клітину, тканину або насіння сої, що містить послідовність ДНК (не відповідну або чужорідну стандартній рослині, насінню, тканині або клітині сої) SEQ ID No 11, або що містить послідовність ДНК SEQ ID No 11, від нуклеотида 2257 до нуклеотида 16601, або що містить послідовність ДНК, щонайменше на 99 % або 99.5 % ідентичну послідовності SEQ ID No 11, або що містить послідовність ДНК, 19 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше на 99 % або 99.5 % ідентичну послідовності SEQ ID No 11, від нуклеотида 2257 до нуклеотида 16601. Крім того, тут представлені трансгенна рослина, рослинна клітина, тканина або насіння сої, геном яких містить подію EE-GM3, що характеризується молекулою нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, істотно подібну з SEQ ID No 2, від нуклеотида 1441 до нуклеотида 1462, і молекулою нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, істотно подібну з SEQ ID No 3, від нуклеотида 230 до нуклеотида 251, або комплементарні ланцюги таких послідовностей, а також рослина, рослинна клітина, тканина або насіння сої, геном яких містить подію EE-GM3, що характеризується молекулою нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, істотно подібну з SEQ ID No 2, і молекулою нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, істотно подібну з SEQ ID No 3, або комплементарні ланцюги таких послідовностей. Крім того, тут представлені рослина, тканина або насіння сої, що містять EE-GM3, що характеризуються вмістом у геномі нуклеотидної послідовності, що має щонайменше 80 %, 90 %, 95 % або 100 % ідентичності з SEQ ID No 2 від нуклеотида 1431 до нуклеотида 1472, і нуклеотидної послідовності, що має щонайменше 80 %, 90 %, 95 % або 100 % ідентичності з SEQ ID No 3, від нуклеотида 220 до 261, або комплементарних ланцюгів зазначених послідовностей. Використовуваний тут, термін "ізоксафлютол" відноситься до гербіциду ізоксафлютолу, тобто [(5-циклопропил-4-ізоксазолил)[2-(метилсульфонил)-4-(трифторметил)феніл]метанону], його активного метаболіту, дикетонітрилу й будь-яких сумішей розчинів, що містять зазначені сполуки. Гербіциди, що інгібують HPPD, придатні для обробки події відповідно до даного винаходу, являють собою дикетонітрили, наприклад, 2-ціан-3-циклопропіл-1-(2-метилсульфоніл4-трифторметилфеніл)-пропан-1,3-діон та 2-ціан-1-[4-(метилсульфоніл)-2-трифторметилфеніл]3-(1-метилциклопропіл)пропан-1,3-фіон; інші ізоксазоли; та піразолинати, наприклад, топрамезон, тобто, [3-(4,5-дигідро-3-ізоксазоліл)-2-метил-4-(метилсульфоніл)феніл](5-гідрокси1-метил-1H-піразол-4-ил)метанон] та пірасульфотол [(5-гідрокси-1,3-диметилпіразол-4-ил(2метилсульфонил-4-трифторметилфенил)метанон]; або піразофен [2-[4-(2,4-дихлорбензоїл)-1,3диметилпіразол-5-ілокси]ацетофенон]. В одному з варіантів втілення даного винаходу поле, призначене для посадки рослин сої, що містять подію EE-GM3, можна обробити гербіцидом-інгібітором HPPD, наприклад, ізоксафлютолом ('IFT'), до посадки рослин сої або посіву насіння, що очищає поле від бур'янистих рослин, знищуваних інгібітором HPPD, і надає можливість нульової обробки ґрунту з посадкою або посівом сої на цьому попередньо обробленому полі згодом (випальне застосування гербіциду-інгібітору HPPD). Залишкова активність IFT також захищає сходи й зростаючі рослини сої від конкуренції з бур'янистими рослинами на ранніх стадіях росту. Після досягнення рослинами сої певного розміру й початку повторної появи бур'янистих рослин можна застосовувати гліфосат або суміш інгібітор HPPD-Гліфосат у якості післясходового гербіциду над верхівками рослин. У ще одному варіанті втілення даного винаходу поле, на якому посіяне насіння, що містить подію EE-GM3, можна обробити гербіцидом-інгібітором HPPD, наприклад, IFT, до появи сходів рослин сої, але після посіву насіння (поле можна очистити від бур'янистих рослин до посіву іншими засобами, звичайно, за допомогою загальноприйнятих прийомів обробки ґрунту, наприклад, оранки, культиваторної обробки або підготовки посівних місць), причому залишкова активність буде підтримувати поле вільним від бур'янистих рослин, знищуваних гербіцидом, забезпечуючи відсутність конкуренції сходам і зростаючим рослинам з боку бур'янистих рослин (довсходове застосування гербіциду-інгібітору HPPD). Після досягнення рослинами сої певного розміру й початку повторної появи бур'янистих рослин можна застосовувати гліфосат або суміш інгібітор HPPD-Гліфосат у якості післясходового гербіциду над верхівками рослин. В іншому варіанті втілення даного винаходу рослини, що містять подію EE-GM3, можна обробити гербіцидом-інгібітором HPPD, наприклад, IFT, над верхівками рослин сої, що зійшли з посіяного насіння, що очищає поле від бур'янистих рослин, знищуваних інгібітором HPPD, причому це застосування можна здійснювати разом з (наприклад, у результаті змішування в обприскувачі), до або після обробки гліфосатом у якості післясходового гербіциду над верхівками рослин (післясходове застосування гербіциду-інгібітору HPPD (із гліфосатом або без нього)). Крім того, відповідно до даного винаходу, рослини сої, що несуть EE-GM3, можна обробити наступними інсектицидами, гербіцидами або фунгіцидами, або насіння сої, що несуть EE-GM3, можна покрити шляхом дражирування оболонкою, що містить наступні інсектициди, гербіциди або фунгіциди: 20 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Гербіциди для сої: алахлор, бентазон, трифторалін, хлорімурон-етил, хлорансулам-метил, феноксапроп, фомесафен, флуазифоп, гліфосат, імазамокс, імазахін, імазетапір, (S-)метолахлор, метрибузин, пендиметалін, тепралоксидим, ізоксафлютол. Інсектициди для сої: лямбда-цигалотрин, метоміл, паратіон, тіокарб, імідаклоприд, клотіанидін, тіаметоксан, тіаклоприд, ацетаміприд, динотефуран, флубендіамид, ринаксипир, циазипир, спиносад, спиноторам, емамектин бензоат, фипронил, етипрол, дельтаметрин, β-цифлутрин, гама- і лямбда-цигалотрин, , 4-[[(6-хлорпіридин-3-ил)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, спиротетрамат, спиродиклофен, трифлумурон, флонікамид, тіодикарб, бета-цифлутрин. Фунгіциди для сої: азоксистробин, ципроконазол, епоксиконазол, флутріафол, піраклостробин, тебуконазол, трифлоксистробін, протіоконазол, тетраконазол. У наступних прикладах описані розробка й ідентифікація елітної події EE-GM3, розробка різних ліній сої, що містять зазначену подію, і розробка інструментів для специфічної ідентифікації елітної події EE-GM3 у біологічних зразках. Якщо в Прикладах не зазначене інше, всі рекомбінантні методики здійснювали у відповідності зі стандартними протоколами відповідно до опису в "Sambrook J and Russell DW (eds.) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York" і в "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl К (eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York". Стандартні матеріали й посилання описані в "Croy RDD (ed.) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford" і в "Brown ТА, (1998) Molecular Biology LabFax, 2nd Edition, Academic Press, San Diego". Стандартні матеріали й методики полімеразних ланцюгових реакцій (ПЦР) наведені у "McPherson MJ and Moller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" і в "PCR Applications Manual, 3rd Edition (2006), Roche Diagnostics GmbH, Mannheim або www.roche-appliedscience.com". Варто розуміти, що може виникнути необхідність корекції ряду параметрів будь-якого лабораторного протоколу, наприклад, протоколів ПЦР-ідентифікації в нижченаведених Прикладах, до умов, специфічних для лабораторії, і їхньої незначної модифікації для одержання аналогічних результатів. Наприклад, при використанні різних способів підготовки ДНК або виборі інших праймерів можуть знадобитися інші оптимальні умови для протоколу ПЦР. Разом з тим, ці варіанти корекції очевидні для фахівців і, більше того, докладно описані в сучасних керівництвах із застосування ПЦР. В описі й прикладах наведені посилання на наступні послідовності: SEQ ID No 1: фрагмент SalI нуклеотидної послідовності вектора pSF10. SEQ ID No 2: нуклеотидна послідовність, що включає 5'-ділянку, що фланкує чужорідну ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів в EE-GM3. SEQ ID No 3: нуклеотидна послідовність, що включає 3'-ділянку, що фланкує чужорідну ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів в EE-GM3. SEQ ID No 4: праймер SOY028 SEQ ID No 5: праймер SOY029 SEQ ID No 6: праймер SMP187 SEQ ID No 7: праймер STV019 SEQ ID No 8: нуклеотидна послідовність амплікона SEQ ID No 9: праймер 1 для ампліфікації контрольного фрагмента (SOY01) SEQ ID No 10: праймер 2 для ампліфікації контрольного фрагмента (SOY02) SEQ ID No 11: нуклеотидна послідовність чужорідної ДНК і рослинних фланкуючих послідовностей в EE-GM3 SEQ ID No 12: праймер SHA130 SEQ ID No 13: праймер SHA178 Приклади 1. Трансформація Glycine max генами стійкості до гербіцидів. 1.1. Опис чужорідної DNA, що включає химерні гени 2mEPSPS і HPPD-Pf-W336 Плазміда pSF10 являє собою вектор клонування, похідний від pUC19, що містить химерний ген 2mepsps і химерний ген hppd-Pf-W336, розташовані у фрагменті SalI розміром приблизно 7.3 т.п.о. Повний опис ДНК, що містяться між двома сайтами рестрикції SalI, наведено нижче в Таблиці 1. Нуклеотидна послідовність представлена в SEQ ID No: 1. 60 21 UA 114275 C2 Таблиця 1 Положення нуклеотидів у ДНК, що міститься між сайтами рестрикції SalI в pSF10 (SEQ ID No 1) Положення нуклеотидів Орієнтація 188-479 комплементарний ланцюг 480-1556 комплементарний ланцюг 1557-1928 комплементарний ланцюг 1929-2069 комплементарний ланцюг 2070-3359 комплементарний ланцюг 3360-4374 4375-4855 4856-5227 5228-6565 6566-7252 5 10 Опис і посилання 3'nos: послідовність, що включає 3'-нетрансльовану ділянку гена нопалінсинтази з T-ДНК pTiT37 Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982, Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 561-573) hppdPf W336: послідовність, що кодує, 4гідроксифенілпіруватдіоксигенази штаму Pseudomonas fluorescens A32, модифікована заміною амінокислоти гліцин-336 триптофаном, відповідно до опису в Boudec et al. (2001), патент США US6245968B1 TPotp Y: послідовність, що кодує, оптимізованого похідного перехідного пептиду (заміна на тирозин по положенню 55), що містить послідовність генів малої субодиниці рибулозо-1, 5біфосфаткарбоксилази/оксигенази Zea mays (кукурудзи) і Helianthus annuus (соняшника), відповідно до опису в Lebrun et al. (1996) US5510471 5'tev: послідовність, що включає лідуючу послідовність вірусу гравірування тютюну відповідно до опису в Carrington and Freed (1990) Journal of Virology, 64, 15901597 Ph4a748 ABBC: послідовність, що включає промоторну ділянку гену гістону H4 Arabidopsis thaliana, що включає внутрішню дуплікацію (Chaboute et al., 1987) Plant Molecular Biology, 8, 179-191. Ph4a748: послідовність, що включає промоторну ділянку гена гістону H4 Arabidopsis thaliana (Chaboute et al., 1987) Plant Molecular Biology, 8, 179-191. intron1 h3At: перший інтрон гена II варіанта гістону H3.III Arabidopsis thaliana (Chaubet et al., 1992) Journal of Molecular Biology, 225, 569-574. TPotp C: послідовність, що кодує, оптимізованого перехідного пептиду, що містить послідовність генів малої субодиниці рибулозо-1, 5біфосфаткарбоксилаи/оксигенази Zea mays (кукурудзи) і Helianthus annuus (соняшник), відповідно до опису в Lebrun et al. (1996) US5510471 2mepsps: послідовність, що кодує, подвійного мутантного гена 5-єнолпірувилшикімат-3-фосфатсинтази Zea mays (кукурудзи) (Lebrun et al., 1997) WO9704103-A 1 3'histonAt: послідовність, що включає 3'-нетрансльовану ділянку гена гістону H4 Arabidopsis thaliana (Chaboute et al., 1987) Plant Molecular Biology, 8, 179-191. 1.2. Подія EE-GM3 Очищений за допомогою ВЕРХ вирівняний по SalI фрагмент pSF10 розміром приблизно 7.3 т.п.о. (що містить ген стійкості до гліфосату 2mEPSPS і ген стійкості до інгібіторів HPPD HPPDPf-W336) використовували для одержання трансформованих рослин сої шляхом прямого переносу генів у клітини сої типу Jack (Nickell, C. D., G. R. Noel, D. J. Thomas, and R. Waller. Registration of "Jack" soybean. Crop Sci 1365. 30.1990) з наступною регенерацією трансформованих рослинних клітин у трансгенні фертильні рослини сої. 1.2.1. Ідентифікація елітної події EE-GM3 Селекцію елітної події EE-GM3 виконували, ґрунтуючись на масштабній процедурі селекції на основі високого рівня експресії й стабільності генів стійкості до гербіцидів і була оцінена його 22 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сумісність із оптимальними агрономічними характеристиками, наприклад, висотою рослини, висотою до вузла, стійкістю до полягання, ростом, урожайністю. Селекцію рослин, що містили цю подію, здійснювали із широкого діапазону різних трансформаційних подій, отриманих з використанням тих самих химерних генів. Параметри, використані при селекції цієї події, являли собою: а) прийнятну стійкість до застосування гербіциду ізоксафлютола при польових випробуваннях, б) прийнятну стійкість до застосування гербіциду гліфосата при польових випробуваннях, в) прийнятну стійкість до комбінованого застосування гербіцидів ізоксафлютола та гліфосата при польових випробуваннях, г) включення трансгенів стійкості до гербіцидів в одиночний локус геному рослини сої за відсутності послідовності вектора, д) подібність загальних агрономічних характеристик з вихідними рослинами, використаними при трансформації (дозрівання, полягання, схильність до захворювань та ін.), та е) відсутність значної втрати врожайності внаслідок інсерції що трансформує ДНК (у порівнянні з ізогенною лінією, що не містить події, наприклад, лінією рослин, використаною для трансформації, вирощеною за тих самих умов). З покоління T3 виділили гомозиготну лінію сої по трансформаційній події EE-GM3 для одержання насіння. В галузях адаптації вихідного сорту Jack провели багаторайонні польові дослідження в декількох повторах. Польові випробування включали стійкість до гербіцидів і агрономічну продуктивність. Виявлено, що агрономічна продуктивність рослин, що містять EEGM3, була порівнянна із сортом Jack (за відсутності застосування гербіцидів). Польові випробування також показали, що рослини, що несуть EE-GM3, має: - аналогічну сорту Jack морфологію рослини й характеристики насіння, - відсутність змін реакції на захворювання сої в порівнянні із сортом Jack і - відсутність змін пророщення або спокою насіння у порівнянні із сортом Jack. Насіння (покоління T1 або S1), зібрані з вихідного трансформанта (T0) (рослини, трансформованої конструктом з метою одержання події EE-GM3) у вегетаційному будиночку, висаджували на полі. Три ділянки засіяли й обробили гліфосатом у кількості 0, 2 або 4 кг/га. Насіння збирали з рослин, що демонстрували бажаний рівень стійкості до гербіциду гліфосату. Насіння (покоління T2), зібране із самообпилених рослин T1, вирощених на поле, сіяли з розрахунку "рослина на гряду". Аналіз розщеплення даних у грядах (повністю або частково стійких) і окремих рослин у грядах (стійких або чутливих) з використанням критерію хі-квадрат продемонстрував очікуване менделівське спадкування одиночної інсерції в EE-GM3. Селекцію й нагромадження насіння продовжували до визначення гомозиготності лінії по трансформаційній події EE-GM3 і його відбору для одержання насіння у четвертому поколінні. Далі насіння покоління T5 використовували як кандидат для розробки різних сортів. Рослини шостого покоління (покоління T6) схрещували зі стандартними лініями сої для схрещування відповідно до програми інтрогресії, призначеної для переносу події на розширену основу зародкової плазми комерційної сої. Гібридні рослини F1 (лінії EE-GM3 x стандартні лінії) вирощували до дозрівання й висаджували насіння F2. Зразки листів 901 рослини F2 аналізували, використовуючи ПЦР-праймери, призначені для визначення зіготності інсерції EEGM3. Спостерігали очікуване, відповідно до законів Менделя, співвідношення розщеплення одиночної інсерції 1:2:1. Обрану подію EE-GM3 включали в різні комерційні генетичні оточення й порівнювали результати польових випробувань у різних районах. Стійкість рослин до гербіциду гліфосату та/або гербіциду ізоксафлютолу оцінювали при різних варіантах обробки. Рослини демонстрували гарну стійкість до гербіцидів. Спадкування вивчали, використовуючи сотні різних сортів сої, що містять подію EE-GM3, і застосовуючи гербіциди. Виділені в результаті цих випробувань лінії потім розмножували на полі й також обробляли гербіцидом. У результаті цих випробувань розмножили 50 виділених ліній і обробили їх гербіцидом. Показники фітотоксичності для останніх ліній, обприсканих ізоксафлютолом і гліфосатом, показали деяку варіабельність відповіді, однак діапазон відповідей серед ліній відображав варіабельність, аналогічну тій, що спостерігалася серед 4 повторів події EE-GM3 у вихідному оточенні Jack, вирощеного при такому ж режимі обробки й умовах навколишнього середовища. Таким чином, у рослин, що містять EE-GM3, спостерігали стійкість до релевантних гербіцидів серед широкого діапазону зародкової плазми. Крім того, рослини, що містили подію EE-GM3, мали нормальну морфологію листя, квітів і бобів, чудову фертильність й не проявляли аномальної схильності до захворювань або комах у різних варіантах генетичного оточення. Під час інтрогресії в різні варіанти генетичного оточення не виявили проблем з порушеннями або аномаліями. В один із сезонів виконали дослідження в 10 районах, призначене для порівняння агрономічної продуктивності сої, що містила трансформаційну подію EE-GM3 і що 23 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 характеризувалася подвійною стійкістю до гербіцидів, з різними вихідним сортами, що трансформуються, - сортом Jack і деякими нетрансгенними сортами сої. Рослини EE-GM3 вирощували на повторюваних ділянках, використовуючи випадкове розташування ділянок і або стандартні заходи боротьби з бур'янистими рослинами, або призначені для використання гербіциди - гліфосат і ізоксафлютол. Ділянки з рослинами сої, що містять трансформаційну подію EE-GM3, обприскували гербіцидом ізоксафлютолом при запланованій витраті 70 грамів активного компонента/га та гербіцидом гліфосатом - при запланованій витраті 1060 грамів активного компонента/га. Застосування гербіциду на зазначені рослини здійснювали у вигляді листового аерозолю приблизно на стадії росту рослини V4-V5. Агрономічні спостереження здійснювали на початку, середині й кінці сезону. Густота рослинного покриву (параметр: кількість прямостійких рослин) для ділянки із сортом Jack і нетрансгенними сортами перевищувала густоту на ділянках з подією EE-GM3 на величину, рівній одному стандартному відхиленню. Раннє неспівпадіння кількості прямостійких рослин було результатом якості партії насіння, оскільки насіння для посадки рослин, що містять EE-GM3, одержували в інкубаторі протягом протилежного сезону, у той час як насіння нетрансгенних сортів одержували протягом безперервного нормального вегетаційного періоду в умовах США. У той же час кількість днів до досягнення 50 % схожості й показників потужності рослин були однакові, що вказувало на порівнянність партій насіння по цих параметрах продуктивності. При підрахунку прямостійких рослин наприкінці сезону зберігалося неспівпадіння сорту Jack і нетрансгенних сортів від рослин з EE-GM3 на величину одного стандартного відхилення. Урожай рослин з подією EEGM3 з ділянки також був нижче, ніж урожай сорту Jack, на величину одного стандартного відхилення, можливо, у результаті меншої густоти рослин на ділянках з рослинами, що містили подію EE-GM3. Урожай нетрансгенних сортів був вище, ніж у сорту Jack, що можна було очікувати через удосконалення потенціалу врожайності в сучасних сортах. У ході одного з випробувань показники життєстійкості рослин оцінювали на трьох стадіях росту: V4-5, R1 і повної зрілості. Першу оцінку здійснювали незабаром після запланованого застосування гербіцидів. Під час останньої оцінки життєстійкості рослини, що містили EE-GM3, обприскані обома гербіцидами, мали ті ж показники, що й необроблені рослини сорту Jack або необроблені рослини, що містили EE-GM3. По оцінках, зроблених агрономами, на стадіях росту V4-5 і R1 рослини, обприскані гербіцидами, одержували оцінку життєстійкості, рівну 3-4 (помірне пошкодження). Необприскані рослини (нетрансформовані рослини сорту Jack або рослини сої, що містили EE-GM3) одержали оцінку, рівну 4.6-4.8 (оцінка, рівна 5, означає відсутність пошкоджень). При останній оцінці життєстійкості рослин всі ділянки одержували однакові оцінки, рівні 5 (відсутність пошкоджень). Один з випробувальних сезонів відрізнявся особливо більшою кількістю опадів, і пошкодження посівів, що містять EE-GM3, після обробки призначеними гербіцидами було більш очевидним, ніж в інші сезони. Польові випробування також включали моніторинг характеристик пристосування (розмноження, стійкості до захворювань, фертильності, розльоту насіння, періоду спокою, виживаності). Відтворені характеристики - кількість днів до появи сходів, кількість днів до 50 % цвітіння й кількість днів до 90 % дозрівання бобів - у рослин, що містили EE-GM3, і рослин сорту Jack не різнилися. Неспівпадінь у реакції на природне зараження захворюваннями рослин і комахами-шкідниками не відзначено. Незважаючи на те, що EE-GM3 давали менший урожай, ніж сорт Jack, неспівпадінь у фертильності (маса 100 насіння) не виявлено. Оцінка параметрів розкидання насіння (руйнування бобів і полягання рослин) показала, що рослини EE-GM3 і Jack мають однаковий показник руйнування бобів, однак рослини EE-GM3 мали меншу схильність до полягання. Оцінка насіння, зібраного з 10 районів, не виявила проблем, пов'язаних з оцінкою пророщення або спокою насіння. У ході випробувань під час сезону з особливо більшою кількістю опадів кінцевий урожай рослин з подією EE-GM3, незалежно від способу боротьби з бур'янистими рослинами, був нижче, ніж урожай сорту Jack, на величину одного стандартного відхилення (можливо, у результаті меншої густоти рослин на ділянках з рослинами, що містили подію EE-GM3). Протягом особливо вологого сезону описували пошкодження посівів (вигорало до 10-30 % площі посівів) на ділянках з рослинами EE-GM3 протягом шести тижнів після обробки листя гербіцидами гліфосатом і ізоксафлютолом. Однак після дозрівання всім ділянкам призначили оцінку життєстійкості рослин "відсутність пошкоджень". Очікувалося, що повторні багаторайонні польові випробування рослин з EE-GM3, включеним в оточення елітного сорту сої, у порівнянні з майже ізогенними сестринськими лініями, що не містили трансгена, не покажуть неспівпадінь урожайності між рослинами, що містили подію EE-GM3, і майже ізогенними лініями (за відсутності обробки гербіцидами). Крім того, при повторних польових випробуваннях виявили значну стійкість посівів 24 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (вигоряння менш 10 %) рослин сої, що містили EE-GM3, при до- або післясходовій обробці IFT (70 г активного компонента/га з 0.5 % NIS, Agridex), а також значну стійкість посівів (вигоряння менш 10 %) рослин сої, що містили EE-GM3, при післясходовій обробці пірасульфотолом (35 г активного компонента/га з 0.5 % NIS, Agridex) - ще одним гербіцидом-інгібітором HPPD. 1.2.2. Ідентифікація фланкуючих ділянок і чужорідної ДНК елітної події EE-GM3 Послідовність ділянок, що фланкують чужорідну ДНК, що включає гени стійкості до гербіцидів в елітній події EE-GM3, визначали в такий спосіб: 1.2.2.1. Права (5'-) фланкуюча ділянка Фрагмент, ідентифікований як такий, що містить 5'-фланкуючу ділянку, секвенували; його нуклеотидна послідовність представлена в SEQ ID No 2. Послідовність між нуклеотидами 1 і 1451 відповідала ДНК рослини, у той час як послідовність між нуклеотидами 1452 і 1843 відповідала чужорідній ДНК. 1.2.2.2. Ліва (3'-) фланкуюча ділянка Фрагмент, ідентифікований як такий, що містить 3'-фланкуючу ділянку, секвенували, його нуклеотидна послідовність представлена в SEQ ID No 3. Послідовність між нуклеотидами 1 і 240 відповідала чужорідній ДНК, у той час як послідовність між нуклеотидами 241 і 1408 відповідала ДНК рослини. 1.2.2.3. Чужорідна ДНК в EE-GM3, що містить гени стійкості до гербіцидів За допомогою різних молекулярних методик визначили, що чужорідна ДНК елітної події EEGM3, що включала гени стійкості до гербіцидів, містила дві часткові 3'-послідовності histonAt в орієнтації " голова-голова", а потім дві майже повні копії Sal-Фрагмента pSF10 в орієнтації " голова-хвіст" (див. Фігуру 1). Чужорідна ДНК в EE-GM3, що містить гени стійкості до гербіцидів, таким чином, містила наступні послідовності по порядку: - від нуклеотида 1 до нуклеотида 199: нуклеотидна послідовність, що відповідала комплементарному ланцюгу нуклеотидної послідовності SEQ ID No 1 від нуклеотида 6760 до нуклеотида 6958; - від нуклеотида 200 до нуклеотида 624: нуклеотидна послідовність, що відповідала нуклеотидної послідовності SEQ ID No 1 від нуклеотида 6874 до нуклеотида 7298; - від нуклеотида 625 до нуклеотида 7909: нуклеотидна послідовність, що відповідала нуклеотидної послідовності SEQ ID No 1 від нуклеотида 7 до нуклеотида 7291; - від нуклеотида 7910 до нуклеотида 15163: нуклеотидна послідовність, що відповідала нуклеотидної послідовності SEQ ID No 1 від нуклеотида 12 до нуклеотида 7265; і - від нуклеотида 15164 до нуклеотида 15187: нуклеотидна послідовність, що відповідала нуклеотидної послідовності SEQ ID No 3 від нуклеотида 217 до нуклеотида 240 (ця послідовність не відповідає ані плазмідній ДНК pSF10, ані ДНК рослини дикого типу й тому називається філер-ДНК). Безпосередньо зверху цій чужорідній ДНК передувала безперервна з нею 5'-фланкуюча послідовність SEQ ID No 2 від нуклеотида 1 до 1451, а безпосередньо знизу від цієї чужорідної ДНК розташовувалася безперервна з нею 3'-фланкуюча послідовність SEQ ID No 3 від нуклеотида 241 до нуклеотида 1408. Підтверджене повне секвенування чужорідної ДНК і фланкуючих послідовностей ДНК в EEGM3 дозволило одержати послідовність, представлену в SEQ ID No 11. У цій послідовності включена ДНК розташовувалася від положення 1452 до положення 16638, а дві майже повні копії pSF10 розташовувалися в орієнтації " голова-хвіст" від положення 2257 до положення 16601. 5'-фланкуюча послідовність ДНК в SEQ ID No 11 являла собою послідовність від положення 1 до положення 1451 в SEQ ID No 11, а 3'-фланкуюча послідовність ДНК в SEQ ID No 11 являла собою послідовність від положення 16639 до положення 17806 в SEQ ID No 11. 2. Розробка протоколу ПЦР-ідентифікації для EE-GM3. 2.1. Праймери Розроблено специфічні праймери, що розпізнають послідовності в межах елітної події. Розроблений праймер, що розпізнає послідовність у межах 3'-фланкуючі ділянки EE-GM3. Другий праймер вибрали в межах послідовності чужорідної ДНК, так що праймери перекривали послідовність розміром приблизно 263 нуклеотидів. Виявили, що наступні праймери дозволяли одержати найбільш ясні й відтворені результати в ході ПЦР із ДНК EE-GM3: SOY028: 5'-ATC.gCT.TTA.ACg.TCC.CTC.Ag-3 (SEQ ID No: 4) (мішень: включена ДНК) SOY029: 5'-СAA.ggC.CTC.gAg.ATT.АТС-3" (SEQ ID No.: 5) (мішень: ДНК рослини) Праймери, мішенню яких була ендогенна послідовність, переважно включали в суміш для 25 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЦР. Ці праймери слугували внутрішнім контролем для невідомих зразків і позитивного контролю ДНК. Позитивний результат, отриманий при використанні пари ендогенних праймерів (присутність ПЦР-ампліфікованого фрагмента розміром 413 п.о.) продемонстрував, що із препарату геномної ДНК можна одержати достатню кількість продукту ПЦР - ДНК належної якості. Вибрали ендогенні праймери, що розпізнавали ендогенний ген актину сої: SOY01: 5'-gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT-3" (SEQ ID No: 9) SOY02: 5'-gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.CC-3" (SEQ ID No: 10) 2.2. Ампліфіковані фрагменти Очікувані ампліфіковані фрагменти при ПЦР являли собою: Для пари праймерів SOY01-SOY02: 413 п.о. (ендогенний контроль) Для пари праймерів SOY028-SOY029: 263 п.о. (елітна подія EE-GM3) 2.3. Матрична ДНК Матричну ДНК виділяли із фрагмента листя, одержаного компостуванням, згідно Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991). Якщо використовували ДНК, виділену іншими способами, необхідно було виконати тестовий прогін з використанням різних кількостей матриці. Звичайно найкращі результати одержували при використанні 50 нг геномної матричної ДНК. 2.4. Призначені позитивний і негативний контролі Щоб уникнути помилкових позитивних або негативних результатів визначили, що в ПЦРпрогін необхідно було включити наступні позитивний і негативний контролі: - Контроль майстер-мікса (негативний контроль ДНК). Це - ПЦР, у ході якої в реакційну суміш не вносили ДНК. Якщо одержували очікуваний результат - відсутність продукту ПЦР, - це означало, що суміш для ПЦР не забруднена ДНК-мішенню. - Позитивний контроль ДНК (зразок геномної ДНК, що заздалегідь містив трансгенні послідовності). Успішна ампліфікація позитивного контролю демонструвала, що ПЦР проходила за умов, що забезпечували ампліфікацію послідовностей-мішеней. - Контроль ДНК дикого типу. Це - ПЦР, у ході якої матриця ДНК являла собою геномну ДНК, виділену з нетрансгенної рослини. Якщо одержували очікуваний результат - відсутність ампліфікації трансгенного продукту ПЦР при ампліфікації ендогенного продукту ПЦР, - це означало, що в зразку геномної ДНК не відбувалося фонової ампліфікації, що виявляється, трансгена. 2.5. Умови ПЦР Оптимальні результати одержували при наступних умовах (мається на увазі, що при описі різних умов для оптимальних результатів представлені приклади таких умов. Ясно, що фахівець може змінювати умови, реагенти й параметри, наприклад, використовувати інші Taqполімерази та досягати бажаних результатів): - суміш ПЦР для об'єму реакційної суміші 25 мкл містила: 20 нг матричної ДНК 2.5 мкл 10х буфера для ампліфікації (поставлявся виробником з Taq-полімеразою) 0.5 мкл 10 мм dNTP 0.4 мкл SOY01 (10 пмоль/мкл) 0.4 мкл SOY02 (10 пмоль/мкл) 0.7 мкл SOY028 (10 пмоль/мкл) 0.7 мкл SOY029 (10 пмоль/мкл) 0.1 мкл Taq-ДНК-полімерази (5 одиниць/мкл) воду до об'єму 25 мкл - профіль термоциклювання, що дозволяв отримані оптимальні результати, виглядав у такий спосіб: 4 хв при 95 °C Потім: 1 хв при 95 °C 1 хв при 57 °C 2 хв при 72 °C Протягом 5 циклів Потім: 30 с при 92 °C 30 с при 57 °C 1 хв при 72 °C Протягом 25 циклів Потім: 10 хвилин при 72 °C 2.6. Аналіз в агарозному гелі Для оптимальної візуалізації результатів ПЦР визначили, що від 10 до 20 мкл зразків ПЦР необхідно було нанести на 1.5 % агарозний гель (трис-боратний буфер) з відповідним маркером 26 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекулярної маси (наприклад, леддером 100 п.о. Pharmacia). 2.7. Підтвердження результатів Визначили, що дані, отримані зі зразків ДНК трансгенних рослин з використанням одного прогону ПЦР і однієї суміші ПЦР, не повинні вважатися прийнятними, якщо 1) позитивний контроль ДНК не дозволяв одержати очікуваних продуктів ПЦР (трансгенних і ендогенних фрагментів), 2) негативний контроль ДНК не був негативним при ПЦР-ампліфікації (не підтверджується відсутність фрагментів) і 3) контроль ДНК дикого типу не дозволяв одержати очікуваних результатів (ампліфікації ендогенного фрагмента). При дотриманні протоколу ПЦР-ідентифікації для EE-GM3 відповідно до вищенаведеного опису видимі кількості трансгенних і ендогенних продуктів ПЦР очікуваного розміру в доріжках указували на те, що відповідна рослина, з якого виділили геномну матричну ДНК, успадкувало елітну подію EE-GM3. Якщо в доріжках були відсутні видимі кількості трансгенних продуктів ПЦР і були присутні видимі кількості ендогенних продуктів ПЦР, це вказувало на те, що відповідна рослина, з якого виділили геномну матричну ДНК, не містила зазначеної елітної події. Якщо в доріжках були відсутні видимі кількості ендогенних і трансгенних продуктів ПЦР, це вказувало на те, що якість та/або кількість геномної ДНК не дозволяло одержати продукт ПЦР. Розрахунок оцінок для цих рослин був неможливий. Необхідно було повторити виділення геномної ДНК і виконати новий прогін ПЦР із відповідними контролями. 2.8. Використання диференціального протоколу ПЦР для ідентифікації EE-GM3 Перед спробою скринінгу невідомих зразків виконували тестовий прогін з відповідними контролями. Для розробленого протоколу могла вимагатися оптимізація компонентів, що могла відрізнятися в різних лабораторіях (виділення матричної ДНК, Taq-ДНК-полимераза, якість праймерів, dNTP, термоциклера та інш.). У цьому протоколі ключову роль відігравала ампліфікація ендогенної послідовності. Було необхідно досягти умов ПЦР і термоциклювання, у ході яких можлива ампліфікація еквімолярних кількостей як ендогенної, так і трансгенної послідовностей відомої трансгенної матричної геномної ДНК. У всіх випадках, коли не відбувалася ампліфікація ендогенного фрагмента-мішені або коли не відбувалася ампліфікація послідовностей-мішеней, згідно електрофорезу в агарозному гелі при однаковій інтенсивності фарбування етидій-бромідом, могла вимагатися оптимізація умов ПЦР. Відповідно до вищеописаного протоколу тестували матеріал листя ряду рослин сої, деякі з яких містили EE-GM3. Зразки елітної події EE-GM3 і сої дикого типу використовували в якості позитивного й негативного контролів, відповідно. На Фігурі 2 показаний результат, отриманий при використанні Протоколу ПЦР-ампліфікації елітної події EE-GM3 і ряди зразків рослин сої. Виявлено, що зразки в доріжках 2 і 3 містили елітну подію EE-GM3, оскільки була виявлена смуга, що відповідала 263 п.о., у той час як зразки в доріжках 4-8 не містили EE-GM3. Доріжки 6 і 7 містили зразки інших трансформаційних подій сої, отриманих при використанні цих же химерних генів стійкості до гербіцидів; доріжка 8 містила ДНК рослин сої дикого типу, а доріжка 9 являла собою зразок негативного контролю (води), доріжки 1 і 10 являли собою маркер молекулярної маси (леддер 100 п.о.). 2.9. Виявлення EE-GM3 за допомогою дПЦР-аналізу в насипній партії насіння Диференційний ПЦР-аналіз (дПЦР) настроїли на виявлення низького рівня EE-GM3 у насипній партії насіння. При відтворених умовах мінімальний рівень, що виявляється успішно, трансгенного насіння у насипній партії нетрансгенного насіння становив 0.4 % (мас/мас). Таким чином, визначили, що межа виявлення становила 0.4 % (мас/мас). При цільовий ПЦР використовували наступні праймери: Прямій праймер, мішенню якого була послідовність Т-ДНК: SHA130 5'-CTA.TAT.TCT.ggT.TCC.AAT.TTA.TC-3" (SED ID No 12) Зворотний праймер, мішенню якого була 3'-фланкуюча послідовність: SMP178 5'-TgA.ggC.ACg.TAT.TgA.TgA.CC-3" (SEQ ID No 13) Розмір очікуваного ампліфікованого фрагмента при ПЦР із використанням цих праймерів становив 115 п.о. Цільову ПЦР виконували, використовуючи приблизно 200 нг матричної ДНК, виділеної з насіння, насипаного на ґрунт, відповідно до інструкції модифікованого набору для виділення й очищення ДНК Gentra Puregene DNA purification extraction kit (Qiagen). Якщо використовували ДНК, виділену іншими способами, необхідно було виконати тестовий прогін з використанням відомих відносних рівнів EE-GM3. Валідовану ПЦР із еталонною системою, мішенню якої була ендогенна послідовність, в ідеалі було необхідно виконувати у вигляді окремого прогону ПЦР для підтвердження придатності зразка ДНК для ПЦР-аналізу щоб уникнути помилкових негативних результатів. 27 UA 114275 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 При використанні невідомих тестуємих зразків ПЦР-експеримент в ідеалі повинен був включати відповідні зразки позитивних і негативних контролів, тобто: - Контроль майстер-микса (негативний контроль ДНК). Це - ПЦР, у ході якої в реакційну суміш не вносили ДНК. Якщо одержували очікуваний результат (відсутність продукту ПЦР) як для цільовий, так і для еталонної систем, це означало, що суміш для ПЦР не забруднена ДНКмішенню. - Позитивний контроль ДНК (зразок геномної ДНК, що заздалегідь містив трансгенні послідовності). Успішна ампліфікація позитивного контролю демонструвала, що ПЦР проходила за умов, що забезпечували ампліфікацію послідовностей-мішеней. - Також у цю ПЦР можна було вносити контроль ДНК дикого типу. Це - ПЦР, у ході якої матриця ДНК являла собою геномну ДНК, виділену з нетрансгенної рослини. Якщо одержували очікуваний результат - відсутність ампліфікації трансгенного продукту ПЦР при ампліфікації ендогенного продукту ПЦР, - це означало, що в зразку геномної ДНК не відбувалося фонової ампліфікації, що виявляється, трансгена. Оптимальні результати одержували за наступних умов Очевидно, що можна використовувати інші Taq-полімерази, і в цьому випадку можна змінювати умови для відповідності рекомендаціям постачальника. - суміш ПЦР для об'єму реакційної суміші 25 мкл містила: 200 нг матричної ДНК 5 мкл 5x робітника буферного розчину 0.25 мкл 20 мм dNTP 0.7 мкл SHA130 (10 пмоль/мкл) 0.4 мкл SHA178 (10 пмоль/мкл) 0.1 мкл GO-Taq-ДНК-полімерази (5 одиниць/мкл) воду до об'єму 25 мкл - профіль термоциклювання, що дозволяв одержати оптимальні результати, виглядав у такий спосіб: 4 хв при 95 °C Потім: 1 хв при 95 °C 1 хв при 57 °C 2 хв при 72 °C Протягом 5 циклів Потім: 30 с при 92 °C 30 с при 57 °C 1 хв при 72 °C Протягом 30 циклів Потім: 10 хвилин при 72 °C Для оптимальної візуалізації результатів ПЦР визначили, що 25 мкл продукту ПЦР необхідно було нанести на 1.5 % агарозний гель (трис-боратный буфер) з відповідним маркером молекулярної маси (наприклад, леддером 50 п.о.). При дотриманні способу ПЦР відповідно до вищенаведеного опису видимі кількості продуктів ПЦР цільової й еталонної систем очікуваного розміру в доріжках вказували на те, що тестований зразок, з якого виділили геномну матричну ДНК, містив рівень елітної події EE-GM3, що перевищував межу виявлення цільової реакції. Якщо в доріжках була відсутня видиму кількість цільових продуктів ПЦР і були присутні видимі кількості продуктів ПЦР еталонної системи, це вказувало на те, що тестований зразок, з якого виділили геномну матричну ДНК, містив рівень елітної події EE-GM3, що становив величину нижче межі виявлення цільової реакції. Якщо в доріжках були відсутні видимі кількості ендогенних і трансгенних продуктів ПЦР, це вказувало на те, що якість та/або кількість геномної ДНК не дозволяла одержати продукт ПЦР. Розрахунок оцінок для цих рослин був неможливий. Необхідно було повторити виділення геномної ДНК і виконати новий прогін ПЦР із відповідними контролями. 3. Використання специфічного інтегрованого фрагмента як зонда для виявлення матеріалу, що включав EE-GM3 Специфічний інтегрований фрагмент EE-GM3 одержували шляхом ПЦР-ампліфікації при використанні специфічних праймерів SOY028 (SEQ ID No 4) і SOY029 (SEQ ID No 5), що дозволяли одержати амплікон з нуклеотидною послідовністю SEQ ID No 8, або шляхом хімічного синтезу, і мітили. Цей інтегрований фрагмент використовували як специфічний зонд для виявлення EE-GM3 у біологічних зразках. Нуклеїнову кислоту виділяли зі зразків відповідно до стандартних процедур. Потім цю нуклеїнову кислоту приводили в контакт зі специфічним 28