Лікування шлунково-кишкових розладів

Реферат: Винахід стосується пептидів, фармацевтичної композиції, яка містить заявлені пептиди та застосування заявленої фармацевтичної композиції для лікування шлунково-кишкових розладів. UA 114274 C2 (12) UA 114274 C2 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Цей винахід стосується пептидів, композицій і способів для лікування розладів діяльності верхніх відділів шлунково-кишкового тракту. Вимога про пріоритет Для даної заявки вимагається пріоритет за заявкою на патент США з реєстраційним № 61/259264, поданою 9 листопада 2009. Взятий загалом, зміст вищезазначеної заявки включений сюди за допомогою посилання. Список послідовностей Ця заявка включає за допомогою посилання список послідовностей, озаглавлений "IW077US_ST25.txt", в його повному об'ємі (6,64 кілобайтів), який був створений 3 листопада 2010 і поданий в електронному вигляді разом з нею. Передумови створення винаходу Функціональна диспепсія (FD) і парез шлунка (GP) є розладами діяльності верхніх відділів шлунково-кишкового тракту (ШКТ), які в сукупності характеризуються симптомами, які включають здуття, біль в епігастральній області (у верхній частині черевної порожнини) і/або печію, нудоту, блювоту і швидке насичення. Можливі методи лікування пацієнтів з FD і GP є дуже обмеженими внаслідок як відсутності ефективності існуючої терапії, так і профілів її недостатньої безпеки. Диспепсію визначають як наявність одного або більше диспепсичних симптомів (болі в епігастральній області, печії, обтяжливого переповнення після їди і швидкого насичення), які, як вважають, виникають в гастродуоденальній області, у відсутність якогонебудь органічного, системного або метаболічного захворювання, яке буде, ймовірно, пояснювати симптоми (див. Drossman, D.A., ed., Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders, 3rd Ed., McLean, VA: Degnon Associates, Inc., 2006). FD стосується диспепсії, яка не має структурного пояснення після стандартних медичних досліджень, що включають ендоскопію верхніх відділів ШКТ. Патофізіологічні механізми, які можуть бути залучені в FD, включають, серед іншого, уповільнене випорожнення шлунка, порушену шлункову акомодацію, підвищену чутливість до розтягнення шлунка, змінену чутливість дванадцятипалої кишки до ліпідів або кислоти і анормальну скорочувальну здатність дванадцятипалої і худої кишок. Пролонгований вплив кислоти на дванадцятипалу кишку також виявляється у деяких пацієнтів з FD і GP, і цей вплив може сповільнювати випорожнення шлунка і викликати FD або GP-подібні симптоми. Диспепсія є синдромом, що часто зустрічається, який становить приблизно 30 % випадків, що виявляються гастроентерологами, при цьому FD представляє приблизно 60 % від всіх таких випадків диспепсії. GP стосується анормальної скорочувальної здатності шлунка, що характеризується уповільненим випорожненням шлунка у відсутність механічної обструкції. GP може бути ідіопатичним, або його причинами можуть бути різні стани, що включають цукровий діабет типу I або типу II, вірусне інфекційне захворювання, склеродермію, розлади нервової системи, такі як хвороба Паркінсона, метаболічні порушення, такі як гіпотиреоз, післяопераційна непрохідність кишечника, і деякі лікарські засоби, що включають наркотичні лікарські засоби від болю, трициклічні антидепресанти і блокатори кальцієвих каналів. Лікування для раку, що включає хіміотерапевтичні лікарські засоби і опромінення грудної клітки і черевної порожнини, можуть також викликати парез шлунка, або тимчасово, або назавжди. Найбільш загальними симптомами є нудота, блювота, здуття, біль в епігастральній області, втрата ваги і швидке насичення. Парез шлунка є хронічним станом, який може приводити до нерідкої госпіталізації, зниженої якості життя і збільшеної непрацездатності, а у важких випадках до підвищеної смертності. Важкий, симптоматичний GP часто зустрічається у індивідуумів, які страждають на діабет, вражаючи 5-10 % осіб, що страждають на діабет, по відношенню до всієї популяції пацієнтів, що становить 1 мільйон, тільки в США. Традиційні можливі методи лікування FD і GP, а також інших розладів діяльності верхніх відділів шлунково-кишкового тракту, мали обмежену ефективність для багатьох пацієнтів. Тому залишається необхідність в нових сполуках і способах лікування FD, GP і інших шлунковокишкових розладів. Короткий виклад суті винаходу Відмітними ознаками за даним винаходом є пептиди, композиції і пов'язані з ними способи лікування розладів діяльності верхніх відділів шлунково-кишкового тракту і їх станів (наприклад, диспепсії, GP, непрохідність кишечника після операції на шлунку, порушення функції стравоходу, функціонального гастродуоденального порушення, шлунково-стравохідного рефлюкса (GERD) або виразки дванадцятипалої кишки або шлунка), а також тут описані інші стани і розлади. Відмітними ознаками композицій є пептиди, які активують гуанілатциклазу С (GC-C) у верхньому відділі ШКТ, але набагато слабкіше активують GC-C в нижньому відділі 1 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ШКТ, або зовсім не активують її. Без обмеження якою-небудь теорією, пептиди за даним винаходом корисні, оскільки вони можуть полегшувати симптоми розладів діяльності верхніх відділів ШКТ (повністю або частково внаслідок збільшення скорочувальної здатності верхніх відділів ШКТ і/або ослаблення болю в епігастральній області/дискомфорт і здуття) без викликання явно виражених ефектів в нижніх відділах ШКТ (наприклад, таких, які обмежують дозу, змін ритму випорожнення кишечника, в тому числі діареї) на рівнях доз і при частоті введення доз, достатніх для ослаблення симптомів у верхніх відділах ШКТ. Пептиди за даним винаходом також застосовні для ослаблення болю і зменшення дискомфорту в шлунковокишковому тракті. В одному аспекті за даним винаходом наданий пептид або його фармацевтично прийнятна сіль, причому пептид включає амінокислотну послідовність: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Xaa14 Gly15 Xaa16 Xaa17, або її фармацевтично прийнятну сіль; де Xaa1 являє собою Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, γ-карбоксиловану Asp, Glu, D-Glu, γ-карбоксиловану Glu, α-аміносуберинову кислоту (Asu), α-аміноадипінову кислоту (Aad), α-амінопімелінову кислоту (Apm) або відсутній; Xaa2 являє собою Asp, γ-карбоксиловану Asp, Glu, γ-карбоксиловану Glu, Asu, Aad, Apm або відсутній; Xaa3 являє собою Asp, γ-карбоксиловану Asp, Glu, γ-карбоксиловану Glu, Asu, Aad, Apm або відсутній; Xaa4 являє собою Cys або D-Cys; Xaa6 являє собою P-Ser, P-Thr, P-гомо-Ser, 4-гідроксиваліну фосфат, P-гомо-Thr, P-Cys або P-Tyr; Xaa7 являє собою Tyr, Leu, Phe або Ile; Xaa8 являє собою Cys або D-Cys; Xaa14 являє собою Thr, Ala або Phe; Xaa16 являє собою Cys або D-Cys; і Xaa17 являє собою Tyr, D-Tyr або відсутній; де якщо Xaa1 присутній, Xaa1 може бути модифікованим в своїй аміногрупі метилом, етандіовою кислотою, пропандіовою кислотою, бутандіовою кислотою, пентандіовою кислотою, гександіовою кислотою, гептандіовою кислотою або октандіовою кислотою; якщо Xaa1 відсутній, а Xaa2 присутній, то Xaa2 може бути модифікованим в своїй аміногрупі метилом, етандіовою кислотою, пропандіовою кислотою, бутандіовою кислотою, пентандіовою кислотою, гександіовою кислотою, гептандіовою кислотою або октандіовою кислотою; або якщо як Xaa1, так і Xaa2 відсутні, то Xaa3 може бути модифікованим в своїй аміногрупі метилом, етандіовою кислотою, пропандіовою кислотою, бутандіовою кислотою, пентандіовою кислотою, гександіовою кислотою, гептандіовою кислотою або октандіовою кислотою. У другому аспекті за даним винаходом надаються фармацевтичні композиції, що включають пептид за даним винаходом. У третьому аспекті за даним винаходом надаються способи лікування шлунково-кишкового розладу, які включають введення фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом. Деталізація одного або більше варіантів здійснення за даним винаходом викладені в супровідному описі. Короткий опис креслень На фіг. 1A ілюструється реакція пептиду, що наводиться як приклад за даним винаходом, з лужною фосфатазою. На фіг. 1B ілюструється гідроліз контрольного п-нітрофенілфосфату фосфатазами. На фіг. 2 представлений приклад, що демонструє, що пептид 2 і пептид 4 стимулюють секрецію соку дванадцятипалої кишки. На фіг. 3 представлені результати дослідження стійкості пептиду 2, дефосфо-пептиду 2 і пептиду 3 в кишковому соку (соку худої кишки) миші. На фіг. 4 представлені результати дослідження ефекту пептидів 2 і 3 на випорожнення рідкого вмісту з шлунка у щурів з STZ-індукованим діабетом. Ці креслення надані як приклад і не передбачають обмеження об'єму даного винаходу. Докладний опис даного винаходу Гуанілатциклаза С (GC-C) є трансмембранним рецептором, який локалізований на апікальній поверхні епітеліальних клітин в шлунку і кишечнику. Рецептор має екстраклітинний лігандзв'язувальний домен, один трансмембранний район і С-кінцеву гуанілілциклазний домен. Коли ліганд зв'язується з екстраклітинним доменом GC-C, внутрішньоклітинний каталітичний 2 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 домен каталізує продукцію cGMP (цГМФ) з GTP (ГТФ). In vivo це збільшення внутрішньоклітинного cGMP ініціює каскад подій, який приводить до збільшення секреції хлориду і бікарбонату в просвіт кишки, підвищення pH в просвіті, зниження поглинання натрію з просвіту, збільшення секреції соку і прискорення проходження вмісту через кишечник. Також встановлено, що cGMP, який секретується двонаправлено з епітелію в слизову оболонку і просвіт, ослабляє активацію аферентних С-волокон, що наводить на думку про можливий механізм знеболювальних дій, що спостерігаються, агоністів GC-C на вісцеральний біль. Лінаклотид, пептидний агоніст GC-C, який призначають перорально і в цей час піддається клінічним випробуванням відносно лікування синдрому подразненої кишки із закрепом (IBS-c) і хронічним закрепом (CC), чинить множинні ефекти на фізіологію нижніх відділів ШКТ: (1) ослаблення вісцерального болю, (2) зменшення здуття і (3) збільшення проходження вмісту через ШКТ, які можуть привести до збільшення частоти стулу і поліпшення консистенції стулу. Перорально лінаклотид, що призначається, чинить місцеву дію внаслідок активації GC-C на поверхні просвіту; після перорального прийому на рівнях терапевтичних доз рівні лінаклотиду, що піддаються виявленню, не виявляються на системному рівні. Таким чином, результати клінічних випробувань лінаклотиду, а також преклінічні дослідження, які були виконані з використанням лінаклотиду і споріднених пептидів, наводять на думку про те, що пептидні агоністи GC-C можуть застосовуватися з терапевтичною метою. Було б корисно мати агоніст GC-C, який міг би використовуватися для полегшення розладів діяльності верхніх відділів ШКТ (наприклад, функціональної диспепсії (FD) і парезу шлунка (GP)) і їх симптомів без стимуляції явно виражених ефектів на ритми випорожнення кишечника, які могли б бути наслідком стимуляції GC-C в нижніх відділах ШКТ. Такий агоніст GC-C міг би зменшити можливість несприятливих подій в нижніх відділах ШКТ, що включають зміну ритмів випорожнення кишечника і пронос. Пептидні агоністи GC-C, що описуються тут, більш активні у верхніх відділах ШКТ (наприклад, шлунку і дванадцятипалій кишці) і менш активні в нижніх відділах ШКТ. Такі агоністи могли б принести користь пацієнтам, що страждають на розлади діяльності верхніх відділів ШКТ (наприклад, FD і GP), внаслідок (1) ослаблення вісцерального болю за допомогою збільшення продукції cGMP і/або інших механізмів, (2) зменшення здуття, (3) збільшення випорожнення шлунка і/або проходження вмісту через верхню частину тонкої кишки (наприклад, проходження вмісту через дванадцятипалу кишку) і (4) нейтралізації кислоти в дванадцятипалій кишці за допомогою стимуляції секреції бікарбонату. Важливо, щоб ці агоністи, внаслідок своєї активності, направленої на верхні відділи ШКТ, були здатні полегшувати симптоми FD і GP без викликання явно виражених ефектів на ритми випорожнення кишечника (наприклад, які могли бути наслідком стимуляції GC-C в нижніх відділах ШКТ). В одному аспекті даним винаходом надається новий пептидний агоніст GC-C, застосовний для лікування шлунково-кишкових розладів, особливо розладів діяльності верхніх відділів ШКТ, таких як FD і GP. Пептидний агоніст GC-C, як розраховано, є активним у верхніх відділах ШКТ, в тому числі стравоході, шлунку і верхній частині тонкої кишки (дванадцятипалої кишки), але менш активним по мірі його проходження через іншу частину тонкої кишки і товсту кишку. Пептиди за даним винаходом також застосовні для зменшення болю в шлунково-кишковому тракті і дискомфорту в ньому. Пептидний агоніст GC-C містить фосфоамінокислоту, наприклад, фосфосерин, із заміною консервативного глутамату або аспартату, що виявляються в інших 2 GC-C пептидах, що є агоністами. Фосфат -OPO3 -фосфоамінокислоти, такий як фосфосерин, здатний виконувати функцію біоміметика COO глутамату або аспартату, так, що пептид, що містить фосфоамінокислоти, здатний до зв'язування з GC-C і її активації. Пептид, що містить фосфоамінокислоти, може зазнавати дефосфорилування під дією лужних фосфатаз кишечника, що значно зменшує зв'язування з GC-C і агоністичну активність пептиду. Лужні фосфатази кишечника виявляються протягом всього ШКТ і найбільш активні в лужному середовищі просвіту, що включає просвіт тонкої кишки. Пептид, що містить фосфоамінокислоти, здатний активувати GC-C у верхніх відділах ШКТ, в тому числі кислому середовищі шлунка і у верхніх відділах ШКТ, зі стимуляцією секреції соку і бікарбонату. Оскільки пептид стимулює секрецію соку і бікарбонату у верхніх відділах ШКТ, середовище в просвіті кишки стає більш лужним, що активує тим самим активність лужних фосфатаз. Тому внаслідок дії пептиду на GCC, а також переміщення пептиду по кишечнику, фосфоамінокислота пептиду перетворюється в дефосфориловану амінокислоту, що зменшує тим самим його активність як агоніста GC-C по мірі його переміщення з верхніх відділів в нижні відділи ШКТ. Як тут використовується, термін "Р-", що передує амінокислоті або її трибуквенному скороченню, стосується фосфоамінокислоти. Наприклад, терміни "P-Ser", "P-Thr", "P-Tyr", "PCys", "P-гомо-Cys", "P-гомо-Ser" і "P-гомо-Thr" стосуються фосфосерину, фосфотреоніну, 3 UA 114274 C2 фосфотирозину, фосфоцистеїну, фосфогомоцистеїну, фосфогомосерину і фосфогомотреоніну, відповідно. Як тут використовується, фосфоамінокислота стосується ефіру або тіоефіру амінокислоти і фосфорної кислоти; наприклад, водень спиртової або тіольної функціональної групи заміщений -P(О)(OH)2. Наприклад, P-Ser має структуру 5 10 15 20 25 30 35 40 45 структуру , P-Tyr має структуру , P-Thr має , і P-Cys має структуру . В одному аспекті за даним винаходом надається пептид або його фармацевтично прийнятна сіль, причому пептид включає амінокислотну послідовність: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Xaa14 Gly15 Xaa16 Xaa17, або її фармацевтично прийнятну сіль; де Xaa1 являє собою Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β- Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, γ-карбоксиловану Asp, Glu, D-Glu, γ-карбоксиловану Glu, α-аміносуберинову кислоту (Asu), α-аміноадипінову кислоту (Aad), α-амінопімелінову кислоту (Apm) або відсутній; Xaa2 являє собою Asp, γ-карбоксиловану Asp, Glu, γ-карбоксиловану Glu, Asu, Aad, Apm або відсутній; Xaa3 являє собою Asp, γ-карбоксиловану Asp, Glu, γ-карбоксиловану Glu, Asu, Aad, Apm або відсутній; Xaa4 являє собою Cys або D-Cys; Xaa6 являє собою P-Ser, P-Thr, P-гомо-Ser, 4-гідроксиваліну фосфат, P-гомо-Thr, P-Cys або P-Tyr; Xaa7 являє собою Tyr, Leu, Phe або Ile; Xaa8 являє собою Cys або D-Cys; Xaa14 являє собою Thr, Ala або Phe; Xaa16 являє собою Cys або D-Cys; і Xaa17 являє собою Tyr, D-Tyr або відсутній; де якщо Xaa1 присутній, Xaa1 може бути модифікованим в своїй аміногрупі метилом, етандіовою кислотою, пропандіовою кислотою, бутандіовою кислотою, пентандіовою кислотою, гександіовою кислотою, гептандіовою кислотою або октандіовою кислотою; якщо Xaa1 відсутній, а Xaa2 присутній, то Xaa2 може бути модифікованим в своїй аміногрупі метилом, етандіовою кислотою, пропандіовою кислотою, бутандіовою кислотою, пентандіовою кислотою, гександіовою кислотою, гептандіовою кислотою або октандіовою кислотою; або якщо як Xaa1, так і Xaa2 відсутні, то Xaa3 може бути модифікованим в своїй аміногрупі метилом, етандіовою кислотою, пропандіовою кислотою, бутандіовою кислотою, пентандіовою кислотою, гександіовою кислотою, гептандіовою кислотою або октандіовою кислотою. У деяких варіантах здійснення відсутні як Xaa2, так і Xaa3. В інших варіантах здійснення Xaa2 являє собою Asp або Glu, а Xaa3 відсутній. У ще одних варіантах здійснення Xaa2 являє собою Asp або Glu, а Xaa3 являє собою Asp або Glu. У деяких варіантах здійснення Xaa7 являє собою Tyr або Leu. У деяких варіантах здійснення Xaa14 являє собою Thr. У деяких варіантах здійснення Xaa17 являє собою Tyr або відсутній. У деяких варіантах здійснення Xaa1 являє собою Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, DAla, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu або D-Glu. У подальших варіантах здійснення Xaa1 являє собою Asp, D-Asp, Glu або D-Glu. У деяких варіантах здійснення Xaa6 являє собою P-Ser або P-Thr. У подальших варіантах здійснення Xaa6 являє собою P-Ser. 4 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення Xaa1, Xaa2 і Xaa3 відсутні, а Xaa4 являє собою D-Cys або Cys. У подальших варіантах здійснення Xaa7 являє собою Tyr або Leu. У подальших варіантах здійснення Xaa14 являє собою Thr. У подальших варіантах здійснення Xaa 17 являє собою Tyr або відсутній. У подальших варіантах здійснення Xaa6 являє собою P-Ser. У деяких варіантах здійснення щонайменше один з Xaa4, Xaa8 або Xaa16 являє собою Cys. У деяких варіантах здійснення щонайменше два з Xaa4, Xaa8 або Xaa16 являють собою Cys. У деяких варіантах здійснення всі з Xaa4, Xaa8 або Xaa16 являють собою Cys. У деяких варіантах здійснення щонайменше один з Xaa4, Xaa8 або Xaa16 являє собою D-Cys. У деяких варіантах здійснення щонайменше два з Xaa4, Xaa8 або Xaa16 являють собою D-Cys. У деяких варіантах здійснення всі з Xaa4, Xaa8 або Xaa16 являють собою D-Cys. У деяких варіантах здійснення надається пептид або його фармацевтично прийнятна сіль, причому пептид включає амінокислотну послідовність Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Thr14 Gly15 Cys16 Xaa17, де Xaa7 являє собою Tyr або Leu. У деяких варіантах здійснення надається пептид або його фармацевтично прийнятна сіль, причому пептид включає амінокислотну послідовність Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; або Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys. У деяких варіантах здійснення надається пептид або його фармацевтично прийнятна сіль, причому пептид включає не більше 50, 40, 30 або 20 амінокислот. У подальших варіантах здійснення пептид включає не більше 19, 18, 17, 16, 15 або 14 амінокислот. В іншому аспекті даним винаходом надається пептид або його фармацевтично прийнятна сіль, причому пептид складається з амінокислотної послідовності: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Cys5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Xaa14 Gly15 Xaa16 Xaa17, або її фармацевтично прийнятної солі; де Xaa1 являє собою Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, D-Ala, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, γ-карбоксиловану Asp, Glu, D-Glu, γ-карбоксиловану Glu, α-аміносуберинову кислоту (Asu), α-аміноадипінову кислоту (Aad), α-амінопімелінову кислоту (Apm) або відсутній; Xaa2 являє собою Asp, γ-карбоксиловану Asp, Glu, γ-карбоксиловану Glu, Asu, Aad, Apm або відсутній; Xaa3 являє собою Asp, γ-карбоксиловану Asp, Glu, γ-карбоксиловану Glu, Asu, Aad, Apm або відсутній; Xaa4 являє собою Cys або D-Cys; Xaa6 являє собою P-Ser, P-Thr, P-гомо-Ser, 4-гідроксиваліну фосфат, P-гомо-Thr, P-Cys або P-Tyr; Xaa7 являє собою Tyr, Leu, Phe або Ile; Xaa8 являє собою Cys або D-Cys; Xaa14 являє собою Thr, Ala або Phe; Xaa16 являє собою Cys або D-Cys; і Xaa17 являє собою Tyr, D-Tyr або відсутній; де якщо Xaa1 присутній, Xaa1 може бути модифікованим в своїй аміногрупі метилом, етандіовою кислотою, пропандіовою кислотою, бутандіовою кислотою, пентандіовою кислотою, гександіовою кислотою, гептандіовою кислотою або октандіовою кислотою; якщо Xaa1 відсутній, а Xaa2 присутній, то Xaa2 може бути модифікованим в своїй аміногрупі метилом, етандіовою кислотою, пропандіовою кислотою, бутандіовою кислотою, пентандіовою кислотою, гександіовою кислотою, гептандіовою кислотою або октандіовою кислотою; або якщо як Xaa1, так і Xaa2 відсутні, то Xaa3 може бути модифікованим в своїй аміногрупі метилом, етандіовою кислотою, пропандіовою кислотою, бутандіовою кислотою, пентандіовою кислотою, гександіовою кислотою, гептандіовою кислотою або октандіовою кислотою. У деяких варіантах здійснення відсутні як Xaa2, так і Xaa3. В інших варіантах здійснення Xaa2 являє собою Asp або Glu, а Xaa3 відсутній. У ще одних варіантах здійснення Xaa2 являє собою Asp або Glu, а Xaa3 являє собою Asp або Glu. У деяких варіантах здійснення Xaa7 являє собою Tyr або Leu. 5 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення Xaa14 являє собою Thr. У деяких варіантах здійснення Xaa17 являє собою Tyr або відсутній. У деяких варіантах здійснення Xaa1 являє собою Asn, D-Asn, Gln, D-Gln, Pro, Ala, β-Ala, DAla, Val, D-Val, Gly, Thr, D-Thr, Asp, D-Asp, Glu або D-Glu. У подальших варіантах здійснення Xaa1 являє собою Asp, D-Asp, Glu або D-Glu. У деяких варіантах здійснення Xaa6 являє собою P-Ser або P-Thr. У подальших варіантах здійснення Xaa6 являє собою P-Ser. У деяких варіантах здійснення Xaa1, Xaa2 і Xaa3 відсутні, а Xaa4 являє собою D-Cys або Cys. У подальших варіантах здійснення Xaa7 являє собою Tyr або Leu. У подальших варіантах здійснення Xaa14 являє собою Thr. У подальших варіантах здійснення Xaa 17 являє собою Tyr або відсутній. У подальших варіантах здійснення Xaa6 являє собою P-Ser. У деяких варіантах здійснення надається пептид або його фармацевтично прийнятна сіль, причому пептид складається з амінокислотної послідовності Cys4 Cys5 P-Ser6 Xaa7 Cys8 Cys9 Asn10 Pro11 Ala12 Cys13 Thr14 Gly15 Cys16 Xaa17, де Xaa7 являє собою Tyr або Leu. У деяких варіантах здійснення надається пептид або його фармацевтично прийнятна сіль, причому пептид складається з амінокислотної послідовності Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys; Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr; або Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys. У деяких випадках пептид є виділеним. У інших пептид є очищеним. У деяких варіантах здійснення Xaa6 є будь-якою амінокислотою, яка може бути фосфорилованою. У деяких варіантах здійснення надається фармацевтично прийнятна сіль пептиду. У деяких випадках фармацевтично прийнятною сіллю є сіль у вигляді хлориду. Варіанти пептидів У деяких випадках може бути бажаним лікування пацієнтів варіантом пептиду, що зв'язується з рецепторами GC-C у кишечнику й активує їх, але є менш активним або більш активним, ніж неваріантна форма пептиду. Зменшена активність може бути результатом зниженої спорідненості до рецептора або зменшеної здатності до активації рецептора після зв'язування, або зниженої стійкості пептиду. Збільшена активність може бути результатом підвищеної спорідненості до рецептора або збільшеної здатності до активації рецептора після зв'язування, або підвищеної стійкості пептиду. У деяких пептидах один або обидва члени однієї чи обох пар залишків Cys, що звичайно утворюють дисульфідний зв'язок, можуть бути заміщені гомоцистеїном,пеніциламіном, 3меркаптопроліном (Kolodziej et al. 1996 Int. J. Pept. Protein Res. 48: 274); β,β-диметилцистеїном (Hunt et al. 1993 Int. J. Pept. Protein Res. 42: 249) або діамінопропіоновою кислотою (Smith et al. 1978 J. Med. Chem. 21: 117) для утворення альтернативних внутрішніх зшивок у положеннях звичайних дисульфідних зв'язків. В інших варіантах здійснення дисульфідні зв'язки можуть бути замінені вуглеводними зшивками (Schafmeister et al. 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 5891, Patgiri et al. 2008 Acc. Chem. Res. 41: 1289, Henchey et al. 2008 Curr. Opin. Chem. Biol. 12: 692). Продукція пептидів В одному варіанті здійснення пептиди або пептиди-попередники за даним винаходом можна продукувати рекомбінантно в будь-якій відомій системі для експресії білків, що включає, без обмеження, бактерії (наприклад, E. coli або Bacillus subtilis), системи з використанням клітин комах (наприклад, системи з використанням клітин Drosophila Sf9), дріжджові клітинні системи (наприклад, S. cerevisiae, S. saccharomyces) або системи для експресії в міцеліальних грибах, або системи для експресії в клітинах тварин (наприклад, системи для експресії в клітинах ссавців). Пептиди або пептиди-попередники за даним винаходом можна також хімічно синтезувати. У випадку рекомбінантної продукції, наприклад, у E. coli, пептиду або варіанту пептиду молекула нуклеїнової кислоти, що кодує пептид, може також кодувати лідерну послідовність, що дає можливість зрілому пептиду секретуватися з клітини. Таким чином, пептид, що кодує послідовність, може включати препослідовність і пропослідовність, наприклад бактеріального пептиду ST, що зустрічається в природі. Секретований зрілий пептид можна очистити з 6 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 культурального середовища. Послідовність, що кодує описуваний тут пептид, можна вмонтувати у вектор, здатний доставляти молекулу нуклеїнової кислоти в бактеріальну клітину і підтримувати її там. Молекулу ДНК можна вмонтувати у вектор, що автономно реплікується (придатні вектори включають, наприклад, pGEM3Z і pcDNA3, і їхні похідні). Векторна нуклеїнова кислота може бути бактеріальною ДНК або ДНК бактеріофага, наприклад, бактеріофага лямбда або M13 і їхніх похідних. За конструюванням вектора, що містить описувану тут нуклеїнову кислоту, може випливати трансформація клітини-хазяїна, такої як бактерія. Придатні бактерії-хазяїни включають, але без обмеження, E. coli, B. subtilis, Pseudomonas і Salmonella. Генетична конструкція також включає, крім кодуючої молекули нуклеїнової кислоти, елементи, що уможливлюють експресію, такі як промотор і регуляторні послідовності. Експресійні вектори можуть містити послідовності, що контролюють транскрипцію, які контролюють ініціацію транскрипції, такі як промотор, енхансер, оператор і послідовності репресорів. Кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям добре відома безліч послідовностей, що контролюють транскрипцію. Експресійний вектор може також включати послідовність, що регулює трансляцію (наприклад, нетрансльовану 5' послідовність, нетрансльовану 3' послідовність або ділянку внутрішньої посадки рибосоми). Вектор може бути здатний до автономної реплікації, або його можна інтегрувати в ДНК хазяїна для забезпечення стабільності під час продукції пептиду. Послідовність, що кодує білок, що включає описуваний тут пептид, можна також злити з нуклеїновою кислотою, що кодує пептидну афінну мітку, наприклад, глютатіон-S-трансферазу (GST), що зв'язує мальтозу E білок, білок A, FLAG-мітку, гексагістидин, myc-мітку або мітку у вигляді HA вірусу грипу, для полегшення очищення. У результаті злиття з афінною міткою чи репортером рамка зчитування для пептиду, що представляє інтерес, з'єднується з рамкою зчитування гену, що кодує афінну мітку, так що створюється трансляційний гібрид. Експресія гібридного гену приводить до трансляції одиничного пептиду, що включає як пептид, що представляє інтерес, так і афінну мітку. У деяких випадках, коли використовуються афінні мітки, послідовність ДНК, що кодує сайт розпізнавання протеазами, буде злита між рамками зчитування для афінної мітки і пептидом, що представляє інтерес. Для продукції пептидів у біологічній системі можуть також використовуватися генетичні конструкції і способи, що підходять для продукції незрілих і зрілих форм описуваних тут пептидів і варіантів у системах для експресії білків, що відрізняються від бактерій, і добре відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям. Продуковані рекомбінантно пептиди можна фосфорилувати, використовуючи відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям способи. У деяких варіантах здійснення пептид рекомбінантно продукують, виділяють із клітини, у якій він був експресований, а потім фосфорилують, використовуючи протеїнкіназу, наприклад, серин/треонін-кіназу чи тирозинкіназу. Велике число кіназ відомо в даній галузі техніки і може використовуватися для цієї мети. Кваліфікований у даній галузі техніки фахівець усвідомить, що різні кінази мають різні субстратні специфічності, і вибере кіназу для застосування на основі послідовності пептиду. В інших варіантах здійснення пептид рекомбінантно продукують у клітині, що також експресує серин/треонін-кіназу або тирозинкіназу, що буде фосфорилувати пептид. В інших варіантах здійснення пептиди можна рекомбінантно продукувати при включенні фосфоамінокислоти. Способи модифікації тРНК, що включають, але без обмеження, модифікацію антикодону, місця приєднання амінокислоти і/або акцепторного стебла, для створення можливості включення амінокислот, що не зустрічаються в природі, і/або довільних амінокислот відомі в даній галузі техніки (Biochem. Biophys. Res. Comm. (2008) 372: 480-485; Chem. Biol. (2009) 16: 323-336; Nat. Methods (2007) 4: 239-244; Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2006) 7: 775-782; Methods (2005) 36: 227-238; Methods (2005) 36: 270-278; Annu. Rev. Biochem. (2004) 73: 147-176; Nuc. Acids Res. (2004) 32: 6200-6211; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100: 6353-6357; Royal Soc. Chem. (2004) 33: 422430). У деяких варіантах здійснення пептиди можна одержати хімічно. Пептиди можна синтезувати безліччю різних способів, що включають синтез у розчині і твердофазний синтез, використовуючи традиційну BOC- або FMOC-захист. Наприклад, пептид можна синтезувати на 2-хлортритилхлориді чи смолі Ванга, використовуючи сполуку амінокислот одну за одною. Можуть використовуватися наступні захисні групи: флуоренілметилоксикарбоніл або третбутилоксикарбоніл (для альфа-аміногруп на N-кінці); тритил або трет-бутил (для тіольних груп Cys); трет-бутил (для γ-карбоксильної групи глутамінової кислоти і гідроксильної групи треоніну, якщо є присутнім); тритил (для β-амідної функції бокового ланцюга аспарагіну і фенольної групи тирозину, якщо є присутнім); тритил чи трет-бутилдиметилсиліл (для гідроксильної групи серину, якщо є присутнім) і трет-бутилоксикарбоніл (для N-кінця перед наступними 7 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модифікаціями бокового ланцюга). Сполука може бути здійснена за допомогою DIC і HOBt у присутності третинного аміну, і з пептиду можна зняти захист, і його можна відщепити від твердої підкладки, використовуючи суміш K (81 % трифтороцтової кислоти, 5 % фенолу, 5 % тіоанізолу, 2,5 % 1,2-етандитіолу, 3 % води, 2 % диметилсульфіду, 1,5 % йодиду амонію у ваговому відношенні). Після видалення трифтороцтової кислоти й інших летких речовин пептид можна осадити, використовуючи органічний розчинник. Дисульфідні зв'язки між залишками Cys можна створити, використовуючи диметилсульфоксид (Tam et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 6657-62) або використовуючи стратегію окислування киснем повітря. Результуючий пептид можна очистити за допомогою хроматографії зі зверненою фазою і піддати ліофілізації. Фосфоамінокислоту, наприклад, фосфосерин, можна ввести в пептид за допомогою будьякого способу, відомого кваліфікованому у даній галузі техніки фахівцю (дивіться, наприклад, G.K. Toth et al. (2007), Current Organic Chemistry 11: 409-426). У деяких варіантах здійснення як частину зборки пептиду на твердій фазі можна ввести захищений аналог фосфоамінокислоти, наприклад, аналог амінокислоти фосфосерину, наприклад, у вигляді Fmoc-Ser[PO(OBzl)OH]-OH (T. Wakamiya et al. (1997), Bioorganic and Medicinal Chemistry 5: 135-145, 1997) або у вигляді Fmoc-Ser[PO(OAryl/Alkyl)2]-OH (G.K. Toth et al. (2007) Current Organic Chemistry, 11: 409-426). В інших варіантах здійснення як частину зборки пептиду на твердій фазі можна ввести захищений аналог амінокислоти, наприклад, захищений аналог амінокислоти серину (наприклад, Fmocзахищений серин із захистом тритилом для бокового ланцюга з гідроксильною групою). Після повної зборки пептидного ланцюга можна вибірково зняти захист із Ser[Trt] або Ser[SiMe2tBu], і можна ввести фосфатну групу, використовуючи фосфорамідитну/окисну стратегію (G. Shapiro et al. (1994) Tetrahedron Letters 35: 869-872; P. Hormozdiari et al. (1996) Tetrahedron Letters, 37: 8227-8230). В інших варіантах здійснення хімічно отриманий пептид можна піддати фосфорилуванню, використовуючи серин/треонін-кіназу або тирозинкіназу, як описано вище. Пептиди можна створити, виділити або використовувати або у формі вільної основи, або у вигляді її фармацевтично прийнятних солей. Приклади солей включають, без обмеження, солі у вигляді ацетату, хлориду, сульфату і фосфату пептиду. Композиції пептидів і агоністів рецептора GC-C В іншому аспекті надані композиції, у яких пептиди, окремо або в комбінації, можуть бути об'єднані з будь-яким фармацевтично прийнятним носієм або середовищем. Пептиди можуть бути об'єднані з матеріалами, що не викликають несприятливу, алергійну або небажану в іншому відношенні реакцію після введення пацієнту. Використовувані носії або середовища включають розчинники, диспергатори, покривні речовини, що активують поглинання речовини, агенти для контрольованого вивільнення й один або більше інертних формотворних засобів (які включають крохмалі, поліоли, засоби для гранулювання, мікрокристалічну целюлозу (наприклад, Celphere, гранули Celphere), розріджувачі, змащувальні речовини, зв'язувальні речовини, речовини, що викликають дезінтеграцію і т.п.) і т.д. Якщо бажано, таблетовані дози описаних композицій можна покрити за допомогою стандартних водних або неводних методів. Приклади формотворних засобів для застосування як фармацевтично прийнятних носіїв і фармацевтично прийнятних інертних носіїв і вищезгаданих додаткових інгредієнтів включають, але без обмеження, зв'язувальні речовини, наповнювачі, агенти, що викликають дезінтеграцію, змащувальні речовини, протимікробні засоби і покривні речовини. Використовуваний тут термін "зв'язувальна речовина" стосується будь-якої фармацевтично прийнятної зв'язувальної речовини, що може використовуватися при здійсненні на практиці за даним винаходом. Приклади фармацевтично прийнятних зв'язувальних речовин включають, без обмеження, крохмаль (наприклад, кукурудзяний крохмаль, картопляний крохмаль і попередньо клейстеризований крохмаль (наприклад, STARCH 1500 і STARCH 1500 LM, продавані Colorcon, Ltd.) і інші крохмалі), мальтодекстрин, желатин, природні і синтетичні камеді, такі як аравійська камедь, порошкоподібний трагакант, гуарову смолу, целюлозу і її похідні (наприклад, метилцелюлозу, гідроксіетилцелюлозу, гідроксіетилметилцелюлозу, гідроксипропілцелюлозу і гідроксипропілметилцелюлозу (гіпромелозу), етилцелюлозу, ацетат целюлози, кальцій-карбоксиметилцелюлозу, натрій-карбоксиметилцелюлозу, карбоксиметилцелюлозу, порошкоподібну целюлозу, надподрібнену целюлозу, TM TM TM TM мікрокристалічну целюлозу (наприклад, AVICEL , таку як AVICEL-PH-101 , -103 і -105 , що продаються FMC Corporation, Marcus Hook, PA, США)), полівініловий спирт, полівінілпіролідон (наприклад, полівінілпіролідон K30), і їхні суміші. Приклади зв'язувальних речовин, що можуть, зокрема, використовуватися у фармацевтичних композиціях, включають полівініловий спирт, полівінілпіролідон (повідон), крохмаль, мальтодекстрин або ефір целюлози (такий як, наприклад, метилцелюлоза, етилцелюлоза, карбоксиметилцелюлоза, гідроксіетилцелюлоза, гідроксіетилметилцелюлоза, 8 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гідроксипропілцелюлоза і гідроксипропілметилцелюлоза). Використовуваний тут термін "напонювач" стосується будь-якого фармацевтично прийнятного наповнювача, що може використовуватися при здійсненні на практиці за даним винаходом. Приклади фармацевтично прийнятних наповнювачів включають, без обмеження, тальк, карбонат кальцію (наприклад, гранули або порошок), двоосновний фосфат кальцію, триосновний фосфат кальцію, сульфат кальцію (наприклад, гранули або порошок), мікрокристалічну целюлозу (наприклад, Avicel PH101 або Celphere CP-305), надподрібнену целюлозу, порошкоподібну целюлозу, декстрати, каолін, маніт, кремнієву кислоту, сорбіт, крохмаль (наприклад, Крохмаль 1500), попередньо клейстеризований крохмаль, лактозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, трегалозу, сахарозу, мальтозу, ізомальт, рафінозу, мальтит, меліцитозу, стахіозу, лактит, палатиніт, ксиліт, міоінозит і їхні суміші. Приклади фармацевтично прийнятних наповнювачів, що можуть, зокрема, використовуватися для покриття пептидів, включають, без обмеження, тальк, мікрокристалічну целюлозу (наприклад, Avicel PH101 або Celphere CP-305), порошкоподібну целюлозу, декстрати, каолін, маніт, кремнієву кислоту, сорбіт, крохмаль, попередньо клейстеризований крохмаль, лактозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, трегалозу, сахарозу, мальтозу, ізомальт, двоосновний фосфат кальцію, рафінозу, мальтит, меліцитозу, стахіозу, лактит, палатиніт, ксиліт, маніт, міоінозит і їхні суміші. Використовуваний тут термін "добавки" стосується будь-яких фармацевтично прийнятних добавок. Фармацевтично прийнятні добавки включають, без обмеження, агенти, що викликають дезінтеграцію диспергуючі добавки, змащувальні речовини, речовини, що сприяють ковзанню, антиоксиданти, добавки для покриття, розріджувачі, поверхнево-активні речовини, коригенти, гігроскопічні речовини, добавки, що активують поглинання, добавки для контрольованого вивільнення, добавки для запобігання злежуванню/злипанню, протимікробні засоби (наприклад, консерванти), фарбувальні речовини, десиканти, пластифікатори і барвники. Як тут використовується, "формотворний засіб" являє собою будь-яку фармацевтично прийнятну добавку, наповнювач, зв'язувальну речовину або агент. Композиції за даним винаходом можуть також необов'язково включати інші терапевтичні інгредієнти, агенти для запобігання злежуванню/злипанню, консерванти, підсолоджувачі, фарбувальні речовини, коригенти, десиканти, пластифікатори, барвники, речовини, що сприяють ковзанню, антиадгезиви, засоби, що знижують статичний заряд, поверхнево-активні речовини (змочувальні речовини), антиоксиданти, плівкоутворювачі і т.п. Будь-який такий необов'язковий інгредієнт повинен бути здатним до поєднання з описуваною тут сполукою для забезпечення стійкості композиції. Композиція може містити в міру необхідності інші добавки, що включають, наприклад, лактозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, трегалозу, сахарозу, мальтозу, рафінозу, мальтит, меліцитозу, стахіозу, лактит, палатиніт, крохмаль, ксиліт, маніт, міоінозит і т.п., і їхні гідрати, і амінокислоти, наприклад, аланін, гліцин і бетаїн, і пептиди і білки, наприклад, альбумін. Композиції можуть включати, наприклад, різні додаткові розчинники, диспергатори, покривні речовини, добавки, що активують поглинання, добавки для контрольованого вивільнення й одну або більше інертних добавок (які включають, наприклад, крохмалі, поліоли, добавки для гранулювання, мікрокристалічну целюлозу, розріджувачі, змащувальні речовини, зв'язувальні речовини, добавки, що викликають дезінтеграцію, і т.п.) і т.д. Якщо бажано, таблетовані дози описаних композицій можна покрити за допомогою стандартних водних або неводних методів. Композиції можуть також включати, наприклад, добавки для запобігання злежуванню/злипанню, консерванти, підсолоджувачі, фарбувальні речовини, коригенти, десиканти, пластифікатори, барвники і т.п. Придатні агенти, що викликають дезінтеграцію, включають, наприклад, агар-агар, карбонат кальцію, мікрокристалічну целюлозу, кроскармелозу натрію, кросповідон, повідон, полакрилін калію, гліколят крохмаль натрію, картопляний або маніоковий крохмаль, інші крохмалі, попередньо клейстеризований крохмаль, глини, інші альгіни, інші целюлози, камеді і їхні суміші. Придатні змащувальні речовини включають, наприклад, стеарат кальцію, стеарат магнію, мінеральну олію, легку мінеральну олію, гліцерин, сорбіт, маніт, поліетиленгліколь, інші гліколі, стеаринову кислоту, натрію лаурилсульфат, тальк, гідрогенізовану рослинну олію (наприклад, арахісову олію, бавовняну олію, соняшникову олію, кунжутну олію, маслинову олію, кукурудзяну олію і соєву олію), стеарат цинку, етилолеат, етиллаурат, агар, силікагель силоїд (AEROSIL 200, W.R. Grace Co., Baltimore, MD, США), аерозоль синтетичного кремнезему, що коагулюється (Evonik Degussa Co., Plano, TX USA), пірогенний діоксид кремнію (CAB-O-SIL, Cabot Co., Boston, MA, США) і їхні суміші. Придатні речовини, що сприяють ковзанню, включають, наприклад, лейцин, кремнію діоксид 9 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 колоїдний, магнію трисилікат, порошкоподібну целюлозу, крохмаль, тальк і триосновний фосфат кальцію. Придатні добавки для запобігання злежуванню/злипанню включають, наприклад, силікат кальцію, силікат магнію, кремнію діоксид, кремнію діоксид колоїдний, тальк і їхні суміші. Придатні протимікробні добавки, що можуть використовуватися, наприклад, як консервант для композицій пептидів, включають, наприклад, бензалконію хлорид, бензетонію хлорид, бензойну кислоту, бензиловий спирт, бутилпарабен, цетилпіридинію хлорид, крезол, хлорбутанол, дегідрооцтову кислоту, етилпарабен, метилпарабен, фенол, фенілетиловий спирт, феноксіетанол, фенілртуті ацетат, фенілртуті нітрат, сорбат калію, пропілпарабен, бензоат натрію, дегідроацетат натрію, пропіонат натрію, сорбінову кислоту, тимерсол, Thymo і їхні суміші. Придатні антиоксиданти включають, наприклад, BHA (бутилований гідроксіанізол), BHT (бутилований гідрокситолуол), вітамін E, пропілгалат, аскорбінову кислоту і її солі або складні ефіри, токоферол і його складні ефіри, альфа-ліпоєву кислоту і бета-каротин. Придатні добавки для покриття включають, наприклад, натрій-карбоксиметилцелюлозу, целюлози ацетат-фталат, етилцелюлозу, желатин, фармацевтичну глазур, гідроксипропілцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлози фталат, метилцелюлозу, поліетиленгліколь, полівінілацетат фталат, шелак, сахарозу, діоксид титану, карнаубський віск, мікрокристалічний віск і їхні суміші. Придатні матеріали для захисних покриттів включають Aquacoat (наприклад, дисперсію Aquacoat Ethylcellulose Aquaeous Dispersion, 15 % у ваговому відношенні, FMC Biopolymer, ECD-30), Eudragit (наприклад, Eudragit E PO PE-EL, Roehm Pharma Polymers) і Opadry (наприклад, дисперсію Opadry AMB, 20 % у ваговому відношенні, Colorcon). У визначених варіантах здійснення добавки, що підходять для композиції пептидів, включають одне або декілька з наступного: сахарози, тальку, стеарату магнію, кросповідону або BHA. Композиції за даним винаходом можуть також включати інші формотворні засоби, агенти і їхні види, що включають, але без обмеження, L-гістидин, Pluronic, Полоксамери (такі як Lutrol і Полоксамер 188), аскорбінову кислоту, глутатіон, підсилювачі проникаючої здатності (наприклад, ліпіди, холат натрію, ацилкарнітин, саліцилати, різнорідні солі жовчної кислоти, міцели з жирних кислот, комплексони, жирну кислоту, поверхнево-активні речовини, середньоланцюгові гліцериди), інгібітори протеаз (наприклад, соєвий інгібітор трипсину, органічні кислоти), агенти, що знижують pН, і підсилювачі поглинання, ефективні у відношенні збільшення біодоступності (що включають, але без обмеження, ті, котрі описані в патентах США з № 608618 і 5912014), матеріали для жувальних таблеток (по типу декстрози, фруктози, моногідрату лактози, лактози й аспартаму, лактози і целюлози, мальтодекстрину, мальтози, маніту, мікрокристалічної целюлози і гуарової смоли, сорбіту кристалічного); агенти для парентерального введення (по типу маніту і повідону); пластифікатори (по типу дибутилсебакату, пластифікаторів для покриттів, полівінілацетату фталату); порошкові речовини, змащувальні (по типу гліцерилбегенату); м'які желатинові капсули (по типу спеціального розчину сорбіту); сфери для покриття (по типу цукрових сфер); агенти для сферонізації (типу гліцерилбегенату і мікрокристалічної целюлози); суспендуючі/гелеутворюючі агенти (типу карагеніну, геланової камеді, маніту, мікрокристалічної целюлози, повідону, гліколяту крохмалю натрію, ксантанової камеді); підсолоджувачі (по типу аспартаму, аспартаму і лактози, декстрози, фруктози, меду, мальтодекстрину, мальтози, маніту, меласи, сорбіту кристалічного, спеціального розчину сорбіту, сахарози); агенти для мокрої грануляції (типу карбонату кальцію, лактози безводної, моногідрату лактози, мальтодекстрину, маніту, мікрокристалічної целюлози, повідону, крохмалю), палений цукор, натрійкарбоксиметилцелюлозу, ароматизатор "Вишня з вершками" і ароматизатор "Вишня", лимонну кислоту безводну, лимонну кислоту, цукрову пудру, D&C Red № 33, D&C Yellow #10 Aluminum Lake, динатрію едетат, 15 % етиловий спирт, FD&C Yellow № 6 Aluminum lake, FD&C Blue #1 Aluminum Lake, FD&C Blue № 1, FD&C blue № 2 Aluminum lake, FD&C Green № 3, FD&C Red № 40, FD&C Yellow № 6 Aluminum Lake, FD&C Yellow № 6, FD&C Yellow № 10, гліцеринпальмітостеарат, гліцерилмоностеарат, індигокармін, лецитин, маніт, метил- і пропілпарабени, моноамонію гліцирризинат, природний і штучний ароматизатор "Апельсин", фармацевтичну глазур, полоксамер 188, Полідекстрозу, полісорбат 20, полісорбат 80, полівідон, попередньо клейстеризований кукурудзяний крохмаль, попередньо клейстеризований крохмаль, червоний оксид заліза, сахарин натрію, натрієву сіль карбоксиметилового ефіру, хлорид натрію, цитрат натрію, фосфат натрію, ароматизатор "Полуниця", синтетичний чорний оксид заліза, синтетичний червоний оксид заліза, діоксид 10 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 титану і білий віск. У деяких варіантах здійснення надається фармацевтична композиція, що включає 2+ 2+ описуваний тут пептид і один або більше стабілізуючих агентів, що вибираються з Mg , Ca , 2+ 2+ + + 3+ Zn , Mn , K , Na або Al , їхньої комбінації і/або просторово утрудненого первинного аміну. У 2+ 2+ 2+ подальших варіантах здійснення агентом є Mg , Ca або Zn або їхня комбінація. У деяких варіантах здійснення катіон надається у вигляді, без обмеження, ацетату магнію, хлориду магнію, фосфату магнію, сульфату магнію, ацетату кальцію, хлориду кальцію, фосфату кальцію, сульфату кальцію, ацетату цинку, хлориду цинку, фосфату цинку, сульфату цинку, ацетату марганцю, хлориду марганцю, фосфату марганцю, сульфату марганцю, ацетату калію, хлориду калію, фосфату калію, сульфату калію, ацетату натрію, хлориду натрію, фосфату натрію, сульфату натрію, ацетату алюмінію, хлориду алюмінію, фосфату алюмінію або сульфату алюмінію. У подальших варіантах здійснення катіон надається у вигляді хлориду магнію, хлориду кальцію, фосфату кальцію, сульфату кальцію, ацетату цинку, хлориду марганцю, хлориду калію, хлориду натрію або хлориду алюмінію. В інших варіантах здійснення катіон надається у вигляді хлориду кальцію, хлориду магнію або ацетату цинку. В іншому варіанті здійснення стабілізуючим агентом є просторово утруднений первинний амін. В подальшому варіанті здійснення просторово утрудненим первинним аміном є амінокислота. Крім того, в подальшому варіанті здійснення амінокислотою є амінокислота, що зустрічається в природі. В усе ще подальшому варіанті здійснення амінокислоту, що зустрічається в природі, вибирають із групи, що складається з гістидину, фенілаланіну, аланіну, глутамінової кислоти, аспарагінової кислоти, глутаміну, лейцину, метіоніну, аспарагіну, тирозину, треоніну, ізолейцину, триптофану, гліцину і валіну; більш того, амінокислотою, що зустрічається в природі, є лейцин, ізолейцин, аланін або метіонін. В іншому варіанті здійснення просторово утрудненим первинним аміном є амінокислота, що не зустрічається в природі (наприклад, 1-аміноциклогексанкарбонова кислота). В подальшому варіанті здійснення просторово утрудненим первинним аміном є циклогексиламін, 2-метилбутиламін або поліамін, такий як хітозан. В іншому варіанті здійснення один або більше просторово утруднених первинних амінів може використовуватися в композиції. У деяких випадках просторово утруднений первинний амін має формулу , де R1, R2 і R3 незалежно вибирають з H, C(O)OH, C1-C6 алкілу, C1-C6 алкілефіру, C1-C6 алкілтіоефіру, C1-C6 алкілкарбонової кислоти, C1-C6 алкілкарбоксиламіду й алкіларилу, при цьому будь-яка група може бути однократно або багаторазово заміщена галогеном або аміногрупою, і за умови, що не більш двох з R1, R2 і R3 являють собою H. В іншому варіанті здійснення не більш одного з R1, R2 і R3 незалежно є H. В інших варіантах здійснення надається фармацевтична композиція, що включає 2+ 2+ 2+ 2+ + фармацевтично прийнятного носія, пептид, катіон, що вибирається з Mg , Ca , Zn , Mn , K , + 3+ Na або Al , або їхньої суміші, і просторово утруднений первинний амін. В одному варіанті 2+ 2+ 2+ здійснення катіоном є Mg , Ca або Zn або їхня суміш. В подальшому варіанті здійснення фармацевтична композиція, крім того, включає фармацевтично прийнятну зв'язувальну речовину і/або фармацевтично прийнятну речовину, що сприяє ковзанню, змащувальну речовину або добавку, що виконує функцію як речовини, що сприяє ковзанню, так і речовини, що змащує, і/або антіоксидант. У деяких варіантах здійснення фармацевтична композиція вноситься в носій. У деяких варіантах здійснення носієм є наповнювач. У деяких випадках молярне співвідношення катіон:просторово утруднений первинний амін:пептид у водному розчині, внесеному в носій, становить 5-100:5-50:1. У деяких випадках молярне співвідношення катіон:просторово утруднений первинний амін може дорівнювати або перевищувати 2:1 (наприклад, знаходитися між 5:1 і 2:1). Таким чином, у деяких випадках молярне співвідношення катіон: просторово утруднений первинний амін: пептид у водному розчині, внесеному в носій, становить 100:50:1, 100:30:1, 80:40:1, 80:30:1, 80:20:1, 60:30:1, 60:20:1, 50:30:1, 50:20:1, 40:20:1, 20:20:1, 10:10:1, 10:5:1 або 5:10:1. Коли зв'язувальна речовина, наприклад, метилцелюлоза, присутня у розчині, що є агоністом GC-C пептиду, внесеному в носій, він може бути присутнім у кількості, що складає 0,5-2,5 % у ваговому відношенні (наприклад, 0,7 %-1,7 % або 0,7 %-1 %, або 1,5 %, або 0,7 %). 2+ 2+ 2+ 2+ + + 3+ Було встановлено, що катіон, що вибирається з Mg , Ca , Zn , Mn , K , Na або Al , застосовний для пригнічення утворення продукту окислування, що є агоністами рецептора GCC поліпептидів під час збереження. Також було встановлено, що просторово утруднений 11 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 первинний амін застосовний для пригнічення утворення адукту формальдегіду і імінів ("продукту приєднання формальдегіду до імінів"), що є агоністами рецептора GC-C поліпептидів під час збереження. Тому композиції, що є агоністами рецептора GC-C поліпептидів, що включають 2+ 2+ 2+ 2+ + + 3+ катіон, що вибирається з Mg , Ca , Zn , Mn , K , Na або Al , наприклад, двовалентний 2+ 2+ 2+ катіон, що вибирається з Zn , Mg і Ca , і/або просторово утруднений первинний амін, такий як амінокислота, мають термін збереження (обумовлений за допомогою хроматографії по ступеню чистоти і/або за допомогою вагового аналізу), достатній для виробництва, збереження і розподілу лікарського засобу. Крім того, хоча присутність просторово утрудненого первинного аміну може збільшити утворення продукту гідролізу ланаклотиду під час зберігання, комбінація просторово утрудненого первинного аміну і катіона, наприклад, але без обмеження, комбінація 2+ лейцину і Ca , пригнічує утворення продукту гідролізу, що являється агоністом рецептора GC-C поліпептиду, а також продукту окислування, що виявляється агоністом рецептора GC-C поліпептиду під час зберігання, приводячи до навіть більшої загальної стійкості, що визначається за допомогою вагового аналізу або за допомогою хроматографії по ступеню чистоти. В подальшому варіанті здійснення фармацевтична композиція, крім того, включає фармацевтично прийнятну зв'язувальну речовину або добавку, і/або фармацевтично прийнятну речовину, що сприяє ковзанню, змащувальну речовину або добавку, що виконує функцію як речовини, що сприяє ковзанню, так і речовини, що змащує, і/або антиоксидант. Придатні фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом будуть, як правило, включати кількість активної сполуки(к) разом з фармацевтично прийнятним розріджувачем або формотворним засобом, таким як стерильний водний розчин, для надання діапазону кінцевої концентрації, в залежності від наміченого застосування. Методи готування в цілому добре th відомі в даній галузі техніки, як проілюстровано в Rеміngtоn's Pharmaceutical Sciences (18 Edition, Mack Publishing Company, 1995). Для лікування шлунково-кишкових розладів описувані тут пептиди переважно вводять перорально, наприклад, у вигляді таблетки, капсули, саше, що містить заздалегідь задану кількість гранул активного інгредієнта, гелю, пасти, сиропу, болюса, електуарію, суспензії, порошку, ліофілізованого порошку, гранул, у вигляді розчину або суспензії у водному розчині або неводному розчині; у вигляді рідкої емульсії типу "олія у воді" або рідкої емульсії типу "вода в олії", через посередництво ліпосомного препарату (див., наприклад, EP 736299) або в деякій іншій формі. Призначувані перорально композиції можуть включати зв'язувальні речовини, змащувальні речовини, інертні розріджувачі, змащувальні, поверхнево-активні або диспергуючі речовини, коригенти і гігроскопічні речовини. Призначувані перорально препарати, такі як таблетки, можуть необов'язково мати покриття або насічку, і їх можна скласти для забезпечення тривалого, уповільненого або контрольованого вивільнення активного інгредієнта, що міститься в них. Пептиди можна вводити разом з іншими агентами, використовуваними для лікування шлунково-кишкових розладів, що включають, але без обмеження, описувані тут агенти. В іншому аспекті придатні фармацевтичні композиції можуть включати один або більше інших терапевтичних засобів. Такі терапевтичні засоби включають, без обмеження, анальгетики; антисекреторні засоби, що включають інгібітори протонного насоса, антагоністи кислотного насоса, антагоністи рецепторів H2; інгібітори PDE5; агоністи GABA-B; речовини, що посилюють екскрецію жовчної кислоти; прокінетики і засоби, що стимулюють випорожнення кишечнику; антидепресанти; антибіотики; протиблювотні засоби і засоби для захисту слизової оболонки. Способи лікування У деяких варіантах здійснення за даним винаходом надається спосіб лікування шлунковокишкових розладів. У деяких варіантах здійснення шлунково-кишковим розладом є розлад діяльності верхніх відділів ШКТ. В подальшому варіанті здійснення розладом є GP, непрохідність кишечника після операції на шлунку, порушення функції стравоходу, функціональне гастродуоденальне порушення, шлунково-стравохідний рефлюкс (GERD), глютенова хвороба, запалення слизової оболонки або виразка дванадцятипалої кишки або шлунка. У деяких варіантах здійснення шлунково-кишковим розладом є GP. У подальших варіантах здійснення GP є ідіопатичним GP, GP, причиною якого є цукровий діабет, або GP після хірургічного втручання. У деяких варіантах здійснення шлунково-кишковим розладом є непрохідність кишечника після операції на шлунку. У деяких варіантах здійснення шлунково-кишковим розладом є порушення функції стравоходу. 12 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення порушенням функції стравоходу є функціональна печія, функціональний біль у грудній клітці передбачуваного стравохідного походження, функціональна дисфагія або істеричний комок. У деяких варіантах здійснення шлунково-кишковим розладом є функціональне гастродуоденальне порушення. У деяких варіантах здійснення функціональним гастродуоденальним порушенням є FD, розлад у вигляді відрижки, розлад у вигляді нудоти або блювоти або синдром румінації. В подальшому варіанті здійснення функціональним гастродуоденальним порушенням є FD. У деяких варіантах здійснення FD є дистрес-синдром або епігастральний больовий синдром, що виникають після прийому їжі. У деяких варіантах здійснення розладом у вигляді відрижки є аерофагія або неуточнена надмірно сильна відрижка. У деяких варіантах здійснення розладом у вигляді нудоти або блювоти є хронічна ідіопатична блювота, функціональна блювота або синдром циклічної блювоти. У деяких варіантах здійснення шлунково-кишковим розладом є шлунково-стравохідний рефлюкс (GERD). У деяких варіантах здійснення шлунково-кишковим розладом є глютенова хвороба. У деяких варіантах здійснення шлунково-кишковим розладом є запалення слизової оболонки. У деяких варіантах здійснення шлунково-кишковим розладом є виразка дванадцятипалої кишки або шлунка. Описувані тут пептиди й агоністи можуть використовуватися по окремості або в комбінованій терапії для лікування, попередження або ослаблення вісцерального болю, пов'язаного з розладом діяльності верхніх відділів шлунково-кишкового тракту, або болю, пов'язаного з іншим порушенням, описуваним тут. Описувані тут агоністи рецептора GC-C можуть призначатися в комбінації з іншими агентами. Наприклад, пептиди можуть призначатися разом з анальгезуючим пептидом або сполукою. Анальгезуючий пептид або сполука можуть бути ковалентно приєднані до описуваного тут пептиду, або він може бути окремим агентом, що призначають разом або послідовно з описуваним тут пептидом при комбінованій терапії. Описувані тут агоністи рецептора GC-C можуть також призначатися в комбінації з іншими агентами, використовуваними для лікування розладів діяльності верхніх відділів ШКТ, що включають антидепресанти, засоби, що стимулюють випорожнення кишечника або прокінетики, протиблювотні засоби, антибіотики, інгібітори протонного насоса, блокатори продукції кислоти в шлунку (наприклад, антагоністи рецепторів гістаміну Н2), антагоністи кислотного насоса, інгібітори PDE5, агоністи GABA-B, речовини, що підсилюють екскрецію жовчної кислоти, і засоби для захисту слизової оболонки. У деяких варіантах здійснення застосовні анальгетики, що можуть використовуватися разом з описуваними тут пептидами, включають блокатори Ca каналів (наприклад, зиконотид), антагоністи рецепторів 5HТ (наприклад, антагоністи рецепторів 5HT3, 5HT4 і 5HT1), агоністи 5HT4 (наприклад, тегасерод (Zelnorm)), мозаприд, метоклопрамід, закоприд, цизаприд, рензаприд, похідні бензімідазолу, такі як BIMU 1 і BIMU 8, і лірексаприд), агоністи 5HT1 (наприклад, суматриптан і буспірон), агоністи опіоїдних рецепторів (наприклад, лоперамід, федотозин, пентапептид енкефалін, морфін, дифенілоксилат, фракефамід, тримебутин і фентаніл), агоністи рецепторів CCK (наприклад, локсиглумід і декслоксиглумід), антагоністи рецепторів NK1 (наприклад, апрепітант, вофопітант, езлопітант, R-673 (Hoffmann-La Roche Ltd), SR-48968 і SR-14033 (Sanofi Synthelabo), CP-122721 (Pfizer, Inc.), GW679769 (Glaxo Smith Kline) і TAK-637 (Takeda/Abbot)), агоністи рецепторів NK2 (наприклад, непадутант, саредутант, GW597599 (Glaxo Smith Kline), SR-144190 (Sanofi-Synthelabo) і UK-290795 (Pfizer Inc)), агоністи рецепторів NK3 (наприклад, осанетант (SR-142801; Sanofi-Synthelabo), SR-241586 і талнетант), інгібітори зворотного захоплення норадреналіну-серотоніну (NSRI) (наприклад, мілнаципран), агоністи рецепторів ванілоїдів і канабаноїдів, сіалорфін і споріднені до сіалорфіну пептиди. У літературі описані анальгетики різних класів. У деяких варіантах здійснення один або більше інших терапевтичних засобів може використовуватися в комбінації з пептидами, що описуються тут. Такі засоби включають антидепресанти, засоби, що стимулюють випорожнення кишечника або прокінетики, протиблювотні засоби, антибіотики, інгібітори протонного насоса, блокатори продукції кислоти в шлунку (наприклад, антагоністи рецепторів гістаміну Н2), антагоністи кислотного насоса, інгібітори PDE5, агоністи GABA-B, речовини, що посилюють екскрецію жовчної кислоти, і засоби для захисту слизової оболонки. Приклади антидепресантів включають, без обмеження, трициклічні антидепресанти, такі як 13 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амітриптилін (Elavil), дезипрамін (Norpramin), іміпрамін (Tofranil), амоксапін (Asendin), нортриптилін; вибіркові інгібітори повторного захоплення серотоніну (SSRI), такі як пароксетин (Paxil), флуоксетин (Prozac), сертралін (Zoloft) і цитралопрам (Celexa); і інші, такі як доксепін (Sinequan) і тразодон (Desyrel). Приклади засобів, що стимулюють випорожнення кишечника, і прокінетиків включають, без обмеження, ітоприд, октреотид, бетанехол, метоклопрамід (Reglan), домперидон (Motilium), еритроміцин (і його похідні) і цизаприд (Propulsid). Приклад протиблювотних засобів включає, без обмеження, прохлорперазин. Приклади антибіотиків, які можуть використовуватися, включають ті, які можуть використовуватися для лікування Heliobacter pylori інфекцій, такі як амоксицилін, тетрациклін, метронідазол або кларитроміцин. Інші антибіотики, такі як еритроміцин і його похідні, можуть також використовуватися в комбінації з пептидами, що описуються тут. Приклади інгібіторів протонного насоса включають, без обмеження, омепразол (Prilosec), езомепразол (Nexium), лансопразол (Prevacid), пантопразол (Protonix) і рабепразол (Aciphex). Приклади блокаторів рецепторів H2 включають, без обмеження, циметидин, ранітидин, фамотидин і нізатидин. Приклади антагоністів кислотного насоса включають, без обмеження, ревапразан, CS-S26 (J. Pharmacol. Exp. Ther. (2007) 323: 308-317), PF-03716556 (J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009) 328(2): 671-679) і YH1885 (Drug Metab. Dispos. (2001) 29(1): 54-59). Приклади інгібіторів PDE5 включають, без обмеження, аванафіл, лоденафіл, міроденафіл, синденафілу цитрат, тадалафіл, варденафіл і уденафіл. Агоністи GABA-B включають, без обмеження, баклофен і XP19986 (CAS реєстраційний № 847353-30-4). Приклади речовин, що посилюють екскрецію жовчної кислоти, включають, без обмеження, GT102-279, холестирамін, колесевелам, колесевеламу гідрохлорид, урсодезоксихолієву кислоту, колестипол, колестилан, севеламер, полідіаліламін, зшитий з епіхлоргідрином, діалкіламіноалкільні похідні зшитого декстрану і N-(циклоалкіл)алкіламіни. Приклади засобів для захисту слизової оболонки включають, без обмеження, сукральфат (Carafate), тепренон, полапрецинк, цетраксат і вісмуту субсаліцилат. Комбінованої терапії можна досягнути за допомогою призначення двох або більше агентів, наприклад, описуваного тут агоніста рецептора GC-C і іншого терапевтичного пептиду або сполуки, кожний з яких складають і призначають по окремості, або за допомогою призначення двох або більше агентів в одному препараті. Комбінована терапія також охоплює інші комбінації. Наприклад, два агенти можуть бути складені разом і призначатися спільно з окремим препаратом, що містить третій агент. Хоч два або більше агентів при комбінованій терапії можуть призначатися одночасно, це може і не бути так. Наприклад, призначення першого агента (або комбінації агентів) може передувати призначенню другого агента (або комбінації агентів) на хвилини, години, дні або тижні. Таким чином, два або більше агентів можуть призначатися з хвилинними інтервалами один від одного, або з 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18 або 24годинними інтервалами один від одного, або інтервалами, що складають 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 днів один від одного, і з 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10-тижневими інтервалами один від одного. У деяких випадках можливі навіть більш довгі інтервали. Хоч в багатьох випадках бажано, щоб два або більше агентів, що використовуються в комбінованій терапії, знаходилися в організмі пацієнта в один і той же час, це може і не бути так. Доза Діапазон доз для дорослих людей може в більшості випадків складати від 5 мкг до 100 мг/день при пероральному призначенні пептидного агоніста GC-C, що описується тут. Таблетки, капсули або інші форми представлення, що надаються в дискретних одиницях, можуть з метою зручності містити кількість сполуки, що описується тут, яка є ефективною в такій дозі, або вони можуть призначатися у вигляді їх множини, наприклад, множини одиниць, що містять від 25 мкг до 2 мг або приблизно від 100 мкг до 1 мг. Визначення точної кількості сполуки, що прописується пацієнту, буде обов'язком лікуючого лікаря. Однак доза, що використовується, буде залежати від ряду чинників, що включають вік і стать пацієнта, конкретне порушення, що піддається лікуванню, і його тяжкість. У різних варіантах здійснення дозовану одиницю призначають разом з їжею в будь-який час дня, без їжі в будь-який час дня, з їжею після утримання від їжі протягом ночі (наприклад, разом з сніданком), після легкої закуски з низьким вмістом жиру у час, коли час лягати спати. В одному конкретному варіанті здійснення дозовану одиницю призначають до або після вживання їжі (наприклад, прийому їжі). У подальшому варіанті здійснення дозовану одиницю призначають приблизно за 15 хвилин - 1 годину до споживання їжі. У різних варіантах здійснення дозовану одиницю призначають один раз на день, два рази на день, три рази на день, чотири рази на день, п'ять разів на день або шість разів на день. У певних варіантах здійснення дозована 14 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 35 одиниця і добова дози еквівалентні. У варіантах здійснення даного винаходу, що стосуються комбінованої терапії точна кількість кожного з двох або більше активних інгредієнтів в дозованій одиниці буде залежати від необхідної дози кожної сполуки. Тому корисним може бути створення дозованої одиниці, яка буде, при призначенні відповідно до конкретної схеми введення доз (наприклад, схемою введення доз, в якій задане певне число одиниць і конкретне хронометрування введення), доставляти дозу кожної сполуки, що дорівнює дозі, яка призначалася б у разі лікування пацієнта лише однією сполукою. В інших випадках можливо, бажаним буде створення дозованої одиниці, яка буде доставляти дозу однієї або більше сполук, яка менше дози, яка призначалася б у разі лікування пацієнта лише однією сполукою. Нарешті, можливо, бажаним буде створення дозованої одиниці, яка буде доставляти дозу однієї або більше сполук, яка перевищує дозу, яка призначалася б у разі лікування пацієнта лише однією сполукою. Фармацевтична композиція може включати додаткові інгредієнти, що включають, але без обмеження, активні інгредієнти і формоутворюючі засоби, що описуються тут. У певних варіантах здійснення один або більше терапевтичних засобів дозованої одиниці може знаходитися в препараті з тривалим або контрольованим вивільненням, а додаткові терапевтичні засоби можуть не знаходитися в препараті з тривалим вивільненням. Наприклад, пептид або агоніст, що описується тут, може знаходитися в препараті з контрольованим вивільненням або в препараті з тривалим вивільненням в тій же дозованій одиниці, що і інший агент, який може знаходитися або може не знаходитися в препараті або з контрольованим вивільненням або з тривалим вивільненням. Таким чином, в певних варіантах здійснення бажаним може бути забезпечення негайного вивільнення одного або більше агентів, що описуються тут, і контрольоване вивільнення одного або більше інших агентів. Даний винахід був описаний з посиланням на деякі, наведені як приклади варіанти його здійснення. Однак кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям буде видно з всією очевидністю, що можливе втілення за даним винаходом в конкретних формах, що відрізняються від форм, наведених як приклади варіантів здійснення, описані вище. Таке втілення можливе, не виходячи за межі суті за даним винаходом. Наведені як приклади варіанти здійснення є тільки ілюстративними і не повинні вважатися такими, що обмежують будь-яким чином. Об'єм за даним винаходом визначається прикладеною формулою винаходу і її еквівалентами, а не попереднім описом. ПРИКЛАДИ GC-C пептиди, що є агоністами, або їх фармацевтично прийнятні солі, що описуються тут, були приготовані за допомогою хімічного твердофазного синтезу і природного укладання (окислення киснем повітря) American Peptide Company (Sunnyvale, CA). Пептиди і їх послідовності представлені нижче (де амінокислотна послідовність являє собою стандартний однобуквенний код, а "pS" означає фосфосерин): Назва пептиду Пептид 1 Дефосфо-пептид 1 Пептид 2 Дефосфо-пептид 2 Пептид 3 Пептид 4 Пептид 5 Пептид 6 40 45 50 Амінокислотна послідовність ССрSLCCNPACTGCY СCSLCCNPACTGCY ССрSLCCNPACTGC СCSLCCNPACTGC CCELCCNPACTGCY CCEFCCNPACTGCY DDCCpSLCCNPACTGCY DDCCpSYCCNPACTGCY Приклад 1: Ефекти лужної і кислих фосфатаз на субстрати, що є пептидами Для реакцій з використанням лужної фосфатази вихідні розчини пептидів готували в концентрації 1 мг/мл в 0,1 M Tris-HCl pH 8, і їх зберігали при -20 °C до проведення аналізів. Для реакцій з використанням кислих фосфатаз вихідні розчини пептидів готували в концентрації 1 мг/мл в 50 мМ фосфату натрію pH 6, і їх зберігали при -20 °C до проведення аналізів. Реакція з використанням лужної фосфатази Лужна фосфатаза кишечника теляти (CIP) була отримана від New England BioLabs, Ipswich, MA, каталожний № M0290S. Реакційний розчин з CIP готували за допомогою розведення буфером (50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl pH 8, 1 мМ MgCl2, 50 % гліцерину) до 0,5 одиниць/мкл. Реакційні розчини з лужною фосфатазою складали в загальних об'ємах = 20 мкл, що містять: 2 мкл 10X буфера для CIP (1M NaCl, 500 мМ Tris-HCl pH 8, 100 mM MgCl2) 2 мкл вихідного розчину пептиду (1 мг/мл) 15 UA 114274 C2 5 10 15 20 25 30 12 мкл H2О 4 мкл лужної фосфатази (0, 0,5 або 2 одиниці) Реакційні розчини обережно змішували і інкубували протягом 90 хвилин при 37 °C. Ці реакційні розчини зберігали при -20 °C до аналізу. Для аналізу реакційних розчинів 7,5 мкл обробленого CIP пептиду розбавляли до 50 мкл з використанням 0,1 % мурашиної кислоти у воді до кінцевої концентрації, що дорівнює 10 мкМ. Кінцевий розчин в об'ємі 20 мкл потім аналізували з допомогою LCMS (рідинної хроматомас-спектрометрії) з використанням умов, представлених в таблиці 1 нижче. Складали контрольні реакції для ферментативної активності, що містять 10 мМ пнітрофенілфосфат замість пептиду. Після інкубації реакції розбавляли з використанням 0,1 мл 100 мМ боратного буфера pH 9 і зчитували оптичну густину при 405 нм для контролювання появи п-нітрофенолу. Реакції з використанням кислих фосфатаз Кисла фосфатаза картоплі (PoAP) була отримана від Sigma, St. Louis, MS., каталожний № P1146, а кисла фосфатаза передміхурової залози людини (HuPrAP) була отримана від MP Biochemicals, Solon, OH, каталожний № 153872. Кислі фосфатази розводили із забезпеченням розчину, що містить 0,5 одиниць AP/мкл, використовуючи 50 мМ ацетат натрію pH 5, 0,2 мМ MgCl2. Реакційні розчини з кислими фосфатазами складали в загальних об'ємах = 20 мкл, що містять: 2 мкл 10X буфера для кислої фосфатази (500 мМ ацетат натрію pH 5,2, 2 мМ MgCl 2) 2 мкл вихідного розчину пептиду (1 мг/мл) 12 мкл H2О 4 мкл кислої фосфатази (0,5 або 2 одиниці) Реакційні розчини обережно змішували і інкубували протягом 90 хвилин при 37 °C. Реакційні розчини зберігали при -20 °C для аналізу пізніше. Для аналізу 7,5 мкл реакцій з кислою фосфатазою розбавляли до 50 мкл з використанням 0,1 % мурашиної кислоти у воді до кінцевої концентрації, що дорівнює 10 мкМ. Кінцеві реакції в об'ємі 20 мкл потім аналізували з допомогою LCMS з використанням умов, представлених в таблиці 1 нижче. Складали контрольні реакції для ферментативної активності з розбавленням до 10 мМ пнітрофенілфосфату замість пептиду. Після інкубації реакції розбавляли з використанням 0,1 мл 100 мМ боратного буфера pH 9 і зчитували оптичну густину при 405 нм для контролювання появи п-нітрофенолу. Таблиця 1 Аналіз за допомогою LCMS MS: Тип іонів: Діапазон сканування: HPLC: Колонка: Швидкість потоку: Температура колонки: Температура автодозатора: Об'єм ін'єкування: Рухомі фази: Градієнт Thermo Scientific LTQ Orbitrap Discovery електророзпилювання позитивно заряджених іонів (ESI*) 200–2000 маса/заряд Waters Acquity UPLC Thermo Hypersil Gold aQ, 2,1×50 мм, 1,9 мкм 400 мкл/хв. 40C 4C 20 мкл A=0,1 % мурашиної кислоти в H2О B=0,1 % мурашиної кислоти в суміші 85:15 (в об'ємному відношенні) ацетонітрил:метанол Час (хв.) %А %В 0 98 2 2,4 98 2 25,2 20 80 26,2 20 80 27,2 10 90 30,2 98 2 35 98 2 16 UA 114274 C2 5 10 Таблиці 2 і 3 показують, що у використовуваних умовах 0,5 одиниць лужної фосфатази кишечника для аналізу теляти (pH 8) і 0,5 одиниць або кислої фосфатази картоплі, або кислої фосфатази передміхурової залози людини (pH 5) ефективно гідролізували п-нітрофенілфосфат. Чутливість пептиду 1 і пептиду 2 до обробки фосфатазами оцінювали за допомогою аналізу продуктів реакції з допомогою LC-MS. Таблиці 2 і 3 показують, що при pH 8 лужна фосфатаза кишечника теляти ефективно дефосфорилювала пептид 1 і пептид 2. У відмінність від лужної фосфатази, кислі фосфатази картоплі і передміхурової залози людини були дуже неефективними в дефосфорилюванні пептиду 1 в умовах, в яких вони ефективно гідролізували п-нітрофенілфосфат (таблиця 2). Кисла фосфатаза передміхурової залози людини була також дуже неефективною в дефосфорилюванні пептиду 2 (таблиця 3). Як окремий контроль, пептид 3 обробляли і не обробляли лужною фосфатазою кишечника теляти, і результуючі реакції аналізували з допомогою LC-MS. Обробка CIP не впливала на пептид 3 (не представлені дані). Таблиця 2 Дефосфорилування пептиду 1 Субстрат п-нітрофенілфосфат Той, що Дефосфоризалишається (%) лований (%) Лужна фосфатаза рН 8 0 100 Кисла фосфатаза 0 100 картоплі рН 5 Кисла фосфатаза передміхурової залози 0 100 людини рН 5 Пептид 1 Той, що Дефосфоризалишається (%) лований (%) 0 100 77,8 22,1 93,8 6,2 15 Таблиця 3 Дефосфорилування пептиду 2 Субстрат п-нітрофенілфосфат Той, що Дефосфоризалишається (%) лований (%) Лужна фосфатаза рН 8 0 100 Кисла фосфатаза передміхурової залози 0 100 людини рН 5 20 25 30 35 Пептид 2 Той, що Дефосфоризалишається (%) лований (%) 0 100 95,9 4,1 Приклад 2: Акумулювання cGMP в клітинах T84, що використовується для аналізу активності GC-C. 5 Для аналізу cGMP 4,5×10 клітин T84/мл вирощували протягом ночі в 24-ямкових планшетах для культивування тканин. На наступний день клітини T84 промивали двічі 1 мл DMEM+20 мМ MES (pH 5) або DMEM+50 мМ бікарбонат натрію (pH 8), при цьому ці буфери не містили сироватку. Після другого промивання клітини інкубували з 450 мкл 1 мМ ізобутилметилксантину (IBMX) в буфері або з pH 5, або з pH 8 протягом 10 хвилин при 37 °C для інгібування будь-якої фосфодіестеразної активності. Потім пептиди розбавляли буфером або з pH 5, або з pH 8 до 10x концентрації. Розчин пептиду в об'ємі, що дорівнює 50 мкл, розбавляли до кінцевого об'єму, що дорівнює 500 мкл, суспензією клітин T84, доводячи концентрацію кожного пептиду до 1x. Аналіз кривих, що визначаються одинадцятьма точками, був виконаний для кожного пептиду, з використанням кінцевих концентрацій пептидів, що досліджуються в кожному аналізі, в нМ: 10000, 3000, 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1. Не було контролю для пептидів, що використовується для визначення ендогенних рівнів cGMP. Пептиди інкубували протягом 30 хвилин при 37 °C. Через 30 хвилин видаляли супернатанти, і клітини лізували з використанням 0,1 M HCl. Клітини лізували протягом 30 хвилин на льоду. Через 30 хвилин лізати відсмоктували піпеткою, вміщували в 96-ямковий планшет для HPLC і центрифугували при 1000хg протягом 10 хвилин для видалення будь-якого клітинного дебрису. Супернатанти, отримані в результаті попереднього центрифугування, видаляли і вміщували в новий 96-ямковий планшет для HPLC. Зразки розбавляли рівним 17 UA 114274 C2 5 об'ємом 1 M ацетату амонію (pH 7) для нейтралізації зразків для кращої хроматографії. Для побудови калібровочної кривої 2x cGMP готували в 0,1 M HC1 і потім розбавляли рівним об'ємом 1 M ацетату амонію, з отриманням наступних кінцевих концентрацій в нМ: 1024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1. Концентрації cGMP визначали в кожному зразку, використовуючи представлені в таблиці 4 умови LC-MS і певну розрахунково-калібровочну криву. Значення EC50 розраховували на основі графіків залежності відповіді від концентрації, створених за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism. Таблиця 4 Умови LC-MS MS: Тип іонів Тип сканування: Сполука: cGMP HPLC: Колонка: Швидкість потоку: Температура колонки: Температура автодозатора: Об'єм ін'єкування: Рухомі фази: Градієнт: Thermo Quantum ESI* MRM Час витримування (хв.) 346