Композиція, що містить антитіло, яке зв’язується з доменом ii her2, і його кислі варіанти

Реферат: Винахід належить до фармацевтики та медицини і стосується композиції, що містить НЕR2антитіло головного типу, яке зв'язується з доменом II HER2, і яке містить амінокислотні UA 104585 C2 (12) UA 104585 C2 послідовності варіабельної області легкого ланцюга і варіабельної області важкого ланцюга SEQ ID NО: 3 і 4, і його кислі варіанти, що включають варіант із відновленим дисульфідним зв'язком і невідновлюваний варіант. Також описаний спосіб одержання такої композиції та фармацевтичний склад, що її містить. UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Споріднені заявки Дана заявка претендує на пріоритет попередньої заявки на видачу патенту США № 61/024825, поданої 30 січня 2008, опис якої включений у дану заявку у вигляді посилання в повному обсязі для всіх цілей. Галузь винаходу Даний винахід стосується композиції, що містить HER2-антитіло головного типу, яке зв'язується з доменом II HER2, і його кислих варіантів. Винахід також стосується фармацевтичних препаратів, що містять композицію, і терапевтичних застосувань композиції. Рівень техніки Представники сімейства рецепторних тирозинкіназ HER є важливими медіаторами клітинного росту, диференціювання і життєздатності. Сімейство рецепторів включає чотири окремих представники, у тому числі рецептор епідермального фактору росту (EGFR, ErbB1 або HER1), HER2 (ErbB2 або p185neu), HER3 (ErbB3) і HER4 (ErbB4 або tyro2). EGFR, що кодується геном erbB1, причинно залучений до розвитку злоякісних новоутворень у людини. Зокрема, підвищену експресію EGFR спостерігали в злоякісній пухлині молочної залози, сечового міхура, легені, голови, шиї і шлунка, а також при гліобластомах. Підвищена експресія рецептора EGFR часто асоційована з підвищеною продукцією ліганду EGFR, що трансформує фактор росту альфа (TGF-α), деякими пухлинними клітинами, що призводить до активації рецептора за допомогою автокринного шляху стимуляції. Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994). Моноклональні антитіла, спрямовані проти EGFR або його лігандів, TGF-α і EGF, оцінювали як терапевтичні засоби для лікування таких злоякісних захворювань. Див., наприклад Baselga and Mendelsohn, вище; Masui et al. Cancer Research 44: 1002-1007 (1984); і Wu et al. J. Clin. Invest. 95: 1897-1905 (1995). Другий представник сімейства HER, p185neu, спочатку ідентифікували як продукт гена, що трансформує, із нейробластом хімічно оброблених щурів. Активована форма протоонкогена neu виникає внаслідок точкової мутації (валін на глутамінову кислоту) у трансмембранній ділянці білка, що кодується. Ампліфікацію гомолога neu людини спостерігали при ракові молочної залози та яєчника, що корелювало з поганим прогнозом (Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 707-712 (1989); і патент США No. 4968603). До цього часу не повідомлялося про точкову мутацію, аналогічну до точкової мутації в протоонкогені neu, у разі пухлин людини. Надекспресію HER2 (часто, але не завжди внаслідок ампліфікації гена) також спостерігали в інших карциномах, включаючи карциноми шлунка, ендометрію, слинної залози, легені, нирки, ободової кишки, щитовидної залози, підшлункової залози і сечового міхура. Див. нарівні з іншими публікаціями King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet: 1:765-767 (1986); Fukushige et al., Mol Cell Biol, 6:955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol Oncol, 38:364 (1990); Werners et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al, Mol Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland et al. Br.J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams et al. Pathobiology 59:4652 (1991); і McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990). HER2 може бути надекспресований у злоякісній пухлині простати (Gu et al., Cancer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28: 827-33 (1997); Ross et al., Cancer 79: 2162-70 (1997); і Sadasivan et al., J. Urol. 150: 126-31 (1993)). Описані антитіла, спрямовані проти білкових продуктів p185neu щура і HER2 людини. Drebin ізі співавторами одержали антитіла проти продукту гена neu щура, p185neu. Див., наприклад, Drebin et al., Cell 41: 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991); і WO94/22478. У публікації Drebin et al. Oncogene 2: 273-277 (1988) повідомляється, що суміші антитіл, що взаємодіють із двома різними ділянками p185neu, призводять до синергетичного протипухлинного впливу на neu-трансформовані клітини NIH-3T3, імплантовані мишам nude. Див. також патент США № 5824311, опублікований 20 жовтня 1998. У публікації Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) описане створення панелі антитіл до HER2, які були охарактеризовані з використанням лінії клітин пухлини молочної залози людини SK-BR-3. Відносну проліферацію клітин SK-BR-3 після впливу антитіл визначали забарвленням моношару кристалічним фіолетовим через 72 години. За допомогою такого аналізу максимальне інгібування одержували з використанням антитіла, названого 4D5, яке інгібувало проліферацію клітин на 56 %. Інші антитіла в панелі в даному аналізі знижували проліферацію клітин у меншому ступені. Крім того виявлено, що антитіло 4D5 сенсибілізувало лінії пухлинних клітин молочної залози, надекспресуючих HER2, до цитотоксичної дії TNF-α. Див. також патент США № 5677171, опублікований 14 жовтня 1997. HER2-антитіла, що обговорюються в роботі Hudziak зі співавторами, додатково охарактеризовані в Fendly et al. 1 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al. In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3): 117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al. Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al. J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996); і Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997). Рекомбінантний гуманізований варіант мишачого HER2-антитіла 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, трастузумаб або HERCEPTIN®; патент США № 5821337) є клінічно активним у пацієнтів з метастатичними злоякісними пухлинам молочної залози, надекспресуючими HER2, які одержували екстенсивну попередню протипухлинну терапію (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)). Трастузумаб був дозволений для реалізації Управлінням із контролю за продуктами харчування і лікарськими засобами 25 вересня 1998 для лікування пацієнтів із метастатичним раком молочної залози, пухлини в яких надекспресують білок HER2. Інші HER2-антитіла з різними властивостями описані в Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47:933937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk etal. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver et.al., Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga etal. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth etal. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); U.S. Patent No. 5,783,186; і Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997); патент США № 5783186; і Klapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997). Скринінг гомології призвів до ідентифікації двох інших представників сімейства рецепторів HER; HER3 (патенти США № 5183884 і 5480968, а також Kraus et al., PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989)) і HER4 (заявка на видачу патенту EP № 599274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); і Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993)). Обидва зазначених рецептора мають підвищену експресію, принаймні, у деяких лініях клітин раку молочної залози. Рецептори HER звичайно виявляють у клітинах у різних поєднаннях, і вважається, що гетеродимеризація збільшує різноманітність клітинних відповідей на безліч лігандів HER (Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR зв'язується шістьма різними лігандами; епідермальним фактором росту (EGF), трансформуючим фактором росту альфа (TGF-α), амфірегуліном, епідермальним фактором росту (HB-EGF), що зв'язує гепарин, бетацелюліном і епірегуліном (Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994)). Сімейство білків херегулінів, що утворюються внаслідок альтернативного сплайсингу одного гена, є лігандами для HER3 і HER4. Сімейство херегулінів включає альфа-, бета- і гамма-херегуліни (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); патент США № 5641869; і Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)); фактори диференціювання neu (NDF), гліальні фактори росту (GGF); активність, що індукує рецептор ацетилхоліну (ARIA); і фактор, одержаний із сенсорних нейронів і мотонейронів (SMDF). Огляд див. у Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec. and Cell. Neurosci. 7: 247-262 (1996) і Lee et al. Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995). Недавно ідентифіковані три додаткових ліганди HER; нейрегулін-2 (NRG-2), який, як повідомляється, зв'язує або HER3, або HER4 (Chang et al. Nature 387: 509-512 (1997); і Carraway et al. Nature 387: 512-516 (1997)); нейрегулін-3, який зв'язує HER4 (Zhang et al. PNAS (USA) 94(18): 9562-7 (1997)); і нейрегулін-4, який зв'язує HER4 (Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)). HB-EGF, бетацелюлін і епірегулін також зв'язуються з HER4. Хоча EGF і TGFα не зв'язують HER2, EGF стимулює EGFR і HER2 до утворення гетеродимеру, який активує EGFR і призводить до трансфосфорилування HER2 у гетеродимері. Димеризація і/або трансфосфорилування, мабуть, активують тирозинкіназу HER2. Див. Earp et al., вище. Подібно до цього, коли HER3 коекспресується з HER2, утворюється активний комплекс передачі сигналу, і антитіла, спрямовані проти HER2, здатні руйнувати такий комплекс (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). Крім того, афінність HER3 стосовно херегуліну (HRG) підвищується до стану більш високої афінності у випадку коекспресії з HER2. Див. також, Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995); і Lewis et al., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996) стосовно комплексу білків HER2-HER3. HER4, подібно до HER3, утворює активний комплекс передачі сигналу з HER2 (Carraway and Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)). Щоб цілеспрямовано впливати на шлях передачі сигналу HER, було розроблено rhuMAb 2C4 (пертузумаб), у вигляді гуманізованого антитіла, яке інгібує димеризацію HER2 з іншими рецепторами HER, тим самим інгібуючи кероване лігандом фосфорилування та активацію, а 2 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 також активацію нижче по ходу шляхів RAS і AKT. У фазі I випробувань пертузумабу, у ролі єдиного засобу лікування солідних пухлин, 3 пацієнти з раком яєчника на пізній стадії зазнавали лікування пертузумабом. В одного пацієнта спостерігали тривалу часткову відповідь, і в іншого пацієнта мало місце стабільне захворювання протягом 15 тижнів. Agus et al. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22: 192, Abstract 771 (2003). Композиції варіантів антитіл У патенті № 6339142 описана композиція HER2-антитіл, що містить суміш анти-HER2 антитіла та одного або декількох його кислих варіантів, при цьому кількість кислого варіанту (варіантів) складає менш ніж приблизно 25 %. Трастузумаб є прикладом HER2-антитіла. У стендовій доповіді Reid зі співавторами, представленій на конференції з добре охарактеризованих біотехнологічних фармацевтичних препаратів (Well Characterized Biotech Pharmaceuticals conference) (січень 2003), "Effects of Cell Culture Process Changes on Humanized Antibody Characteristics", описана композиція не маючих назви гуманізованих IgG1-антитіл, гетерогенних на N-кінці внаслідок поєднання сигнального пептиду VHS, N-кінцевого глутаміну і піроглутамінової кислоти в їхньому важкому ланцюгу. У доповіді Harris зі співавторами "The Ideal Chromatographic Antibody Characterization Method", представленій на конференції з одержання антитіл IBC (лютий 2002), повідомляється про приріст VHS на важкому ланцюгу E25, гуманізованого анти-IgE-антитіла. У стендовій доповіді Rouse зі співавторами, представленій на "WCBP Top Down" Glycoprotein Characterization by High Resolution Mass Spectrometry and Its Application to Biopharmaceutical Development" (6-9 січня 2004), описана композиція моноклонального антитіла з N-кінцевою гетерогенністю внаслідок залишків сигнального пептиду -3AHS або -2HS у його легкому ланцюгу. У презентації на конференції IBC (вересень 2000) "Стратегічне використанням досліджень і аналізів сумісності для одержання добре охарактеризованих біологічних препаратів" Jill Porter наводить обговорення форми ZENAPAX™, що пізно елюює, із трьома додатковими амінокислотними залишками в його важкому ланцюгу. У US2006/0018899 описана композиція, що містить антитіло пертузумаб головного типу і варіант із подовженням у вигляді амінокінцевого лідера, а також інші форми варіантів антитіла пертузумабу. Суть винаходу Згідно з першим аспектом винахід стосується композиції, що містить HER2-антитіло головного типу, яке зв'язується з доменом II HER2, і його кислі варіанти, при цьому кислі варіанти включають глікозильований варіант, варіант із відновленим дисульфідним зв'язком або невідновлюваний варіант. Переважно кислими варіантами є глікозильований варіант, дезамінований варіант, варіант із відновленим дисульфідним зв'язком, сіалілований варіант і невідновлюваний варіант. Бажана кількість кислих варіантів складає менше ніж приблизно 25 %. В іншому аспекті винахід стосується композиції, що містить HER2-антитіло головного типу, що включає варіабельні послідовності легкого ланцюга і варіабельні послідовності важкого ланцюга в SEQ ID NO: 3 і 4, відповідно, і кислі варіанти антитіла головного типу, при цьому кислі варіанти включають глікозильований варіант, дезамінований варіант, варіант із відновленим дисульфідним зв'язком, сіалілований варіант і невідновлюваний варіант. Винахід також стосується фармацевтичних композицій, що містять композиції у фармацевтично прийнятному носії. Крім того, винахід стосується способу лікування HER2-позитивної злоякісної пухлини у пацієнта, що включає введення фармацевтичного препарату пацієнта в кількості, ефективній для лікування злоякісної пухлини. Що стосується таких способів, як показано в прикладі, наведеному в даному описі, переважно, щоб антитіло головного типу і кислі варіанти мали по суті одну і ту саму фармакокінетику. В іншому аспекті винахід стосується способу одержання фармацевтичної композиції, що включає: (1) одержання композиції, що містить HER2-антитіло головного типу, яке зв'язується з доменом II HER2, і його кислі варіанти, включаючи глікозильований варіант, варіант із відновленим дисульфідним зв'язком або невідновлюваний варіант, і (2) оцінку кислих варіантів у композиції і підтвердження того, що їхня кількість складає менше ніж приблизно 25 %. В одному варіанті здійснення винаходу кислі варіанти оцінюють способом, вибраним із групи, що складається з іонообмінної хроматографії, при якій композицію обробляють сіалідазою, капілярного електрофорезу у відновлювальних умовах із використанням додецилсульфату натрію (CE-SDS), CE-SDS у не відновлювальних умовах, хроматографії з використанням боронату і картування пептидів. 3 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Стислий опис креслень На фігурі 1 показана схема структури білка HER2 та амінокислотні послідовності доменів I-IV (SEQ ID NO: 19-22, відповідно) його позаклітинного домену. На фігурах 2A і 2B зображено вирівнювання амінокислотних послідовностей варіабельного домену легкого ланцюга (VL) (фіг. 2A) і варіабельного домену важкого ланцюга (VH) (фіг. 2B) мишачого моноклонального антитіла 2C4 (SEQ ID NO: 1 і 2, відповідно); доменів VL і VH варіанту 574 гуманізованого 2C4 (SEQ ID NO: 3 і 4, відповідно) і консенсусних каркасів VL і VH людини (hum κl, підгрупа I легкого ланцюга каппа; humIII, підгрупа III важкого ланцюга) (SEQ ID NO: 5 і 6, відповідно). Зірочками відмічені відмінності між варіантом 574 гуманізованого 2C4 і мишачим моноклональним антитілом 2C4, або між варіантом 574 гуманізованого 2C4 і каркасом людини. Визначальні комплементарність ділянки (CDR) зазначені в квадратних дужках. На фігурах 3A і 3B показані амінокислотні послідовності легкого ланцюга (SEQ ID NO: 15) і важкого ланцюга (SEQ ID NO: 16) пертузумабу. CDR показані жирним шрифтом. Залишок вуглеводу зв'язаний з Asn 299 важкого ланцюга. На фігурах 4A і 4B показані амінокислотні послідовності легкого ланцюга (SEQ ID NO: 17) і важкого ланцюга (SEQ ID NO: 18) пертузумабу, кожна з яких містить інтактну амінокінцеву послідовність сигнального пептиду. На фігурі 5 схематично зображено зв'язування 2C4 із ділянкою зв'язування HER2 у гетеродимері, яке запобігає гетеродимеризації з активованим EGFR або HER3. На фігурі 6 зображений зв'язок HER2/HER3 із шляхами MAPK і Akt. На фігурі 7 показане порівняння активності трастузумабу і пертузумабу. На фігурах 8A і 8B показані амінокислотні послідовності легкого ланцюга (SEQ ID NO: 13) і важкого ланцюга (SEQ ID NO: 14) трастузумабу. На фігурах 9A і 9B зображена послідовність легкого ланцюга варіанту пертузумабу (SEQ ID NO: 23) і послідовність важкого ланцюга варіанту пертузумабу (SEQ ID NO: 24). На фігурі 10 показана схема експерименту з виділення MP (головного піка) і AV (кислих варіантів) при катіонному обміні, культивування клітин, витягання і оцінки ФК (фармакокінетики) та аналітичних випробувань. Свіже середовище = стандартне середовище; використане середовище = стандартне середовище після 12 діб культивування клітин, клітини витягували центрифугуванням. Розчинений кисень, pH та інші параметри не контролювали. На фігурі 11 показана типова катіонообмінна хроматограма (CEX) DIONEX PROPAC™ із прикладу 1. На фігурі 12 показаний аналіз вихідної речовини пертузумабу і фракції CEX. AV = кислий варіант, MP = головний пік і BV = варіант із властивостями основи. На фігурі 13 показана CEX головного піка (MP), введеного в середовище культивування клітин та інкубованого протягом 12 діб. На фігурі 14 описані умови інкубації головного піка. На фігурі 15 узагальнені способи характеристики кислих варіантів. На фігурі 16 показана концентрація пертузумабу в залежності від часу в дослідженнях ФК у прикладі 1. На фігурі 17 показана площа під кривою (AUC) і середні геометричні відношення, одержані в дослідженні ФК у прикладі 1. Детальний опис переважних варіантів I. Визначення Термін "антитіло головного типу" у даному описі стосується структури з амінокислотною послідовністю антитіла в композиції, яка є кількісно переважаючою молекулою антитіла в композиції. Переважно антитілом головного типу є HER2-антитіло, таке як антитіло, яке зв'язується з доменом II HER2, антитіло, яке інгібує димеризацію HER більш ефективне, ніж трастузумаб, і/або антитіло, яке зв'язується з ділянкою зв'язування HER2 у гетеродимері. У переважному варіанті даного винаходу антитілом головного типу є антитіло, що містить амінокислотні послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга і варіабельної ділянки важкого ланцюга SEQ ID NO: 3 і 4 і найбільш переважним є таке, що містить амінокислотні послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга SEQ ID NO: 15 і 16 (пертузумаб). Антитіло з "варіантом амінокислотної послідовності" у даному описі означає антитіло з амінокислотною послідовністю, яка відрізняється від послідовності антитіла головного типу. Звичайно варіанти амінокислотної послідовності будуть мати, принаймні, приблизно 70 % гомологію з антитілом головного типу, і переважно вони будуть, принаймні, приблизно на 80 %, і переважніше, принаймні, приблизно на 90 % гомологічними до антитіла головного типу. Варіанти амінокислотної послідовності мають заміни, делеції і/або додавання в деяких положеннях у межах або поблизу амінокислотної послідовності антитіла головного типу. 4 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Прикладами варіантів амінокислотної послідовності згідно з даним винаходом є кислий варіант (наприклад, дезамінований варіант антитіла), варіант із властивостями основи, антитіло з подовженням у вигляді амінокінцевого лідера (наприклад, VHS-) в одному або двох легких ланцюгах антитіла, антитіло з С-кінцевим залишком лізину в одному або двох важких ланцюгах антитіла, антитіло з одним або декількома окисленими залишками метіоніну і т.д. і включають поєднання змін амінокислотних послідовностей важкого і/або легкого ланцюгів. "Кислий варіант" означає варіант антитіла головного типу, який є більш кислим, ніж антитіло головного типу. Кислий варіант набуває негативний заряд або втрачає позитивний заряд у порівнянні з антитілом головного типу. Такі кислі варіанти можуть бути відділені з використанням методики розділення, такої як іонообмінна хроматографія, яка дозволяє розділяти білки відповідно до заряду. Кислі варіанти антитіла головного типу елююються раніше, ніж головний пік, при розділенні катіонообмінною хроматографією. "Варіант із відновленим дисульфідним зв'язком" має ще один зв'язаний дисульфідним зв'язком цистеїн(цистеїни), хімічно відновлений до форми вільного тіолу. Такий варіант можна спостерігати з використанням заснованої на гідрофобній взаємодії хроматографії або способом розділення за розміром, таким як капілярний електрофорез із додецилсульфатом натрію (CESDS), наприклад, як описано в прикладі 1. В даному описі "невідновлюваний варіант" означає варіант антитіла головного типу, який не може бути хімічно відновлений до важкого і легкого ланцюга обробкою відновником, таким як дитіотреітол. Такі варіанти можна оцінювати за допомогою обробки композиції відновником і оцінки одержаної композиції з використанням методики, яка дозволяє оцінювати розмір білка, такий як капілярний електрофорез із додецилсульфатом натрію (CE-SDS), наприклад, із використанням методики, описаної в прикладі 1 нижче. Антитіло з "варіантом глікозилювання" у даному описі означає антитіло з одним або декількома зв'язаними з ним вуглеводними залишками, які відрізняються від одного або декількох вуглеводних залишків, зв'язаних з антитілом головного типу. Приклади варіантів глікозилювання згідно з винаходом включають антитіло з G1- або G2-олігосахаридною структурою замість G0-олігосахаридної структури, зв'язаної з його Fc-ділянкою, антитіло з одним або двома вуглеводними залишками, зв'язаними з одним або двома легкими ланцюгами, антитіло, що не містить вуглеводу, зв'язаного з одним або двома важкими ланцюгами антитіла, антитіло, яке сіаліловане, і т.д., а також поєднання таких змін глікозилювання. У тому випадку, коли антитіло має Fc-ділянку, олігосахаридна структура, така як структура, показана на фіг. 14 у даному описі, може бути зв'язана з одним або двома важкими ланцюгами антитіла, наприклад за залишком 299. У випадку пертузумабу переважаючою олігосахаридною структурою була структура G0, при цьому інші олігосахаридні структури, такі як G0-F, G-1, Man5, Man6, G1-1, G1(1-6), G1(1-3) і G2 виявлені в менших кількостях у композиції пертузумабу. Якщо не обумовлено особливо "олігосахаридна структура G1" в даному описі включає структури G1(1-6) і G1(1-3). З метою даного опису "сіалілований варіант" означає варіант антитіла головного типу, що містить один або декілька сіалілованих вуглеводних залишків, зв'язаних з одним або двома важкими ланцюгами такого антитіла. Сіалілований варіант можна виявити при оцінці композиції (наприклад, при іонообмінній хроматографії) з обробкою або без обробки сіалідазою, наприклад, як описано в прикладі. "Глікозильований варіант" означає антитіло, з яким був ковалентно зв'язаний цукор, такий як глюкоза. Таке додавання може бути здійснене внаслідок взаємодії глюкози із залишком лізину в білці (наприклад, у середовищі для культивування клітин). Глікозильований варіант може бути ідентифікований в мас-спектрометричному аналізі відновленого антитіла, при якому оцінюють збільшення маси важкого і легкого ланцюгів. Глікозильований варіант також можна кількісно оцінити хроматографією з використанням боронату, пояснення до якої наведені в прикладі 1 нижче. Глікозильований варіант відрізняється від антитіла з варіантом глікозилювання. "Дезаміноване" антитіло являє собою антитіло, в якому один або декілька залишків аспарагіну дериватизовані, наприклад, до аспарагінової кислоти, сукциніміду або ізоаспарагінової кислоти. Прикладом дезамінованого антитіла є варіант пертузумабу, в якому Asn386 і/або Asn-391 в одному або двох важких ланцюгах пертузумабу дезаміновані. "Варіант із подовженням у вигляді амінокінцевого лідера" у даному описі стосується антитіла головного типу з одним або декількома амінокислотними залишками амінокінцевої лідерної послідовності на амінокінці будь-якого одного або декількох важких або легких ланцюгів антитіла. Типове подовження у вигляді амінокінцевого лідера містить або складається з трьох амінокислотних залишків, VHS, присутніх на одному або обох легких ланцюгах варіанту антитіла. 5 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Гомологію" визначають як відсоток залишків у варіанті амінокислотної послідовності, які ідентичні після вирівнювання послідовностей і введення пропусків, якщо це необхідно, щоб добитися максимальної гомології у відсотках. Способи і комп'ютерні програми для вирівнювання добре відомі в даній галузі. Однією з таких комп'ютерних програм є програма "Align 2", розроблена Genentech, Inc., яка була подана разом із документацією для користувача в Бюро охорони авторських прав США, Washington, DC 20559, 10 грудня 1991. З метою даного опису "катіонообмінний аналіз" стосується будь-якого способу, при якому композицію, що містить дві або більше сполук, розділяють на основі відмінностей зарядів, використовуючи катіонообмінник. Катіонообмінник звичайно містить ковалентно зв'язані негативно заряджені групи. Переважно в цьому випадку катіонообмінник є слабким катіонообмінником і/або містить карбоксилатну функціональну групу, наприклад, катіонообмінна колонка PROPAC WCX-10TM, що продається Dionex. "HER-рецептор" є рецепторною тирозиновою протеїнкіназою, яка стосується сімейства HERрецепторів і включає рецептори EGFR, HER2, HER3 і HER4 та інших представників такого сімейства, які будуть ідентифіковані в майбутньому. HER-рецептор як правило може містити позаклітинний домен, який може зв'язувати ліганд HER; ліпофільний трансмембранний домен; консервативний внутрішньоклітинний тирозинкіназний домен; і домен передачі сигналу, що знаходиться на карбоксильному кінці і несе декілька залишків тирозину, які можуть бути фосфорилованими. Переважно HER-рецептор являє собою HER-рецептор людини з нативною послідовністю. Позаклітинний домен HER2 містить чотири домени: домен I (амінокислотні залишки приблизно від 1 до 195), домен II (амінокислотні залишки приблизно від 196 до 319), домен III (амінокислотні залишки приблизно від 320 до 488) і домен IV (амінокислотні залишки приблизно від 489 до 630) (нумерація залишків без сигнального пептиду). Див. Garrett et al. Mol. Cell. 11: 495-505 (2003), Cho et al. Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004) і Plowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1746-1750 (1993). Також див. фіг. 1 у даному описі. Терміни "ErbB1", "HER1", "рецептор епідермального фактору росту" і "EGFR" використовують у даному описі взаємозамінно, і вони стосуються EGFR, який описаний, наприклад, у Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914 (1987), включаючи його мутантні форми, що зустрічаються в природі (наприклад, делеційний мутант EGFR, який описаний у Humphrey et al. PNAS (USA) 87: 4207-4211 (1990)). ErbB1 стосується гена, що кодує білковий продукт EGFR. Вирази "ErbB2" і "HER2" використовують у даному описі взаємозамінно, і вони стосуються білка HER2 людини, описаного наприклад у Semba et al., PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) і Yamamoto et al. Nature 319: 230-234 (1986) (номер доступу в Genebank X03363). Термін "erbB2" стосується гена, що кодує ErbB2 людини, і "neu" стосується гена, що кодує p185neu щура. Переважний HER2 являє собою HER2 людини з нативною послідовністю. "ErbB3" і "HER3" стосуються поліпептиду рецептора, який описаний, наприклад, у патентах США № 5183884 і 5480968, а також у Kraus et al. PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989). Терміни "ErbB4" і "HER4" в даному описі стосуються поліпептиду рецептора, який описаний, наприклад, у заявці на видачу патенту EP № 599274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993); і Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993), включаючи його ізоформи, які описані, наприклад, у WO99/19488, опублікованій 22 квітня 1999. Під "лігандом HER" мають на увазі поліпептид, який зв'язується і/або активує рецептор HER. Ліганд HER, що представляє особливий інтерес згідно з даним винаходом, є лігандом HER людини з нативною послідовністю, таким як епідермальний фактор росту (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247: 7612-7621 (1972)); трансформуючий фактор росту альфа (TGF-α) (Marquardt et al., Science 223: 1079-1082 (1984)); амфірегулін, також відомий як автокринний фактор росту шванноми і кератиноцитів (Shoyab et al. Science 243: 1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348: 257-260 (1990); і Cook et al. Mol. Cell. Biol. 11: 2547-2557 (1991)); бетацелюлін (Shing et al., Science 259: 1604-1607 (1993); і Sasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 1173 (1993)); гепарин-зв'язуючий епідермальний фактор росту (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251: 936939 (1991)); епірегулін (Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270: 7495-7500 (1995); і Komurasaki et al. Oncogene 15: 2841-2848 (1997)); херегулін (див. нижче); нейрегулін-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387: 512-516 (1997)); нейрегулін-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 95629567 (1997)); нейрегулін-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)); і cripto-(CR-1) (Kannan et al. J. Biol. Chem. 272(6): 3330-3335 (1997)). Ліганди HER, які зв'язують EGFR, включають EGF, TGF-α, амфірегулін, бетацелюлін, HB-EGF та епірегулін. Ліганди HER, які зв'язують HER3, включають херегуліни. Ліганди HER, здатні зв'язувати HER4, включають бетацелюлін, епірегулін, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 і херегуліни. 6 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Херегулін" (HRG) при використанні в даному описі стосується поліпептиду, що кодується продуктом гена херегуліну, який описаний у патенті США № 5641869 або в Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993). Приклади херегулінів включають херегулін-α, херегулін-β1, херегулін-β2 і херегулін-β3 (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992) і патент США № 5641869); фактор диференціювання neu (NDF) (Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)); активність, що індукує рецептор ацетилхоліну (ARIA) (Falls et al. Cell 72: 801-815 (1993)); гліальні фактори росту (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)); фактор, одержаний із сенсорних нейронів і мотонейронів (SMDF) (Ho et al. J. Biol. Chem. 270: 14523-14532 (1995)); γ-херегулін (Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)). Термін включає біологічно активні фрагменти і/або варіанти амінокислотної послідовності поліпептиду HRG із нативною послідовністю, такі як його фрагмент EGF-подібного домену (наприклад, HRGβ1177-244).) "Димер HER" у даному описі означає нековалентно зв'язаний димер, що містить, принаймні, два HER-рецептора. Такі комплекси можуть утворюватися, коли на клітину, експресуючу два або більше HER-рецепторів, впливає ліганд HER, і вони можуть бути виділені імунопреципітацією і проаналізовані в SDS-ПААГ, як описано, наприклад, у Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Приклади таких димерів HER включають гетеродимери EGFR-HER2, HER2-HER3 і HER3-HER4. Крім того, димер HER може містити два або більше HER2-рецепторів, об'єднаних з іншим HER-рецептором, таким як HER3, HER4 або EGFR. З димером можуть бути асоційовані інші білки, такі як субодиниця рецептора цитокіну (наприклад gp130). "Ділянка зв'язування у гетеродимері" HER2 стосується ділянки у позаклітинному домені HER2, яка контактує або служить місцем зв'язування з ділянкою у позаклітинному домені EGFR, HER3 або HER4 при утворенні з ними димеру. Ділянка виявлена в домені II HER2. Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004). "Активація HER" або "активація HER2" стосується активації або фосфорилування будь-якого одного або декількох рецепторів HER або рецепторів HER2. Загалом, активація HER призводить до трансдукції сигналу (наприклад, трансдукції сигналу, викликаної внутрішньоклітинним кіназним доменом HER-рецептора, фосфорилуючим залишки тирозину в HER-рецепторі або поліпептиді субстрату). Активація HER може бути опосередкована зв'язуванням ліганду HER із димером HER, що містить рецептор HER, який становить інтерес. Зв'язування ліганду HER із димером HER може активувати кіназний домен одного або декількох HER-рецепторів у димері і тим самим призводити до фосфорилування залишків тирозину в одному або декількох HER-рецепторах і/або до фосфорилування залишків тирозину в додатковому(их) субстратному(их) поліпептиді(дах), такому(их) як внутрішньоклітинні кінази Akt або MAPK. Термін "антитіло" в даному описі використовують у самому широкому значенні, і термін спеціально охоплює інтактні моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, поліспецифічні антитіла (наприклад біспецифічні антитіла), утворені, принаймні, із двох інтактних антитіл, і фрагменти антитіл, за умови, що вони виявляють необхідну біологічну активність. Термін "моноклональне антитіло" у значенні, що використовується в даному описі, стосується антитіла, одержаного з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними і/або зв'язують один і той же епітоп, за винятком можливих варіантів, які можуть виникати під час одержання моноклонального антитіла, таких як варіанти, описані в даній публікації. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які звичайно містять різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло спрямоване проти однієї детермінанти на антигені. Крім своєї специфічності моноклональні антитіла мають перевагу, що полягає в тому, що вони не містять домішок інших імуноглобулінів. Визначення "моноклональне" вказує на природу антитіла, як антитіла, одержаного з по суті гомогенної популяції антитіл, і його не треба розглядати як таке, що вимагає одержання антитіла яким-небудь конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, що застосовуються згідно з даним винаходом, можуть бути одержані способом на основі гібридом, уперше описаним у Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), або можуть бути одержані способами на основі рекомбінантної ДНК (Див., наприклад, патент США № 4816567). "Моноклональні антитіла" також можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл із використанням способів, описаних, наприклад, у Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) і Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991). Моноклональні антитіла в даному описі спеціально включають "химерні" антитіла, в яких частина важкого і/або легкого ланцюга ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, одержаних від конкретного виду, або що стосуються конкретного класу або підкласу антитіл, тоді як інша частина ланцюга (ланцюгів) ідентична або гомологічна відповідним 7 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностям в антитілах, одержаних від іншого виду, або що стосуються іншого класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, за умови, що вони виявляють необхідну біологічну активність (патент США № 4816567 і Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). Химерні антитіла, що представляють інтерес згідно з даним винаходом, включають "приматизовані" антитіла, що містять антигензв'язуючі послідовності варіабельного домену, одержані від примату, що відрізняється від людини (наприклад, мавпи Старого Світу, людиноподібні мавпи і т.д.) і послідовності константної ділянки людини. "Фрагменти антитіл" містять частину інтактного антитіла, що переважно включає його антигензв'язуючу або варіабельну ділянку. Приклади фрагментів антитіл включають фрагменти Fab, Fab, F(ab)2 і Fv; діантитіла; лінійні антитіла; одноланцюгові молекули антитіл і поліспецифічні антитіла, утворені з фрагмента(ів) антитіл. "Інтактне антитіло" являє собою антитіло, яке містить антигензв'язуючу варіабельну ділянку, а також константний домен легкого ланцюга (CL) і константні домени важкого ланцюга, CH1, CH2 і CH3. Константні домени можуть бути константними доменами з нативною послідовністю (наприклад, константні домени людини з нативною послідовністю) або з варіантами амінокислотної послідовності. Переважно інтактне антитіло має одну або декілька ефекторних функцій і містить олігосахаридну структуру, зв'язану з його одним або двома важкими ланцюгами. "Ефекторні функції" антитіла стосуються біологічної активності, що стосується Fc-ділянки (Fc-ділянки з нативною послідовністю або Fc-ділянки з варіантом амінокислотної послідовності) антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіл включають зв'язування C1q; комплементзалежну цитотоксичність; зв'язування рецептора Fc; залежну від антитіл опосередковану клітинами цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; знижувальну регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора, BCR) і т.д. Термін "Fc-ділянка" у даному описі використовують для визначення С-кінцевої ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, включаючи Fc-ділянки з нативною послідовністю або варіанти Fc-ділянки. Хоча межі Fc-ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну можуть варіювати, Fc-ділянку важкого ланцюга IgG людини звичайно визначають у проміжку від амінокислотного залишку приблизно в положенні Cys226 або приблизно від положення Pro230 до карбоксильного кінця Fc-ділянки. С-кінцевий лізин (залишок 447 згідно з системою нумерації EU) Fc-ділянки може бути видалений, наприклад, під час одержання або очищення антитіла або при рекомбінантному конструюванні нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг антитіла. Відповідно, композиція інтактних антитіл може містити популяції антитіл із видаленням всіх залишків K447, популяції антитіл без видалених залишків K447 і популяції антитіл, які складаються з суміші антитіл, що містять і що не містять залишок K447. Якщо в даному описі не обумовлено особливо, то нумерація залишків d важкого ланцюга імуноглобуліну являє собою нумерацію згідно з покажчиком EU, який описаний у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). "Покажчик EU згідно Kabat" стосується нумерації залишків IgG1антитіла EU людини. Залежно від амінокислотної послідовності константних доменів своїх важких ланцюгів інтактні антитіла можуть бути віднесені до різних "класів". Існує п'ять основних класів інтактних антитіл: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, і деякі з них можуть бути додатково розділені на "підкласи" (ізотипи), наприклад IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2. Константні домени важкого ланцюга, які відповідають різним класам антитіл, названі α, δ, ε, γ і μ, відповідно. Субодиничні структури і трьохмірні конфігурації різних класів імуноглобулінів добре відомі. "Залежна від антитіл опосередкована клітинами цитотоксичність" і "ADCC" стосуються опосередкованої клітинами відповіді, при якій неспецифічні цитотоксичні клітини, які експресують рецептори Fc (FcR) (наприклад природні клітини-кілери (NK), нейтрофіли і макрофаги) пізнають зв'язане антитіло на клітині-мішені і потім викликають лізис клітини-мішені. Первинні клітини для опосередкування ADCC, NK-клітини, експресують тільки FcγRIII, тоді як моноцити експресують FcγRI, FcγRII і FcγRIII. Експресія FcR на гематопоетичних клітинах підсумована в таблиці 3 на сторінці 464 у публікації Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Щоб оцінити активність в ADCC молекули, що становить інтерес, можна здійснити аналізи ADCC in vitro, такі як аналізи, описані в патентах США № 5500362 або 5821337. Застосовні ефекторні клітини для таких аналізів включають мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) і природні клітини-кілери (NK). Альтернативно або додатково ADCC-активність молекули, що становить інтерес, можна оцінити in vivo, наприклад, у тваринній моделі, такій як модель, описана в Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998). "Ефекторними клітинами людини" є лейкоцити, які експресують один або декілька FcR і 8 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснюють ефекторні функції. Переважно клітини експресують, принаймні, FcγRIII і здійснюють ADCC-ефекторну функцію. Приклади лейкоцитів людини, які опосередковують ADCC, включають мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC), природні клітини-кілери (NK), моноцити, цитотоксичні Т-клітини і нейтрофіли; при цьому переважними є PBMC і NK-клітини. Ефекторні клітини можуть бути виділені з їхнього природного джерела, наприклад з крові або PBMC, як описано в даній публікації. Терміни "Fc-рецептор" і "FcR" використовують для опису рецептора, який зв'язується з Fcділянкою антитіла. Переважним FcR є FcR людини з нативною послідовністю. Крім того, переважним FcR є FcR, який зв'язує IgG-антитіло (гамма-рецептор), і переважних рецепторів стосуються рецептори підкласів FcγRI, FcγRII і FcγRIII, включаючи алельні варіанти і альтернативно сплайсовані форми зазначених рецепторів. Рецептори FcγRII включають FcγRIIA "активуючий рецептор") і FcγRIIB ("інгібуючий рецептор"), які мають схожі амінокислотні послідовності, які відрізняються головним чином своїми цитоплазматичними доменами. Активуючий рецептор FcγRIIA містить у своєму цитоплазматичному домені заснований на тирозині мотив активації імунорецептора (ITAM). Рецептор FcγRIIB, що інгібує, містить у своєму цитоплазматичному домені заснований на тирозині мотив інгібування імунорецептора (ITIM) (див. огляд у Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Огляд, присвячений FcR, представлений у Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); і de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Інші FcR, включаючи FcR, які будуть ідентифіковані в майбутньому, включені в даному описі в термін "FcR". Термін також включає неонатальний рецептор, FcRn, який відповідає за перенесення материнських IgG у плід (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) і Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).) "Комплемент-залежна цитотоксичність" і "CDC" стосуються здатності молекули лізувати мішень у присутності комплементу. Шлях активації комплементу ініціюється зв'язуванням першого компонента системи комплементу (C1q) із молекулою (наприклад, антитілом) у комплексі зі своїм антигеном. Щоб оцінити активацію комплементу можна здійснити аналіз CDC, наприклад, як описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). "Нативні антитіла" звичайно є гетеротетрамерними глікопротеїдами з молекулярною масою приблизно 150000 дальтон, що складаються з двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких (Н) ланцюгів. Кожен легкий ланцюг зв'язаний із важким ланцюгом одним ковалентним дисульфідним зв'язком, тоді як кількість дисульфідних зв'язків між важкими ланцюгами варіює в різних ізотипах імуноглобулінів. Кожен важкий і легкий ланцюг також має рівномірно розташовані внутрішньоланцюгові дисульфідні містки. Кожен важкий ланцюг має на одному кінці варіабельний домен (VH), за яким йде декілька константних доменів. Кожен легкий ланцюг має варіабельний домен на одному кінці (VL) і константний домен на іншому кінці. Константний домен легкого ланцюга вирівняний із першим константним доменом важкого ланцюга, і варіабельний домен легкого ланцюга вирівняний з варіабельним доменом важкого ланцюга. Вважають, що конкретні амінокислотні залишки утворюють поверхню розділу між варіабельними доменами легкого ланцюга і важкого ланцюга. Термін "варіабельний" стосується того факту, що деякі частини варіабельних доменів значною мірою відрізняються за послідовністю серед антитіл і використовуються в зв'язуванні і забезпеченні специфічності кожного конкретного антитіла стосовно його конкретного антигену. Однак варіабельність нерівномірно розподілена протягом варіабельних доменів антитіл. Вона сконцентрована в трьох ділянках, що називають гіперваріабельними ділянками, у варіабельних доменах як легкого ланцюга, так і важкого ланцюга. Більш високо консервативні частини варіабельних доменів називають каркасними ділянками (FR). Кожен із варіабельних доменів нативних важкого і легкого ланцюгів містить чотири FR, в основному приймаючих конфігурацію β-шарів, сполучених трьома гіперваріабельними ділянками, які утворюють петлі, що зв'язують і в деяких випадках створюють частину бета-шаруватої структури. Гіперваріабельні ділянки в кожному ланцюгу утримуються разом у безпосередній близькості ділянками FR і з гіперваріабельними ділянками з іншого ланцюга роблять внесок в утворення антигензв'язуючої ділянки антитіл (Див. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константні домени безпосередньо не залучені до зв'язування антитіла з антигеном, але виявляють різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в залежній від антитіл опосередкованій клітинами цитотоксичності (ADCC). Термін "гіперваріабельна ділянка" при використанні в даному описі стосується амінокислотних залишків антитіла, які відповідають за зв'язування антигену. Гіперваріабельна ділянка звичайно містить амінокислотні залишки з "ділянки, що визначає комплементарність" 9 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або "CDR" (наприклад залишки 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга і 31-35 (H1), 50-65 (H2) і 95-102 (H3) у варіабельному домені важкого ланцюга; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) і/або залишки з "гіперваріабельної петлі" (наприклад залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга і 26-32 (H1), 53-55 (H2) і 96-101 (H3) у варіабельному домені важкого ланцюга; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Залишки "каркасної ділянки" або "FR" являють собою інші залишки варіабельного домену, що відрізняються від залишків гіперваріабельної ділянки, які визначені в даному описі. Розщеплення антитіл папаїном дає два ідентичних антигензв'язуючих фрагменти, що назвають "Fab”-фрагментами, кожен з однією антигензв'язуючою ділянкою, і залишковий "Fc”фрагмент, назва якого відображає його здатність легко кристалізуватися. Обробка пепсином дає F(ab)2-фрагмент, який має дві антигензв'язуючих ділянки і ще здатний перехресно зв'язувати антиген. "Fv" являє собою мінімальний фрагмент антитіла, який містить повну ділянку пізнавання антигену і зв'язування антигену. Зазначена ділянка складається з димеру одного варіабельного домену важкого ланцюга та одного варіабельного домену легкого ланцюга в тісній нековалентній асоціації. У зазначеній конфігурації взаємодіють три гіперваріабельних ділянки кожного варіабельного домену, визначаючи антигензв'язуючу ділянку на поверхні димеру VHVL. Разом шість гіперваріабельних ділянок надають антитілу специфічність у зв'язуванні антигену. Однак навіть один варіабельний домен (або половина Fv, що містить тільки три гіперваріабельні ділянки, специфічні стосовно антигену) має здатність пізнавати і зв'язувати антиген, хоча і з більш низькою афінністю, ніж повна ділянка, що зв'язує. Fab-фрагмент також містить константний домен легкого ланцюга і перший константний домен (CH1) важкого ланцюга. Fab-фрагменти відрізняються від Fab-фрагментів додаванням декількох залишків на карбоксильному кінці домену CH1 важкого ланцюга, включаючи один або декілька цистеїнів із шарнірної ділянки антитіла. Fab-SH у даному описі є позначенням Fab, в якому залишок(ки) цистеїну константних доменів несуть принаймні одну вільну тіольну групу. F(ab)2-фрагменти антитіла звичайно одержують у вигляді пари Fab-фрагментів, між якими є цистеїни шарнірної ділянки. Також відомі інші типи хімічного зв'язування фрагментів антитіл. "Легкі ланцюги" антитіл будь-якого виду хребетних можна віднести до одного з двох явно відмінних типів, що називають каппа (κ) і лямбда (λ), на основі амінокислотних послідовностей із константних доменів. "Одноланцюгові Fv" або "scFv" фрагменти антитіл містять домени VH і VL антитіла, при цьому зазначені домени присутні в одному поліпептидному ланцюгу. Переважно поліпептид Fv додатково містить поліпептидний лінкер між доменами VH і VL, який дозволяє scFv утворювати необхідну структуру для зв'язування антигену. Огляд, присвячений scFv, див. у Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). scFv-фрагменти HER2-антитіл описані в WO 93/16185, патенті США № 5571894 і патенті США № 5587458. Термін "діантитіла" стосується невеликих фрагментів антитіл із двома антигензв'язуючими ділянками, і такі фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), зв'язану з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) в одному і тому ж поліпептидномуланцюгу (VHVL). Завдяки використанню лінкеру, який є дуже коротким, щоб забезпечити можливість спаровування між двома доменами на одному і тому ж ланцюгу, домени вимушені спаровуватися з комплементарними доменами іншого ланцюга та утворювати дві антигензв'язуючих ділянки. Діантитіла більш повно описані, наприклад, в EP 404097, WO 93/11161 і Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993). "Гуманізовані" форми антитіл тварин, що відрізняються від людини, (наприклад гризунів) являють собою химерні антитіла, які містять мінімальну послідовність, одержану з імуноглобуліну тварини, що відрізняється від людини. Головним чином гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (реципієнтне антитіло), в яких залишки з гіперваріабельної ділянки реципієнта замінені залишками з гіперваріабельної ділянки виду, що відрізняється від людини (донорне антитіло), такого як миша, щур, кролик або примат, що відрізняється від людини, що має необхідну специфічність, афінність і місткість. У деяких випадках залишки каркасної ділянки (FR) імуноглобуліну людини замінюють відповідними залишками тварини, що відрізняється від людини. Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які не зустрічаються ні в реципієнтному антитілі, ні в донорному антитілі. Такі модифікації здійснюють для того, щоб додатково підвищити ефективність антитіла. Загалом, гуманізоване антитіло буде містити, по суті всі з, принаймні, одного і звичайно двох 10 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельних доменів, в яких всі або в основному всі гіперваріабельні петлі відповідають петлям імуноглобуліну тварини, що відрізняється від людини, і всі або в основному всі FR є FR з послідовності імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло необов'язково також буде містити, принаймні, частину константної ділянки імуноглобуліну (Fc), звичайно константної ділянки імуноглобуліну людини. Більш детальний опис див. у Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) і Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Гуманізовані HER2-антитіла включають huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D54, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 і huMAb4D5-8 або трастузумаб (HERCEPTIN®), які описані в таблиці 3 патенту США No. 5821337, спеціально включеного в даний опис у вигляді посилання; гуманізоване антитіло 520C9 (WO93/21319); і гуманізоване антитіло 2C4, яке описане в даній публікації. ”, З метою даного опису "трастузумаб", "HERCEPTIN® і "huMAb4D5-8" стосуються антитіла, що містить амінокислотні послідовності легкого і важкого ланцюга SEQ ID NO: 13 і 14, відповідно. У даному описі "пертузумаб" і "rhuMAb 2C4" стосуються антитіла, що містить амінокислотні послідовності легкого і важкого ланцюга SEQ ID NO: 3 і 4, відповідно. Коли пертузумаб є інтактним антитілом, він переважно містить амінокислотні послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга SEQ ID NO: 15 і 16, відповідно. "Голе антитіло" означає антитіло (яке визначене в даному описі), яке не кон'юговане з гетерологічною молекулою, такою як цитотоксичний залишок або радіоактивна мітка. "Ізольованим" антитілом є антитіло, яке було ідентифіковане і відділене і/або витягнуте з компонентів його природного середовища. Забруднюючими компонентами його природного середовища є речовини, які можуть заважати діагностичним або терапевтичним застосуванням антитіла, і можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини. У переважних варіантах антитіло буде очищене (1) у ступені, що складає більш ніж 95 % мас. антитіла, яке визначають способом Лоурі, і найпереважніше більш ніж 99 % мас., (2) у такому ступені, який достатній для одержання, принаймні, 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності з використанням секвенатора з циліндром, що обертається або (3) до гомогенності за оцінкою в SDS-ПААГ у відновлювальних або не відновлювальних умовах із використанням забарвлення Кумасі синім або переважно сріблом. Ізольоване антитіло включає антитіло, що знаходиться in situ в рекомбінантних клітинах, оскільки, принаймні, один компонент із природного середовища антитіла не може бути присутнім. Однак звичайно ізольоване антитіло буде одержане, принаймні, за допомогою однієї стадії очищення. Антитіло, яке "інгібує димеризацію HER більш ефективне, ніж трастузумаб" є антитілом, яке зменшує кількість або усуває димери HER більш ефективно (наприклад, принаймні, приблизно в 2 рази більш ефективно), ніж трастузумаб. Переважно таке антитіло інгібує димеризацію HER2, принаймні, приблизно також ефективно, як антитіло, вибране з групи, що складається з мишачого моноклонального антитіла 2C4, Fab-фрагмента мишачого моноклонального антитіла 2C4, інтактного пертузумабу і Fab-фрагмента пертузумабу. Інгібування димеризації HER можна оцінити, досліджуючи димери HER безпосередньо або оцінюючи активацію HER або передачу сигналу нижче за течією, яка є результатом димеризації HER, і/або оцінюючи сайт зв'язування антитіло-HER2, і т.д. Аналізи для скринінгу антитіл, що мають здатність інгібувати димеризацію HER більш ефективно, ніж трастузумаб, описані в Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002) і WO01/00245 (Adams et al.). Тільки як приклад можна провести аналіз інгібування димеризації HER із використанням, наприклад, оцінки інгібування утворення димерів HER (див. наприклад фіг. 1A- В в Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002); і WO 01/00245); зменшення активації лігандом HER клітин, які експресують димери HER (наприклад, WO 01/00245 і фіг. 2A-В в Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)); блокування зв'язування ліганду HER із клітинами, які експресують димери HER (наприклад, WO 01/00245 і фіг. 2E в Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)); інгібування клітинного росту злоякісних клітин (наприклад, клітин MCF7, MDA-MD-134, ZR-75-1, MD-MB-175, T47D), які експресують димери HER у присутності (або за відсутності) ліганду HER (наприклад, WO 01/00245 і фіг. 3A-D в Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)); інгібування передачі сигналу нижче за течією (наприклад, інгібування HRG-залежного фосфорилування AKT або інгібування HRG- або TGFα-залежного фосфорилування MAPK) (див., наприклад, WO 01/00245 і фіг. 2C-D в Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)). Також можна оцінити, чи інгібує антитіло димеризацію HER, досліджуючи сайт зв'язування антитілоHER2, наприклад, за допомогою оцінки структури або моделі, такої як кристалічна структура, антитіла, зв'язаного з HER2 (див., наприклад, Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004)). HER2-антитіло може "інгібувати HRG-залежне фосфорилування AKT" і/або "інгібувати HRG 11 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або TGFα-залежне фосфорилування MAPK" більш ефективно (наприклад, принаймні, у 2 рази більш ефективно), ніж трастузумаб (як приклад див. Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002) і WO 01/00245). HER2-антитіло може являти собою антитіло, яке "не інгібує відщеплення ектодомену HER2" (Molina et al. Cancer Res. 61: 4744-4749(2001)). HER2-антитіло, яке "зв'язується з сайтом зв'язування у гетеродимері" HER2, зв'язується із залишками в домені II (і необов'язково також зв'язується із залишками в інших доменах позаклітинного домену HER2, таких як домени I і III), і може стерично ускладнювати, принаймні, у деякій мірі, утворення гетеродимеру HER2-EGFR, HER2-HER3 або HER2-HER4. Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004) охарактеризували кристалічну структуру HER2-пертузумаб, депоновану в RCSB Protein Data Bank (ID-код IS78), ілюструючи типове антитіло, яке зв'язується із сайтом зв'язування HER2 у гетеродимері. Антитіло, яке "зв'язується з доменом II" HER2, зв'язується із залишками в домені II і необов'язково із залишками в іншому домені(ах) HER2, таких як домени I і III. "Засіб, що інгібує ріст" при використанні в даному описі стосується сполуки або композиції, яка інгібує ріст клітини, зокрема злоякісної клітини, що експресує HER, або in vitro, або in vivo. Таким чином, засобом, що інгібує ріст, може бути засіб, який значною мірою зменшує відсотковий вміст клітин, що надекспресують HER, у S-фазі. Приклади засобів, що інгібують ріст, включають засоби, які блокують проходження клітинного циклу (в іншому місці, що відрізняється від S-фази), такі як засоби, які індукують затримку в G1-фазі і затримку в M-фазі. Класичні блокатори M-фази включають алкалоїди барвінку (вінкристин і вінбластин), таксани та інгібітори топоізомерази II, такі як доксорубіцин, епірубіцин, даунорубіцин, етопозид і блеоміцин. Засоби, які затримують у G1, також розповсюджують свою дію на затримку в S-фазі, наприклад ДНК-алкілуючі агенти, такі як тамоксифен, преднізон, дакарбазин, мехлоретамін, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил і ara-C. Додаткову інформацію можна знайти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., у розділі 1, озаглавленому "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особливо на стор. 13. Прикладами антитіл "що інгібують ріст" є антитіла, які зв'язуються з HER2 і інгібують ріст злоякісних клітин, що надекспресують HER2. Переважні HER2-антитіла, що інгібують ріст клітин пухлини молочної залози SK-BR-3 у культурі клітин більш ніж на 20 % і переважно більш ніж на 50 % (наприклад, приблизно від 50 % до приблизно 100 %) при концентрації антитіла приблизно від 0,5 до 30 мкг/мл, при цьому інгібування росту визначають через шість діб після впливу на клітини SK-BR-3 антитілом (див. патент США № 5677171, опублікований 14 жовтня 1997). Аналіз інгібування росту клітин SK-BR-3 більш детально описаний у зазначеному патенті і в даному описі нижче. Переважним антитілом, що інгібує ріст, є гуманізований варіант мишачого моноклонального антитіла 4D5, наприклад трастузумаб. Антитілом, яке "індукує апоптоз" є антитіло, яке індукує запрограмовану загибель клітин, яку визначають за зв'язуванням анексину V, фрагментацією ДНК, зморщуванням клітин, розширенням ендоплазматичного ретикулума, фрагментацією клітин і/або утворенням мембранних пухирців (що називають апоптозними тільцями). Клітиною звичайно є клітина, яка надекспресує рецептор HER2. Переважно клітина є пухлинною клітиною, наприклад клітиною молочної залози, яєчника, шлунка, ендометрію, слинної залози, легені, нирки, ободової кишки, щитовидної залози, підшлункової залози або сечової міхура. In vitro клітина може являти собою клітину SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 або SKOV3. Є різні способи оцінки клітинних подій, пов'язаних з апоптозом. Наприклад, транслокацію фосфатидилсерину (PS) можна виміряти за зв'язуванням анексину; фрагментацію ДНК можна оцінити, одержуючи при електрофоретичному розділенні ДНК-леддер; і конденсацію ядер/хроматину нарівні з фрагментацією ДНК можна оцінити за будь-яким збільшенням кількостей гіподиплоїдних клітин. Переважно антитілом, яке індукує апоптоз, є антитіло, яке призводить приблизно до 2-50кратної, переважно приблизно 5-50-кратної і найпереважніше приблизно 10-50-кратних індукції зв'язування анексину в порівнянні з необробленою клітиною в аналізі зв'язування анексину з використанням клітин BT474 (див. нижче). Прикладами HER2-антитіл, які індукують апоптоз, є 7C2 і 7F3. "Епітоп 2C4" являє собою ділянку позаклітинного домену HER2, з якою зв'язується антитіло 2C4. Щоб провести скринінг щодо антитіл, які зв'язуються з епітопом 2C4, можна здійснити загальноприйнятий аналіз перехресного блокування, такий як аналіз, описаний в Antibodies, А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно можна здійснити картирування епітопів, щоб оцінити, чи зв'язується антитіло з епітопом 2C4 HER2, використовуючи способи, відомі в даній галузі, і/або можна дослідити 12 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 структуру антитіло-HER2 (Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)), щоб з'ясувати, який домен (домени) HER2 зв'язується (зв'язуються) антитілом. Епітоп 2C4 містить залишки з домену II позаклітинного домену HER2. 2C4 і пертузумаб зв'язуються з позаклітинним доменом HER2 в місці з'єднання доменів I, II і III. Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004). "Епітоп 4D5" являє собою ділянку позаклітинного домену HER2, з якою зв'язуються антитіло 4D5 (ATCC CRL 10463) і трастузумаб. Зазначений епітоп розташований поблизу трансмембранного домену HER2 і в домені IV HER2. Щоб провести скринінг стосовно антитіл, які зв'язуються з епітопом 4D5, можна здійснити загальноприйнятий аналіз перехресного блокування, такий як аналіз, описаний у Antibodies, А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно можна здійснити картирування епітопів, щоб оцінити, чи зв'язується антитіло з епітопом 4D5 HER2 (наприклад, із будь-яким одним або декількома залишками в ділянці приблизно від залишку 529 до залишку 625, включно, як показано на фіг. 1). "Епітоп 7C2/7F3" являє собою ділянку на N-кінці в домені I позаклітинного домену HER2, з якою зв'язуються антитіла 7C2 і/або 7F3 (кожне з яких депоноване в ATCC, див. нижче). Щоб провести скринінг стосовно антитіл, які зв'язуються з епітопом 7C2/7F3, можна здійснити загальноприйнятий аналіз перехресного блокування, такий як аналіз, описаний в Antibodies, А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно можна здійснити картирування епітопів, щоб встановити, чи зв'язується антитіло з епітопом 7C2/7F3 на HER2 (наприклад, будь-яким одним або декількома залишками в ділянці приблизно від залишку 22 до залишку 53 HER2, як показано на фіг. 1). "Лікування" стосується як терапевтичного лікування, так і профілактичних або превентивних заходів. До суб'єктів, що потребують лікування, належать суб'єкти, що вже мають захворювання, а також суб'єкти, в яких необхідно запобігти захворюванню. Тому у пацієнта, якого необхідно лікувати згідно з даним винаходом, може бути діагностована наявність захворювання, або він може бути схильним або чутливим до захворювання. Терміни "злоякісна пухлина" і "злоякісний" стосуються або описують фізіологічний стан у ссавців, який звичайно характеризується нерегульованим клітинним ростом. Приклади злоякісної пухлини включають без обмеження карциному, лімфому, бластому (включаючи медулобластому і ретинобластому), саркому (включаючи ліпосаркому і саркому синовіальних клітин), нейроендокринні пухлини (включаючи карциноїдні пухлини, гастриному і рак острівцевих клітин), мезотеліому, шванному (включаючи акустичну нейрому), менінгіому, аденокарциному, меланому і лейкоз або лімфоїдні злоякісні утворення. Конкретніші приклади таких злоякісних пухлин включають рак сквамозних клітин (наприклад, рак клітин сквамозного епітелію), рак легені, включаючи дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легені і плоскоклітинну карциному легені, рак очеревини, гепатоклітинний рак, рак шлунка, включаючи рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залоза, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак ободової кишки, рак прямої кишки, рак ободової і прямої кишки, ендометріальну карциному або карциному матки, карциному слинних залоз, рак нирок, рак простати, рак вульви, рак щитовидної залози, карциному печінки, карциному заднього проходу, карциному пеніса, рак сім'яників, рак стравоходу, пухлини жовчних шляхів, а також рак голови і шиї. Термін "ефективна кількість" стосується кількості лікарського засобу, ефективної при лікуванні захворювання у пацієнта. Коли захворюванням є злоякісна пухлина, ефективна кількість лікарського засобу може зменшувати кількість злоякісних клітин; зменшувати розмір пухлини; інгібувати (тобто певною мірою сповільнювати і переважно зупиняти) інфільтрацію злоякісних клітин до периферичних органів; інгібувати (тобто певною мірою сповільнювати і переважно зупиняти) пухлинні метастази; певною мірою інгібувати ріст пухлини; і/або певною мірою ослабляти один або декілька симптомів, пов'язаних зі злоякісною пухлиною. Залежно від ступеня, в якому лікарський засіб може запобігати росту і/або вбивати існуючі злоякісні клітини, він може бути цитостатичним і/або цитотоксичним. Ефективна кількість може продовжувати виживаність без прогресування, призводити до об'єктивної відповіді (включаючи часткову відповідь, PR, або повну відповідь, CR), збільшувати загальну тривалість виживання і/або ослабити один або декілька симптомів злоякісної пухлини. "HER2-позитивна злоякісна пухлина" являє собою злоякісну пухлину, що містить клітини, які мають білок HER2 на клітинній поверхні. Злоякісна пухлина, яка "надекспресує" HER-рецептор, являє собою злоякісну пухлину, яка має значно вищі рівні HER-рецептора, такого як HER2, на клітинній поверхні в порівнянні з незлоякісною клітиною такого ж типу тканини. Така надекспресія може бути викликана ампліфікацією генів або підвищеною транскрипцією або трансляцією. Надекспресію рецептора 13 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 HER можна визначити в діагностичному або прогностичному аналізі за допомогою оцінки підвищених рівнів білка HER, присутнього на поверхні клітини (наприклад, із використанням імуногістохімічного аналізу; IHC). Альтернативно або додатково можна виміряти рівні кодуючої HER нуклеїнової кислоти в клітині, наприклад, способами флуоресцентної гібридизації in situ (FISH; Див. WO98/45479, опубліковану в жовтні 1998), Саузерн-блотингу або полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), такої як кількісна ПЛР у режимі реального часу (qRT-ПЛР). Також можна дослідити надекспресію рецептора HER вимірюванням антигену "що злущується" (наприклад, позаклітинного домену HER) у біологічній рідині, такій як сироватка (див. наприклад патент США № 4933294, опублікований 12 червня 1990; WO 91/05264, опубліковану 18 квітня 1991; патент США № 5401638, опублікований 28 березня 1995; і Sias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). За винятком зазначених вище аналізів фахівцеві доступні різні аналізи in vivo. Наприклад, можна піддати клітини в організмі пацієнта впливу антитіла, який необов'язково мітять міткою, що реєструється, наприклад, радіоактивним ізотопом, і можна оцінити у пацієнта зв'язування антитіла з клітинами, наприклад, зовнішнім скануванням радіоактивності або аналізом біопсії, взятої у пацієнта, попередньо підданого впливу антитіла. Навпаки, злоякісна пухлина, яка "не надекспресує рецептор HER2" являє собою злоякісну пухлину, яка не експресує більш високі, ніж нормальні рівні рецептора HER2 у порівнянні з незлоякісною клітиною того ж типу тканини. Злоякісна пухлина, яка "надекспресує" ліганд HER, являє собою злоякісну пухлину, яка продукує значно вищі рівні такого ліганду в порівнянні зі незлоякісною клітиною такого ж типу тканини. Така надекспресія може бути викликана ампліфікацією гена або підвищеною транскрипцією або трансляцією. Надекспресію ліганду HER можна визначити діагностично, оцінюючи рівні ліганду (або кодуючої його нуклеїнової кислоти) у пацієнта, наприклад у біопсії пухлині, або в різних діагностичних аналізах, таких як IHC, FISH, Саузерн-блотинг, ПЛР або аналізи in vivo, описані вище. Термін "цитотоксичний засіб" у значенні, що використовується в даному описі стосується речовини, яка інгібує або запобігає функціонуванню клітин і/або спричиняє руйнування клітин. 211 131 125 90 186 Мається на увазі, що термін включає радіоактивні ізотопи (наприклад, At , I , I , Y , Re , 188 153 212 32 Re , Sm , Bi , P і радіоактивні ізотопи Lu), хіміотерапевтичні засоби і токсини, такі як низькомолекулярні токсини або ферментативно активні токсини, що мають походження з бактерій, грибів, рослин або тварин, включаючи їх фрагменти і/або варіанти. "Хіміотерапевтичним засобом" є хімічна сполука, застосовна для лікування злоякісної пухлини. Приклади хіміотерапевтичних засобів включають алкілувальні агенти, такі як тіотепа і циклофосфамід (CYTOXAN®); алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбохінон, метуредопа та уредопа; етиленіміни і метилмеламіни, включаючи алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметилмеламін; ацетогеніни (зокрема булатацин і булатацинон); дельта-9-тетрагідроканабінол (дронабінол, MARINOL®); бета-лапахон; лапахол; колхіцини; бетулінову кислоту; камптотецин (включаючи синтетичний аналог топотекан (HYCAMTIN®), CPT-11 (іринотекан, CAMPTOSAR®), ацетилкамптотецин, скополектин і 9-амінокамптотецин); бріостатин; калістатин; CC-1065 (включаючи його синтетичні аналоги адозелезин, карзелезин і бізелезин); подофілотоксин; подофілінову кислоту; теніпозид; криптофицини (зокрема криптофицин 1 і криптофицин 8); доластатин; дуокарміцин (включаючи синтетичні аналоги KW2189 і CB1-TM1); елеутеробін; панкратистатин; саркодиктиїн; спонгістатин; азотистий іприт, такий як хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, гідрохлорид оксиду мехлоретаміну, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, урамустин; нітрозосечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин і ранімнустин; антибіотики, такі як енедіїнові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, зокрема каліхеаміцин гамма II і каліхеаміцин омега II (див. наприклад Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динеміцин, включаючи динеміцин А; еспераміцин; а також хромофор неокарциностатину і споріднені хромофори хромопротеїнів – енедіїнові антибіотики, аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, карабіцин, карміноміцин, карзинофілін, хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, 6-діазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубіцин (включаючи ADRIAMICIN®, морфолінодоксорубіцин, ціаноморфолінодоксорубіцин, 2-піролінодоксорубіцин, доксорубіцинoHCl в ін'єктованих ліпосомах (DOXOL®), ліпосомний доксорубіцин TLC D-99 (MYOCET®), пегільований ліпосомний доксорубіцин (CAELYX®) і дезоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцеломіцин, мітоміцини, такі як мітоміцин С, мікофенолову кислоту, ногаламіцин, олівоміцини, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як 14 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 метотрексат, гемцитабін (GEMZAR®), тегафур (UFTORAL®), капецитабін (XELODA®), епотилон і 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурину, такі як флударабін, 6-меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; аналоги піримідину, такі як анцитабін, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин; засоби, що пригнічують функції надниркових залоз, такі як аміноглютетімід, мітотан, трилостан; компенсатор фолієвої кислоти, такий як фолінова кислота; ацеглатон; глікозид альдофосфаміду; амінолевулінову кислоту; енілурацил; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазихон; елфорнітин; ацетат еліптинію; етоглуцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентинан; лонідаінин; майтанзиноіди, такі як майтанзин і ансамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопіданмол; нітраерин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; 2-етилгідразид; прокарбазин; полісахаридний комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофіран; спірогерманій; тенуазонову кислоту; триазиквон; 2,2,2-трихлортриетиламін; трихотецени (зокрема токсин Т-2, веракурин А, роридин А й ангуідин); уретан; дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("ara-C"); тіотепа; таксоїд, наприклад паклітаксел (TAXOL®), препарат паклітакселу на основі сконструйованих зв'язаних з альбуміном наночастинок (ABRAXANE™) і доцетаксел (TAXOTERE®); хлорамбуцил; 6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; засоби на основі платини, такі як цисплатин, оксаліплатин і карбоплатин; алкалоїди барвінку, які запобігають полімеризації тубуліну з мікротрубочок, що утворюються, включаючи вінбластин (VELBAN®), вінкристин (ONCOVIN®), ; віндезин (ELDISINE®, FILDESIN®) і вінорелбін (NAVELBINE®); етопозид (VP-16); іфосфамід мітоксантрон; лейковорин; новантрон; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; ібандронат; інгібітор топоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин (DMFO); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота, включаючи бексаротен (TARGRETIN®); біфосфонати, такі як клодронат (наприклад, BONEFOS® або OSTAC®), етидронат (DIDROCAL®), NE-58095, золедронову кислоту/золедронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памідронат (AREDIA®), тілудронат (SKELID®) або ризендронат (ACTONEL®); троксацитабін (1,3-діоксолановий нуклеозидний аналог цитозину); антисмислові олігонуклеотиди, зокрема олігонуклеотиди, які інгібують експресію генів на шляхах передачі сигналів, залучених у проліферацію аберрантних клітин, таких як наприклад PKC-альфа, Raf, H-Ras і рецептора епідермального фактору росту (EGF-R); вакцини, такі як вакцина THERATOPE® і вакцини для генної терапії, наприклад, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® і вакцина VAXID®; інгібітор топоізомерази 1 (наприклад, LURTOTECAN®); rmRH (наприклад, ABARELIX®); BAY439006 (сорафеніб; Bayer); SU-11248 (Pfizer); перифосин, інгібітор ЦОГ-2 (наприклад, целекоксиб або еторикоксиб), інгібітор протеосом (наприклад, PS341); бортезоміб (VELCADE®); CCI-779; типіфарніб (811577); орафеніб, ABT510; інгібітор Bcl-2, такий як облімерсен натрію (GENASENSE®); піксантрон; інгібітори EGFR (див. визначення нижче); інгібітори тирозинкіназ (див. визначення нижче); і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого з зазначених вище засобів; а також поєднання двох або більше із зазначених вище засобів, такі як CHOP, скорочена назва комбінованої терапії циклофосфамідом, доксорубіцином, вінкристином і преднізолоном, і FOLFOX, скорочена назва схеми лікування оксаліплатином (ELOXATIN™) у поєднанні з 5-FU і лейковорином. Також у зазначене визначення включені протигормональні засоби, які діють, регулюючи або інгібуючи дію гормонів на пухлини, такі як антиестрогени зі змішаним профілем агоніст/антагоніст, включаючи тамоксифен (NOLVADEX®), 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, тореміфен (FARESTON®); ідоксифен, дролоксифен, ралоксифен (EVISTA®), триоксифен, кеоксифен і вибіркові модулятори рецепторів естрогену (SERM), такі як SERM3; чисті антиестрогени без агоністичних властивостей, такі як фулвестрант (FASLODEX®) і EM800 (такі засоби можуть блокувати димеризацію рецепторів естрогену (ER), інгібувати зв'язування ДНК, посилювати метаболізм ER і/або знижувати рівні ER); інгібітори ароматази, включаючи стероїдні інгібітори ароматази, такі як форместан і ексеместан (AROMASIN®), і нестероїдні інгібітори ароматази, такі як анастразол (ARIMIDEX®), летрозол (FEMARA®) і аміноглутетимід та інші інгібітори ароматази, включаючи ворозол (RIVISOR®), ацетат мегестролу (MEGASE®), фадрозол, імідазол; агоністи рилізинг-гормону лютеїнізуючого гормону, включаючи лейпролід (LUPRON® і ELIGARD®), гозерелін, бузерелін і триптерелін; статеві стероїди, включаючи прогестини, такі як ацетат мегестролу і ацетат медроксипрогестерону, естрогени, такий як діетилстилбестрол і премарин і андрогени/ретиноїди, такі як флуоксиместерон, повністю трансретиноєва кислота і фенретинід; онапристон; анти-прогестерони; знижувальні регулятори рецепторів естрогенів (ERD); анти-андрогени, такі як флутамід, нілутамід і бікалутамід; тестолактон; і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого з зазначених вище 15 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 засобів; а також поєднання двох або більше із зазначених вище засобів. У значенні, що використовується в даному описі термін "спрямований до EGFR лікарський засіб" стосується терапевтичного засобу, який зв'язується з EGFR і необов'язковий інгібує активацію EGFR. Приклади таких засобів включають антитіла і малі молекули, які зв'язуються з EGFR. Приклади антитіл, які зв'язуються з EGFR, включають MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (див. патент США № 4943533, Mendelsohn et al.) і їхні варіанти, такі як химерне антитіло 225 (C225 або цетуксимаб; ERBUTIX®) і реконструйоване антитіло 225 людини (H225) (див. WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, повністю людське спрямоване до EGFR антитіло (Imclone); антитіла, які зв'язують мутант EGFR типу II (патент США № 5212290); гуманізовані і химерні антитіла, які зв'язують EGFR, які описані в патенті США № 5891996; і людські антитіла, які зв'язують EGFR, такі як ABX-EGF або панітумумаб (див. WO98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A: 636-640 (1996)); EMD7200 (матузумаб) гуманізоване EGFR-антитіло, спрямоване проти EGFR, яке конкурує з EGF і TGF-альфа за зв'язування EGFR (EMD/Merck); людське EGFR-антитіло, HuMax-EGFR (GenMab); повністю людські антитіла, відомі як E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 і E7.6.3 і описані в US 6235883; MDX-447 (Medarex Inc); і mAb 806 або гуманізоване mAb 806 (Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29): 3037530384 (2004)). Анти-EGFR-антитіло може бути кон'юговане з цитотоксичним засобом з утворенням таким чином імунокон'югата (Див., наприклад, EP 659439 A2, Merck Patent GmbH). Антагоністи EGFR включають малі молекули, такі як сполуки, описані в патентах США № 5616582, 5457105, 5475001, 5654307, 5679683, 6084095, 6265410, 6455534, 6521620, 6596726, 6713484, 5770599, 6140332, 5866572, 6399602, 6344459, 6602863, 6391874, 6344455, 5760041, 6002008 і 5747498, а також у наступних публікаціях PCT: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016 і WO99/24037. Конкретні малі молекули, що є антагоністами EGFR, включають OSI-774 (CP-358774, ерлотиніб, TARCEVA® Genentech/OSI Pharmaceuticals); PD 183805 (CI 1033, 2-пропенамід, N-[4-[(3-хлор-4-фторфеніл)аміно]-7-[3-(4-морфолініл)пропокси]-6хіназолініл]дигідрохлорид, Pfizer Inc.); ZD 1839, гефітиніб (IRESSA®) 4-(3-хлор-4-фтораніліно)7-метокси-6-(3-морфолінопропокси)хіназолін, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-аміно-4-(3метилфеніламіно)хіназолін, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-хлор-4-фторфеніл)-N2-(1метилпиперидин-4-іл)піримідо[5,4-d]піримідин-2,8-діамін, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ((R)-4[4-[(1-фенілетил)аміно]-1H-піроло[2,3-d]піримідин-6-іл]фенол); (R)-6-(4-гідроксифеніл)-4-[(1фенілетил)аміно]-7H-піроло[2,3-d]піримідин); CL-387785 (N-[4-[(3-бромфеніл)аміно]-6хіназолініл]-2-бутинамід); EKB-569 (N-[4-[(3-хлор-4-фторфеніл)аміно]-3-ціано-7-етокси-6хінолініл]-4-(диметиламіно)-2-бутенамід) (Wyeth); AG1478 (Sugen); AG1571 (SU 5271; Sugen); подвійні інгібітори тирозинкіназ EGFR/HER2, такі як лапатиніб (GW 572016 або N-[3-хлор-4-[(3фторфеніл)метокси]феніл]-6-[5-[[[2-метилсульфоніл)етил]аміно]метил]-2-фураніл]-4хіназолінамін; Glaxo-SmithKline) або похідні ціаногуанідинхіназоліну і ціаноамідинхіназоламіну. "Інгібітор тирозинкінази" означає молекулу, яка інгібує тирозинкіназну активність тирозинкінази, таку як рецептор HER. Приклади таких інгібіторів включають спрямовані до EGFR лікарські засоби, зазначені в попередньому абзаці; низькомолекулярний інгібітор тирозинкінази HER2, такий як TAK165, доступний від Takeda; CP-724714, пероральний вибірковий інгібітор тирозинкінази рецептора ErbB2 (Pfizer і OSI); подвійні інгібітори HER, такі як EKB-569 (доступний від Wyeth), який переважно зв'язує EGFR, але інгібує як HER2-, так і EGFRнадекспресуючі клітини; лапатиніб (GW572016, доступний від GlaxoSmithKline), пероральний інгібітор тирозинкінази HER2 і EGFR; PKI-166 (доступний від Novartis); пан-HER-інгібітори, такі як канетиніб (CI-1033; Pharmacia); інгібітори Raf-1, такі як антисмисловий агент ISIS-5132, доступний від ISIS Pharmaceuticals, який інгібує передачу сигналу Raf-1; не спрямовані до HER інгібітори TK, такі як мезилат іматинібу (Gleevac™), доступний від Glaxo; інгібітор регульованої позаклітинними сигналами MAPK-кінази 1 CI-1040 (доступний від Pharmacia); хіназоліни, такі як PD 153035, 4-(3-хлораніліно)хіназолін; піридопіримідини; піримідопіримідини; піролопіримідини, такі як CGP 59326, CGP 60261 і CGP 62706; піразолопіримідини, 4-(феніламіно)-7H-піроло[2,3d]піримідини; куркумін (диферулоілметан, 4,5-біс(4-фтораніліно)фталімід); тирфостини, що містять залишки нітротіофену; PD-0183805 (Warner-Lamber); антисмислові молекули (наприклад, молекули, які зв'язуються з нуклеїновою кислотою, що кодує HER); хіноксаліни (патент США № 5804396); трифостини (патент США № 5804396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK787 (Novartis/Schering AG); пан-HER-інгібітори, такі як CI-1033 (Pfizer); афінітак (ISIS 3521; Isis/Lilly); мезилат іматинібу (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); семаксиніб (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); похідні ціаногуанідинхіназолін і ціаноамідинхіназоламін; або засоби, описані в будь-якій із наступних патентних публікацій: 16 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 патент США № 5804396; WO 99/09016 (American Cyanimid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca); і WO96/33980 (Zeneca) і US2005/0101617. "Антиангіогенний засіб" стосується сполуки, яка блокує або в деякій мірі перешкоджає розвитку кровоносних судин. Антиангіогенним фактором може бути, наприклад, мала молекула або антитіло, яке зв'язується з фактором росту або рецептором фактору росту, залученим до стимуляції ангіогенезу. Переважним антиангіогенним фактором згідно з винаходом є антитіло, яке зв'язується з фактором росту ендотелію судин (VEGF), таке як бевацизумаб (AVASTIN®). Термін "цитокін" є родинною назвою білків, що вивільняються однією популяцією клітин, які діють на іншу клітину як міжклітинні медіатори. Прикладами таких цитокінів є лімфокіни, монокіни і традиційні поліпептидні гормони. До цитокінів належить гормон росту, такий як гормон росту людини, N-метіоніл-гормон росту людини і бичачий гормон росту; паратиреоїдний гормон; тироксин; інсулін; проінсулін; релаксин; прорелаксин; глікопротеїдні гормони, такі як фолікулостимулючий гормон (ФСГ), тиреотропін (ТСГ) і лютеїнізуючий гормон (ЛГ); фактор росту гепатоцитів; фактор росту фібробластів; пролактин; плацентарний лактоген; фактор некрозу пухлин-α і -β; мюлерова інгібуюча субстанція; мишачий асоційований із гонадотропіном пептид; інгібін; активін; фактор росту ендотеліальних клітин судин; інтегрин; тромбопоетин (TPO); фактори росту нервів, такі як NGF-β; фактор росту тромбоцитів; трансформуючі фактори росту (TGF), такі як TGF-α і TGF-α; інсуліноподібний фактор росту-I і -II; еритропоетин (EPO); остеоіндуктивні фактори; інтерферони, такі як інтерферон-α, -β і -γ, колонієстимулюючі фактори (CSF), такі як CSF макрофагів (M-CSF), CSF гранулоцитів і макрофагів (GM-CSF) і CSF гранулоцитів (G-CSF); інтерлейкіни (IL), такі як IL-1, IL-1-α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL9, IL-10, IL-11, IL-12, фактор некрозу пухлини, такий як TNF-α або TNF-β; та інші поліпептидні фактори, включаючи LIF і ліганд kit (KL). У значенні, що використовується в даному описі термін цитокін включає білки з природних джерел або з культури рекомбінантних клітин і біологічно активні еквіваленти цитокінів із нативною послідовністю. II. Композиції варіанту HER2-антитіла Даний винахід, принаймні, частково, стосується композицій декількох HER2-антитіл. Переважно HER2-антитіло (будь-яке одне або обидва антитіла: HER2-антитіло головного типу і варіант такого антитіла) являє собою антитіло, яке зв'язується з доменом II HER2, інгібує димеризацію HER більш ефективно ніж трастузумаб і/або зв'язується з ділянкою зв'язування у гетеродимері HER2. Переважний варіант антитіла головного типу згідно з винаходом являє собою антитіло, що містить амінокислотні послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга і варіабельної ділянки важкого ланцюга SEQ ID NO: 3 і 4, і найпереважніше що містить амінокислотні послідовності легкого ланцюга і важкого ланцюга EQ ID NO: 15 і 16 (пертузумаб). Композиція згідно з винаходом містить HER2-антитіло головного типу, яке зв'язується з доменом II HER2, і його кислі варіанти, при цьому кислі варіанти включають один, два або три з наступних варіантів: глікозильований варіант, варіант із відновленим дисульфідним зв'язком і невідновлюваний варіант. Кислі варіанти в композиції можуть включати один, два, три, чотири або п'ять із наступних варіантів: глікозильований варіант, дезамінований варіант, варіант із відновленим дисульфідним зв'язком, сіалілований варіант і невідновлюваний варіант. Переважно загальна кількість всіх кислих варіантів у композиції складає менше ніж приблизно 25 %. В одному варіанті глікозильований варіант, дезамінований варіант, варіант із відновленим дисульфідним зв'язком, сіалілований варіант і невідновлюваний варіант становлять, принаймні, приблизно 75-80 % від кислих варіантів у композиції. Винахід, крім того, стосується композиції, що містить HER2-антитіло головного типу, що містить послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга і варіабельної ділянки важкого ланцюга SEQ ID NO: 3 і 4, відповідно, і кислі варіанти антитіла головного типу, при цьому кислі варіанти включають один, два, три, чотири або п'ять із наступних варіантів: глікозильований варіант, дезамінований варіант, варіант із відновленим дисульфідним зв'язком, сіалілований варіант і невідновлюваний варіант. Винахід стосується способу одержання фармацевтичної композиції, що включає: (1) одержання композиції, що містить HER2-антитіло головного виду, яке зв'язується з доменом II HER2, і його кислі варіанти, включаючи глікозильований варіант, варіант із відновленим дисульфідним зв'язком або невідновлюваний варіант, і (2) оцінку кислих варіантів у композиції і підтвердження того, що їхня кількість складає менше ніж приблизно 25 %. Спосіб передбачає об'єднання композиції до, під час або після стадії (2) із фармацевтично прийнятним носієм. В одному варіанті композиція, що оцінюється на стадії (2), знаходиться в фармацевтично прийнятному носії. 17 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному варіанті, принаймні, приблизно 75-80 % кислих варіантів (складових менше ніж приблизно 25 % композиції) вибрані з: глікозильованого варіанту, дезамінованого варіанту, варіанту із відновленим дисульфідним зв'язком, сіалілованого варіанту і не відновлюваного варіанту. Кислі варіанти можна оцінювати декількома способами, але переважно такі способи включають один, два, три, чотири або п'ять із наступних способів: іонообмінну хроматографію (IEC), у разі якої композицію обробляють сіалідазою до, після і/або у час IEC (щоб оцінити сіалілований варіант), відновлюваний CE-SDS (наприклад, щоб оцінити варіант із відновленим дисульфідним зв'язком), не відновлюваний CE-SDS (щоб оцінити невідновлюваний варіант), хроматографію з використанням боронату (наприклад, щоб оцінити глікозильований варіант) і пептидне картирування (наприклад, щоб оцінити дезамінований варіант). В одному варіанті сумарні кислі варіанти оцінюють іонообмінною хроматографією, наприклад, використовуючи слабкий катіонообмінник і/або катіонообмінник із карбоксилатною функціональною групою (наприклад, використовуючи колонку для хроматографії WCX-10 DIONEX PROPAC™). В одному варіанті такої хроматографії умови для хроматографії включають буфер А, що містить 20 мМ бістрис, pH 6,0; буфер В, що містить 20 мМ бістрис, 200 мМ NaCl, pH 6,0; і градієнт 0,5 % буфера В із витратою 1,0 мл/хв. Композиція необов'язково містить варіант із подовженням у вигляді амінокінцевого лідера. Переважно подовження у вигляді амінокінцевого лідера знаходиться на легкому ланцюгу варіанту антитіла (наприклад, на одному або двох легких ланцюгах варіанту антитіла). HER2антитіло головного виду або варіант антитіла можуть являти собою інтактне антитіло або фрагмент антитіла (наприклад, фрагменти Fab або F(ab)2), але переважно вони є інтактними антитілами. Варіант антитіла згідно з винаходом може містити подовження у вигляді амінокінцевого лідера на будь-якому одному або декількох важких або легких ланцюгах. Переважно подовження у вигляді амінокінцевого лідера знаходиться на одному або двох легких ланцюгах антитіла. Подовження у вигляді амінокінцевого лідера переважно містить або складається з VHS-. Присутність подовження у вигляді амінокінцевого лідера в композиції може бути виявлена різними способами аналізу, включаючи без обмеження, аналіз N-кінцевої послідовності, аналіз відносно гетерогенності зарядів (наприклад, катіонообмінна хроматографія або капілярний зональний електрофорез), мас-спектрометрія і т.д.) Кількість варіанту антитіла в композиції звичайно знаходиться в діапазоні від кількості, яка складає нижню межу визначення в аналізі (переважно катіонообмінному аналізі), що використовується для визначення варіанту, до кількості, яка менша ніж кількість антитіла головного типу. Звичайно приблизно 20 % або менше (наприклад, від 1 % до приблизно 15 %, наприклад, від 5 % до приблизно 15 % і переважно приблизно від 8 % до приблизно 12 %) від кількості молекул антитіла в композиції містять подовження у вигляді амінокінцевого лідера. Таку кількість у відсотках переважно визначають, використовуючи катіонообмінний аналіз. Передбачаються додаткові зміни амінокислотної послідовності антитіла головного типу і/або варіанту, включаючи без обмеження антитіло, що містить С-кінцевий залишок лізину на одному або двох важких ланцюгах (такий варіант антитіла може бути присутнім у кількості приблизно від 1 % до приблизно 20 %), антитіло з одним або декількома окисленими залишками метіоніну (наприклад, пертузумаб, що містить окислений met-254) і т.д. Крім того, крім сіалілованого варіанту, що обговорювався вище, антитіло головного типу або варіант можуть додатково містити варіанти глікозилювання, ті, що не обмежують приклади яких включають антитіло, що містить олігосахаридну структуру G1 або G2, зв'язану з його Fcділянкою, антитіло, що містить вуглеводний залишок, зв'язаний із його легким ланцюгом (наприклад один або два вуглеводних залишки, таких як глюкоза або галактоза, зв'язаних з одним або двома легкими ланцюгами антитіла, наприклад, зв'язаних з одним або декількома залишками лізину), антитіло, що містить один або два неглікозильованих важких ланцюги, і т.д. Необов'язкове антитіло, що містить один або два легких ланцюги, при цьому будь-який один або обидва легких ланцюги містять амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 23 (включаючи його варіанти, такі як варіанти, описані в даній публікації). Антитіло додатково містить один або два важких ланцюги, при цьому будь-який один або обидва важких ланцюги містять амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 16 або SEQ ID NO: 24 (включаючи його варіанти, такі як варіанти, описані в даній публікації). Композиція може бути одержана з генетично сконструйованої лінії клітин, наприклад, лінії клітин яєчника китайського хом'ячка (CHO),що експресує HER2-антитіло, або може бути одержана пептидним синтезом. III. Одержання HER2-антитіл Опис, що йде далі, наведений для ілюстрації способів одержання антитіл, що 18 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовуються згідно з даним винаходом. HER2-антигенний, що використовується для одержання антитіл, може являти собою наприклад розчинну форму позаклітинного домену HER2 або його частини, що містить необхідний епітоп. Альтернативно для створення антитіл можна використати клітини, що експресують HER на своїй клітинній поверхні (наприклад, клітини NIH-3T3, трансформовані для надекспресії HER2; або лінію клітин карциноми, таку як клітини SK-BR-3, див. Stancovski et al., PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991)). Інші форми HER2, застосовні для створення антитіла, будуть очевидними для фахівців у даній галузі. (i) Моноклональні антитіла Моноклональні антитіла одержують із популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають популяцію, є ідентичними і/або зв'язують один і той же епітоп, за винятком можливих варіантів, які можуть виникати під час одержання моноклонального антитіла, таких як варіанти, описані в даній публікації. Таким чином, визначення "моноклональне" вказує на характер антитіла, як антитіла, що не є сумішшю дискретних антитіл. Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням способу на основі гібридом, уперше описаному Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), або можуть бути одержані способами на основі рекомбінантної ДНК (патент США № 4816567). У способі на основі гібридом мишу або іншу придатну тварину-хазяїна, такого як хом'ячок, імунізують як описано вище, щоб спричинити появу лімфоцитів, які продукують або здатні продукувати антитіла, які будуть специфічно зв'язуватися з білком, що використовується для імунізації. Альтернативно лімфоцити можна імунізувати in vitro. Потім лімфоцити зливають із клітинами мієломи, використовуючи придатний агент для зливання, такий як поліетиленгліколь, щоб утворити гібридомну клітину (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59103 (Academic Press, 1986)). Одержані таким чином клітини гібридоми висівають і вирощують у придатному культуральному середовищі, яке переважно містить одну або декілька речовин, які інгібують ріст або життєздатність незлитих вихідних клітин мієломи. Наприклад, якщо в вихідних клітинах мієломи відсутній фермент гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансфераза (HGPRT або HPRT), то в культуральне середовище для гібридом звичайно будуть включати гіпоксантин, аміноптерин і тимідин (середовище HAT), і такі речовини запобігають росту HGPRT-дефіцитних клітин. Переважні клітини мієломи являють собою клітини, які ефективно зливаються, підтримують на стабільно високому рівні продукцію антитіл відібраними продукуючими антитіла клітинами і чутливі до такого середовища, як середовище HAT. Серед них переважними лініями клітин мієломи є лінії клітин мієломи мишей, такі як лінії, одержані з пухлин мишей MOPC-21 і MPC-11, доступних із Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, і клітини SP-2 або X63-Ag8-653, доступні з Американської колекції типів культур, Rockville, Maryland USA. Лінії клітин мієломи людини і гетеромієломи миші-людини також були описані для одержання моноклональних антитіл людини (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); і Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Культуральне середовище, в якому вирощують клітини гібридоми, аналізують стосовно продукції моноклональних антитіл, спрямованих проти антигену. Переважно специфічність зв'язування моноклональних антитіл, продукованих клітинами гібридоми, визначають за допомогою імунопреципітації або аналізом зв'язування in vitro, таким як радіоімуноаналіз (РІА) або твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA). Афінність зв'язування моноклонального антитіла, наприклад, можна визначити аналізом за Скетчардом, як описано в Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980). Після того, як встановлено, що клітини гібридоми продукують антитіла необхідної специфічності, афінності і/або активності, клони можуть бути субклоновані способами лімітуючого розведення і вирощені стандартними способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Придатні культуральні середовища для зазначеної мети включають, наприклад, середовище D-MEM або RPMI-1640. Крім того, клітини гібридоми можуть бути вирощені in vivo у вигляді асцитних пухлин у тварини. Моноклональні антитіла, секретовані субклонами, відповідним чином відділяють від культурального середовища, асцитної рідини або сироватки звичайними способами очищення антитіл, такими як, наприклад, хроматографія з використанням білок А-сефарози, гідроксилапатиту, гель-електрофорез, діаліз або афінна хроматографія. ДНК, що кодує моноклональні антитіла легко виділяють і секвенують, використовуючи звичайні способи (наприклад, використовуючи олігонуклеотидні зонди, які здатні специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкі і легкі ланцюги мишачих антитіл). Клітини гібридоми служать як переважне джерело такої ДНК. Після виділення ДНК може бути вміщена в 19 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресуючі вектори, які потім трансфікують у клітини-хазяїни, такі як клітини Е. coli, клітини мавп COS, клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO) або клітини мієломи, які в іншому випадку не продукують білок антитіла, щоб одержати синтез моноклональних антитіл у рекомбінантних клітинах-хазяїнах. Оглядові статті про рекомбінантну експресію в бактеріях ДНК, що кодує антитіло, включають Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) і Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992). У наступному варіанті моноклональні антитіла або фрагменти антитіл можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл, створених із використанням способу, описаного в публікаціях McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). В Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) і Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) описане виділення мишачих і людських антитіл, відповідно, із використанням фагових бібліотек. У подальших публікаціях описане одержання високо афінних (нМ-діапазон) антитіл людини за допомогою перетасовування ланцюгів (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), а також комбінаторна інфекція і рекомбінація in vivo як методика конструювання дуже великих фагових бібліотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Таким чином, зазначені способи є прийнятною альтернативою традиційним способам на основі продукуючих моноклональні антитіла гібридом для виділення моноклональних антитіл. ДНК також може бути модифікована, наприклад підстановкою кодуючої послідовності константних доменів важкого і легкого ланцюгів людини замість гомологічних мишачих послідовностей (патент США № 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)) або ковалентним зв'язуванням із кодуючою імуноглобулін послідовністю всією або частини послідовності, що кодує неімуноглобуліновий поліпептид. Звичайно такими неімуноглобуліновими поліпептидами замінюють константні домени антитіла, або ними замінюють варіабельні домени однієї антигензв'язуючої ділянки антитіла, щоб створити химерне бівалентне антитіло, що містить одну антигензв'язуючу ділянку, що має специфічність стосовно одного антигену, та іншу антигензв'язуючу ділянку, що має специфічність стосовно іншого антигену. (ii) Гуманізовані антитіла Способи гуманізації антитіл тварин, що відрізняються від людини, описані в даній галузі. Переважно гуманізоване антитіло має один або декілька амінокислотних залишків, введених у нього з джерела, яке відрізняється від людини. Зазначені амінокислотні залишки тварини, що відрізняється від людини, часто називають залишками, що "імпортуються", які звичайно беруть із варіабельного домену, що "імпортується". Гуманізацію можна по суті виконати, слідуючи способу Вінтера і співавторів (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), заміною послідовностями гіперваріабельних ділянок відповідних послідовностей антитіла людини. Відповідно такі "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами (патент США № 4816567), в яких значно менша частина, ніж інтактний варіабельний домен людини, була замінена відповідною послідовністю виду, що відрізняється від людини. На практиці гуманізовані антитіла звичайно являють собою антитіла людини, в яких деякі залишки гіперваріабельної ділянки і можливо деякі залишки FR замінені залишками з аналогічних ділянок антитіл гризунів. Вибір варіабельних доменів людини, як легкого, так і важкого ланцюга, антитіл, що використовуються для одержання гуманізованих, дуже важливий для зниження антигенності. Згідно з так званим способом "оптимальної підгонки" послідовність варіабельного домену антитіла гризуна піддають скринінгу в порівнянні з повною бібліотекою відомих послідовностей варіабельних доменів людини. Послідовність людини, яка найбільш близька до послідовності гризуна, потім беруть як каркасну ділянку (FR) людини для гуманізованого антитіла (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). В іншому способі використовують конкретну каркасну ділянку, одержану з консенсусної послідовності всіх антитіл людини конкретної підгрупи легких або важких ланцюгів. Один і той же каркас можна використати для декількох різних гуманізованих антитіл (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)). Крім того, важливо щоб антитіла були гуманізовані зі збереженням високої афінності стосовно антигену та інших сприятливих біологічних властивостей. Для досягнення зазначеної мети згідно з переважним способом гуманізовані антитіла одержують, проводячи аналіз початкових послідовностей і різних концептуальних гуманізованих продуктів із використанням трьохмірних моделей початкових і гуманізованих послідовностей. Трьохмірні моделі імуноглобулінів загальнодоступні та відомі фахівцям у даній галузі. Доступні комп'ютерні програми, які ілюструють і показують можливі трьохмірні конформаційні структури вибраних для дослідження послідовностей імуноглобуліну. Дослідження таких зображень дозволяє 20 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проаналізувати вірогідну роль залишків у функціонуванні вибраної для дослідження послідовності імуноглобуліну, тобто аналізувати залишки, які впливають на здатність вибраного для дослідження імуноглобуліну зв'язувати відповідний йому антиген. Таким чином можуть бути вибрані та об'єднані залишки FR із реципієнтних послідовностей і послідовностей, що імпортуються так, щоб досягнути необхідних характеристик антитіла, таких як підвищена афінність стосовно антигену(нів)-мішені. Загалом, залишки гіперваріабельної ділянки безпосередньо і в найбільшому ступені впливають на зв'язування антигена. У патенті США № 6949245 описане одержання типових гуманізованих HER2-антитіл, які зв'язують HER2 і блокують активацію рецептора HER лігандом. Гуманізоване антитіло, що становить особливий інтерес згідно з винаходом, блокує опосередковану EGF, TGF-α і/або HRG активацію MAPK по суті так само ефективно, як і мишаче моноклональне антитіло 2C4 (або його Fab-фрагмент), і/або зв'язує HER2 по суті так само ефективно, як і мишаче моноклональне антитіло 2C4 (або його Fab-фрагмент). Гуманізоване антитіло згідно з винаходом може, наприклад, містити залишки гіперваріабельної ділянки тварини, що відрізняється від людини, включені у варіабельний домен важкого ланцюга людини, і може додатково містити заміну в каркасній ділянці (FR) у положенні, вибраному з групи, що складається з 69H, 71H і 73H, використовуючи систему нумерації варіабельного домену, наведену у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). В одному варіанті гуманізоване антитіло містить заміни в FR у двох або у всіх положеннях 69H, 71H і 73H. Типове гуманізоване антитіло, що представляє інтерес згідно з винаходом, містить визначальні комплементарність залишки варіабельного домену важкого ланцюга GFTFTDYTMX, де X переважно означає D або S (SEQ ID NO: 7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO:8) і/або NLGPSFYFDY (SEQ ID NO:9), що необов'язково містять амінокислотні модифікації таких залишків CDR, наприклад модифікації, що по суті зберігають або підвищують афінність антитіла. Наприклад, варіант антитіла, що становить інтерес, може мати приблизно від одного до семи або приблизно п'ять амінокислотних замін у зазначеній вище послідовності CDR варіабельного домену важкого ланцюга. Такі варіанти антитіл можуть бути одержані дозріванням афінності, наприклад як описано нижче. Найбільш переважне гуманізоване антитіло містить амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 4. Гуманізоване антитіло може містити залишки визначальної комплементарність ділянки варіабельного домену легкого ланцюга KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 10); SASYX1 × 2X3, де X1 переважно означає R або L, X2 переважно означає Y або Е, і X3 переважно означає Т або S (SEQ ID NO: 11); і/або QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12), наприклад, додатково до залишків CDR варіабельного домену важкого ланцюга, зазначених у попередньому абзаці. Такі гуманізовані антитіла необов'язково містять амінокислотні модифікації зазначених вище залишків CDR, наприклад модифікації, що по суті зберігають або підвищують афінність антитіла. Наприклад, варіант антитіла, що становить інтерес, може мати приблизно від однієї до семи або приблизно п'ять амінокислотних замін у зазначених вище послідовностях CDR варіабельного домену легкого ланцюга. Такі варіанти антитіл можуть бути одержані дозріванням афінності, наприклад як описано нижче. Найбільш переважне гуманізоване антитіло містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 3. Дана заявка також стосується антитіл із дозрілою афінністю, які зв'язують HER2 і блокують активацію рецептора HER лігандом. Початковим антитілом може бути антитіло людини або гуманізоване антитіло, наприклад антитіло, що містить послідовності варіабельного домену легкого і/або важкого ланцюга SEQ ID No. 3 і 4, відповідно (тобто варіанту 574). Афінно дозріле антитіло переважно зв'язується з рецептором HER2 з афінністю, що перевершує афінність мишачого 2C4 або варіанту 574 (наприклад, приблизно в два або приблизно в чотири рази підвищена афінність та афінність, підвищена приблизно в 100 разів або приблизно в 1000 разів, що наприклад оцінюється з використанням ELISA HER2-позаклітинного домену (ECD)). Типові залишки CDR варіабельного домену важкого ланцюга для заміни включають H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 або поєднання двох або більш (наприклад, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести або семи зазначених залишків). Приклади залишків CDR варіабельного домену легкого ланцюга для зміни включають L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 або поєднання двох або більше (наприклад, від двох до трьох, чотирьох, п'яти або до десяти зазначених залишків). Розглядаються різні форми гуманізованого антитіла або афінно дозрілого антитіла. Наприклад, гуманізоване антитіло або афінно дозріле антитіло може являти собою фрагмент антитіла, такий як Fab, який необов'язково кон'югований з одним або декількома 21 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цитотоксичними засобами, щоб створити імунокон'югат. Альтернативно гуманізоване антитіло або афінно дозріле антитіло може являти собою інтактне антитіло, таке як інтактне IgG1антитіло. (iii) Людські антитіла Як альтернатива гуманізації можуть бути створені людські антитіла. Наприклад, у цей час можна одержувати трансгенних тварин (наприклад, мишей), які здатні після імунізації продукувати повний репертуар антитіл людини за відсутності продукції ендогенних імуноглобулінів. Наприклад, описано, що гомозиготна делеція гена з'єднуючої ділянки важкого ланцюга (JH) антитіла у химерних і мутантних по зародковій лінії мишей призводить до повного інгібування продукції ендогенних антитіл. Перенесення ряду генів імуноглобуліну зародкової лінії людини в таких мутантних по зародковій лінії мишей буде призводити до продукції антитіл людини при антигенній стимуляції. Див., наприклад, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); і патенти США No. 5591669, 5589369 і 5545807. Альтернативно можна використати методику фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)) для одержання людських антитіл і фрагментів антитіл in vitro з репертуару генів варіабельних (V) доменів імуноглобуліну від неімунізованих донорів. Згідно з зазначеним способом гени V-доменів антитіл клонують у рамці з геном або основного, або мінорного білка оболонки нитчастого бактеріофага, такого як M13 або fd, і виводять у вигляді функціональних фрагментів антитіл на поверхню фагової частинки. Оскільки нитчаста частинка містить однонитчасту копію ДНК фагового геному, то селекція на основі функціональних властивостей антитіла також призводить до селекції гена, що кодує антитіло, яке виявляє такі властивості. Таким чином, фаг імітує деякі властивості В-клітини. Фаговий дисплей може бути виконаний у різних формах, огляд яких наведений, наприклад, у Johnson, K. S. and Chiswell, D. J., Current Opinion. in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Для фагового дисплея можна використати декілька джерел ділянок V-генів. Наприклад, Clackson зі співавторами (Nature, 352: 624-628 (1991)) виділили ряд різноманітних антитіл проти оксазолону з невеликої випадкової комбінаторної бібліотеки V-генів, одержаної із селезінок імунізованих мишей. Можна сконструювати репертуар V-генів неімунізованих людей донорів і можна виділити антитіла до ряду різноманітних антигенів (включаючи автоантигени), по суті слідуючи, наприклад, способу, описаному Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) або Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). Див. також патенти США № 5565332 і 5573905. Антитіла людини також можуть бути утворені активованими in vitro В-клітинами (див. патенти США 5567610 і 5229275). HER2-антитіла людини описані в патенті США No. 5772997, опублікованому 30 червня 1998, і у WO 97/00271, опублікованій 3 січня 1997. (iv) Фрагменти антитіл Розроблені різні способи одержання фрагментів антитіл. Традиційно такі фрагменти одержували внаслідок протеолітичного розщеплення інтактних антитіл (див., наприклад, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) і Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Однак у цей час такі фрагменти можуть безпосередньо продукуватися рекомбінантними клітинами-хазяїнами. Наприклад, фрагменти антитіл можуть бути виділені з фагових бібліотек антитіл, що обговорюються вище. Альтернативно Fab-SH-фрагменти можуть бути безпосередньо витягнуті з клітин Е. coli і хімічно зв'язані з утворенням F(ab)2-фрагментів (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Згідно з іншим способом F(ab)2-фрагменти можуть бути виділені безпосередньо з культури рекомбінантних клітин-хазяїнів. Інші способи одержання фрагментів антитіл будуть відомі фахівцеві в даній галузі. В інших варіантах переважне антитіло являє собою одноланцюговий Fv-фрагмент (scFv). Див. WO 93/16185, патент США № 5571894 і патент США № 5587458. Фрагмент антитіла також може являти собою "лінійне антитіло", наприклад таке, як описано в патенті США 5641870. Такі лінійні фрагменти антитіл можуть бути моноспецифічними або біспецифічними. (v) Біспецифічні антитіла Біспецифічні антитіла являють собою антитіла, які мають специфічність зв'язування, принаймні, до двох різних епітопів. Приклади біспецифічних антитіл можуть зв'язуватися з двома різними епітопами білка HER. В інших таких антитілах сайт зв'язування HER2 може бути об'єднаний зі сайтом (сайтами) зв'язування EGFR, HER3 і/або HER4. Альтернативно плече до HER2 можна об'єднати з плечем, яке зв'язується із молекулою на лейкоциті, що запускає, такою як молекула Т-клітинного рецептора (наприклад, CD2 або CD3), або Fc-рецепторами для IgG (FcγR), такими як FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) і FcγRIII (CD16), для того щоб сфокусувати механізми клітинного захисту на HER2-експресуючій клітині. Біспецифічні антитіла також можна 22 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використати для локалізації цитотоксичних засобів поблизу клітин, які експресують HER2. Зазначені антитіла мають HER2-зв'язуюче плече і плече, яке зв'язує цитотоксичний засіб (наприклад, сапонін, анти-інтерферон-α, алкалоїд барвінку, ланцюг А рицину, метотрексат або гаптен радіоактивного ізотопу). Біспецифічні антитіла можуть бути одержані у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл (наприклад, біспецифічні F(ab)2-антитіла). У WO 96/16673 описане біспецифічне HER2/FcγRIII-антитіло, і в патенті США № 5837234 описане біспецифічне HER2/FcγRI-антитіло IDM1 (Osidem). Біспецифічне HER2/Fcγ-антитіло показане в WO98/02463. У патенті США № 5821337 описане біспецифічне HER2/CD3-антитіло. MDX-210 є біспецифічним HER2-FcγRIII-Ат. Способи одержання біспецифічних антитіл відомі в даній галузі. Традиційне одержання повнорозмірних біспецифічних антитіл засноване на коекспресії двох пар важкий ланцюг-легкий ланцюг імуноглобуліну, при цьому два ланцюги мають різну специфічність (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Внаслідок випадкового вибору важких і легких ланцюгів імуноглобуліну такі гібридоми (квадроми) продукують можливу суміш 10 різних молекул антитіл, з яких тільки одна має правильну біспецифічну структуру. Очищення правильної молекули, яку звичайно здійснюють, використовуючи стадії афінної хроматографії, є досить громіздким, а виходи продукту низькими. Схожі способи описані в WO 93/08829 і в Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991). Згідно з іншим способом варіабельні домени антитіл із необхідною специфічністю зв'язування (ділянки зв'язування антитіло-антиген) зливають із послідовностями константних доменів імуноглобуліну. Зливання переважно здійснюють із константним доменом важкого ланцюга імуноглобуліну, що містить, принаймні, частину шарнірної ділянки, ділянок CH2 і CH3. Переважно мати першу константну ділянку важкого ланцюга (C H1), що містить сайт, необхідний для зв'язування легкого ланцюга, присутній, принаймні, в одному із зливань. ДНК, що кодують зливання важкого ланцюга імуноглобуліну і у разі необхідності легкого ланцюга імуноглобуліну, вбудовують в окремі експресуючі вектори і котрансфікують у придатний організм хазяїна. Це дає велику гнучкість при коректуванні взаємних співвідношень трьох поліпептидних фрагментів у таких варіантах, коли нерівні співвідношення трьох поліпептидних ланцюгів, що використовуються в конструкції, дають оптимальні виходи. Однак можна вбудовувати кодуючі послідовності для двох або всіх трьох поліпептидних ланцюгів в один експресуючий вектор у тому випадку, коли експресія, принаймні, двох поліпептидних ланцюгів у рівних співвідношеннях дає високі виходи або коли співвідношення не мають особливого значення. У переважному варіанті зазначеного способу біспецифічні антитіла складаються з гібридного важкого ланцюга імуноглобуліну з першою специфічністю зв'язування в одному плечі і гібридної пари важкого ланцюга-легкого ланцюга імуноглобуліну (що забезпечує другу специфічність зв'язування) в іншому плечі. Виявлено, що така асиметрична структура полегшує відділення необхідної біспецифічної сполуки від небажаних поєднань ланцюгів імуноглобуліну, оскільки наявність легкого ланцюга імуноглобуліну тільки в одній половині біспецифічної молекули забезпечує простий спосіб розділення. Такий спосіб описаний в WO 94/04690. Більш детальний опис створення біспецифічних антитіл див., наприклад, у Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). Згідно з іншим способом, описаним у патенті США № 5731168, ділянка контакту між парою молекул антитіл може бути сконструйована так, щоб максимізувати відсоток гетеродимерів, які витягують із культури рекомбінантних клітин. Переважна ділянка контакту містить, принаймні, частину домену CH3 константного домену антитіла. У зазначеному способі один або декілька невеликих бічних ланцюгів амінокислот із ділянки контакту першої молекули антитіла замінюють більш великими бічними ланцюгами (наприклад, тирозину або триптофану). Створюють компенсувальні "западини", що мають розмір ідентичний або схожий із розміром великого бічного ланцюга(ланцюгів), на ділянці контакту другої молекули антитіла, замінюючи великі бічні ланцюги амінокислот меншими бічними ланцюгами (наприклад аланіну або треоніну). Це забезпечує механізм збільшення виходу гетеродимеру в порівнянні з іншими небажаними кінцевим продуктами, такими як гомодимери. Біспецифічні антитіла включають поперечно зшиті антитіла або "гетерокон'югати" антитіл. Наприклад, одне з антитіл в гетерокон'югаті може бути зв'язане з авідином, інше з біотином. Такі антитіла, наприклад, були запропоновані для спрямування клітин імунної системи до небажаних клітин (патент США № 4676980) і для лікування ВІЛ-інфекції (WO 91/00360, WO 92/200373 і EP 03089). Гетерокон'юговані антитіла можуть бути одержані з використанням будьякого зручного способу утворення поперечних зшивань. Відповідні агенти, що поперечно зшивають, добре відомі в даній галузі та описані в патенті США № 4676980 нарівні з описом ряду способів утворення поперечних зшивань. 23 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Способи створення біспецифічних антитіл з фрагментів антитіл також описані в літературі. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть бути одержані з використанням хімічного зв'язування. Brennan зі співавторами (Science, 229: 81 (1985)) описують спосіб, при якому інтактні антитіла протеолітично розщеплюють, щоб створити F(ab)2-фрагменти. Одержані фрагменти відновлюють в присутності агента, що створює комплекси дитіолу, арсеніту натрію, щоб стабілізувати сусідні дитіоли і запобігти утворенню міжмолекулярного дисульфіду. Потім створені Fab-фрагменти перетворюють у похідні тіонітробензоату (TNB). Один із Fab-TNBпохідних потім знову перетворюють у Fab-тіол відновленням із використанням меркаптоетиламіну і змішують з еквімолярною кількістю іншого Fab-TNB-похідного з утворенням біспецифічного антитіла. Одержані біспецифічні антитіла можна використати як агенти для вибіркової іммобілізації ферментів. Недавні досягнення полегшили пряме витягання Fab-SH-фрагментів із Е. coli, які можуть бути хімічно зв'язані з утворенням біспецифічних антитіл. У публікації Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) описане одержання повністю гуманізованої молекули біспецифічного антитіла на основі F(ab)2. Кожен Fab-фрагмент окремо секретувався з клітин Е. coli, і його піддавали хімічному зв'язуванню in vitro з утворенням біспецифічного антитіла. Утворене таким чином біспецифічне антитіло здатне зв'язуватися з клітинами, надекспресуючими рецептор HER2, і нормальними Т-клітинами людини, а також запускати літичну активність цитотоксичних лімфоцитів людини проти пухлинних мішеней молочної залози людини. Також описані різні способи одержання і виділення біспецифічних фрагментів антитіл безпосередньо з культури рекомбінантних клітин. Наприклад, були одержані біспецифічні антитіла з використанням лейцинових блискавок. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Пептиди лейцинової блискавки з білків Fos і Jun зв'язували з Fab-частинами двох різних антитіл за допомогою зливання генів. Гомодимери антитіл відновлювали в шарнірній ділянці, щоб утворити мономери, і потім знову окисляли з утворенням гетеродимерів антитіл. Такий спосіб також можна використати для одержання гомодимерів антитіл. Спосіб "діантитіл", описаний у публікації Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), забезпечив альтернативний механізм одержання біспецифічних фрагментів антитіл. Фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), зв'язаний із варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) лінкер, який дуже короткий, щоб забезпечити можливість спаровування між двома доменами на одному і тому ж ланцюгу. Відповідно домени V H і VL одного фрагмента вимушені спаровуватися з комплементарними доменами VL і VH іншого фрагмента, утворюючи при цьому дві антигензв'язуючі ділянки. Також повідомлялося про іншу методику одержання біспецифічних фрагментів антитіл із використанням димерів одноланцюгового Fv (sFv). Див. Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994). Передбачаються антитіла з більше ніж двома валентностями. Наприклад, можуть бути одержані триспецифічні антитіла. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). (vi) Інші модифікації амінокислотної послідовності Пропонується модифікація(ії) амінокислотних послідовностей HER2-антитіл, описаних у даній публікації. Наприклад, може бути бажаним поліпшення афінності зв'язування і/або інших біологічних властивостей антитіла. Варіанти амінокислотної послідовності HER2-антитіла одержують введенням відповідних змін нуклеотидів у нуклеїнову кислоту HER2-антитіла або пептидним синтезом. Такі модифікації включають, наприклад, делеції і/або інсерції і/або заміни залишків в амінокислотних послідовностях HER2-антитіла. Здійснюють будь-яке поєднання делеції, інсерції і заміни, щоб одержати кінцеву конструкцію, за умови, що кінцева конструкція має необхідні характеристики. Зміни амінокислот також можуть змінювати посттрансляційні процеси в HER2-антитілі, такі як зміна кількості або положення сайтів глікозилювання. Застосовний спосіб ідентифікації деяких залишків або ділянок HER2-антитіла, які є переважними ділянками для мутагенезу, називають "мутагенезом із використанням сканування аланіном", який описаний Cunningham and Wells Science, 244: 1081-1085 (1989). У цьому випадку ідентифікують залишок або групу залишків-мішеней (наприклад, заряджених залишків, таких як arg, asp, his, lys і glu) і замінюють нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (найпереважніше аланіном або поліаланіном), щоб вплинути на взаємодію амінокислот з антигеном HER2. Ті ділянки амінокислот, які виявляють функціональну чутливість до замін, потім поліпшують введенням додаткових або інших варіантів у ділянки або замість ділянок заміни. Таким чином, хоча ділянку введення варіанту амінокислотної послідовності попередньо визначають, немає необхідності в попередньому визначенні природи мутації як такої. Наприклад, щоб проаналізувати ефективність мутації в даній ділянці проводять alaсканування або випадковий мутагенез у кодоні-мішені або ці мішені та експресовані варіанти HER2-антитіл піддають скринінгу стосовно необхідної активності. 24 UA 104585 C2 5 10 15 Інсерції в амінокислотних послідовностях включають зливання з аміно- і/або карбоксильним кінцем довжиною в діапазоні від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше залишків, а також інсерції всередині послідовності одного або декількох амінокислотних залишків. Приклади кінцевих інсерцій включають HER2-антитіло з N-кінцевим залишком метіонілу або антитіло, злите з цитотоксичним поліпептидом. Інші інсерційні варіанти молекули HER2-антитіла включають зливання N- або С-кінця HER2-антитіла з ферментом (наприклад, у випадку ADEPT) або поліпептидом, який збільшує час напівжиття антитіла в сироватці. Варіантом іншого типу є варіант з амінокислотними замінами. Такі варіанти мають, принаймні, один амінокислотний залишок у молекулі HER2-антитіла, замінений іншим залишком. Місця, що становлять найбільший інтерес для мутагенезу шляхом замін, включають гіперваріабельні ділянки або CDR, але також передбачаються зміни і в ділянці FR або Fс. Консервативні заміни показані в таблиці 1 під заголовком "переважні заміни". Якщо такі заміни призводять до зміни біологічної активності, то можуть бути введені додаткові істотні зміни, названі "прикладами замін" у таблиці 1, або зміни, додатково описані нижче при описі класів амінокислот, і може бути проведений скринінг продуктів. Таблиця 1 Початковий залишок Ala (А) Arg(R) Asn(N) Asp (D) Cys (С) Gln(Q) Glu (Е) Gly(G) His (Н) Ile (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe(F) Pro (Р) Ser(S) Thr (Т) Trp(W) Tyr(Y) Val (V) 20 25 30 35 Приклади заміни Val; Leu; Ile Lys; Gin; Asn Gin; His; Asp, Lys; Arg Glu; Asn Ser; Ala Asn; Glu Asp; Gin Ala Asn; Gin; Lys; Arg Leu; Val; Met; Ala; Phe; Норлейцин Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe Arg; Gin; Asn Leu; Phe; Ile Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Ala Thr Val; Ser Tyr; Phe Trp; Phe; Thr; Ser Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин Переважні заміни Val Lys Gin Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu Ile Arg Leu Tyr Ala Thr Ser Tyr Phe Leu Істотні модифікації біологічних властивостей антитіла здійснюють відбором замін, які істотно відрізняються за своїм впливом на підтримку (a) структури поліпептидного остова в ділянці заміни, наприклад, у вигляді шаруватої або спіральної конформації, (b) заряду або гідрофобності молекули в сайті-мішені, або (с) величини бічного ланцюга. Амінокислоти можуть бути згруповані у відповідності з подібністю у властивостях їхніх бічних ланцюгів (в A. L. Lehninger, Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) неполярні: Ala (А), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (Р), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) незаряджені полярні: Gly (G), Ser (S), Thr (Т), Cys (З), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) кислі: Asp (D), Glu (Е) (4) основні: Lys (K), Arg (R), His(Н) Альтернативно залишки, що зустрічаються в природі можуть бути розділені на групи на основі загальних властивостей бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) кислі: Asp, Glu; (4) основні: His, Lys, Arg; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: Gly, Pro; (6) ароматичні: Trp, Tyr, Phe. 25 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Неконсервативні заміни спричиняють за собою заміну представника одного з зазначених класів представником іншого класу. Будь-який залишок цистеїну, не залучений до підтримки правильної конформації HER2антитіла, також може бути замінений, звичайно серином, щоб підвищити стабільність молекули до окислення і запобігти аномальному поперечному зшиванню. Навпаки, може бути доданий цистеїновий зв'язок (зв'язки) до антитіла, щоб підвищити його стабільність (особливо коли антитіло являє собою фрагмент антитіла, такий як Fv-фрагмент). Особливо переважний тип варіанту із замінами містить заміну одного або декількох залишків гіперваріабельної ділянки вихідного антитіла (наприклад, гуманізованого антитіла або антитіла людини). Загалом, одержаний у результаті варіант(ти), відібрані для подальшої розробки, будуть мати поліпшені біологічні властивості в порівнянні з початковим антитілом, з якого вони створені. Таким способом створення таких варіантів із замінами полягає в дозріванні афінності з використанням фагового дисплея. Коротко, декілька сайтів гіперваріабельної ділянки (наприклад 6-7 сайтів) піддають мутаціям, щоб створити всі можливі амінокислотні заміни в кожному сайті. Одержані таким чином варіанти антитіла представляють у вигляді дисплея в моновалентній формі на частинках нитчастого фага у вигляді зливання з продуктом гена III M13, упакованого в кожній частинці. Представлені у фаговому дисплеї варіанти потім піддають скринінгу щодо їхньої біологічної активності (наприклад, афінності зв'язування), як описано в даній публікації. Щоб ідентифікувати придатні для модифікації сайти гіперваріабельної ділянки можна здійснити мутагенез за допомогою сканування аланіном, ідентифікуючи залишки гіперваріабельної ділянки, що роблять істотний внесок у зв'язування антигену. Альтернативно або додатково може бути корисним аналіз кристалічної структури комплексу антиген-антитіло, щоб ідентифікувати точки контакту між антитілом і HER2 людини. Такі залишки в ділянці контакту і сусідні залишки є кандидатами на заміну способами, розробленими згідно з винаходом. Після створення таких варіантів панель варіантів піддають скринінгу як описано в даній публікації і антитіла з властивостями, що перевищують, в одному або декількох придатних аналізах можна відібрати для подальшої розробки. В іншому типі амінокислотного варіанту антитіла змінена початкова картина глікозилювання антитіла. Під зміною мають на увазі делецію одного або декількох вуглеводних залишків, виявлених в антитілі, і/або додавання одного або декількох сайтів глікозилювання, які не присутні в антитілі. Глікозилювання антитіл звичайно є або N-зв'язаним, або О-зв'язаним. N-зв'язане стосується зв'язування вуглеводного залишку з бічним ланцюгом залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серін і аспарагін-Х-треонін, де X означає будь-яку амінокислоту, за винятком проліну, є послідовностями пізнавання для ферментативного зв'язування вуглеводного залишку з бічним ланцюгом аспарагіну. Таким чином, присутність будь-якого з зазначених трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. О-зв'язане глікозилювання стосується зв'язування одного з цукрів Nацетилгалактозаміну, галактози або ксилози з гідроксіамінокислотою, частіше за все серином або треоніном, хоч також можна використати 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Додавання сайтів глікозилювання до антитіла звичайно здійснюють за допомогою зміни амінокислотної послідовності, так щоб вона містила одну або декілька з описаних вище трипептидних послідовностей (для сайтів N-зв'язаного глікозилювання). Зміну також можна здійснити додаванням або заміною одного або декількох залишків серину або треоніну до послідовності вихідного антитіла (для сайтів О-зв'язаного глікозилювання). У тому випадку, коли антитіло містить Fc-ділянку, може бути змінений зв'язаний із ним вуглевод. Наприклад, антитіла зі зрілою вуглеводною структурою, в якій втрачена фукоза, зв'язана з Fc-ділянкою антитіла, описані в заявці на видачу патенту США № US 2003/0157108 A1, Presta, Антитіла з N-ацетилглюкозаміном (GlcNAc), що розгалужується в олігосахаридній структурі, зв'язаній із Fc-ділянкою антитіла, описані в WO 03/011878, Jean-Mairet et al. і в патенті США No. 6602684, Umana et al. Антитіла, принаймні, з одним залишком галактози в олігосахаридній структурі, зв'язаній із Fc-ділянкою антитіла, описані в WO97/30087, Patel et al. Див., також заявки на видачу патенту WO98/58964 (Raju, S.) і WO99/22764 (Raju, S.), що стосуються антитіл зі зміненим вуглеводом, зв'язаним з їхньою Fc-ділянкою. У даному винаході передбачаються композиції антитіл, що містять антитіло головного типу з такими вуглеводними структурами, зв'язаними з одним або двома важкими ланцюгами Fc-ділянки. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують варіанти амінокислотної послідовності HER2антитіла, одержують різними способами, відомими в даній галузі. Такі способи включають без обмеження виділення з природного джерела (у разі варіантів амінокислотної послідовності, що зустрічаються в природі) або одержання з використанням опосередкованого олігонуклеотидами 26 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (або сайт-специфічного) мутагенезу, ПЛР-мутагенезу і касетного мутагенезу раніше одержаного варіанту або версії HER2-антитіла, що не є варіантом. (vii) Скринінг антитіл із необхідними властивостями Способи створення антитіл описані вище. Крім того, можна відібрати антитіла з певними необхідними біологічними властивостями. Щоб ідентифікувати антитіло, яке блокує активацію лігандом рецептора HER, можна визначити здатність антитіла блокувати зв'язування ліганду HER із клітинами, експресуючими рецептор HER (наприклад, кон'югований з іншим рецептором HER, з яким рецептор HER, що становить інтерес, утворює HER-гетероолігомер). Наприклад, клітини, експресуючі в природі або трансфіковані для експресії рецепторів HER HER-гетероолігомера, можна інкубувати з антитілом і потім піддати впливу міченого ліганду HER. Потім можна оцінити здатність HER2антитіла блокувати зв'язування ліганду з рецептором HER у HER-гетероолігомері. Наприклад, інгібування зв'язування HRG із лініями пухлинних клітин молочної залози MCF7 HER2-антитілами можна здійснити з використанням моношарових культур MCF7 на льодові в 24-ямковому планшеті по суті як описано в WO 01/00245. У кожну ямку можна додати 125 моноклональні HER2-антитіла та інкубувати протягом 30 хвилин. Потім можна додати Iмічений rHRG(1177-224 (25 пМ) й інкубацію можна продовжити протягом 4-16 годин. Можна одержати криві залежної від дози відповіді і можна розрахувати значення IC 50 для антитіла, що становить інтерес. В одному варіанті антитіло, яке блокує активацію лігандом рецептора HER, буде мати IC50 для інгібування зв'язування HRG із клітинами MCF7, що складає в даному аналізі приблизно 50 нМ або менше, більш переважно 10 нМ або менше. У тому випадку, коли антитіло являє собою фрагмент антитіла, такий як Fab-фрагмент, IC50 для інгібування зв'язування HRG із клітинами MCF7 у даному аналізі може, наприклад, становити приблизно 100 нМ або менше, більш переважно 50 нМ або менше. Альтернативно або додатково можна проаналізувати здатність HER2-антитіла блокувати фосфорилування тирозину рецептора HER, що стимулюється лігандом HER, присутнього в HER-гетероолігомері. Наприклад, клітини, ендогенно експресуючі рецептори HER або трансфіковані для експресії рецепторів HER, можна інкубувати з антитілом і потім оцінити активність залежного від ліганду HER фосфорилування тирозину з використанням моноклонального антитіла проти фосфотирозину (яке необов'язково кон'юговане з міткою, що реєструється). Аналіз активації кіназного рецептора, описаний у патенті США № 5766863, також придатний для визначення активації рецептора HER і блокування такої активності антитілом. В одному варіанті можна провести скринінг стосовно антитіла, яке інгібує HRG-стимуляцію фосфорилування тирозину p180 у клітинах MCF7, по суті як описано в WO01/00245. Наприклад, клітини MCF7 можна посіяти в 24-ямкові планшети і в кожну ямку додати моноклональні антитіла до HER2 та інкубувати протягом 30 хвилин при кімнатній температурі; потім у кожну ямку можна додати rHRGβ1177-244 до кінцевої концентрації 0,2 нМ й інкубацію можна продовжити протягом 8 хвилин. Середовище можна аспірувати з кожної ямки і реакції можна зупинити додаванням 100 мкл буфера для зразків із SDS (5 % SDS, 25 мМ DTT і 25 мМ трис-HCl, pH 6,8). Кожний зразок (25 мкл) можна піддати електрофорезу в 4-12 %-градієнтному гелі (Novex) і потім електрофоретично перенести на мембрану з полівінілідендифториду. Можна виявити імуноблоти антифосфотирозину (при 1 мкг/мл) і можна кількісно оцінити інтенсивність переважної реактивної смуги з Mr~180000 відбивною денситометрією. Відібране антитіло переважно буде значною мірою інгібувати HRG-стимуляцію фосфорилування тирозину p180 приблизно до 0-35 % від контролю в даному аналізі. Можна одержати криві залежної від дози відповіді стосовно інгібування HRG-стимуляції фосфорилування тирозину p180, яке визначають відбивною денситометрією, і можна розрахувати IC50 для антитіла, що становить інтерес. В одному варіанті антитіло, яке блокує активацію лігандом рецептора HER, буде мати IC 50 для інгібування HRG-стимуляції фосфорилування тирозину p180 у даному аналізі приблизно 50 нМ або менше, більш переважно 10 нМ або менше. У тому випадку, коли антитіло являє собою фрагмент антитіла, такий як Fab-фрагмент, IC50 стосовно інгібування HRG-стимуляції фосфорилування тирозину p180 у даному аналізі може, наприклад, становити приблизно 100 нМ або менше, більш переважно 50 нМ або менше. Також можна оцінити інгібуючий ріст вплив антитіла на клітини MDA-MB-175, наприклад, по суті як описано в Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997). Згідно з даним аналізом клітини MDA-MB-175 можна обробити моноклональним HER2-антитілом (10 мкг/мл) протягом 4 діб і забарвити кристалічним фіолетовим. Інкубація з HER2-антитілом може показати інгібуючий ріст вплив на зазначену лінію клітин, подібний впливу, що надається моноклональним антитілом 2C4. У наступному варіанті екзогенний HRG по суті не буде відміняти таке інгібування. Переважно антитіло буде здатне інгібувати проліферацію клітин MDA-MB-175 у більшому 27 UA 104585 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ступені, ніж моноклональне антитіло 4D5 (і необов'язково у більшому ступені, ніж моноклональне антитіло 7F3), як у присутності, так і за відсутності екзогенного HRG. В одному варіанті HER2-антитіло, що становить інтерес, може блокувати залежне від херегуліну зв'язування HER2 із HER3 як у клітинах MCF7, так і в клітинах SK-BR-3, яке визначають в експерименті з коімунопреципітації, такому як описано в WO01/00245, значною мірою більш ефективне, ніж моноклональне антитіло 4D5, і переважно значною мірою більш ефективне, ніж моноклональне антитіло 7F3. Щоб ідентифікувати HER2-антитіла, що інгібують ріст, можна провести скринінг стосовно антитіл, які інгібують ріст злоякісних клітин, які надекспресують HER2. В одному варіанті вибране антитіло, що представляє інтерес та інгібує ріст, здатне інгібувати ріст клітин SK-BR-3 у культурі клітин приблизно на 20-100 % і переважно приблизно на 50-100 % при концентрації антитіла приблизно від 0,5 до 30 мкг/мл. Щоб ідентифікувати такі антитіла можна провести аналіз SK-BR-3, описаний у патенті США № 5677171. Згідно з зазначеним аналізом клітини SKBR-3 вирощують у суміші 1:1 середовища F12 і DMEM із додаванням 10 % фетальної сироватки теляти, глутаміну і пеніциліну і стрептоміцину. Клітини SK-BR-3 висівають по 20000 клітин на чашку для культури клітин діаметром 35 мм (2 мл/чашку діаметром 35 мм). У чашку додають від 0,5 до 30 мкг/мл HER2-антитіла. Через шість днів підраховують кількість клітин у порівнянні з необробленими клітинами, використовуючи електронний лічильник клітин COULTER™. Такі антитіла, які інгібують ріст клітин SK-BR-3 приблизно на 20-100 % або приблизно на 50-100 %, можуть бути відібрані у ролі антитіл, що інгібують ріст. Див. патент США № 5677171 стосовно аналізу для скринінгу антитіл, що інгібують ріст, таких як 4D5 і 3E8. Щоб відібрати антитіла, які індукують апоптоз, є аналіз зв'язування анексину з використанням клітин BT474. Клітини BT474 культивують і висівають на чашки, як обговорювалося в попередньому абзаці. Потім середовище видаляють і замінюють тільки свіжим середовищем або середовищем, що містить 10 мкг/мл моноклонального антитіла. Після триденного періоду інкубації моношари промивають PBS і відділяють трипсинізацією. Потім 2+ клітини центрифугують, ресуспендують у зв'язуючому Ca буфері і ділять на аліквоти в пробірки як обговорюється вище для аналізу загибелі клітин. Потім у пробірки вносять мічений анексин (наприклад, анексин V-FTIC) (1 мкг/мл). Зразки можна проаналізувати з використанням проточного цитометра FACSCAN™ і комп'ютерної програми FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Антитіла, які індукують статистично значущі рівні зв'язування анексину в порівнянні з контролем, відбирають як антитіла, що індукують апоптоз. Крім аналізу зв'язування анексину існує аналіз забарвлення ДНК із використанням клітин BT474. Щоб здійснити такий аналіз клітини BT474, які були оброблені антитілом, що становить інтерес, як описано в двох попередніх абзацах, інкубують із 9 мкг/мл HOECHST 33342™ протягом 2 годин при 37С, потім аналізують на проточному цитометрі EPICS ELITE™ (Coulter Corporation), використовуючи комп'ютерну програму MODFIT LT™ (Verity Software House). Антитіла, які індукують зміну відсоткового вмісту апоптозних клітин, який у 2 рази або більше (і переважно в 3 рази або більше), ніж вміст у необроблених клітинах (аж до 100 % апоптозних клітин), можуть бути відібрані у ролі проапоптозних антитіл із використанням даного аналізу. Див. WO98/17797 стосовно аналізу скринінгу антитіл, які індукують апоптоз, таких як 7C2 і 7F3. Щоб здійснити скринінг антитіл, які зв'язуються з епітопом на HER2 антитілом, що зв'язується і становить інтерес, можна здійснити звичайний аналіз перехресного блокування, такий як аналіз, описаний в Antibodies, А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), щоб оцінити чи має місце перехресне блокування антитілом зв'язування такого антитіла, як 2C4 або пертузумаб, з HER2. Альтернативно або додатково можна здійснити картирування епітопів способами, відомими в даній галузі і/або можна дослідити структуру комплексу антитіло-HER2 (Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004)), щоб виявити який домен(ни) HER2 зв'язується (зв'язуються) антитілом. (viii) Імунокон'югати Винахід також стосується імунокон'югатів, що містять антитіло, кон'юговане з цитотоксичним засобом, таким як хіміотерапевтичний засіб, токсин (наприклад, низькомолекулярний токсин або ферментативно активний токсин, що походить із клітин бактерій, грибів, рослин або тварин, включаючи його фрагменти і/або варіанти) або радіоактивний ізотоп (тобто радіокон'югат). Хіміотерапевтичні засоби, застосовні для створення таких імунокон'югатів, були описані вище. Також передбачаються кон'югати антитіла та одного або декількох низькомолекулярних токсинів, таких як каліхеаміцин, майтанзин (патент США № 5208020), трихотен і CC1065. В одному переважному варіанті винаходу антитіло кон'югує з однією або декількома молекулами майтанзину (наприклад, приблизно від 1 до 10 молекул майтанзину на молекулу антитіла). Майтанзин може бути, наприклад, перетворений у May-SS-Me, який може бути 28