Спосіб отримання fc-фрагмента імуноглобуліну, вільного від початкового метіонінового залишку, в масовому масштабі

Реферат: Винахід належить до способу отримання Fc-фрагмента імуноглобуліну, вільного від початкового метіонінового залишку в масовому масштабі шляхом отримання експресуючого вектора, який включає нуклеотидну послідовність, що кодує рекомбінантний Fc-фрагмент імуноглобуліну, складений з Fc-фрагмента імуноглобуліну, зв’язаного своїм N-кінцем з шарнірною областю імуноглобуліну за допомогою пептидного зв’язку трансформування прокаріотичної клітини рекомбінантним експресуючим вектором з отриманням трансформанта; культивування трансформанта для того, щоб експресувати фрагмент Fc імуноглобуліну як «тіло включення»; і виділення і очищення області Fc імуноглобуліну, де вказана шарнірна область має цистеїн, серин або пролін як початкову амінокислоту N-кінця, і вказаний експресуючий вектор не включає сигнальну послідовність. Винахід також належить до мономерного або димерного фрагмента імуноглобуліну, вільного від початкового метіонінового UA 97628 C2 (12) UA 97628 C2 залишку, отриманого згідно з заявленим способом. UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід стосується способу виробництва мономерної або димерної області Fc імуноглобуліну, позбавленої початкових метіонінових залишків, в масовому масштабі, шляхом використання рекомбінантного експресуючого вектора, що включає в себе нуклеотидну послідовність, що кодує рекомбінантну область Fc імуноглобуліну, включаючи шарнірну область імуноглобуліну. Рівень техніки З прогресом генної інженерії, було розроблено і використано велике число білкових лікарських препаратів. Чутливі до денатурації або протеолітичного розщеплення в тілі, білкові лікарські препарати, проте, складно втримувати в постійній концентрації in vivo і в титрах протягом довгого періоду часу. Поліпшення стабільності білків in vivo, що може привести до збереження концентрації білкового лікарського препарату in vivo на відповідному рівні, є важливим не тільки для підвищення ефективності терапії, але і для допомоги пацієнтам, яким необхідно робити часті ін'єкції білкових лікарських препаратів, в плані зручності і вартості. Багато спроб було зроблено для збільшення стабільності in vivo білкових лікарських препаратів протягом довгого періоду часу, наприклад, зміною складу білка, злиттям білка з іншим білком, або хімічним або біологічним приєднанням відповідного полімеру до поверхні білка. Одним таким способом є виготовлення злитого білка з областю Fc імуноглобуліну. Область Fc імуноглобуліну опосередковує ефекторні функції, такі як комплемент-залежна цитотоксичність (CDC) або антитіло-залежна клітинно-опосередкована цитотоксичність (ADCC), також як і антигензв'язувальна здатність, яка є унікальною функцією імуноглобулінів. Також, область Fc містить послідовність, що бере участь в зв'язуванні з рецептором Fc новонародженого (FcRn), який відіграє роль в регуляції рівнів сироватки IgG шляхом збільшення перенесення материнського IgG до новонароджених і часу напівжиття IgG (Ghetie and Ward, Immunology Today 18: 592-598, 1997), і ця послідовність регулює взаємодію між білком А і білком G. Багаточисельні дослідження були проведені з метою підвищення стабільності терапевтичного білка шляхом злиття цього фрагмента Fc з терапевтичним білком. Наприклад, патент Кореї № 249572 розкриває злитий білок, який отримують приєднанням важкого ланцюга області Fc (Fc) з її аміно-кінця до карбоксильного кінця білка, такого як рецептор IL4, рецептор IL7, рецептор G-CSF або ЕРО рецептор, і продукування отриманого злитого білка в клітинах ссавців. Патент США № 5605690 описує злитий білок, що включає рецептор фактора некрозу пухлин, злитий своїм карбоксильним кінцем з похідним Fc людського IgG1, причому злитий білок продукується в клітинах тварин. Також, Tanox Inc. повідомила в патентах США № 5723125 і 5908626 про гібридну молекулу, що включає людський інтерферон альфа або бета, який приєднаний зі свого карбоксильного кінця до нативного людського Fc IgG4 за допомогою пептидного лінкера, і вироблену в клітинах тварин. Lexigen Inc., як описано в міжнародній публікації заявки РСТ WO 00/69913, отримала нативний IgG1 Fc, приєднаний своїм карбоксильним кінцем до амінного кінця людського інтерферону генетичною рекомбінацією без використання лінкера, і виготовила злитий білок в клітинах тварин. Патентна публікація США № 20030082679 розкриває злитий білок із збільшеним часом напівжиття в сироватці, який включає людський G-CSF, приєднаний зі свого карбоксильного кінця до аміно-кінця IgG1 Fc, і який виготовлений в клітинах тварин. Патентна публікація США № 20010053539, патент США № 6030613, міжнародна публікація заявки РСТ WO 99/02709 і WO 01/03737 і європейський патент № 0464533В1 розкривають Fc-злитий білок з більшим часом напівжиття в сироватці, ніж нативний білок, який включає IgG1 Fc, або його похідне, приєднане своїм аміно-кінцем, за допомогою пептидного лінкера, або без пептидного лінкера, до карбоксильного кінця людського ЕРО, ТРО, людського гормону росту або людського бета інтерферону, причому Fc-злитий білок вироблений в клітинах тварин. Ці Fc-злиті білки, як описано вище, збільшують час напівжиття в сироватці цільових білків, але спричиняють за собою проблеми, пов'язані з опосередкуванням ефекторних функцій фрагментом Fc (патент США № 5349053). Через ефекторні функції фрагмента Fc вони фіксують комплемент або зв’язуються з клітинами, що експресують FcRs, що приводить до лізису специфічних клітин і стимулює вироблення і виділення декількох цитокінів, що спричиняють запалення, що приводить до небажаного запалення. Також злиття створює нову амінокислотну послідовність в області сполучення між фрагментом Fc і партнером-білком, яка може потенційно викликати імунні відповіді, якщо білки вводилися протягом довгого часу. У цьому відношенні було зроблено багато спроб отримати імуноглобулін або фрагмент імуноглобуліну, який має великий час напівжиття в сироватці, але позбавлений ефекторних функцій. Cole et al. повідомили, що, коли амінокислотні залишки області СН2 в положеннях 234, 1 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 235 і 237, які, як відомо, відіграють важливу роль в зв'язуванні з Fc рецепторами, замінюються аланіном, що, таким чином, дає Fc похідне, що має зменшену афінність до Fc рецепторів, активність ADCC інгібується (Cole et al., J. Immunol. 159: 3613-3621, 1997). Однак у всіх цих варіантах Fc може мати збільшену імуногенність або антигенність в порівнянні з нативним людським Fc-фрагментом, внаслідок присутності невідповідних амінокислот, і може втратити бажані Fc функції. Серед способів делеції або зменшення небажаних ефекторних функцій, із збереженням високої концентрації імуноглобуліну в сироватці, один оснований на видаленні цукру з імуноглобуліну. Як описано в патенті США № 5585097, агліколізоване похідне антитіла, антиСD3 антитіло, може бути отримане заміною глікозильованого залишку антитіл, аспарагінового залишку в положенні 297 СН2 домену, іншою амінокислотою. Це похідне агліколізованого антитіла виявляє зменшені ефекторні функції, але все ж зберігає афінність до зв'язування з FcRn рецептором без змін у часі напівжиття в сироватці. Однак це похідне також є проблематичним, в тому значенні, що потенційно розпізнається як чужорідний матеріал і відторгається імунною системою, внаслідок продукування нової рекомбінантної структури, що має аномальну послідовність. Патентна публікація США № 20030073164 розкриває спосіб продукування похідного Fc з використанням Е. соlі, яка позбавлена здатності до глікозилювання, з тим, щоб отримати антитіла для лікувальних цілей, позбавлених ефекторних функцій. Американська компанія Amgen Inc. описала в патенті США № 6660843, і в патентних публікаціях США № 20040044188 і 20040053845 похідне людського IgG1 Fc, що має делеції амінокислот, перших п'яти амінокислотних залишків шарнірної області, які приєднані до аміноабо карбоксильного кінця терапевтичного білка або імітації терапевтичного білка пептидом, і його виробництво, з використанням Е. coli-хазяїна. Однак цей злитий білок, що не має сигнальної послідовності, експресується як «тіла включення», і, таким чином, повинен бути підданий додатковому процесу рефолдингу. Цей процес рефолдингу білка зменшує виходи, і, особливо якщо білок присутній як гомодимер або гетеродимер, що разюче зменшує виробництво димера. Також, коли білок, що не має сигнальної послідовності, експресується в Е. соlі, залишок метіоніну приєднується до N-кінця продукту експресії через особливість системи експресії білка Е. соlі. Вищезазначені продукти експресії Amgen Inc. мають N-кінцевий залишок метіоніну, який може викликати імунні відповіді при повторному або надмірному введенні в організм. Також, оскільки ці злиті молекули експресовані в формі злитого білка в Е. соlі приєднанням гена, що кодує терапевтичний білок, до Fc-гена, вони з труднощами експресуються в Е. coli, або терапевтичний білок складно виготовити в Е. coli, якщо його експресія в Е. coli в злитій формі приводить до значного зменшення або втрати активності. Більш того, оскільки злиття двох молекул приводить до аномальної амінокислотної послідовності, що не зустрічається в природі в області сполучення двох білків, злитий білок може потенційно бути розпізнаний імунною системою як «не свій», і, таким чином, викликати імунну відповідь. Щоб вирішити ці проблеми, автори даного винаходу заздалегідь отримали Fc-фрагмент і білковий лікарський препарат як окремі поліпептиди, не використовуючи спосіб злиття, оснований на генетичній рекомбінації, але використовуючи кращі системи експресії і ковалентно зв'язуючи два поліпептиди разом, для використання Fc-фрагмента як носія лікарського препарату. У цьому випадку можливо отримати кон'югат гліколізованого поліпептидного лікарського препарату і агліколізованого Fc, який не викликає небажані імунні відповіді, але має задовільні властивості фізіологічної активності лікарського препарату, тривалості життя і стабільності in vivo. У вищезазначеному випадку, оскільки переважною є агліколізована форма Fc, використовується прокаріотична система експресії, така як Е. coli. Методи виробництва білка, що використовують систему експресії Е. coli, мають декілька переваг над традиційними способами, які використовують клітини тварин, як викладено нижче. Експресуючий вектор Е. coli може бути легко сконструйований, що, таким чином, дозволяє швидко оцінювати експресію білка. Через свій швидкий ріст, Е. coli робить можливим масове виробництво білків, що представляють інтерес, при низькій ціні. Також може бути використаний відносно простий спосіб експресії. Таким чином, Е. coli більш корисна для комерційного виробництва, ніж інші клітинихазяїни. Більшість областей Fc присутні як «тіла включення» в результаті надекспресії в Е. coli. З цієї причини промислові вимоги полягають в тому, щоб області Fc були експресовані у водорозчинній формі в Е. coli. У європейському патенті № 0227110 описане отримання області Fc IgG1, з використанням тільки продукту (клітинного лізату), який експресований у 2 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 водорозчинній формі внаслідок надекспресії області Fc IgG1. Однак вихід імуноглобуліну, експресованого у водорозчинній формі, складає тільки лише не більше за 15 мг/л, що не має значення в значенні промислової корисності. Патентна заявка Кореї № 0092783, що долає проблему, з якою зіткнулися в рівні техніки, представляє новий спосіб експресії області Fc імуноглобуліну не як «тіла включення», але у водорозчинній формі в Е. coli, за допомогою злиття нуклеотидної послідовності відповідної області Fc з сигнальною послідовністю Е. coli. При експресії в Е. coli білок, що представляє інтерес, присутній в розчинній формі, позбавленій сигнального пептиду, з виходом продукту, збільшеним аж до 600 мг/л. Інтенсивне і ретельне дослідження способу продукування, що приводить до даного винаходу, активної аглікозильованої області Fc імуноглобуліну, що не має імунної відповіді, проведене авторами даного винаходу, що має на меті збільшити виробничий вихід до рівня, прийнятного для індустріалізації, привело до відкриття, що, коли нуклеотидна послідовність, що кодує область Fc імуноглобуліну, експресована в формі, злитій N-кінцем зі специфічною шарнірною областю, область Fc імуноглобуліну експресується як «тіла включення», які в кінцевому результаті є димерами або мономерами області Fc імуноглобуліну, позбавленими початкових метіонінових залишків, за допомогою процесів солюбілізації і рефолдингу. Суть винаходу Отже, метою даного винаходу є забезпечити спосіб масового виробництва області Fc імуноглобуліну, позбавленої початкового метіонінового залишку, що включає в себе конструювання вектора, що включає нуклеотидну послідовність, що кодує рекомбінантну область Fc імуноглобуліну, що містить шарнірну область імуноглобуліну; трансформування прокаріотичної клітини вектором; культивування трансформанта, що виходить; і виділення і очищення області Fc імуноглобуліну, експресованої в «тілі включення» з трансформанта. Іншою метою даного винаходу є забезпечити димер або мономер області Fc імуноглобуліну, отримані вищезгаданим способом. Короткий опис креслень Вищеперераховані і інші цілі, особливості та інші переваги даного винаходу будуть, безумовно, більш зрозумілі з подальшого деталізованого опису, даного в об'єднанні з супровідними кресленнями, в яких: Фіг. 1 являє собою фотографію гель-електрофорезу, що показує утворення мономерних і димерних фрагментів області Fc з експресованих «тіл включення» з використанням експресуючого вектора, що має нуклеотидну послідовність, що кодує область Fc людського імуноглобуліну IgG4; Фіг. 2 показує результати ELISA здатності області Fc людського імуноглобуліну IgG4 зв'язуватися з Clq; Фіг. 3 показує результати ELISA здатності області Fc людського імуноглобуліну IgG зв'язуватися з FcRI; Фіг. 4 показує результати ELISA здатності області Fc людського імуноглобуліну IgG зв'язуватися з FcRIII; Фіг. 5 показує результати ELISA здатності області Fc людського імуноглобуліну IgG зв'язуватися з FcRn2; Фіг. 6 показує результати в плані часів напівжиття в сироватці кон'югата EPO-PEG-Fc, отримані використанням області Fc людського імуноглобуліну IgG як переносника; Фіг. 7 являє собою фотографію 15%-SDS-РАGЕ-гелю, на якому, після змішування з еквівалентними об'ємами 2 буфера білкового зразка, пропущені частини ферментованих розчинів, отримані вирощуванням мікробних трансформантів прикладу 2 в ферментерах в умовах експресії; Фіг. 8 являє собою фотографію SDS-PAGE-гелю, на якому розділені і візуалізовані як смуги білки, піддані рефолдингу з експресованих «тіл включення» трансформованих клітин прикладу 2; Фіг. 9 являє собою фотографію 15%-SDS-РАGЕ-гелю, на якому, після змішування з еквівалентними об'ємами 2 буфера білкового зразка, пропущені частини ферментованих розчинів, отримані вирощуванням мікробних трансформантів прикладу 3 в ферментерах в умовах експресії; і Фіг. 10 являє собою фотографію 15%- SDS-РАGЕ-гелю, на якому, після змішування з буфером білкового зразка, позбавленого відновника, такого як DTT або бета-меркаптоетанол, пропущені відповідні експресовані і очищені продукти прикладу 3. Кращий варіант здійснення винаходу В одному аспекті даний винахід стосується способу масового виробництва області Fc імуноглобуліну, що включає в себе конструювання вектора, що включає нуклеотидну 3 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовність, що кодує рекомбінантну область Fc імуноглобуліну, що містить шарнірну область імуноглобуліну; трансформування прокаріотичної клітини з вектором; культивування трансформанта, що виходить; і виділення і очищення області Fc імуноглобуліну, експресованої в формі «тіла включення» з трансформованої клітини. Даний винахід стосується способу масового виробництва області Fc імуноглобуліну, корисної як переносника білкових лікарських препаратів. Знайдено, що коли область Fc імуноглобуліну приєднана N-кінцем до шарнірної області, рекомбінантна область Fc імуноглобуліну, що утворюється, експресована у вигляді «тіл включення», і потім її розчиняють і піддають рефолдингу в димер або мономер в активній формі, позбавленій початкового метіонінового залишку, що кодується ініціюючим кодоном. Даний винахід має величезну значущість як відкриття того, що приєднана до області Fc імуноглобуліну шарнірна область відіграє важливу роль в обробці і рефолдингу рекомбінантної області Fc імуноглобуліну в форму нативної послідовності, позбавленої початкового метіонінового залишку, що кодується ініціюючим кодоном. Шарнірна область, що забезпечує можливість отримання рекомбінантної Fc-області імуноглобуліну у великих кількостях, може бути отримана з IgG, IgA, IgM, IgE або IgD людей і інших тварин, включаючи кіз, свиней, мишей, кроликів, хом'яків, щурів і морських свинок, переважно з IgG, наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4 (SEQ ID NO: 14-17). Шарнірна область, корисна в даному винаході, може бути непроцесованою шарнірною областю або її фрагментом. Переважною формою є фрагмент шарнірної області, що має дві або більше впорядкованих амінокислотних послідовностей, які, більш переважно, містять в собі, щонайменше, один цистеїновий залишок. Практичними для використання в даному винаході є фрагменти шарнірної області, отримані з IgG4 SEQ ID NO: 17, які представлені SEQ ID NO: 18, 19, 20 і 21. Коли використовуються шарнірні області SEQ ID NO: 18, 19, 20 і 21, область Fc імуноглобуліну може бути отримана в димерній або мономерній формі. Шарнірна область SEQ ID NO: 21 дозволяє ефективно отримувати мономер області Fc імуноглобуліну. В інших здійсненнях даного винаходу фрагменти, представлені SEQ ID NO: 48-55 шарнірної області, отриманої з IgG1 SEQ ID NO: 14, і представлені SEQ ID NO: 56-60 шарнірної області, отриманої з IgG2 SEQ ID NO: 15, були використані для виробництва димера області Fc імуноглобуліну. Область Fc імуноглобуліну, здатна вироблятися за даним винаходом, може бути нативною формою, виділеною з людей і інших тварин, включаючи кіз, свиней, мишей, кроликів, хом'яків, щурів і морських свинок, або може бути її рекомбінантом або похідним, отриманим з трансформованих клітин тварин або мікроорганізмів. Переважною може бути область Fc IgG, IgA, IgM, IgE і IgD людей, або їх комбінація, або гібрид. Термін «комбінація», що використовується в даному описі, означає, що поліпептиди, що кодують одноланцюгові фрагменти Fc імуноглобуліну однакового походження, приєднані до одноланцюгових поліпептидів різногопоходження з утворенням димера або багатомера. Термін «гібрид», що використовується в даному описі, означає, що послідовності, що кодують два або більше фрагментів Fc імуноглобуліну різного походження, присутні в одноланцюговому фрагменті Fc імуноглобуліну. Імуноглобулін може переважно бути областю Fc IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4 або її комбінацією або гібридом. Придатні в даному винаході нуклеотидні послідовності, що кодують області Fc людського імуноглобуліну і амінокислотні послідовності, обмежені вказаним, можуть кодуватися нуклеотидними послідовностями з банків даних GenBank і/або EMBL. Область Fc імуноглобуліну даного винаходу включає похідне амінокислотної послідовності. Термін «похідне амінокислотної послідовності» означає послідовність, в якій один або декілька амінокислотних залишків відрізняються від амінокислотної послідовності дикого типу, і може зустрічатися природно або бути виготовленою штучно. Область Fc імуноглобуліну включає похідні, що отримуються від делеції, інсерції, неконсервативного або консервативного заміщення або їх комбінації. Інсерція звичайно здійснюється приєднанням впорядкованої амінокислотної послідовності приблизно 1-20 амінокислот, або може бути здійснена більш довгою послідовністю. Делеція звичайно здійснюється в діапазоні приблизно 1-30 амінокислотних залишків. Амінокислотні заміни в білках і пептидах, які звичайно не змінюють активність білків і пептидів, відомі в даній галузі техніки (Н. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Замінами, що зустрічаються найчастіше, є Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu і Asp/Gly в обох напрямках. Такі похідні можуть бути отримані за допомогою способу хімічного синтезу пептиду або способу, основаного на рекомбінації послідовності ДНК, які відомі в даній галузі техніки (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2d ed., 1989). 4 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, область Fc імуноглобуліну, при бажанні, може бути модифікована з використанням фосфорилування, сульфатування, акрилування, глікозилювання, метилювання, фарнезилювання, ацетилювання, амідування і т.п. Похідне імуноглобуліну даного винаходу переважно є функціональним еквівалентом в своїй натуральній формі, таким чином, маючи схожу біологічну активність, або, при бажанні, може бути зроблено зміною властивості натуральної форми. Переважно, похідні області Fc імуноглобуліну є білками, у яких збільшена структурна стійкість до нагрівання, рН, і т. д. або розчинність, або у яких були поліпшені характеристики відносно утворення дисульфідного зв'язку, сумісності з експресійним хазяїном, зв'язування комплементу, зв'язування Fc рецептора і антитіло-залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (ADCC), при умові, що виготовлені похідні не сильно відрізняються від натуральних форм, що зустрічаються у людей, і які виробляють небажані імунні відповіді у людей і тварин. Переважними похідними є області Fc IgG1, які змінені в такому специфічному залишку, що мають зменшену афінність до Fc рецепторів, які служать посередником антитіло-залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (ADCC). Виготовлене похідне може містити делецію або заміну іншою амінокислотою в лейциновому залишку в положенні 234 СН2 послідовності IgG1 (див. послідовність з бази даних Kobat для нумерації амінокислотних залишків). Більш переважно, Leu234 замінюється фенілаланіном, амінокислотним залишком у відповідному положенні в IgG4. Згідно з даним винаходом, отримана нуклеотидна послідовність, що кодує рекомбінантну область Fc імуноглобуліну, в якій область Fc імуноглобуліну сполучена з шарнірною областю імуноглобуліну. Термін «рекомбінантна область Fc імуноглобуліну», що використовується тут, означає область Fc імуноглобуліну, приєднану N-кінцем до шарнірної області за допомогою пептидного зв'язку. В залежності від області Fc імуноглобуліну, шарнірна область для приєднання може бути вибрана. Переважною є шарнірна область, яка ідентична в походженні з областю Fc імуноглобуліну. У фактичному застосуванні даного винаходу була отримана нуклеотидна послідовність, що кодує рекомбінантну область Fc імуноглобуліну, що складається з амінокислотної послідовності, представленої SEQ ID NO: 7, 9, 11 або 13, в яких область Fc IgG4 приєднана до шарнірної області, що складається з амінокислотної послідовності, представленої SEQ ID NO: 18, 19, 20 або 21. Нуклеотидні послідовності, що кодують рекомбінантні області Fc імуноглобуліну, представлені SEQ ID NO: 6, 8, 10 і 12, відповідно. В іншому варіанті здійснення була отримана нуклеотидна послідовність, що кодує рекомбінантну область Fc імуноглобуліну, що складається з амінокислотної послідовності, представленої SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 або 37, в якій область Fc з IgG1 приєднана до шарнірної області, що складається з амінокислотної послідовності, представленої однією з SEQ ID NO: 48-55. Нуклеотидні послідовності, що отримуються, які кодують рекомбінантні області Fc імуноглобуліну, представлені SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 або 36. У додатковому варіанті здійснення була отримана нуклеотидна послідовність, що кодує рекомбінантну область Fc імуноглобуліну, що складається з амінокислотної послідовності, представленої SEQ ID NO: 39, 41, 43, 45 або 47, в якій область Fc з IgG2 приєднана до шарнірної області, що складається з амінокислотної послідовності, представленої однією з SEQ ID NO: 56-60. Нуклеотидні послідовності, що отримуються, які кодують рекомбінантні області Fc імуноглобуліну, представлені SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44 або 46. Відповідно до даного винаходу, надані рекомбінантні експресуючі вектори, в яких функціонально зв'язані нуклеотидні послідовності, що кодують рекомбінанти областей Fc імуноглобуліну. Термін «рекомбінантний експресуючий вектор», що використовується тут, який описує вектор, здатний до експресії цільового білка у відповідній клітині-хазяїні, стосується генетичної структури, яка включає в себе основні регуляторні елементи, в яких вставка функціонально пов'язаного гена здійснюється таким способом, що він експресується в клітині-носії. Термін «функціонально пов'язаний», що використовується тут, стосується функціонального зв'язку між послідовністю нуклеїнової кислоти, що контролює експресію, і другою нуклеотидною послідовністю, що кодує цільовий білок таким способом, що надає основні функції. Функціональне зв'язування з рекомбінантним вектором може бути отримане, використовуючи рекомбінантну генну інженерію, добре відому в галузі техніки, і сайт-специфічне розщеплення ДНК і лігування можуть бути проведені з використанням загальновідомих в галузі техніки ферментів. Відповідний експресуючий вектор включає регуляторні елементи експресії, такі як промотор, ініціюючий кодон, стоп-кодон, сигнал поліаденілування і енхансер. Ініціюючий кодон і стоп-кодон необхідні для функціонування в індивідуумові, в який вводився генетичний 5 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 конструкт, і повинні бути в рамках кодуючої послідовності. Промотор вектора може бути конститутивним або індуцибельним. Крім того, експресуючі вектори включають маркер селекції, який робить можливим відбір клітин носія, що містять в собі вектор, і експресуючі вектори, що відтворюються, включають ділянку початку реплікації. У докладному здійсненні даного винаходу отримані наступні рекомбінантні експресуючі вектори: pmSCPFc, pmPSCFc, pmCPSFc, pmCPFc, pMEPKFc1, pMSCKFc1, pMDKTFc1, pMCPAFc1, pMPKSFc1, pMCPPFc1, pMPPCFc, pMPCPFc, pmPPCG2Fc, pmPCPG2Fc, pmCPG2Fc, pmCCVG2Fc і pmCVE2Fc. Рекомбінантні експресуючі вектори, що експресують білки, трансформуються в клітинихазяїни. Що стосується мети даного винаходу, клітинами-хазяїнами є прокаріотичні клітини, в яких не здійснюється глікозилювання. Приклади таких прокаріотичних клітин включають Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, Proteus mirabilis і Staphylococcus з перевагою Е. coli. Ілюстративні, не обмежувальні, приклади штамів Е. coli включають BL21 (DE3), JM109, DH серії, ТОР10 і НВ101. Більш переважним є штам BL21 (DE3). Через відсутність системи глікозилювання білка, Е. coli може бути використана як клітина-хазяїн, в якій область Fc імуноглобуліну продукується в формі, позбавленій цукрових фрагментів, які присутні в домені СН2 нативного імуноглобуліну. Цукрові фрагменти домену СН2 імуноглобуліну не чинять впливу на структурну стабільність імуноглобулінів, але є причиною того, що імуноглобуліни служать зв'язувальною ланкою антитіло-залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (ADCC) при об'єднанні з клітинами, що експресують Fc рецептори, і імунними клітинами, щоб секретувати цитокіни для виклику запалення. Також, фрагменти цукрів зв'язуються з Clq частиною першого компонента комплементу СІ, приводячи до фіксації комплементу. Таким чином, коли область Fc імуноглобуліну продукована в агліколізованій формі і приєднана до терапевтичного білка, терапевтичний білок присутній в сироватці протягом подовженого періоду часу без небажаних ефекторних функцій імуноглобулінів. Трансформація рекомбінантних експресуючих векторів в прокаріотичні клітини може бути досягнута будь-яким способом, який дає можливість вводити нуклеїнові кислоти в клітини, і, як відомо в даній галузі техніки, може бути здійснена вибором відповідних стандартних способів відповідно до клітин-хазяїнів. Ці способи включають, але не обмежуються ними, електропорацію, злиття протопластів, осадження фосфатом кальцію (СаРО4), осадження хлоридом кальцію (СаСl2), струшування волокном карбіду кремнію, і трансформацією, опосередкованою PEG, декстрансульфатом і ліпофектаміном. У докладному здійсненні даного винаходу рекомбінантні експресуючі вектори окремо кожний вводяться в Е. coli, таким чином, утворюючи наступні трансформанти: 35 40 45 Трансформанти, що фіксують рекомбінантні експресуючі вектори, культивуються за допомогою загального методу. Умови культивування можуть легко регулюватися, у відповідності з бактерійним штамом, фахівцем в даній галузі техніки. Звичайно середовище, що використовується для культивування, повинне містити всі поживні речовини, необхідні для виживання і росту клітин. Середовище повинне містити різні джерела вуглецю, азоту і мікроелементів. Приклади доступних джерел вуглецю включають глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, крохмаль, вуглеводи, такі як целюлоза, жири, такі як соєве масло, соняшникова олія, касторова олія і кокосове масло, жирні кислоти, такі як пальмітинова кислота, стеаринова кислота і 6 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лінолева кислота, спирти, такі як гліцерин і етанол, і органічні кислоти, такі як оцтова кислота. Ці джерела вуглецю можуть бути використані поодинці або в комбінації двох або більше. Приклади доступних джерел азоту включають органічні джерела азоту, такі як пептон, дріжджовий екстракт, м'ясний екстракт, солодовий екстракт, лікер кукурудзяного екстракту (CSL) і соєва сироватка, і неорганічні джерела азоту, такі як сечовина, сульфат амонію, хлорид амонію, фосфат амонію, карбонат амонію і нітрат амонію. Ці джерела азоту можуть бути використані поодинці або в комбінації двох або більше. У середовищі може міститися джерело фосфору, яке включає дигідрофосфат калію, гідрофосфат калію, і відповідні натрійвмісні солі. На додаток до цього середовище може містити сіль металу, таку як сульфат магнію або сульфат заліза. Середовище може додатково включати амінокислоти, вітаміни, відповідні попередники і т.п. рН культури можна регулювати додаванням до культури сполуки, такої як гідроксид амонію, гідроксид калію, аміаку, фосфорної кислоти і сірчаної кислоти відповідним способом. Також протягом культивування для запобігання утворення пухирців можуть бути використані піногасники, такі як складний ефір полігліколю і жирної кислоти. Для підтримання культури в бажаному стані, в неї вводяться кисень або кисневмісні гази (наприклад, повітря). Температура культивування звичайно становить 20°С-45°С, і переважно 25°С-45°С. Також для виробництва білка у великому масштабі може бути використаний ферментер. Виробництво білка з використанням ферментера потрібно провести, беручи до уваги декілька факторів, включаючи швидкість росту клітин-хазяїнів і рівні експресії білка. Експресію білка можна індукувати за допомогою додавання, наприклад, IPTG в середовище при відповідних умовах культивування. Область Fc імуноглобуліну, надекспресована як «тіла включення», може бути очищена за допомогою загальної методики. Області Fc імуноглобуліну, виготовлені в трансформантах, можуть бути отримані руйнуванням клітин, з використанням «французького преса», ультразвукового апарату, і т. д., збиранням тільки водонерозчинних «тіл включень», що містять область Fc імуноглобуліну, при допомозі центрифугування, солюбілізації і денатурації зібраної фракції з агентами рефолдингу, такими, як сечовина, гуанідин, аргінін, цистеїн, бетамеркаптоетанол і т. д. для її рефолдингу, і очищенням підданого рефолдингу злитого білка при допомозі діалізу, різних хроматографій, таких як гель-хроматографія, іонообміна і зворотнофазова колонкова хроматографія, або ультрафільтрацією, поодинці або в комбінації. Відомо, що в більшості випадків цей процес рефолдингу - дуже складний і приводить до дуже низького виходу рефолдингу і дає рефолдований білок більш низької активності, ніж розчинний у воді білок. Однак способом даного винаходу можна подолати вищезазначені проблеми і виготовити активну область Fc імуноглобуліну, позбавлену початкового метіонінового залишку, в масовому масштабі. Загалом, експресований і продукований в Е. coli екзогенний білок має початковий метіоніновий залишок, що кодується ініціюючим кодоном. Повторне або надмірне введення білкового продукту, що має початковий метіоніновий залишок, може викликати імунну відповідь в людському організмі, достатню, щоб зменшити його терапевтичний ефект, або щоб він був токсичним. Однак, коли рекомбінантна область Fc імуноглобуліну даного винаходу експресована в Е. coli, знайдено, що початковий метіоніновий залишок відщеплений амінопептидазою, природним ферментом цитоплазми, як виміряно аналізом по встановленню N-кінцевої послідовності (Adams et al., J. Моl. Biol. 33:571-589, 1968, Takeda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:1487-1494, 1968). Відомо, що активність таких амінопептидаз залежить від послідовності і структури білка, що цікавить (Moerschell et al., J. Моl. Biol. Chem. 265:1963819643, 1990, James et al., Protein Expression and Purification 41:45-52, 2005). Шарнірна область, прикріплена до області Fc імуноглобуліну, перебуває під впливом амінопептидази, так що початковий метіонін обробляється в мірі, що залежить від її амінокислотної послідовності. Оскільки властивості шарнірної області визначають посттрансляційну модифікацію протеаз, відношення димерів до мономерів можна ефективно регулювати вибором відповідних шарнірних областей. На додаток до цього, коли «тіла включення» піддані рефолдингу, утворення правильних димерів утруднене за рахунок помилкового поєднання цистеїнів в дисульфідних зв'язках. Однак спосіб відповідно до даного винаходу забезпечує утворення правильних дисульфідних зв'язків, що, таким чином, приводить до утворення активних димерів. На додаток до цього, даний винахід може виробляти області Fc імуноглобуліну в більш великому масштабі, ніж це можуть традиційні способи. Наприклад, область Fc імуноглобуліну виробляється з виходом 15 мг/л у відповідності зі способом європейського патенту № ЕР0227110, де область Fc G1 надекспресована і очищена тільки від клітинного лізату, що містить її водорозчинну форму, і з виходом 15-600 мг/л відповідно до патентної заявки Кореї № 0092783, де область Fc імуноглобуліну, приєднана до сигнальної послідовності Е. coli, експресована у водорозчинній формі, але не як «тіло включення». Однак даний винахід може 7 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виробляти область Fc імуноглобуліну з виходом до 3-6 г/л очищенням «тіл включення» рекомбінантної області Fc імуноглобуліну, що містить шарнірну область. Таким чином, спосіб даного винаходу забезпечує високоефективну систему для виробництва областей Fc імуноглобуліну в промисловому масштабі з більш високим виходом, ніж в традиційних способах. В іншому аспекті даний винахід стосується області Fc імуноглобуліну, отриманої відповідно до вищезазначеного способу. Область Fc імуноглобуліну, продукована в прокаріотичних клітинах, таких як Е. coli, згідно з даним способом, не має специфічних обмежень для промислового застосування. Одним характерним застосуванням є використання як переносника для утворення кон'югата з певним лікарським препаратом. Конструкція кон'югата, що складається з області Fc імуноглобуліну, приєднаної до лікарського препарату, спеціально не лімітована. Наприклад, область Fc імуноглобуліну може бути сполучена разом з лікарським препаратом в різних пропорціях, і зв'язок може бути опосередкований, наприклад, через лінкер. Лікарський препарат включає поліпептиди, сполуки, екстракти і нуклеїнові кислоти. Переважним є поліпептидний лікарський препарат (що раніше було тотожне слову «білок»). Приклади лінкерів, корисних в даному винаході, включають білкові і небілкові лінкери, з перевагою небілкового лінкера і крайньою перевагою небілкового полімеру. Переважним прикладом важкого ланцюга імуноглобуліну є Fc. Якщо необхідно збільшити час напівжиття в сироватці, будь-який фізіологічно активний поліпептид може бути використаний без особливих обмежень як білковий партнер області Fc імуноглобуліну, отриманої відповідно до даного способу, з утворенням кон'югата. Такі фізіологічно активні поліпептиди включають ті, що використовуються для лікування і запобігання хворобам людини, і включають цитокіни, інтерлейкіни, інтерлейкін-зв'язувальний білок, ферменти, антитіла, фактори росту, фактори, що регулюють транскрипцію, фактори коагуляції, вакцини, структурні білки, ліганди білків або рецепторів, антигени клітинної поверхні, антагоністи рецепторів і похідні, і їх аналоги. Зокрема, необмежувальні приклади фізіологічно активних поліпептидів включають людський гормон росту, релізинг-гормон гормону росту, релізинг-пептид гормону росту, інтерферони і рецептори інтерферону (наприклад, інтерферон-, - і -, водорозчинний рецептор інтерферону типу І, і т. д.), колонієстимулюючі фактори, інтерлейкіни (наприклад, інтерлейкін-1, -2, -3, -4, -5, 6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 і т. д.) і рецептори інтерлейкіну (наприклад, рецептор IL-1, рецептор IL-4 і т. д.), ферменти (наприклад, глюкоцереброзидаза, ідуронат-2-сульфатаза, альфа-галактозидаза-А, агалзидаза альфа і бета, альфа-L-ідуронідаза, бутирилхолінестераза, хітиназа, глутамат-дикарбоксилаза, іміглуцераза, ліпаза, уриказа, що тромбоцит-активуючий фактор ацетилгідролаза, нейтральна ендопептидаза, мієлопероксидаза, і т. д.), інтерлейкін- і цитокін-зв'язувальні білки (наприклад, IL-18bp, TNF-зв'язувальний білок і т. д.), фактор активації макрофагів, пептид макрофагу, фактор В-клітини, фактор Т-клітини, білок А, інгібітор алергії, глікопротеїни некрозу клітини, імунотоксин, лімфотоксин, фактор некрозу пухлини, супресори пухлини, фактор росту метастазу, антитрипсин альфа-1, альбумін, альфа-лактальбумін, аполіпопротеїн-Е, еритропоетин, високоглікозильований еритропоетин, ангіопоетини, гемоглобін, тромбін, білокактивуючий тромбіновий рецептор, тромбомодулін, фактор VII, фактор VIIa, фактор VIII, фактор IX, і фактор XIII, фактор, що активує плазміноген, білок, що зв'язує фібрин, урокіназа, стрептокіназа, гірудин, білок С, С-реактивний білок, інгібітор реніну, інгібітор колагенази, супероксиддисмутаза, лептин, тромбоцитарний фактор росту, епітеліальний фактор росту, епідермальний фактор росту, ангіостатин, ангіотензин, фактор росту кістки, білок, що стимулює кістку, кальцитонін, інсулін, атріопептин, хрящовий стимулюючий фактор, елкатонін, фактор, що активує сполучну тканину, інгібітор шляху тканинного фактора, фолікулостимулюючий гормон, лютеїнізуючий гормон, релізинг-гормон лютеїнізуючого гормону, фактори росту нервів (наприклад, фактор росту нервів, циліарний нейротрофічний фактор, фактор-1 аксогенезису, мозковий натрій-уретичний пептид, гліоцитарний нейротрофічний фактор, нетрин, фактор, що інгібує нейтрофіл, нейротрофічний фактор, неутурин і т. д.), паратиреоїдний гормон, релаксин, секретин, соматомедин, фактор росту інсулінового типу, гормон кори наднирників, глюкагон, холецистокінін, панкреатичний поліпептид, гастриновивільняючий пептид, кортикотропінвивільняючий фактор, гормон, що стимулює діяльність щитовидної залози, аутотоксин, лактоферин, міостатин, рецептори (наприклад, TNFR(P75), TNFR(P55), рецептор IL-1, рецептор VEGF, рецептор, що активує фактор В-клітин і т. д.), антагоністи рецепторів (наприклад, IL1-Ra і т. д.), антигени клітинної поверхні (наприклад, CD 2, 3, 4, 5, 7, 11а, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 і т. д.), моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, фрагменти антитіл (наприклад, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, i Fd), і вірусні антигени, що використовуються для 8 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отримання вакцин. Фізіологічно активний поліпептид, придатний в даному винаході, може бути нативної форми, може бути продукований генетичною рекомбінацією з використанням прокаріотичних клітин, таких як Е. coli, або еукаріотичних клітин, таких як дріжджові клітини, клітини комах і клітини тварин, або може бути похідним, що має одну або декілька амінокислотних мутацій, але що показує біологічну активність таку ж, як і у нативної форми. У переважному варіанті здійснення даного винаходу фрагмент області Fc імуноглобуліну виготовлений з використанням трансформанта НМ11201, приєднаного до людського еритропоетину (ЕРО), з використанням поліетиленгліколю, що, таким чином, забезпечує білковий кон'югат ЕРО-PEG і області Fc імуноглобуліну. Було знайдено, що цей білковий кон'югат показує подовжений час напівжиття в сироватці в порівнянні не тільки з нативною ЕРО, але також по відношенню до Aranesp (Amgen), відомим як друге покоління ЕРО, що має поліпшений час напівжиття в сироватці. Таким чином, область Fc імуноглобуліну, позбавлена початкового метіонінового залишку, отримана з внутрішньоклітинних включень, з використанням шарнірної області, відповідно до даного винаходу, може бути використана для збільшення часу напівжиття в сироватці і фізіологічної активності поліпептиду, приєднаного до неї, при відсутності ризику виникнення імунної відповіді. Краще розуміння даного винаходу може бути досягнуте за допомогою наступних прикладів, які викладаються в ілюстративних цілях, і не повинні сприйматися як обмеження даного винаходу. ПРИКЛАД 1 Конструювання експресуючого вектора області Fc людського імуноглобуліну IgG4, експресія і очищення області IgG4, і аналіз N-кінцевої послідовності Конструювання експресуючого вектора області Fc IgG4 Щоб клонувати важкий ланцюг області Fc, що включає шарнірну область людського імуноглобуліну IgG4, була проведена RT-PCR з РНК з клітин людської крові, що служать як зразок, як викладено нижче. Спочатку вся РНК була виділена з приблизно 6 мл крові набором Qiamp RNA blood (Qiagen), і ампліфікація гена була проведена з використанням всієї РНК, як зразка, за допомогою набору One-Step RT-PCP (Qiagen). Щоб ампліфікувати гени, що мають різні N-кінцеві послідовності, були використані пари праймерів, представлені SEQ ID NO: 1 і 2, 3 і 2, 4 і 2, і 5 і 2. Щоб полегшити подальшу процедуру клонування гена, ділянка розпізнавання Nde І і ініціюючий кодон ATG, необхідні для експресії білка, були введені в 5'-праймери SEQ ID NO: 1, 3, 4 і 5, і ділянка розпізнавання ВаmНІ, що містить стоп кодон в 3'-праймерах SEQ ID NO: 2. Продукти ампліфікації областей Fc були розщеплені з Nde І і Hind III і вставлені в pET22b (Novagen), оброблену тим же рестрикційним ферментом, що дало, таким чином, відповідно рекомбінантні плазміди. Ці плазміди були сконструйовані як такі, що мають частини загальної амінокислотної послідовності Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys шарнірної області IgG4, як викладено нижче. Плазміда, яка містить ампліфікований ген з SEQ ID NO: 1 і 2, була названа mpSCPFc і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує N-кінцеву амінокислотну послідовність, що починається з Met-Ser-Cys-Pro, як визначено при допомозі секвенування нуклеотидів, SEQ ID NO: 6, що відповідає амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 7. Плазміда, яка містить ампліфікований ген SEQ ID NO: 3 і 2, була названа pmPSCFc і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує N-кінцеву амінокислотну послідовність, що починається з Met-ProSer-Cys-Pro, як визначено при допомозі секвенування нуклеотидів, SEQ ID NO: 8, що відповідає амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 9. Плазміда, яка містить ампліфікований ген SEQ ID NO: 4 і 2, була названа pmCPSFc і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує N-кінцеву амінокислотну послідовність, що починається з Met-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro, як визначено при допомозі секвенування нуклеотидів, SEQ ID NO: 10, що відповідає амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 11. Плазміда, яка містить ампліфікований ген SEQ ID NO: 5 і 2, була названа pmCPFc і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує N-кінцеву амінокислотну послідовність, що починається з Met-Cys-Pro, як визначено при допомозі секвенування нуклеотидів, SEQ ID NO: 12, що відповідає амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 13. Експресуючі вектори були трансформовані в Е. coli BL21 (DE3) щоб отримати трансформанти, позначені BL21/pmSCPFc(HM11200), BL21/pmPSCFc(HM11201), BL21/pmCPSFc(HM 11204) і BL21/pmCPFc(HM11205). Трансформанти BL21/pmSCPFc(HM 11200) і BL21/pmPSCFc(HM11201) помістили на зберігання в Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) 20 червня 2005 під номерами доступу КССМ-10659Р і КССМ-10660Р, відповідно, і трансформанти BL21/pmCPSFc(HM11204) і BL21/pmCPFc(HM 11205) в КССМ 28 липня 2005 під номерами доступу КССМ-10665Р і КССМ-10666Р, відповідно. Експресія і очищення IgG4 Fc 9 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Бактерійні трансформанти, отримані в прикладі , були інокульовані у відповідні ферментери (Marabishi Company) і їм забезпечили умови росту, з подальшим визначенням, чи експресували вони фрагменти області Fc імуноглобуліну. Спочатку кожний трансформант був вирощений в 100 мл середовища LB при перемішуванні протягом ночі, і інокульований в ферментер для великомасштабного культивування. Ферментер був витриманий при температурі 28°С або 35°С. Для запобігання переходу від аеробного до анаеробного навколишнього середовища культури вентилювали повітрям при 20 об./об./хв. і перемішували при 500 об./хв. Щоб скомпенсувати неефективні для росту бактерій поживні речовини, протягом ферментації до культур були додані екстракти глюкози і дріжджів відповідно до ферментаційних станів бактерій. Коли культури досягли значення OD 600 = 80, індуктор, IPTG, був доданий до культур, щоб викликати експресію білка. Культури додатково культивували протягом 40-45 годин, до збільшення значення OD600 до 100-120. Експресію імуноглобуліну Fc, утворення «тіл включень» і утворення димера експресованого імуноглобуліну Fc в трансформованих клітинах Е. coli досліджували як викладено нижче. Щоб дослідити всю внутрішньоклітинну експресію областей Fc імуноглобуліну, частини ферментованих розчинів були змішані з еквівалентними об'ємами 2 буфера білкового зразка і піддані електрофорезу на 15% SDS-PAGE гелі (Criterion Gel, Bio-Rad). Як результат, було помічено, що імуноглобулін Fc надекспресується у всіх продукованих трансформованих клітинах. Потім клітини були зруйновані з використанням ультразвукового апарату (Misonix Company). Клітинний лізат, отриманий таким чином, був центрифугований, щоб відділити водорозчинні сполуки від водонерозчинних сполук. Було знайдено, що більшість надекспресованих сполук існує як «тіла включення», як виміряно електрофорезом на 15% SDSPAGE гелі. «Тіла включення» були піддані подальшому процесу рефолдингу, для того, щоб дослідити, до якої міри Fc була піддана рефолдингу, і в якій мірі утворені димерні області Fc. 10 г ферментативного розчину піддали ультразвуковій обробці в 100 мл лізисного буфера (10 мМ Тріс, рН 9,0, 1 мМ ЕДТА, 0,5% Тритона Х-100, 0,2 М NaCl) щоб зруйнувати клітини. Центрифугування при 10000 об./хв. протягом 20 хв. розділяє клітинний лізат на водорозчинну фракцію і водонерозчинну фракцію як «тіла включення». 2 г цих «тіл включення» були солюбілізовані в суміші 20 мл 1М Тріса (рН 9,0) і 20 мл розчинювального буфера (6М гуанідину, 50 мМ Тріса) і дали можливість реагувати при слабкому перемішуванні при 4°С протягом 30 хв. При подальшому завершенні реакції розчин внутрішньоклітинного включення змішували протягом ночі з 10 об'ємами буфера для рефолдингу (2М сечовини, 50 мМ Тріса, 0,25 М аргініну, 3 мМ цистеїну, рН 9,0) при слабкому перемішуванні. До цієї суміші був доданий буфер протеїнового зразка, позбавлений будь-якого відновника, такого як DTT або бетамеркаптоетанол, з подальшим електрофорезом на 15%-SDS-PAGE гелі (Criterion Gel, Bio-Rad). Області локалізації білка були візуалізовані за допомогою барвника, такого як кумасі діамантовий. Фіг. 1 являє собою зроблену фотографію гелю, на якому білки, піддані рефолдингу з внутрішньоклітинних включень, експресовані трансформантом НМ11201 при 32°С (доріжка 1) і 28°С (доріжка 2), НМ11200 при 28°С (доріжка 3) і 32°С (доріжка 4), НМ11204 при 28°С (доріжка 5) і 32°С (доріжка 6) і НМ11205 при 32°С (доріжка 7) і 28°С (доріжка 8) пропущені в присутності електричного поля, разом з білком Fc, як стандарт, очищений від Е. coli, відповідно до традиційного способу (доріжка 3). Як видно на фіг. 1, значна частина всіх білків приписана білку Fc, значна частина якого існує в димерній формі після рефолдингу. Однак білки Fc відрізняються в співвідношенні димерів до мономерів від одного трансформанта до іншого, тобто відповідно до N-кінцевої амінокислотної послідовності, експресованої трансформантом. Наприклад, значна частина білків Fc HM11201, які починаються з Met-Pro-Ser-Cys-Pro-CH2-CH3, існує в димерній формі. Майже всі білки Fc НМ11205, які починаються з Met-Cys-Pro-CH2-CH3, існують як мономери, але жоден не існує в димерній формі. Вважається, що це приписується до факту, що специфічність обробки амінопептидази в клітинах носія змінюється в залежності від Fc N-кінцевої послідовності. Аналіз N-кінцевої послідовності Фрагменти димерної області Fc імуноглобуліну, піддані рефолдингу з внутрішньоклітинних включень, відрізняються амінокислотною послідовністю від дикого типу через присутність початкового метіонінового залишку. Для того щоб визначити, чи перетворюється метіоніновий залишок протеазами Е. coli, N-кінцеві амінокислотні послідовності були проаналізовані Basic Science Research Institute, Seoul, Korea. Зразки, що використовуються в аналізі амінокислотної послідовності, були отримані, як викладено нижче. Спочатку PVDF мембрана (Bio-Rad) була занурена в метанол приблизно на 2-3 сек. для активації і була достатньо змочена блокувальним буфером (170 мМ гліцину, 25 мМ Трис-НСІ, (рН 8,0), 20% метанолу). Зразки білка, відділені на не відновленому SDS-PAGE гелі, отримані в 10 UA 97628 C2 5 10 прикладі , були вбрані в PVDF мембрану приблизно на одну годину, з використанням блотинг-набору (Hoefer Semi-Dry Transfer Unit, Amersham). Білки, перенесені на PVDF мембрану, були забарвлені білковим барвником кумасі блакитним R-250 (Amnesco) на мить (3-4 сек.) і промиті знебарвлювальним розчином (вода: оцтова кислота: метанол = 5:1:4). Потім фрагменти мембрани, що містять білки, були вирізані ножицями і піддані аналізу N-кінцевої послідовності. Як результат, було знайдено, що білки Fc IgG4, включаючи шарнірну область, мають Nкінцеву послідовність Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys Pro-Ser-Cys-Pro-CH2-CH3. Амінокислотні послідовності і N-кінцеві послідовності білків, експресовані в трансформанти, представлені в наступній таблиці 1. ТАБЛИЦЯ 1 Трансформанти НМ11200 30 35 40 45 Met-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro-СН2 НМ11205 25 Met-Pro-Ser-Cys-Pro-CH2 НМ11204 20 Met-Ser-Cys-Pro-CH2 НМ11201 15 N-кінцеві послідовності Met-Cys-Pro-CH2-CH3 Результати аналізу послідовності Димер Мономер Ser-Cys-Pro-СН2 Pro-CH2 Pro-Ser-Cys-ProPro-Ser-Cys-ProCH2 CH2 Pro-Ser-Cys-ProЗмішаний CH2 Pro-CH2 З даних аналізу секвенування білків слідує, що піддані рефолдингу фрагменти Fc з внутрішньоклітинних включень, що продукуються трансформованими клітинами Е. coli даного винаходу, були піддані процесингу і мають точну N-кінцеву амінокислотну послідовність, позбавлену початкового амінокислотного залишку. Білковий продукт, який залишається в мономерній формі навіть після рефолдингу, позбавлений цистеїнових залишків, і, таким чином, не може утворювати димери. На додаток до цього, як видно з фіг. 1, частина мономера в підданих рефолдингу фрагментах Fc відрізняється від одного трансформанта до іншого, і не існує ніяких димерів в НМ11205. Ці результати показують, що амінокислотна послідовність Nкінцевої ділянки має великий вплив на трансформування N-кінця, так що білок, що має бажану N-кінцеву послідовність, може бути отриманий модулюванням N-кінцевої послідовності. Білки, навіть якщо вони мають однакову амінокислотну послідовність, можуть бути по-різному трансформовані в залежності від умов культивування клітин носія Е. coli, особливо від температури культивування, як розкрито за допомогою наступних тестів. НМ11200, вирощений при низьких температурах (28°С~32°С), експресував злитий білок Fc, в розчинній формі в тих же кількостях, що і в формі «тіл включення». Розчинна форма злитого білка Fc існувала як мономер, позбавлений N-кінцевої амінокислотної послідовності Met-Ser-Cys. Таким чином, автори даного винаходу виявили, що регульоване співвідношення мономерних і димерних фрагментів Fc імуноглобуліну може бути отримане модулюванням N-кінцевої амінокислотної послідовності злитого білка Fc і умов культивування клітин носіїв. Щоб кількісно визначити експресію областей Fc імуноглобуліну в трансформованих клітинах Е. coli, області Fc імуноглобуліну розчину рефолдингу були очищені з використанням колонки протеїну для афінної хроматографії, яка, як відомо, має сильну афінність до імуноглобулінів, як викладено нижче. «Тіла включення», зібрані центрифугуванням, були піддані рефолдингу і потім очищені колонковою хроматографією. Після пропускання 5 мл колонка протеїну для афінної хроматографії (Pharmacia) була збалансована PBS, клітинні лізати були завантажені в колонку при швидкості потоку 5 мл/хв. Незв'язані білки були змиті PBS, а зв'язані білки елюювали 100 мМ цитрату (рН 3,0). Зібрані фракції були знесолені з використанням висолювальної колонки НіРrер 26/10 (Pharmacia) 10 мМ Тріс буфера (рН 8,0). Потім друга аніонообмінна колонкова хроматографія була проведена з використанням 50 мл колонки Q HP 26/10 (Pharmacia). Первинно очищені рекомбінантні області Fc імуноглобуліну були завантажені в Q-Сефарозаколонку HP 26/10 (Pharmacia) і колонку елюювали з лінійним градієнтом (0-0,2М NaCl) в 10 мМ Тріс буфера (рН 8,0), що дало, таким чином, високочисті фракції. Після часткового очищення з використанням колонки протеїну для афінної хроматографії були визначені рівні експресії рекомбінованих областей Fc імуноглобуліну, і результати представлені в таблиці 2 нижче. 11 UA 97628 C2 ТАБЛИЦЯ 2 Плазміди pmSCPFc pmPSCFc pmCPSFc pmCPFc 5 10 15 20 25 30 Трансформанти HM11200 HM11201 HM11204 HM11205 Виходи експресії після очищення за допомогою протеїн-А 5-6 г/л 4-5 г/л 4-5 г/л 3-4 г/л ПРИКЛАД 2 Конструювання експресуючого вектора області Fc людського імуноглобуліну IgG1. Експресія і очищення області Fc IgG1, і аналіз N-кінцевої послідовності Конструювання експресуючого вектора області Fc IgG1. Щоб клонувати важкий ланцюг області Fc, включаючи шарнірну область людського імуноглобуліну IgG1, була проведена RT-PCR тим же способом, як і в прикладі . Щоб ампліфікувати гени, що мають різні N-кінцеві послідовності, були використані наступні праймери. Що стосується 3'-праймера, він мав послідовність 5'-CGC GGA ТСС ТСА ТТТ АСС CGG AGA CAG GGA GAG GCT СТТ С-3' і був використаний для ампліфікації всіх генів, що мають різні Nкінцеві послідовності. Для полегшення подальшої процедури клонування генів, ділянка розпізнавання Nde І була введена в кожний 5'-праймер, а ділянка розпізнавання ВаmНІ в кожний 3'-праймер. Продукти області Fc, ампліфіковані парами праймерів, були вставлені у вектор, що, таким чином, дало відповідні рекомбінантні плазміди, сконструйовані, щоб мати в своєму складі частини загальної амінокислотної послідовності Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-ThrHis-Thr-Cys шарнірної області IgG1, як викладено нижче. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований МЕРК-праймером, була названа pMEPKFc1 і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG1, що починається з Met-Glu-Pro-Lys, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 22, що відповідає амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 23. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований MSCD-праймером, була названа pMSCKFcl і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG1, що починається з Met-Ser-Cys-Asp, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 24, що відповідає амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 25. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований MDKT-праймером, була названа pMDKTFcl і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG1, що починаються з Met-Asp-Lys-Thr, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 26, що відповідає амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 27. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований МСРА 12 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 праймером, була названа pMCPAFcl і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG1, що починається з Met-Cys-Pro, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 28, що відповідає SEQ ID NO: 29. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований MPKS праймером, була названа pMPKSFc1 і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG1, що починається з Met-Pro-Lys-Ser, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: ЗО, що відповідає SEQ ID NO: 31. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований МСРР-праймером, була названа pMCPPFc1 і була прикріплена до послідовності ДНК, яка кодує СН2 або СНЗ IgG1, що починається з Met-Cys-Pro-Pro, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 32, що відповідає SEQ ID NO: 33. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований МРРС-праймером, була названа pMPPCFc і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG1, що починається з Met-ProPro-Cys, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 34, що відповідає SEQ ID NO: 35. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований МРСР праймером, була названа pMPCPFc і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG1, що починається з Met-Pro-Cys-Pro, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 36, що відповідає SEQ ID NO: 37. Експресуючі вектори були трансформовані в Е. coli BL21 (DE3) щоб отримати трансформанти, позначені, відповідно, як BL21/pMERKFc1(HM11206), BL21/pMSCDFc1(HM11207), BL21/pMDKTFc1(HM11208), BL21/pMCPAFc1(HM11209), BL21/pMPKSFc1(HM11210), BL21/pMCPPFc1(HM11211), BL21/pMPPCFc1(HM11212) і BL21/pMPCPFc1(HM11213). Експресія і очищення Fc IgG1 Як і у випадку IgG4, бактерійні трансформанти, отримані в прикладі , були інокульовані у відповідні ферментери (Marubishi Company), і їм забезпечили умови росту, з подальшим визначенням, чи експресували вони фрагменти області Fc імуноглобуліну. Спочатку кожний трансформант виростили в 100 мл середовища LB при перемішуванні протягом ночі, і інокулювали в ферментер для великомасштабного культивування. Ферментер був витриманий при температурі 28°С або 35°С. Для запобігання переходу від аеробного до анаеробного навколишнього середовища, культури вентилювали повітрям при 20 об./об./хв. і перемішували при 500 об./хв. Щоб скомпенсувати неефективні для росту бактерій поживні речовини, протягом ферментації до культур були додані екстракти глюкози і дріжджів відповідно до ферментаційних станів бактерій. Коли культури досягай значення OD 600 = 80, індуктор, IPTG, був доданий до культур, щоб викликати експресію білка. Культури додатково культивували протягом 40-45 годин, до збільшення значення OD600 до 100-120. Експресію імуноглобуліну Fc, утворення «тіл включення» і утворення димера експресованого імуноглобуліну Fc в трансформованих клітинах Е. coli, досліджували, як викладено нижче. Щоб дослідити всю внутрішньоклітинну експресію областей Fc імуноглобуліну, були взяті аліквоти ферментованих розчинів до і після введення. Частини ферментованих розчинів були змішані з еквівалентними 2 об'ємами буфера білкового зразка і піддані електрофорезу на 15% SDS-PAGE гелі (Criterion Gel, Bio-Rad) в наступних відновних умовах. Результати електрофорезу подані на фіг. 7. Стандарт Fc IgG4 був пропущений по доріжці 1, в той час як рівні експресії трансформанта НМ11208 за часом показані на доріжках 2-4, і рівні експресії трансформанта НМ11206 за часом показані на доріжках 5-7. Рівні експресії в трансформантах НМ11207, НМ11212, НМ11209, НМ11210, НМ11213 і НМ11211 показані на доріжках 8-13, відповідно. Як видно на фіг. 7, одиночна смужка 30 кДа (область Fc), яка не спостерігалася до введення IPTG, дуже виразно з'являється у всіх зразках, які зазнали введення IPTG, що показує, шляхом зіставлення із зразком G4Fc, що рекомбінантні області Fc IgG1 були експресовані. Також, області Fc були надекспресовані, що становить, щонайменше, приблизно 30% від загальної кількості експресованих білків. Щоб кількісно визначити експресію областей Fc імуноглобуліну в трансформованих клітинах Е. coli, області Fc імуноглобуліну розчину рефолдингу були очищені аналогічним чином тому, як були очищені Fc IgG4 з використанням колонки протеїну для афінної хроматографії, яка, як відомо, має сильну афінність до імуноглобулінів. Було виявлено серед трансформантів, що плазміда pMSCDFc має найвищий ступінь експресії, який досягає 340 мг на 10 г "тіла включення", в той час як трансформанти pMDKTFc, pMEPKFc, pMPPCFc і pMPCPFc показали ступені експресії 133,3 мг, 159 мг, 110 мг і 120 мг, відповідно. Вміст димерної Fc IgG1 в продуктах експресії був виміряний тим же способом, який використовувався для визначення вмісту димерної Fc IgF4. Клітини ферментованих розчинів були зруйновані з використанням ультразвукового апарату (Misonix Company). Клітинний лізат, 13 UA 97628 C2 5 10 15 20 отриманий таким чином, був центрифугований, щоб відділити водорозчинні сполуки від водонерозчинних сполук. Було знайдено, що більшість надекспресованих сполук існує як «тіла включення», як виміряно електрофорезом на 15% SDS-PAGE. «Тіла включення» були піддані подальшому процесу рефолдингу, для того щоб дослідити, до якої міри Fc була піддана рефолдингу, і чи утворені, і в якій мірі, димерні області Fc. Піддані рефолдингу білки Fc були очищені з використанням колонки протеїну для афінної хроматографії і змішані з буфером білкового зразка, позбавленого будь-якого відновника, такого як DTT або бета-меркаптоетанол, з подальшим електрофорезом на 15% SDS-PAGE (Criterion Gel, Bio-Rad). Області локалізації білка були візуалізовані за допомогою барвника, такого як Кумасі Діамантовий. Фіг. 8 являє собою фотографію гелю, на якому виходи білків з колонки протеїну, піддані рефолдингу з «тіл включення», експресованих реформантом НМ11208 (доріжка 1), реформантом НМ11206 (доріжка 2), реформантом НМ11207 (доріжка 4), реформантом FDM11212 (доріжка 5) і реформантом НМ11213 (доріжка 7), були пропущені в присутності електричного поля, в умовах відсутності відновників, разом з білком Fc IgG4 як стандартом (доріжки 3, 6 і 8). Як видно на фіг. 8, було знайдено, що всі фрагменти Fc IgG1, що використовуються в тесті, утворюють димери, хоч їх кількість відрізняється в деякій мірі. Аналіз N-кінцевої послідовності Як ідентифіковано у випадку Fc IgG4, N-кінцева амінокислотна послідовність визначала посттрансляційний процесинг відносно того, чи залишився початковий метіоніновий залишок, або чи був початковий метіоніновий залишок акуратно процесований, або разом з іншими амінокислотними залишками утворює амінокислотну послідовність, що відрізняється від бажаної. Для того щоб визначити, чи процесований метіоніновий залишок протеазами Е. coli, були проаналізовані різні N-кінцеві амінокислотні послідовності областей IgG1 Fc Basic Science Research Institute, Seoul, Korea. Результати аналізу підсумовані нижче в таблиці 4. 25 ТАБЛИЦЯ 4 Трансформанти НМ11208 НМ11206 НМ11207 НМ11212 НМ11213 30 35 40 45 Результати N-кінцевої послідовності (Димери) Met Met Ser Pro Pro Як видно з таблиці 4, початковий метіоніновий залишок залишається непроцесованим в трансформантах НМ11208 і НМ11206, в яких області Fc IgG1 були надекспресовані в димерних формах, в той час як продукти ферментації НМ11207, НМ11212 і НМ11213 не мають початкових метіонінових залишків внаслідок точного пост-трансляційного процесингу. Взяті разом, дані, отримані за допомогою вищеперерахованих експериментів, показують, що, коли область Fc IgG1 експресована в Е. coli, її N-кінцева амінокислотна послідовність визначає експресію, рівень експресії, частку димера і її N-кінцеву процесію, і що області Fc, позбавлені початкових метіонінових залишків можуть бути виготовлені в масовому масштабі з використанням N-кінцевої послідовності. Області Fc IgG1, отримані відповідно до даного винаходу, можуть бути використані для збільшення часу напівжиття в сироватці і фізіологічної активності фізіологічно активного поліпептиду, приєднаного до неї, без виникнення імунної відповіді внаслідок додавання зовнішніх амінокислотних залишків. ПРИКЛАД 3 Конструювання експресуючого вектора області Fc людського імуноглобуліну IgG2 Конструювання експресуючого вектора області Fc IgG2 Щоб клонувати важкий ланцюг області Fc, включаючи шарнірну область IgG2, RT-PCR була проведена тим же способом, що використовувався для області Fc IgG4. Щоб ампліфікувати гени, що мають різні N-кінцеві послідовності, були використані наступні праймери. 14 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 3'-праймер мав послідовність 5'-CGC GGA ТСС ТСА ТТТ АСС CGG AGA CAG GGA GAG GCT СТТ С-3' і був використаний для ампліфікації всіх генів, що мають різні N-кінцеві послідовності. Для полегшення подальшої процедури клонування генів, ділянка розпізнавання Ndel була введена в кожний 5'-праймер, і ділянка розпізнавання ВаmНІ - в кожний 3'-праймер. Продукти області Fc, ампліфіковані парами праймерів, були вставлені у вектор, що, таким чином, надавало відповідні рекомбінантні плазміди, сконструйовані, щоб мати частини загальної амінокислотної послідовності Glu-Arg-Lys-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys шарнірної області IgG1, як викладено нижче. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований праймером G2MPPCSS, була названа pmPPCG2Fc і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG2, що починається з Met-Pro-Pro-Cys, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 38, що відповідає амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 39. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований праймером G2MPCPSS, була названа pmPCPG2Fc і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG2, що починається з Met-ProCys-Pro, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 40, що відповідає амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 41. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований праймером G2MCPSS, була названа pmCPG2Fc і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG2, що починається з Met-Cys-Pro, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 42, що відповідає амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 43. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований праймером G2MCCVSS, була названа pmCCVG2Fc і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG2, що починається з Met-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 44, що відповідає амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 45. Плазміда, яка містить ген, ампліфікований праймером G2MCVESS, була названа pmCVEG2Fc і була прикріплена до послідовності ДНК, що кодує СН2 або СН3 IgG2, що починається з Met-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro, яка, як проаналізовано шляхом секвенування нуклеотидів, має SEQ ID NO: 46, що відповідає SEQ ID NO: 47. Експресуючі вектори були трансформовані в Е. coli BL21 (DE3) щоб отримати трансформанти, позначені відповідно як BL21/pmPPCPG2Fc (HM11214), BL21/pmPCPG2Fc (НМ11215), BL21/pmCPG2Fc (HM11216), BL21/pmCCVG2Fc (HM11217) і BL21/pmCVEG2Fc (HM11218). Експресія, очищення і аналіз N-кінцевої послідовності Fc IgG2 Як і у випадку IgG4, бактерійні трансформанти, отримані в прикладі , були інокульовані у відповідні ферментери (Marubishi Company), і їм забезпечили умови росту, з подальшим визначенням, чи експресували вони фрагменти області Fc імуноглобуліну. Умови культивування трохи відрізнялися від тих, що використовувалися для Fc IgG4. Було знайдено, що фрагменти областей Fc IgG2 надекспресуються в різних умовах, включаючи температуру, склад середовища, концентрацію індуктора і т. д., як виміряно SDS-PAGE у відновлювальних умовах. Фіг. 9 показує результати 15%-SDS-PAGE ферментованих розчинів, змішаних з еквівалентними об'ємами 2 буфера білкового зразка. Фрагмент Fc IgG4 був використаний як стандарт на доріжці 1, в той час як фрагменти, експресовані з допомогою НМ11214, НМ11215, НМ11216, НМ11217 і НМ11218 пропущені на доріжках 2-6, відповідно. Як видно на фіг. 9, всі п'ять трансформантів, що використовувалися в експерименті, надекспресували фрагменти Fc. 15 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Вміст димерної Fc IgG4 в продуктах експресії був виміряний тим же способом, що і описаний вище. Клітини ферментованих розчинів були зруйновані, і водонерозчинні сполуки клітинного лізату були піддані рефолдингу, після чого тільки фрагменти області Fc були очищені з використанням колонки протеїну для афінної хроматографії. Очищені продукти експресії були змішані з буфером білкового зразка, позбавленим відновника, такого як DTT або бетамеркаптоетанол, і розділені на 15%-SDS-PAGE (Criterion Gel, Bio-Rad). Області локалізації білка були візуалізовані за допомогою барвника, такого як кумасі діамантовий. Фіг. 10 показує результати електрофорезу. Фрагмент Fc IgG4 був використаний як стандарт на доріжках 1 і 7, в той час як димерні фрагменти з НМ11214, НМ11215, НМ11216, НМ11217 і НМ11218 спостерігалися на доріжках 2-6. Як зрозуміло з даних фіг. 10, продукти експресії трансформантів, хоч відрізняються один від одного, в плані N-кінцевої послідовності або умов експресії, можуть всі формувати димери. Для того щоб визначити чи обробляється метіоніновий залишок протеазами Е. coli, різні Nкінцеві амінокислотні послідовності були проаналізовані Basic Science Research Institute, Seoul, Korea. Початковий метіоніновий залишок був видалений з продукту трансформантів НМ11214 і НМ11215, обидва з яких мають залишок проліну в положенні 2. Як видно з цих експериментів, області Fc IgG2 можуть бути експресовані у великому масштабі в Е. coli. На додаток до цього, дані, отримані у вищеперерахованих експериментах, показують, що N-кінцева послідовність області Fc IgG1 визначає експресію, рівень експресії, частку димера, і її N-кінцеву процесію, і що області Fc, позбавлені початкових метіонінових залишків, можуть бути виготовлені в масовому масштабі з використанням N-кінцевої послідовності. Області Fc IgG1, отримані відповідно до даного винаходу, можуть бути використані для збільшення часу напівжиття в сироватці і фізіологічної активності фізіологічно активного поліпептиду, приєднаного до неї, без виникнення імунної відповіді через додавання зовнішніх амінокислотних залишків. ПРИКЛАД 4 Зв'язування C1q з використанням аналізу ELISA Щоб визначити, чи можуть похідні, отримані в прикладі , і білки, що відповідають областям Fc імуноглобулінів, експресовані в трансформантах Е. coli і очищені, зв'язуватися з людським C1q, був проведений твердо фазний імуноферментний аналіз (ELISA), як описано нижче. Як тестові групи були використані області Fc імуноглобуліну, продуковані трансформантами НМ11200 і НМ11201, отримані у вищеперерахованих прикладах. Як стандарт був використаний глікозильований імуноглобулін (IVIGG-globulin S, Green Cross РВМ). Тестові зразки і стандарти були отримані в 10 мМ карбонатного буфера (рН 9,6) в концентрації 1 мкг/мл. Аліквоти зразків були вміщені в 96-ямковий планшет (Nunc) в кількості 200 нг в кожну ямку, і планшет був покритий плівкою всю ніч при 4°С. Після цього кожна ямкка була промита PBS-T (137 мМ NaCl, 2 мМ КСl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ КН2РО4, 0,05% Твіна 20) три рази, блокована 250 мкл блокувального буфера (1% бичачий сироватковий альбумін в PBS-T) при кімнатній температурі протягом 1 години, і знов промита тим же самим PBS-T три рази. Стандарт і тестові зразки були розбавлені в PBS-T до заданої концентрації і додані до ямки, покритої плівкою з антитіл, і планшет був витриманий при кімнатній температурі протягом 1 години і промитий PBS-T три рази. Після цього 2 мкг/мл C1q (R&D Systems) було додано до планшета, і реакція перебігала при кімнатній температурі 2 години, після чого планшет був промитий PBS-T шість разів. 200 мкл 1:1000 розбавленого кон'югата людського антитіла проти C1q людини/пероксидази (Biogenesis, USA) в блокувальному буфері було додано до кожної ямки, і реакція перебігала при кімнатній температурі 1 годину. Після того як кожна ямка була промита PBS-T три рази, еквівалентні об'єми кольорових реагентів А і В (фарбувальну речовину А: стабілізований пероксид, фарбувальна речовина В: стабілізований хромоген; DY 999, R&D Systems) були змішані, і 200 мкл суміші було додано до кожної ямки, з подальшим витримуванням протягом 30 хвилин. Після цього 50 мкл остаточного реакційного розчину, 2М сірчана кислота була додана до кожної ямки. Планшет був зчитаний мікропланшет-рідером (Molecular Device). Оптична густина стандарту і тестових зразків була виміряна при 450 нм, і результати подані на фіг. 2. Як показано на фіг. 2, білки області Fc імуноглобуліну, процесовані в Е. coli відповідно до даного винаходу, показують значно зменшену афінність до C1q. Ці результати показують, що білки області Fc імуноглобуліну даного винаходу майже ніколи не мають ризику викликати імунні відповіді, такі як цитотоксичність і запалення в організмі, коли використовуються як переносник для фізіологічно активних поліпептидів в формі кон'югата. ПРИКЛАД 5 Аналіз зв'язування з FcRI, FcRIII і FcRn2 з використанням ELISA 16 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відомо, що імуноглобулін Fc зв'язує гематоцитні рецептори з FcRI і FcRIII, що служить зв'язувальною ланкою ефекторних функцій, таких як антитіло-залежна цитотоксичність. Щоб визначити, чи служить імуноглобулін Fc, виготовлений в Е. coli, зв'язувальною ланкою таких ефекторних функцій, кожний з рецепторів був отриманий і проаналізований на зв'язувальну здатність при допомозі ELISA. Також, імуноглобулін Fc був проаналізований на зв'язувальну здатність з рецептором FcRn, який, як відомо, має вплив на метаболізм імуноглобуліну в організмі, аналогічним чином. Конструювання штамів експресії людського FcRI, FcRIII і FcRn2 Вся РНК була виділена з людських мононуклеарних клітин периферичної крові, використовуючи набір (Qiagen, Cat. No.??? ), щоб «виловити» гени, що кодують позаклітинні області зв'язування лігандів людських FcRI, FcRIII і FcRn2 при допомозі RT-PCR і РСТ. Гени були злиті з геном GST (Глутатіон S-трансфераза) і клоновані у відповідні експресуючі вектори клітини тварини, прикріпляючи до нього ген дегідрофолатредуктази. Рекомбінантна плазміда рНМ000, отримана таким чином, трансфікована в СНО-клітини. У цьому відношенні, СНО6 клітини були інокульовані в розрахунку 110 клітин на 6-см чашку для культивування, витримані при 37°С протягом 24 годин в 5%-СО2-інкубаторі, і двічі промиті Opti-MEM (Gibco., Cat. № 31985-070). 1 мл Opti-MEM, що містить 10 мкг рНМ000, був змішаний з 1 мл реагенту Ліпофектамін™ (Invitrogen, Cat. № 18324-020). Після стояння протягом 20 хвилин суміш, що утворилася, була додана до отриманих СНО-клітин. Ці клітини були витримані при 37°С протягом 18 годин в 5%-СО2-інкубаторі і відновлені DMEM/F12, доповнені 10% ембріональною телячою сироваткою і 1%-пеніцилін-стрептоміцином перед додатковим витримуванням протягом 48 годин. Для того щоб відібрати трансформовані штами, клітини були оброблені 0,5% трипсином (Gibco., Cat. № 15400-054) у вибраному середовищі -МЕМ (Welgene, Cat. № LM00802), яка включає 10%-бичачу сироватку, діалізовану ембріонально, 1%-пеніцилін-стрептоміцин, і 800 мкг/мл генетицину (Mediatech, Cat. № 61-234RG), з подальшим центрифугуванням. Клітини, трансформовані таким чином, були перенесені в Т25-чашку для культивування (Nunc) і витримані при 37°С в 5%-СО2-інкубаторі до 90% або більш високої конфлюентності. Для того, щоб визначити рівні експресії FcRI, FcRIII і FcRn2, вибрані штами були витримані при 37°С в 5%-СО2-інкубаторі із збільшенням концентрацій МТХ (Sigma, Cat. № М-8407) від 20 нМ із збільшенням на 20 нМ кожні два тижня. Виготовлення і очищення людських FcRI, FcRIII і FcRn2 FcRI, FcRIII і FcRn2 були очищені, як викладено нижче. Вибрані клітинні штами були 8 інокульовані в Cell Factory (Nunc, Cat. № 170009) з розрахунку 3,510 клітин на реактор, і вирощені при 37°С протягом 48 годин в 5%-СО2-інкубаторі, і потім двічі промиті 1 літром PBS на кожний реактор. Клітини були доповнені 1 літром виробничого середовища CHO-A-SFM, що містить 0,3 мМ бутирату натрію (Sigma, Cat. № В-5887) і вирощувалися при 33°С в 5% СО2 інкубаторі, протягом чого експресований супернатант витягувався кожний день, в сумі 7 разів. Зібраний супернатант був центрифугований, відфільтрований за допомогою 0,22 мкм системи фільтрування (Corning), концентрований з використанням системи концентрування (PALL, Cat. № PN OS010C70) і завантажений на смолу хелатуючої сефарози FF (Amersharm pharmacia, Cat. № 17-0575-02) наповненої 0,1 М сульфідом нікелю (Sigma, Cat. № N4887), так що GST FcRI, FcRIII і FcRn2 були приєднані до нікелю. Пов'язані FcRI, FcRIII і FcRn2 були розділені і очищені з колонки 50 мМ NaPi (pH 8,0), 300 mM NaCl і 250 мМ імідазолу. Аналіз зв'язування з FcRI FcRI, очищений в прикладі , був розбавлений до концентрації 0,75 мкг/мл в PBS (рН 7,4), аліквоти були вміщені в 96-ямковий планшет (Nunc, Maxisorp) в кількості 100 мкл в кожну ямку, і витримувалися протягом 18 годин при 4°С, так щоб рецептор був прикріплений до дна 96-ямкового планшета. Кожна ямка 96-ямкового планшета була промита три рази 300 мкл промивного буфера PBS (рН 7,4), що містить 0,05% Твін 20 (Amresco, Cat. № 0777). Потім 300 мкл PBS (рН 7,4) що містить 0,1% Твіна 20 і 3% BSA (телячий сироватковий альбумін, Amresco, Cat. № 0332) додали до кожної ямки, щоб запобігти небажаному приєднанню інших сполук до дна ямки, і витримували при 37°С протягом 1 години, після чого реакційний розчин був повністю видалений з ямки. З сироватковим людським IgG і Fc, розділені обробкою сироваткового людського IgG папаїном, що служив як стандарт, продукти НМ11200 і НМ11201, очищені в прикладі 2, були розбавлені до концентрації 9 мкг/мл відповідними аналізуючими буферами, з подальшими повторюваними серійними розбавленнями 1:3 аналізуючим буфером сім разів. 100 мкл розбавленого розчину вмістили в кожну ямку 96-ямкового планшета, і реакція перебігала при 25 °С протягом 2 годин, зі струшуванням при постійній інтенсивності, і ямка була промита шість разів промивним буфером. Для того щоб дослідити, чи всі продукти НМ11200 і НМ11201 і 17 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стандарти, прикріплені до дна 96-ямкового планшета, були приєднані до FcRI, 1:100000 розбавлений розчин козячого HRP-кон'югованого антитіла проти людського важкого ланцюга (Chemicon, AP309P) в аналізуючому буфері був вміщений в об'ємі 100 мкл в кожну ямку і реагував при 25°С протягом 2 годин, зі струшуванням при постійній інтенсивності. Після промивання шість разів промивним буфером 100 мкл субстрат (BD bioscience, Cat. № 555214), який був здатний реагувати з HRP, кон'югованим з антитілом, було вміщено в кожну ямку, і реакція перебігала при 25°С протягом 20 хвилин. Реакція була припинена 2н сірчаною кислотою, і оптична густина була виміряна з допомогою ELISA-рідера (Molecular Devices, мікропланшет-рідер) при 450 нм. Як видно на фіг. 3, майже жоден з білків Fc, виготовлених в Е. coli, не зв'язується з FcRI, в той час як людський IgG і Fc, обидва глікозильовані, були міцно зв'язані з FcRI. Аналіз зв'язування з FcRIII З сироватковим людським IgG і Fc, розділеними обробкою сироваткового людського IgG папаїном, що служить як стандарт, продукти НМ11200 і НМ11201, очищені в прикладі , були розбавлені до концентрації 9 мкг/мл у відповідному карбонатному буфері (рН 9,0), з подальшими повторюваними серійними розбавленнями 1:3 карбонатним буфером сім разів. 100 мкл розбавленого розчину вміщували в кожну ямку 96-ямкового планшета, і витримували при 4°С протягом 18 годин, так щоб вони прикріпилися до дна 96-ямкового планшета. Кожна ямка 96-ямкового планшета була промита три рази 300 мкл промивного буфера, що складається з PBS (рН 7,4), що містить 0,05% Твіна-20 (Amresco, Cat. № 0777). Після цього 300 мкл аналізуючого буфера, що складається з PBS (рН 7,4), що містить 0,1% Твіна-20 і 5% знежиреного сухого молока (Difco, Cat. № 232100) додали до кожної ямки, щоб запобігти небажаному приєднанню інших сполук до дна ямка, і витримували при 37°С протягом 1 години, після чого реакційний розчин був повністю видалений з ямки. FcRIII, очищений в прикладі , був розбавлений до концентрації 1 мкг/мл в розчині, що аналізується. 100 мкл розбавленого розчину вмістили в кожну ямку 96-ямкового планшета, і реакція перебігала при 25 °С протягом 2 годин, зі струшуванням при постійній інтенсивності. Ямка була промита шість разів промивним буфером. Кроляче антитіло проти GST (Chemicon, AB3282), яке було здатне зв'язуватися з GST (глутатіон S-трансфераза) FcRIII, сполучене з продуктом НМ11200, НМ11201 і стандартами, було розбавлене 1:10000 в аналізуючому буфері, і 100 мкл розбавленого розчину вмістили в кожну ямку, і реакція перебігала при 25°С протягом 2 годин, зі струшуванням при постійній інтенсивності. Потім, після промивання ямок шість разів промивним буфером, 100 мкл 1:7500 розбавленого розчину антитіла по відношенню до антитіла кролика в аналізуючому буфері було вміщено в кожну ямку. Після реакції при 25°С протягом 2 годин, зі струшуванням при постійній інтенсивності, 96ямковий планшет був промитий шість разів промивним буфером. Субстрат був доданий аналогічним, як в прикладі чином, і оптична густина була виміряна з допомогою ELISAрідера. Як видно на фіг. 4, майже жоден з білків FcRIII, виготовлених в Е. coli, не зв'язується з FcRI, в той час як людський імуноглобулін G і Fc, обидва глікозильовані, були міцно зв'язані з FcRIII. Аналіз зв'язування з FcRn2 З сироватковим людським імуноглобуліном G і Fc, розділеним обробкою сироваткового людського IgG папаїном, що слугував як стандарт, продукти НМ11200 і НМ11201, очищені в прикладі , були розбавлені до концентрації 20 мкг/мл відповідним карбонатним буфером (рН 9,0), з подальшими повторюваними серійними розбавленнями 1:3 карбонатним буфером сім разів. 100 мкл розбавленого розчину вміщували в кожну ямку 96-ямкового планшета, і витримували при 4°С протягом 18 годин, так що вони прикріпилися до дна 96-ямкового планшета. Кожна ямка 96-ямкового планшета була промита три рази 300 мкл промивного буфера, що складається з PBS (рН 7,4), що містить 0,05% Твін-20 (Amresco, Cat. № 0777). Після цього 300 мкл аналізуючого буфера, що складається з PBS (рН 7,4), що містить 0,1% Твіна-20 і 0,5% BSA (Amresco, Cat. № 0332), додали до кожної ямки, щоб запобігти небажаному приєднанню інших сполук до дна ямки, і витримали при 37°С протягом 1 години, після чого реакційний розчин був повністю видалений. FcRn2, очищений в прикладі , був розбавлений до концентрації 3 мкг/мл в розчині, що аналізується. 100 мкл розбавленого розчину вміщували в кожну ямку 96-ямкового планшета і реакція перебігала при 25°С протягом 2 годин, зі струшуванням при постійній інтенсивності. Ямка була промита шість разів промивним буфером. Кроляче антитіло анти-GST (Chemicon, АВ3282), здатне зв'язуватися з GST (глутатіон S-трансфераза) FcRn2, сполучене з продуктом НМ11200, НМ11201 і стандартами, було розбавлено 1:10000 в аналізуючому буфері, і 100 мкл розбавленого розчину вміщували в кожну ямку і реакція перебігала при 25°С протягом 2 годин, зі струшуванням при постійній 18 UA 97628 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інтенсивності. Потім, після промивання ямок шість разів промивним буфером, 100 мкл 1:7500 розбавленого розчину антитіла відносно антитіла кролика в аналізуючому буфері було вміщено в кожну ямку. Після реакції при 25°С протягом 2 годин, зі струшуванням при постійній інтенсивності, 96ямковий планшет був промитий шість разів промивним буфером. Субстрат був доданий аналогічним чином, як в прикладі 5-2, і оптична густина була виміряна з допомогою ELISA рідера. Подібно людському IgG і глікозильованому Fc, як видно на фіг. 5, білки Fc, продуковані в Е. coli, міцно зв'язані з FcRn2 ПРИКЛАД 6 Отримання і фармокінетичний аналіз кон'югата людського ЕРО Отримання людського ЕРО Щоб отримати кон'югат людського ЕРО (еритропоетин), спочатку ген ЕРО був ампліфікований при допомозі RT-PCR з використанням загальної РНК, виділеної з клітин людської крові, і клонований у вектор pBluscript II (Stratagen), таким чином, з утворенням вектора pBlueEP. Щоб перенести клонований ген ЕРО в експресуючий вектор клітини тварини pCMV/dhfr-(pCDNA3.1 (Invitrogen Company), що містить dhfr-ген), pBlueEP був розщеплений з Hindlll і ВаmНІ, і ЕРО ген-вмісний фрагмент, отриманий таким чином, вставлений в експресуючий вектор клітини тварини, обробленої тими ж самими рестрикційними ферментами, із забезпеченням, таким чином, pcmvEP. Цей експресуючий вектор, що несе ЕРО ген, був переміщений в СНО клітини, штам експресії білка з використанням реагенту Ліпофектаміну (Gibco). Клітини були оброблені МТХ з концентрацією, що поступово зростає до 120 нМ, щоб підвищити його рівні експресії. ЕРО був експресований на високих рівнях, вище, чим 100 мг на літр. Отримання комплексу людського EPO-PEG ALD-PEG-ALD (Shearwater), 3,4-кДа поліетиленгліколь, що має активні альдегідні групи на обох кінцях, був змішаний з деякими кількостями 100 мМ фосфатного буфера, що містить ЕРО, отриманий у в концентрації 5 мг/мл, що підходить для формування мольного відношення ЕРО: PEG 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 і 1:20. До цієї суміші був доданий відновник - ціанборгідрид натрію (NaCNBH3, Sigma), до кінцевої концентрації 20 мМ, і реакція перебігала при 4°С протягом 2 годин, зі слабким перемішуванням, щоб дозволити PEG селективно приєднатися до кінцевої аміногрупи ЕРО. Щоб отримати комплекс PEG і ЕРО в пропорції 1:1, реакційна суміш була піддана гель-хроматографії з використанням колонки Superdex® (Pharmacia). Комплекс EPOPEG елюювали з колонки 10 мМ буфер фосфату калію (рН 6,0) як елююючого буфера, при цьому був видалений ЕРО, не приєднаний до PEG, PEG, що не прореагував, і димерні побічні продукти, в яких PEG приєднаний до двох молекул ЕРО. Очищений комплекс EPO-PEG був сконцентрований до 5 мг/мл. За допомогою цього експерименту було знайдене оптимальне мольне відношення ЕРО до PEG, яке забезпечує найвищу реакційну здатність і утворення найменшої кількості побічних продуктів, таких як димери, і яке складає від 1:2,5 до 1:5. Отримання кон'югата людського комплексу EPO-PEG і рекомбінантної області Fc імуноглобуліну Комплекс EPO-PEG, отриманий в прикладі , був приєднаний до області Fc імуноглобуліну, продукованої з використанням НМ11201 в прикладі . Більш детально, фрагмент області Fc імуноглобуліну (приблизно 53 кДа), отриманої в прикладі , був розчинений в 10 мМ фосфатному буфері і змішаний з EPO-PEG комплексом при молярному співвідношенні комплексу EPO-PEG: область Fc, що дорівнює 1:1, 1:2, 1:4 і 1:8. Після підгонки концентрації фосфатного буфера реакційного розчину до 100 мМ, був доданий відновник ціанборгідрид натрію (NaCNBH3, Sigma) до кінцевої концентрації 20 мМ, і реакція перебігала при 4°С протягом 20 годин, при слабому перемішуванні. За допомогою цього експерименту було знайдене оптимальне мольне відношення EPO-PEG комплексу до фрагмента області Fc, яке забезпечує найвищу реакційну здатність і утворення найменших кількостей побічних продуктів, таких як димери, і яке становить 1:2. Після реакції спаровування реакційна суміш була піддана рідинній хроматографії високого тиску для того, щоб видалити речовини, що не прореагували, і побічні продукти. Розчин реакції спаровування був знесолений з використанням знесолювальної колонки НіРrер 26/10 (Pharmacia) 10 мМ буфером Трис (рН 8,0). Потім реакційний розчин був завантажений в 50 мл колонку Q HP 26/10 (Pharmacia) з швидкістю потоку 8 мл/хв., і ця колонка елюювалась NaCl лінійного градієнта 0М 0,2М, щоб отримати бажані фракції. Зібрані фракції були знов завантажені на колонку роlуСАТ 21,5250, збалансовану 10 мМ ацетатним буфером (рН 5,2) з швидкістю потоку 15 мл/хв., і ця колона елюювалась NaCl лінійного градієнта 0,1М 0,3М, що, таким чином, забезпечувало високо чисті фракції. Фармакокінетичний аналіз 19 UA 97628 C2 5 10 15 Нативна ЕРО, отримана в прикладі , Aranesp (Amgen), що має більший вміст сіалової кислоти для того, щоб збільшити свій час напівжиття, і кон'югат EPO-PEG-Fc (тестова група), отриманий в прикладі , були підшкірно введені в дозі 100 мкг/кг п'яти SD-щурам. Після підшкірної ін'єкції були зібрані зразки крові після 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 і 48 годин в контрольних групах і після 1, 12, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 240, 288, 336 і 384 години в тестових групах. Зразки крові були зібрані в 1,5-мл-пробірки, коагульовані і центрифуговані протягом 10 хв. з використанням високошвидкісної мікроцентрифуги Eppendorf для видалення кров'яних клітин. Рівні сироваткового білка були виміряні ELISA з використанням антитіла, специфічного до ЕРО. Таблиця 6, наведена нижче, і фіг. 6 показують час напівжиття в сироватці нативного білка і білкового кон'югата. Білковий кон'югат EPO-PEG-Fc (Е. соіі), отриманий з використанням області Fc імуноглобуліну, продукованої відповідно до даного винаходу як переносник, показав значно більш довгий час напівжиття в сироватці, ніж у випадку нативної ЕРО. Було знайдено, що цей збільшений час напівжиття вище, ніж у Aranesp, який, як відомо, є другим поколінням ЕРО, що має довгий час напівжиття в сироватці. ТАБЛИЦЯ 6 1 Сmах (мкг/мл) 2 Тmах (ГОД.) 3 Т1/2 (год.) 4 AUC (нг.год./мл) 5 MRT (год.) ЕРО 30,4 12,0 6,1 713 15,1 кон'югат EPO-PEG-Fc 192,8 48,0 47,0 20436 88 Aranesp 96,8 12,0 16,4 4064 32 1 Максимальна концентрація сироватки Час, необхідний для досягнення максимальної концентрації лікарського засобу 3 Час напівжиття лікарського засобу в сироватці 4 Область під кривою залежності концентрації в сироватці-час 5 Середній час перебування молекули лікарського засобу в організмі 2 20 ПРОМИСЛОВА ЗАСТОСОВНІСТЬ Як описано для цієї мети, спосіб відповідно доданого винаходу робить можливим масове виробництво області Fc імуноглобуліну в «тілах включення», що формуються в Е. coli, з використанням рекомбінантної області Fc імуноглобуліну, що містить шарнірну область. Приєднана до фізіологічно активного білка, отримана область Fc імуноглобуліну може бути ефективно використана для збільшення часу напівжиття в сироватці і фізіологічної активності фізіологічно активного білка без ризику виникнення імунних відповідей. 25 20 UA 97628 C2 21 UA 97628 C2 22 UA 97628 C2 23 UA 97628 C2 24 UA 97628 C2 25 UA 97628 C2 26 UA 97628 C2 27 UA 97628 C2 28