Спосіб направлення клітинної відповіді на інфекційний агент, клітину, інфіковану вказаним агентом, пухлинну, злоякісну клітину або аутоімунну клітину (варіанти), клітина, яка експресує мембранозв’язаний білкови

1 Способ направления клеточного ответа на инфекционный агент, клетку, инфицированную указанным агентом, опухолевую, злокачественную клетку или аутоиммунную клетку у млекопитающего, где указанному млекопитающему вводят эф фективное количество терапевтических клеток, отличающийся тем, что указанные клетки экспрессируют мембраносвязанный белковый химерный рецептор, который включает (а) внеклеточную часть CD4, способную специфично распознавать и связывать указанный агент или указанную клетку, и (Ь) внутриклеточную часть Т-клеточного рецептора CD3, С, или г\ полипептид, полипептид Вклеточного рецептора или полипептид Fcрецептора, способный подавать указанной терапевтической клетке сигнал на разрушение связанного с рецептором агента или связанной с рецептором клетки 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный клеточный ответ является МНС-независимым 3 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный рецепторный белок представляет собой С,, г\, у, CD3 дельта, ТЗ гамма, mbl или В29 4 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный химерный рецептор содержит (а) аминокислоты 421-532 SEQ ID NO 6 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala 421 425 430 Tyr Gin Gin Gly Gin Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 435 440 445 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 450 455 460 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gin Glu Gly Leu Tyr Asn 465 470 475 480 Glu Leu Gin Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu H e Gly Met 485 490 495 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin Gly 500 505 510 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gin Ala 5X5 520 525 Leu Pro Pro Arg 530; Зоя о О 00 5 41870 (b) аминокислоты 423-455, 438-455, 461-494 или 494-528 S E Q ID N O 6, указанной в подпункте (а), (с) аминокислоты 400-420 S E Q ID N O 6 Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly H e Leu Phe H e Tyt Gly Val H e Leu Thr 400 405 410 ' 415 Ale Leu Phe Leu 420; (d) аминокислоты 421-575 S E Q ID N O 4 Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala J 421 - 425 430 Asn Leu Gin Asp Pro Asn Gin Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 435 440 445 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu 450 • 455. 460 Met Gly Gly Lys Gin Gin Arg Arg Arg Asn Pro Gin Glu Gly Val Tyr 465 470 475 480 Asn Ala Leu Gin Lys Asp Lya Met Pro Qlu Ala Tyr Ser Glu H e Gly 485 490 495 Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin 500 505 510 Asp Ser His Phe Gin Ala Val Gin Phe Gly Asn Arg Arg Glu Arg Glu 515 520 , 525 Gly Ser Glu Leu Thr Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ala Arg Pro Lys Gly 530 535 540 Glu Ser Thr Gin Gin Ser Ser Gin Ser Cys Ala Ser Val Phe Ser H e 555 550 565 560 Pro Thr Leu Trp Ser Pro Trp Pro Pro Ser Ser Ser Ser Gin Leu 565 570 575 (e) аминокислоты 423-455, 438-455, 461-494 или 494-528 SEQ ID NO 4, указанной в подпункте (d), ; (f) аминокислоты 400-420 SEQ ID NO 4 Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly H e Leu Phe H e Tyr Gly Val 400 405 410 He He 415 r Thr Ala Leu Tyr Leu 420 ; (g) аминокислоты 421-462 S E Q ID N O 5 Arg Leu Lys H e Gin Val Arg Lys Ala Asp H e Ala 421 ^425 430 Ser Arg Glu Lys Ser Asp Ala Val Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Asn 435 440 445 Gin Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gin 450 455 460 462 / (h) аминокислоты 402-419 S E Q ID N O 5 Tyr H e Leu Asp Ala H e Leu Phe Leu Tyr Gly H e Val Leu Thr Leu Leu Tyr 402 405 410 415; 41870 (і) аминокислоты YMTLNPRAPTDDDKNIY, (l) аминокислоты 132-171 SEQ ID NO 24 Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gin Ala Leu Leu Arg 132 135 140 Asn Asp Gin Val Tyr Gin Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gin Tyr 145 150 155 160 Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys 165 170; (k) аминокислоты 140-182 SEQ ID NO 25 Asp Gly Val Arg Gin -140 Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gin Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gin Leu Tyr 145 150 155 160 Gin Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gin Tyr Ser His Leu Gin Gly 165 170 175 Asn Gin Leu, Arg Arg Asn 180; ( ) аминокислоты 162-220 SEQ ID N O 26 I Arg Trp Gin Asn Glu Lys Phe Gly Val Asp Met Pro Asp Asp Tyr 162 165 170 175 Glu Asp Glu Asn>Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cya Ser Met 180 185 190 Туе Glu Asp lie Ser Arg Gly Leu Gin Gly Thr Tyr Gin Asp Val Gly 195 200 205 Asn Leu His lie Gly Asp Ala Gin Leu Glu Lys Pro 210 215 * 220; или (m) аминокислоты 183-228 SEQ ID N O 27 Asp Asp Gly Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp 183 185 190 His Thr Tyr Glu 'Gly Leu Asn lie Asp Gin Thr Ala Thr Tyr Glu Asp 195 200 205 H e Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Cly Glu His 210 215 220 Pro Gly Gin Glu 225. 5 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанные терапевтические клетки выбраны из группы, содержащей (a) Т-лимфоциты, (b) цитотоксические Т-лимфоциты, (c) натуральные киллеры, (d) нейтрофилы, (e) гранулоциты, (f) макрофаги, (д) тучные клетки, (п) клетки HeLa, и (і) эмбриональные стволовые клетки (ES) 6 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный инфекционный агент представляет собой вирус иммунодефицита 7 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанная внеклеточная часть включает связывающую оболочку ВИЧ часть CD4 или ее функциональное производное, связывающее оболочку ВИЧ 8 Способ по п 1, отличающийся тем, что указанный цитотоксический Т-лимфоцит является CD8+ цитотоксическим Т-лимфоцитом 9 Способ направления клеточного ответа на инфекционный агент, клетку, инфицированную указанным агентом, опухолевую, злокачественную клетку или аутоиммунную клетку у млекопитающего, где указанному млекопитающему вводят эффективное количество терапевтических клеток, отличающийся тем, что указанные клетки экспрессируют мембраносвязанныи белковый химерный рецептор, который включает (а) внеклеточную часть CD4, способную специфично распознавать и связывать указанный агент или указанную клетку, и (Ь) трансмембранную часть Т-клеточного рецеп 41870 тора, В-клеточного рецептора или полипептид Fcрецептора, способный подавать указанной терапевтической клетке сигнал на разрушение связанного с рецептором агента или связанной с рецептором клетки 10 Способ по п 9, отличающийся тем, что указанный клеточный ответ является МНС-независимым 11 Способ по п 9, отличающийся тем, что указанный рецепторный белок представляет собой С,, г\, у, CD3 дельта, ТЗ гамма, mbl или В29 12 Способ по п 9, отличающийся тем, что указанный химерный рецептор содержит (a) аминокислоты 421-532 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (b) аминокислоты 423-455, 438-455, 461-494 или 494-528 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (c) аминокислоты 400-420 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (d) аминокислоты 421-575 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (e) аминокислоты 423-455, 438-455, 461-494 или 494-528 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (f) аминокислоты 400-420 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (д) аминокислоты 421-462 SEQ ID NO 5, указанной в п 4, (h) аминокислоты 402-419 SEQ ID NO 5, указанной в п 4, (і) аминокислоты YMTLNPRAPTDDDKNIY, (|) аминокислоты 132-171 SEQ ID NO 24, указанной в п 4, (к) аминокислоты 140-182 SEQ ID NO 25, указанной в п 4, (I) аминокислоты 162-220 SEQ ID NO 26, указанной в п 4, или (ш) аминокислоты 183-228 SEQ ID NO 27, указанной в п 4 13 Способ по п 9, отличающийся тем, что указанные терапевтические клетки выбраны из группы, содержащей (a) Т-лимфоциты, (b) цитотоксические Т-лимфоциты, (c) натуральные киллеры, (d) нейтрофилы, (е) гранулоциты, (f) макрофаги, (д) тучные клетки, (h) клетки HeLa, и (і) эмбриональные стволовые клетки (ES) 14 Способ по п 9, отличающийся тем, что указанный инфекционный агент представляет собой вирус иммунодефицита 15 Способ по п 9, отличающийся тем, что указанная внеклеточная часть включает связывающую оболочку ВИЧ часть CD4 или ее функциональное производное, связывающее оболочку ВИЧ 16 Способ по п 9, отличающийся тем, что указанный цитотоксический Т-лимфоцит является CD8+ цитотоксическим Т-лимфоцитом 17 Клетка, экспрессирующая мембраносвязанный белковый химерный рецептор, причем указанный рецептор включает (а) внеклеточную часть, способную специфично распознавать и связывать инфекционный агент, клетку, инфицированную указанным агентом, опухолевую, злокачественную клетку или аутоиммунную клетку, и (Ь) внутриклеточную часть Т-клеточного рецептора, Вклеточного рецептора или полипептид Fcрецептора, способный подавать указанной терапевтической клетке сигнал на разрушение связанного с рецептором агента или связанной с рецептором клетки 18 Клетка по п 17, где указанный клеточный ответ является МНС-независимым 19 Клетка по п 17, где указанный рецепторный белок представляет собой С,, г\, у, CD3 дельта, ТЗ гамма, mbl или В29 20 Клетка по п 17, где указанный химерный рецептор содержит (a) аминокислоты 421-532 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (b) аминокислоты 423-455, 438-455, 461-494 или 494-528 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (c) аминокислоты 400-420 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (d) аминокислоты 421-575 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (e) аминокислоты 423-455, 438-455, 461-494 или 494-528 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (f) аминокислоты 400-420 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (д) аминокислоты 421-462 SEQ ID NO 5, указанной в п 4, (h) аминокислоты 402-419 SEQ ID NO 5, указанной в п 4, (і) аминокислоты YMTLNPRAPTDDDKNIY, (|) аминокислоты 132-171 SEQ ID NO 24, указанной в п 4, (к) аминокислоты 140-182 SEQ ID NO 25, указанной в п 4, (I) аминокислоты 162-220 SEQ ID NO 26, указанной в п 4, или (ш) аминокислоты 183-228 SEQ ID NO 27, указанной в п 4 21 Клетка по п 17, где указанные терапевтические клетки выбраны из группы, содержащей (a) Т-лимфоциты, (b) цитотоксические Т-лимфоциты, (c) натуральные киллеры, (d) нейтрофилы, (е) гранулоциты, (f) макрофаги, (д) тучные клетки, (h) клетки HeLa, и (і) эмбриональные стволовые клетки (ES) 22 Клетка по п 17, где указанная внеклеточная часть включает связывающую оболочку ВИЧ часть CD4 или ее функциональное производное, связывающее оболочку ВИЧ 23 Клетка по п 17, где указанный цитотоксический Т-лимфоцит является CD8+ цитотоксическим Т-лимфоцитом 24 Клетка по п 17, где указанная внеклеточная часть представляет собой молекулу иммуноглобулина или ее антиген-связывающий фрагмент 25 Клетка, экспрессирующая мембраносвязанный белковый химерный рецептор, причем указанный рецептор включает (а) внеклеточную часть, способную специфично распознавать и связывать инфекционный агент, клетку, инфицированную указанным агентом, опухолевую, злокачественную клетку или аутоиммунную клетку, и (Ь) трансмем 41870 бранную часть Т-клеточного рецептора, Вклеточного рецептора или полипептид Fcрецептора, способный подавать указанной терапевтической клетке сигнал на разрушение связанного с рецептором агента или связанной с рецептором клетки 26 Клетка по п 25, где указанный клеточный ответ является МНС-независимым 27 Клетка по п 25, где указанный рецепторный белок представляет собой С,, г\, у, CD3 дельта, ТЗ гамма, mbl или В29 28 Клетка по п 25, где указанный химерный рецептор содержит (a) аминокислоты 421-532 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (b) аминокислоты 423-455, 438-455, 461-494 или 494-528 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (c) аминокислоты 400-420 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (d) аминокислоты 421-575 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (e) аминокислоты 423-455, 438-455, 461-494 или 494-528 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (f) аминокислоты 400-420 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (д) аминокислоты 421-462 SEQ ID NO 5, указанной в п 4, (h) аминокислоты 402-419 SEQ ID NO 5, указанной в п 4, (і) аминокислоты YMTLNPRAPTDDDKNIY, (|) аминокислоты 132-171 SEQ ID NO 24, указанной в п 4, (к) аминокислоты 140-182 SEQ ID NO 25, указанной в п 4, (I) аминокислоты 162-220 SEQ ID NO 26, указанной в п 4, или (ш) аминокислоты 183-228 SEQ ID NO 27, указанной в п 4 29 Клетка по п 25, где указанные терапевтические клетки выбраны из группы, содержащей (a) Т-лимфоциты, (b) цитотоксические Т-лимфоциты, (c) натуральные киллеры, (d) нейтрофилы, (е) гранулоциты, (f) макрофаги, (д) тучные клетки, (h) клетки HeLa, и (і) эмбриональные стволовые клетки (ES) 30 Клетка по п 25, где указанная внеклеточная часть включает связывающую оболочку ВИЧ часть CD4 или ее функциональное производное, связывающее оболочку ВИЧ 31 Клетка по п 25, где указанный цитотоксический Т-лимфоцит является CD8+ цитотоксическим Т-лимфоцитом 32 Клетка по п 25, где указанная внеклеточная часть представляет собой молекулу иммуноглобулина или ее антиген-связывающий фрагмент 33 ДНК, кодирующая химерный рецептор, который содержит (a) аминокислоты 421-532 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (b) аминокислоты 423-455, 438-455, 461-494 или 494-528 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (c) аминокислоты 400-420 SEQ ID NO 6, указанной в п 4, (d) аминокислоты 421-575 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (e) аминокислоты 423-455, 438-455, 461-494 или 494-528 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (f) аминокислоты 400-420 SEQ ID NO 4, указанной в п 4, (д) аминокислоты 421-462 SEQ ID NO 5, указанной в п 4, (h) аминокислоты 402-419 SEQ ID NO 5, указанной в п 4, (і) аминокислоты YMTLNPRAPTDDDKNIY, (|) аминокислоты 132-171 SEQ ID NO 24, указанной в п 4, (к) аминокислоты 140-182 SEQ ID NO 25, указанной в п 4, (I) аминокислоты 162-220 SEQ ID NO 26, указанной в п 4, или (ш) аминокислоты 183-228 SEQ ID NO 27, указанной в п 4 34 Вектор, содержащий ДНК химерного рецептора, охарактеризованную в п 33 35 Способ лечения инфекции вируса иммунодефицита, включающий введение млекопитающему клетки-хозяина, охарактеризованной вп 17 36 Способ лечения инфекции вируса иммунодефицита, включающий введение млекопитающему клетки-хозяина, охарактеризованной в п 25 Настоящее изобретение относится к функциональным химерам, сконструированным на основе Т-клеточного рецептора, Fc-рецептора или Вклеточного рецептора и обладающим способностью к переадресации функции иммунной системы В частности, настоящее изобретение относится к регуляции лимфоцитов, макрофагов, природных клеток-киллеров, или гранулоцитов путем экспрессии в этих клетках химер, стимулирующих клеточный ответ на мишени, распознаваемые химерами Настоящее изобретение также относится к функциональным химерам на основе Т-клеточного, В-клеточного, или Fc-рецептора, обладающим способностью стимулировать терапевтические клетки на специфическое распознавание и разрушения либо клеток, инфицированных каким-либо конкретным инфицирующим агентом, либо самого инфицирующего агента, либо опухолевой клетки, либо аутореактивной клетки В частности, настоящее изобретение относится к продуцированию химер на основе Т-клеточного рецептора или Fc-рецептора, способных направлять цитотоксичные Т-лимфоциты на специфическое распознавание и лизис клеток, экспрессирующих оболочечные белки ВИЧ Поэтому настоящее изобретение относится к лечению таких заболеваний, как СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита), которые вызываются вирусом ВИЧ 41870 Предшествующий уровень техники Распознавание Т-клетками антигена посредством Т-клеточного рецептора лежит в основе ряда иммунологических явлений Т-клетки управляют так называемым клеточно-опосредованным иммунитетом То есть, эти клетки иммунной системы участвуют в разрушении чужеродных тканей или инфицированных клеток Существует несколько типов Т-клеток "хелперы" и "супрессоры", то есть клетки, модулирующие иммунный ответ, а также цитотоксичные клетки (или "киллеры"), которые осуществляют прямое разрушение аномальных клеток Т-клетка, которая распознает специфический антиген, расположенный на поверхности другой клетки, становится активированной, после чего она может размножаться, и если она является цитотоксичной клеткой, то она может уничтожать связанную клетку Аутоиммунные заболевания обусловлены продуцированием либо антител, которые реагируют с тканями хозяина, либо иммунных эффекторных Т-клеток, которые являются аутореактивными В некоторых случаях, аутоантитела могут возникать при нормальном Т- и В-клеточном ответе, активированным чужеродными веществами или организмами, которые содержат антигены, перекрестно реагирующие с аналогичными соединениями в тканях организма Примерами клинически релевантных аутоантител являются рецепторы ацетилхолина при миастении (myasthema gravis), и антитела против ДНК, антитела против эритроцитов, и антитела против тромбоцитов при системной красной волчанке ВИЧ и иммунопатогенез В 1984 г было показано, что ВИЧ является этиологическим фактором СПИДа Однако со времени выявления этого заболевания, критерии, которые должны быть включены в его диагностику, неоднократно пересматривались Но несмотря на изменения диагностических параметров, общим классифицирующим фактором СПИДа является инфицирование вирусом ВИЧ с последующим развитием персистентных симптомов, свидетельствующих о генерализации патологического процесса, и СПИД-сопровождающих заболеваний, таких, как вторичные инфекции, новообразования, и нейрологические расстройства См , например, Harrison's Prmoiples of internal Medicine, 12-е изд , McGraw Hill (1991) ВИЧ представляет собой ретровирус человека, относящийся к группе лентивирусов Известны четыре ретровируса человека, которые принадлежат к двум основным группам Тлимфотропные вирусы человека, HTLV-1 и HTLV2, и вирусы иммунодефицита человека, ВИЧ-1 и ВИЧ-2 Из них первые два являются трансформирующими вирусами, а два вторых являются цитопатичными вирусами При этом, во всем мире ВИЧ-1 был идентифицирован как основной возбудитель СПИДа Гомология между последовательностями ВИЧ-1 и ВИЧ-2 составляет 40%, причем, ВИЧ-2 обнаруживает более близкое сходство с некоторыми членами группы вирусов иммунодефицита обезьян (SIV) См , например, Curran J и др , Science 329 1357-1359 1985, Wilss R и др, Nature, 324 572575(1986) ВИЧ имеет гены, которые обычно присутствуют в ретровирусах env, gag и рої, также шесть дополнительных генов, участвующих в репликации и других биологических функциях вируса Как указывалось ранее, общим характерным признаком СПИДа является глубокая иммунодепрессия, преимущественно, клеточного иммунитета Эта иммуносуппрессия является причиной возникновения заболеваний, вызываемых условнопатогенными факторами, например, некоторых инфекций и опухолей Было показано, что главной причиной иммунодефицита, вызывающего СПИД, является качественный и количественный дефицит субпопуляции Т-лимфоцитов (популяции Т4) Фенотипически, эта субпопуляция клеток определяется присутствием поверхностной молекулы CD4, которая, как было продемонстрировано, является клеточным рецептором для ВИЧ См Dalgleish и др , Nature, 21312-763 (1985) Хотя Т4-клетка является основным типом клеток, инфицируемых ВИЧ, однако практически любая клетка человека, экспрессирующая молекулу CD4 на своей поверхности, может быть связана и инфицирована вирусом ВИЧ Но по традиции, роль хелперов/индукторов обычно отводят Т-клеткам с CD4+, указывая тем самым на присущую им способность сообщать активирующий сигнал В-клеткам, или индуцировать Т-лимфоциты, несущие реципроксный маркер CD3, для того, чтобы в конечном счете превратиться в цитотоксичные/суппрессорные клетки См Reinhezz и Schlossman, Cell, 19 821-827 (1980), Goldstein и др, Immmol Rev, 68 5-42 (1982) ВИЧ специфически и с высокой степенью аффинности связывается посредством определенного участка аминокислотной последовательности вирусной оболочки (др120) с частью области СО4-молекулы, расположенной у ее N-конца После связывания этот вирус внедряется в мембрану клетки-мишени и интернализуется После интернализации вируса, с помощью обратной транскрипгазы происходит транскрипция его геномной РНК в ДНК, которая интегрируется в клеточную ДНК, где она присутствует в течение жизни клетки в качестве "провируса" Этот провирус может оставаться латентным или активироваться с транскрипцией мРНК и геномной РНК, которая приводит к синтезу (сборке) белка, образованию нового вириона, и активной его репликацией с отпочкованием от клеточной поверхности Хотя точный механизм, благодаря которому этот вирус вызывает гибель клетки, пока еще не установлен, однако, по всей вероятности, гибель клетки происходит в результате массивного бадинга (отпочкования) этого вируса от клеточной поверхности, который приводит к разрушению плазматической мембраны и осмотическому разбалансированию Во время инфицирования, хозяйский организм продуцирует антитела против вирусных белков, включая основные оболочечные гликопротеи 41870 ны gp120 и gp41 Однако, несмотря на этот гуморальный иммунитет, болезнь прогрессирует с развитием летальной иммуносуппрессии, характеризующейся множественными условно-патогенными инфекциями, паразитемией, деменцией и смертельным исходом Недостаточность продуцирования хозяйским организмомантител против вируса для прекращения прогрессирования болезни является одним из самых роковых и грозных аспектов этой инфекции, поскольку попытки вакцинации, предпринятые на основе стандартных методик, не предвещают каких-либо значительных результатов В эффективности гуморального ответа на вирусы иммунодефицита могут играть роль два фактора Первый заключается в том, что подобно другим РНК-содержащим вирусам (в частности, ретровирусам), вирусы иммунодефицита обнаруживают высокую степень мутации в ответ на иммунный контроль хозяина А второй фактор заключается в том, что сами оболочечные гликопротеины являются сильно гликозилированными молекулами, представляющими очень мало эпитопов, пригодных для высокоаффинного связывания с антителом Таким образом, оболочка этого вируса представляет собой неудобную антигенную мишень и практически не позволяет хозяину ограничить вирусную инфекцию путем продуцирования специфических антител Клетки, инфицированные вирусом ВИЧ, экспрессируют на своей поверхности гликопротеин др120 Этот гликопротеин опосредует связывание клеток, имеющих CD4+, с помощью реакции, аналогичной реакции, при которой вирусы внедряются в неинфицированные клетки, образуя в результате многоядерные гигантские клетки с непродолжительным сроком жизни Образование синцитий зависит от прямого взаимодействия оболочечного гликопротеина др120 с белком CD4 (См Dalgleisch и др , см выше, Klatzman D и др , Nature, 312 763 (1984), Me Dougal T S и др , Nature, 231 382 (1986), Sodzoski T и др , Nature, 322 470 (1986), Lifeon T D и др , Nature, 323 725 (1986), Sodzoski T и др , Nature, 321 412(1986)) Свидетельством того, что связывание CD4 с др120 обусловлено вирусной инфекцией клеток, несущих СО4-антиген, является обнаружение того факта, что между ор120 и CD4 образуется комплекс (См McDougal и др ) Другие исследователи показали, что клеточные линии, неподверженные инфицированию ВИЧ-вирусом, превращались в инфицируемые клеточные линии после трансфекции и экспрессии человеческого гена кДНК CD4 (См Maddon и др , Cell, 46 333-348(1986)) Группой ученых были предложены и успешно продемонстрированы in vitro терапевтические программы, основанные на использовании растворимого CD4 в качестве пассивного агента, препятствующего вирусной адсорбции и синцитийопосредованной клеточной трансмиссии (Deen и др , Nature, 3321 82-84 (1988), Fister и др , Nature, 331 76-78 (1988), Hussey и др , Nature, 331 78-81 (1988), Smite и др , Science, 238 1704-1707 (1987), Traunecker и др , Nature, 331 84-86 (1988), а затем были получены СО4-иммуноглобулиновые гибридные белки с более длительным временем полужизни и невысокой биологической активностью (Capon и др, Nature, 337 525-531 (1989), Traunecker и др , Nature, 339, 68-70 (1989), Burn и др , Nature, 344 667-670 (1990), Zettlmeissl и др , DNA Cell Biol 9 347-353(1990) Хотя конъюгаты СО4-иммунотоксина или гибридные белки обладают достаточно сильной цитотоксичностью для инфицированных клеток m vitro (Chaudhary и др , Nature 335 369-372 (1988), Till и др , Science, 242 1166-1168 (1988)), однако латентность синдрома и иммунодефицита указывает на незначительную вероятность того, что лишь одно терапевтическое введение будет эффективным для борьбы со столь тяжелой вирусной нагрузкой, к тому же, антигенность чужеродных гибридных белков, очевидно, будет ограничивать возможности их применения для лечения, требующего многократного приема определенных доз Испытания, проведенные с обезьянами, пораженными SIV, показали, что если животным, не обнаруживающим заметной СО4-цитопении, вводить растворимый CD4, то в результате этого наблюдается снижение SIV-титра и улучшение in vitro - показателей потенциала костного мозга (Watanab и др , Nature, 337 267-270 (1989)) Однако после прекращения обработки наблюдалось быстрое восстановление вируса, что позволяет предположить, что для предотвращения прогрессирующего истощения иммунной системы, описанную выше обработку, возможно, понадобится проводить в течение всей жизни Т-клеточные и Fc-рецепторы Для экспрессии клеточной поверхностью большинства из многочисленных форм Т-клеточных рецепторов антигена (TCR) требуется совместная экспрессия, по крайней мере, 6 различных полипептидных цепей (Weiss и др, J Ехр Med , 160 1284-1299 (1984), Orloffhashi и др, Nature, 316 606-609 (1985), Berkhout и др , J Biol Chem , 263 8528-8536 (1988), Sussman и др, Cell, 52 85-95 (1988)), а именно а/р-цепи связывания с антигеном, три полипептида СОЗ-комплекса и '% Если любая из этих цепей отсутствует, то стабильной экспрессии остальных членов комплекса не происходит % является ограничивающим полипептидом для поверхностной экспрессии полного комплекса (Sussman и др, Cell, 52 85-95 (1988)), и очевидно, он опосредует, по крайней мере, часть программ клеточной активации, стимулированной путем распознавания лиганда рецептором ((Weissman и др , ЕМВО Т 8 3651-3656 (1989), Frank и др , Science, 249-174-177 (1990)) % (дзэта), который представляет собой интегральный мембранный 32 кДа-гомодимер типа 1, имеет внеклеточный домен из 9 остатков, который не содержит сайтов для N-концевого присоединения гликана, и внутриклеточный домен из 112 мышиных остатков или 113 человеческих остатков (Weissman и др , Science, 238 1018-1020 (1988а), Weissman и др, Proc Natl Acad Sci USA, 85-9709-9713 (1988b)) Изоформа 4 называемая г\ (эта) (Bamyash > и др , J Biol Chem , 263 9874-9878 (1988), Oiloff и др, J Biol Chem, 264 14812-14814 (1989)), кото 41870 рая образуется в результате альтернативного пути мРНК-сплайсинга (Tin и др , Proc Natl Acad Sci USA, 87 3319-3233 (1990), присутствует в сниженных количествах в клетках, экспрессирующих рецептор антигена Гетеродимеры ^ - Л. очевидно являются медиаторами образования инозитолфосфата, а также запрограммированной рецегтгор-инициируемой гибели клеток, называемой апоптозом (Мегсер и др, Science, 242 571-574 (1988), Мегсер и др, Science, 246 1162-1165) (1989)) Подобно 4 и Л. ассоциированная с Fc-peцептором у-цепь экспрессируется в комплексах клеточной поверхности вместе с дополнительными полипептидами, некоторые из которых опосредуют распознавание лиганда, а функции других являются неопределенными Гамма-цепь имеет гомодимерную структуру и общую организацию, аналогичную той, которую имеет 4. и является компонентом высокоафинного рецептора IgE тучных клеток/базофилов, т е FcCR1-рецептора, состоящего, по крайней мере, из трех различных полипептидных цепей (Blank и др , Nature, 337 187-189 (1989), Ra и др , Nature, 241 752-754 (1989)), и одного из низкоаффинных рецепторов для 1gG, который в мышах представлен Fc yR11 (Ra и др , J Biol Chem J Biol Chem , 264 15323-15327 (1989)), а в человеке CD16TH, образуемого путем экспрессии подтипа CD16 макрофагами и природными киллерами (трансмембранного CD16) (Lamer и др, Nature, 342 803-805 (1989), Anderson и др , Proc Natl Acad Sci USA, 87 2274-2278 (1990), и полипептид с неопределенной функцией (Anderson и др , Proc Natl Acad Sci USA, 87 2274-2278(1990)) Недавно было установлено, что у экспрессируется мышиной линией Т-клеток, CTL, в которых образуются гомодимеры, а также у -'%-и у- г\гетеродимеры (Orlaff и др, Nature, 347 189-191 (1990)) Fc-рецепторы опосредуют фагоцитоз иммунных комплексов, трансцитоз и антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC) (Ravetch и Kmet, Annu Rev Immunol , 9 457-492 (1991), Unkeless и др , Annu Rev Immunol , 6 251-281 (1988), a Mellman Curr Opm Immunol , 1 16-25(1988)) Недавно было показано, что один из низкоаффинных типов мышиного Fc-рецептора (FcRy 111В1) опосредует интернализацию lg-покрытых мишеней в окаймленные ямки клатрина, а другой низкоаффинный рецептор (FcR у 111 А) опосредует ADCC посредством своего связывания с одним или несколькими членами небольшого семейства "триггерных молекул" (Miettmeu и др, Cell, 58 317-327 (1989), и Hunziker и Mellman J Cell Biol , 109 3291-3302(1989)) Эти триггерные молекулы ( у-цепь Т-клеточного рецептора (TCR), ^-цепь TCR, и т]-цепь Fcрецептора) взаимодействуют с лиганд-распознающими доменами различных рецепторов иммунной системы, и могут автономно инициировать программы клеточных эффекторов, включая цитолиз, следующий после агрегации (Samelson и др , Cell, 43 223-231 (1985), Weisman и др, Science, 239 1018-1020 (1988), Tin и др Proc Natl Acad Sci USA, 87 3319-3323 (1990), Blank и др , Nature, 337 187-189 (1989), Lamer и др , Nature, 342 803805 (1989), Kuzosaki и Ravetch, Nature, 342 805807 (1989), Hibbs и др , Science, 246 1608-1611 (1989), Anderson и др , Proc Natl Acad Sci USA, 87 2274-2278 (1990), и Irving и Weiss, Cell, 64 891901 (1991)) Однако, если провести параллели между семействами мышиных и человеческих низкоаффинных Fc-рецепторов, то можно заметить, что человеческие изотипы FcP у 11А и С не имеют мышиных аналогов Отчасти, это можно объяснить тем, что их функции еще не установлены Поскольку использование in vivo гуморальных агентов на основе CD4 может быть ограниченным, то авторами настоящей заявки были начаты исследования возможностей повышения клеточного иммунитета к ВИЧ В результате этих исследований, они получили химерные белки, в которых внеклеточный домен CD4 соединен с сигнал-передающими элементами трансмембранных и/или внутриклеточных доменов Т-клеточного рецептора, Fc-рецептора 1дС, или А-клеточного рецептора Цитотоксичные Т-клетки, экспрессирующие химеры, которые содержат внеклеточный домен CD4, обнаруживают значительную активность в ГКГ-независимом разрушении клеточных мишеней, экспрессирующих белки ВИЧ-оболочки Особенно важным и новым элементом этого способа является идентификация цепей одного Тклеточного рецептора или Fc-рецептора и В-клеточного рецептора, агрегации которых достаточно для инициации клеточного ответа Особенно ценным применением этого способа является использование химер настоящего изобретения, содержащих CD4 и £, г\ или у и направляющих цитолитические Т-лимфоциты на распознавание и разрушение клеток, экспрессирующих др120 ВИЧ Краткое описание изобретения Хотя нативные Т-клеточные, В-клеточные и Fc-рецепторы являются или могут быть сложными многомерными структурами, которые сами по себе не поддаются стандартным манипуляциям, однако настоящее изобретение иллюстрирует возможность создания химер, содержащих внутриклеточный домен любой из ряда различных молекул, обладающих способностью распознавать мишени В частности, конструирование химер, содержащих внутриклеточную область дзета-эта, или гамма-цепей Т-клеточного/Рс-рецептора, присоединенную к внеклеточной области соответствующим образом сконструированной молекулы антитела, дает возможность клеткам иммунной системы, ответственным за распознавание мишеней, специфически переориентироваться на антиген, распознаваемый внеклеточной частью антитела Таким образом, благодаря части антитела, способной к распознаванию определенной детерминанты на поверхности патогена, клетки иммунной системы, "вооруженные" указанной химерой, будут реагировать на присутствие патогена осуществлением эффекторной программы, соответствующей их линии дифференцировки, например, хелперные Т-лимфоциты будут реагировать с помощью своей цитотоксической активности про 41870 тив мишени, а В-лимфоциты будут аісгивироваться для синтеза антител Макрофаги и гранулоциты будут осуществлять свои эффекторные программы, включая высвобождение цитоксинов, фагоцитоз и генерирование реактивного кислорода Аналогичным образом, благодаря части антитела, способной к распознаванию опухолевых клеток, должен значительно повыситься ответ иммунной системы на опухолевые клетки Кроме того, благодаря антителу, способному распознавать иммунные клетки, обладающие нежелательной реактивностью с собственными детерминантами (то есть, аутореактивные клетки), эти клетки могут быть селективно разрушены Хотя эти примеры приведены в отношении использования химерных антител в качестве традиционного иллюстрирующего материала, однако настоящее изобретение не ограничивается лишь химерными антителами, и его объем может включать в себя использование внеклеточных доменов, не принадлежащих антителам, и благодаря этому, изобретение может обладать важными преимуществами Например, если внеклеточной частью является рецептор для вируса, бактерии или паразита, то клетки, "вооруженные"такими химерами, будут представлять собой специфические клеткимишени, экспрессирующие вирусные, бактериальные или паразитические детерминанты Преимущество такого метода по сравнению с использованием антител заключается втом, что нативный рецептор для патогена может обладать исключительно высокой селективностью или аффинностью по отношению к данному патогену, что позволит продуцировать иммунный ответ с более высокой степенью точности Аналогично, для удаления клеток иммунной системы, которые обнаруживают нежелательную способность реагировать с собственными антигенами, может быть достаточным присоединить антиген (либо в качестве интактного белка, в случае, если проводится терапия по элиминации В-клеток, либо ГКГ-комплекса, в случае, если проводится терапия по элиминации Т-клеток) к внутриклеточным дзета-, эта-, или гамма-цепям, что будет способствовать специфическому конъюгированию аутоиммунных клеток В качестве другого применения указанных химер может быть осуществлен контроль in vivo популяций клеток после генетического конструирования других форм Например, было предложено использовать лимфоциты, способствующие инфильтрации опухолей, или натуральные клеткикиллеры для осуществления своего цитотоксического действия в отношении опухолевых сайтов Настоящее изобретение относится к традиционным способам регулирования числа и активности указанных лимфоцитов и клеток без их удаления из организма пациента для in vitro-амплификации Так например, поскольку внутриклеточные домены химерных рецепторов опосредуют пролиферативный ответ клеток, то координация внеклеточных доменов посредством различных агрегирующих факторов (например, антитело, специфичное для внеклеточного домена) будет приводить к пролиферации клеток, несущих химеры Хотя конкретное осуществление настоящего изобретения предусматривает использование химер, содержащих дзета-, эта- или гамма-цепи или их активные фрагменты (например, обсуждаемые ниже), однако для целей настоящего изобретения, раскрываемых ниже, могут быть использованы любые другие цепи рецепторов, имеющие аналогичные функции (например, в гранулоцитах или Влимфоцитах) Отличительными особенностями предпочтительных молекул-триггеров клеток иммунной системы являются их способность к автономной экспресии, то есть в виде одной цепи, их способность образовывать гибриды с внеклеточным доменом (те химеры), присутствующие на поверхности терапевтических клеток, и их способность инициировать эффекторные программы клеток после вторичной агрегации, направленной на встречу с лигандом-мишенью В настоящее время наиболее широко используемый метод доставки химер в клетки иммунной системы осуществляется с помощью некоторых форм генной терапии Однако реконструирование клеток иммунной системы с использованием химерных рецепторов путем смешивания соответствующим образом солюбилизированного очищенного химерного белка может также привести к образованию популяции сконструированных клеток, способной реагировать на распознаваемые мишени благодаря внеклеточному домену химер Аналогичные методы были использованы, например, для введения интактного ВИЧ-рецептора, CD4, в эритроциты для терапевтических целей В этом случае популяция сконструированных клеток будет неспособной к самоподдержанию Настоящее изобретение относится к химерам, полученным на основе функционально упрощенных Т-клеточного, В-клеточного и Fc-рецепторов и способным к переориентации функции иммунной системы Более конкретно, настоящее изобретение относится к регулированию лимфоцитов, макрофагов, природных клеток-киллеров или гранулоцитов путем экспрессии в этих клетках указанных химер, способных посредством своего распознавания мишеней стимулировать у клеток ответную реакцию на эти мишени Настоящее изобретение также относится к способу ориентации клеточного ответа на инфекционный агент, опухолевую или раковую клетку или аутоиммуннореактивную клетку Указанный способ адресации клеточного ответа у млекопитающего заключается в том, что этому млекопитающему вводят эффективное количество терапевтических клеток, обладающих способностью распознавать и разрушать вышеуказанный инфицирующий агент, опухолевую или раковую клетку, или аутореактивную клетку В другом варианте осуществления настоящего изобретения, способ аориентации клеточного ответа на инфицирующий агент заключается в том, что пациенту вводят терапевтические клетки, обладающие способностью к распознаванию и разрушению указанного агента, причем, этим агентом является специфический вирус, бактерия, простейший организм или грибок В частности, этот способ направлен против таких агентов, как ВИЧ и Pneumocystis саппм 41870 Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу ориентации клеточного ответа на ВИЧ-инфицированную клетку Этот способ заключается в том, что пациенту вводят эффективное количество цитотоксичных Т-лимфоцитов, обладающих способностью к специфическому распознаванию и лизису клеток, инфицированных ВИЧ Таким образом, в одном варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу "нацеливания" клеточного ответа на ВИЧ-инфицированные клетки, заключающемуся в том, что пациенту вводят эффективное количество цитотоксичных Т-лимфоцитов, обладающих способностью к специфическому распознаванию и лизису ВИЧ-инфицированных клеток В другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к химерным рецепторным белкам, способствующим специфическому распознаванию и лизису ВИЧ-инфицированных клеток цитотоксичными Т-лимфоцитами В еще одном своем варианте, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным вектором, который содержит химерные рецепторы В следующем своем варианте, настоящее изобретение относится к антителу, направленному против химерных рецепторов настоящего изобретения Для получения цитотоксичных Т-лимфоцитов, которые обладали бы способностью связываться и разрушать ВИЧ-инфицированные клетки, авторами настоящего изобретения были сконструированы рецепторные химеры Эти химерные рецепторы являются функционально активными и обладают исключительно высокой способностью к специфическому связыванию и лизису клеток, экспрессирующих др120 Следовательно, целью настоящего изобретения является осуществление способа лечения пациентов, инфицированных вирусом ВИЧ Таким образом, настоящее изобретение является еще одним важным шагом на пути к полному и эффективному излечению от СПИДа Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения, которые, однако, не ограничивают его объема, будут более понятны из последующего детального описания изобретения В этом описании приводятся конкретные ссылки на различные методики, известные специалистам и описанные в литературе по молекулярной биологии и иммунологии Эти публикации и другие материалы вводятся в настоящее описание во всей своей полноте и целостности посредством ссылки Ниже приводятся работы, в которых описаны стандартные методики осуществления техники рекомбинантных ДНК, а именно J D Watson и др , Molecular Biology of the Gene, vol, I и II, Benjamin Cummi Publishing Company, Inc publisher, Menlo Park CA (1987), Darnell J E и др , Molecular Cell Biology, Scientific American Book Inc, Publisher, New York, N Y (1986), Lewm В М , Genes II, John Wiley & Sons, publishers, Нью-Йорк, N Y , 1985, Old R W и др , Principles of Gene Manipulation An Introductm to Genetic Engineering, 2-ое изд , Universitu of California Press, pubhster, Berkele CA (1981), Mamatis, T и др , Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2-ое изд , Cold Spring Harobor Laboratory, publisher, Cord Spring Harobor, NY (1989), и Current Pratocols in Molecular Biology, Ausubel и др , Wiley Press, Нью-Йорк, N Y (1989) Определения Термин "клонирование" подразумевает использование in vitro-рекомбинантной техники для введения конкретного гена или другой ДНК-последовательности в векторную молекулу Для успешного клонирования нужного гена, необходимо использовать способы генерирования ДНК-фрагментов, присоединения этих фрагментов к векторным молекулам, введения сконструированной ДНК-молекулы в хозяйскую клетку, в которой она может реплицироваться, и отбора клона, имеющего нужный ген, из хозяйских клеток-реципиентов Термин "кДНК" означает комплементарную или копийную ДНК, продуцированную из РНК-матрицы с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы) Так, например, "кДНК-клон" означает двухцепочечную ДНК-последовательность, комплементарную нужной РНК-молекуле и вносимую в вектор клонирования Термин "кДНК-библиотека" означает коллекцию рекомбинатных ДНК-молекул, содержащих кДНК-вставки, которые представляют собой ДНКкопии мРНК, экспрессированные клеткой во время получения кДНК-библиотеки Такая кДНК-библиотека может быть получена известными методами, описанными, например, в Mamatis и др , Molecular Cloning A Laboratory Manual, см выше Обычно сначала РНК выделяют из клетки организма, из генома которого необходимо клонировать конкретный ген Для целей настоящего изобретения предпочтительно использовать клеточные линии лимфоцитов млекопитающего и, в частности, человека Согласно настоящему изобретению особенно предпочтительным вектором является штамм WR вируса коровьей оспы Термин "вектор" означает ДНК-молекулу, происходящую, например от плазмиды, бактериофага, или вируса млекопитающего или насекомого, в которую могут быть инсертированы или клонированы фрагменты ДНК Вектор может содержать один или несколько уникальных рестрикционных сайтов и может обладать способностью к автономной репликации в определенном организме-хозяине или организменосителе, таким, чтобы клонированная последовательность могла репродуцироваться Так, например, термин "вектор экспрессии ДНК" означает любой автономный элемент, способный регулировать синтез рекомбинантного пептида Примерами таких ДНК-экспрессирующих векторов являются бактериальные плазмиды, фаговые плазмиды, плазмиды млекопитающих и насекомых и вирусы Термин "в основном, чистый" относится к соединению, например, белку, полипептиду, или антителу, которые, в основном, не содержат компонентов, которые обычно в них присутствуют в 10 41870 естественных условиях Соединение считается, в основном, чистым, если нужное соединение составляет, по крайней мере, 60%, более предпочтительно 75% и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% от всего материала в образце Чистота соединения может быть измерена любым подходящим методом, например, с помощью колоночной хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле или ВЭЖХ-анализа Если речь идет о нуклеиновой кислоте, то термин "в основном, чистый" означает последовательность нуклеиновой кислоты, ее сегмент, или фрагмент, не содержащие генов, фланкирующих эти последовательности в их естественном состоянии (например, в этих последовательностях отсутствуют гены, которые фланкируют нуклеиновую кислоту в ее нативном геноме) Термин "функциональное производное" означает "фрагменты", "варианты", "аналоги", или "химические производные" молекулы Термин "фрагмент" молекулы, такой, как любая последовательность кДНК настоящего изобретения, относится к любой нуклеотидной субпопуляции молекулы Термин "вариант" молекулы относится к природной молекуле, в основном, аналогичной либо целой молекуле, либо ее фрагменту Термин "аналог" молекулы относится к молекуле, не встречающейся в природе и, в основном, аналогичной либо целой молекуле, либо ее фрагменту Если говорят, что указанная молекула, "в основном, аналогична" другой молекуле, то имеют ввиду, что последовательности обеих молекул, в основном, одинаковые При этом, в основном, одинаковые аминокислотные молекулы обладают аналогичными биологическими активностями Так, например, в контексте настоящего описания две молекулы могут рассматриваться как варианты, даже если одна из молекул содержит больше или меньше аминокислотных остатков, чем другая, или последовательность аминокислотных остатков одной молекулы отличается от последовательности другой, при условии, что эти две молекулы имеют аналогичные активности Если в контексте настоящего описания указывается, что данная молекула является "химическим производным" другой молекулы, то это означает, что эта молекула содержит дополнительные химические группы, которые, обычно, не являются частью данной молекулы Эти группы способствуют улучшению растворимости молекулы, ее абсорбции, времени биологической полужизни и т п Альтернативно, указанные группы могут способствовать снижению токсичности молекулы, устранению или ослаблению любого нежелательного побочного действия молекулы и т п Группы, способные к опосредованию указанных действий, раскрываются, например, в Remington's Pharmacetical Sciences, 16th , Make Publishing Co , Eastor, Penn (1980) Аналогично, термин "функциональное производное" химерного рецептора настоящего изобретения означает "фрагменты", "варианты" или "аналоги" гена, которые могут быть "в основном, аналогичными" в отношении нуклеотидной последовательности и которые кодируют молекулу, обладающую активностью, аналогичной, например, активности Т-клеточно-, В-клеточно- или Fc-рецепторной химеры Так, например, используемое в настоящем описании понятие "Т-клеточный, В-клеточный или Fc-рецепторный химерный белок" означает любое функциональное производное, фрагменты, варианты, аналоги, или химические производные, которые могут быть, в основном, аналогичными химерам "дикого типа", которые обладают аналогичной активностью (то есть, наиболее предпочтительно, чтобы их активность составляла 90%, более предпочтительно 70% и просто предпочтительно 40% или, по крайней мере, 10% от активности рецепторной химеры) Под активностью функционального производного химерного рецептора подразумевается специфическое связывание (с его внеклеточной частью) с агентом-мишенью или клеткой, с последующим разрушением указанного агента или клетки, причем указанная активность может быть проверена, например, с помощью любого из анализов, описанных ниже ДНК-последовательность, кодирующая Тклеточно-, В-клеточно- или Fc-рецепторную химеру настоящего изобретения, или их функциональные производные, может быть рекомбинирована с помощью векторной ДНК и с использованием стандартной техники, включая затупление концов для лигирования, переваривание рестриктирующими ферментами для получения нужных концов, заполнения липких концов, обработку щелочной фосфатазои во избежание нежелательного связывания и лигирования соответствующими лигазами Техника таких манипуляций раскрывается Маниатисом Т и др (см выше) и хорошо известна специалистам Нуклеиновокислотная молекула, такая, как ДНК, считается "способной к экспрессии" полипептида, если она содержит нуклеотидные последовательности, которые включают в себя области регулирования транскрипции и трансляции, причем, эти последовательности являются "правильно сшитыми" с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептид Правильной сшивкой считается такая сшивка, при которой регуляторные ДНК-последовательности и ДНК-последовательность, необходимая для экспрессии, соединены таким образом, чтобы была обеспечена экспрессия нужного гена Точные требования в отношении природы регуляторных областей, необходимых для экспресси гена, могут варьироваться от организма к организму, но, в основном, такими областями являются промоторная область (в прокариотах), которая содержит промотор (который стимулирует инициацию РНК-транскрипции), а также ДНК-последовательности, которые после транскрипции в РНК становятся сигналом инициации синтеза белка Такими областями являются 5'-некодирующие последовательности, участвующие в инициации транскрипции и трансляции, такие, как ТАТАблок, кэппинг-последовательность, СААТ-последовательность и т п По желанию, вышеуказанными способами может быть получена некодирующая область 3' для генной последовательности, кодирующей бе 11 41870 лок Эта область может быть сохранена из-за ее регуляторных последовательностей, таких, как область терминации транскрипции и область полиаденилирования Таким образом, сохраняя З'-область, естественно связанную с ДНК-последовательностью, кодирующей белок, можно обеспечить наличие сигналов терминации транскрипции Если в экспрессирующей хозяйской клетке сигналы терминации транскрипции не являются достаточно функциональными, то З'-область хозяйской клетки может быть заменена Если указывается, что две ДНК-последовательности (такие, как промоторная последовательность и последовательность, кодирующая Тклеточно-, В-клеточно- или Fc-рецептурную химеру) являются правильно сшитыми, то при этом подразумевается, что природа связи между этими двумя ДНК-последовательностями (1) не приводит к введению мутации со сдвигом рамки, (2) не препятствует способности промоторной последовательности регулировать инициацию транскрипции последовательности гена, кодирующего химерный рецептор, или (3) не препятствует способности последовательности гена, кодирующего химерный рецептор, транскрибироваться последовательностью промотора В целях настоящего изобретения может быть использована любая подходящая клеточная линия миеломы После слияния полученные гибридомные клетки селективно выдерживают в НАТсреде, после чего их клонируют при лимитирующем разведении, например, как описано Wands J R и др (Gastroenterology, 80 225-232 (1981)) Затем гибридомные клетки, полученные описанным селективным способом, анализируют для идентификации клонов, которые секретируют антитела, способные связываться с химерой Согласно настоящему изобретению, могут быть также использованы политональные или предпочтительно сайт-специфические политональные антитела Антитела против Т-клеточно-рецепторной, В-клеточно-рецепторной или Fc-рецепторной химеры могут быть использованы для контроля количества химерного рецептора (или теток, несущих химерный рецептор) у пациента Эти антитела являются весьма подходящими для использования в стандартном иммунодиагностическом анализе, известном специалистам, включая иммунометрические или "сэндвич"-анализы, такие, как прямой, обратный и одновременный "сэндвич"-анализы Эти антитела могут быть использованы в любых комбинациях, которые могут быть определены самим специалистом без излишнего экспериментирования, для осуществления иммуноанализов с приемлемой специфичностью, чувствительностью и точностью Общие принципы иммунологии описаны в следующих известных работах Roitt L , Essential Immunology, 6-ое изд , Blackwell Scientific Publications, Publisher, Оксфорд (1988), Kimball J W , Introduction to Immunology, 2-ое изд , Macmillan Publishing Co, Publisher, Нью-Йорк (1986), Poitt L и др, Immunology, Gowez Medical Publishing Ltd , Publisher, Лондон (1985), Campbell A, "Monoclonal Antibody Technology", в Burdon R , и др , изд , Laboratory Techmgues in Biochemistry and Molecular Biology, vol 13, Elsevier, Pubhster, Амстердам (1984), Klein J , Immunology The Science of SelfNonelf Discrimination, John Wiley & Sons, Publisher, Нью-Йорк (1982), и Kennett R , и др , изд , Monoclonal Antibodies, Hybndoma A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, Publisher, НьюЙорк (1980) Промоторная область считается правильно сцепленной с ДНК-последовательностью, если промотор способен инициировать транскрипцию ДНК-последовательности Таким образом, для экспрессии белка необходимо присутствие сигналов транскрипции и трансляции, распознаваемых соответствующим хозяином Настоящее изобретение также относится к экспрессии Т-клеточно-, В-клеточно- или Fc-рецепторному химерному белку или его функциональному производному в прокариотической или эукариотической клетке, причем экспрессия в эукариотической клетке (а в частности, в лимфоците человека) является предпочтительной Согласно настоящему изобретению, антитела могут быть получены любым из имеющихся для этой цели методов Например, клетки, экспрессирующие рецепторный химерный белок, или его функциональное производное, могут быть введены животному для продуцирования сыворотки, содержащей политональные антитела, обладающие способностью связываться с химерой Согласно настоящему изобретению, предпочтительными являются моноклональные антитела Такие моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомной технологии (Kohler и др , Nature, 256 495 (1975), Kohler и др , Eur J Immunol , 6 511 (1976), Kohler и др , Eur J Immunol, 6 292 (1976), Hammerlmg и др, в "Monochonal Antibodies and T-Cell Hebndomas, Elsevier, N Y , стр 563-684 (1981) В общих чертах, эта технология включает в себя иммунизацию животного Т-клеточно-, В-клеточно- или Fc-рецепторного химерного антигена Затем спленоциты этих животных экстрагируют и гибридизируют с соответствующей линией клеток миеломы Под термином "обнаружение" подразумевается определение присутствия или отсутствия данного вещества, или определение его количества Этот термин используется по отношению к материалам, композициям, и методам настоящего изобретения для их качественных или количественных оценок Получение других гибридов, секретирующих монотональные антитела с такой же специфичностью, как и антитела, описанные выше, может быть осуществлено с использованием техники антиидиотипического скрининга (Potocmjak и др, Science 215 1637 (1982)) Вкратце, антиидиотипическое антитело представляет собой антитело, которое узнает специфические детерминанты, присутствующие на антителе, продуцированном нужным т о н о м 12 41870 за, биотинавиддин-пероксидаза, пероксидаза хрена, щелочная фосфотазан-аспарагиназа, клюкозооксидаза, р-галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-\/І-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза Присутствие меченных антител может быть также обнаружено путем их мечения радиоактивными изотопами, которые могут быть затем идентифицированы с помощью гамма-счетчика или сцинтилляционного счетчика Согласно настоящему изобретению, предпочтительными изотопами являются 3 Н, 1 2 5 1, 32 Р, Это антиидиотипическое антитело может быть получено путем иммунизации животного того же штамма, что и животное, использованное в качестве источника моноклонального антитела, нужным моноклональным антителом Иммунизированное животное будет распознавать и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела посредством продуцирования антител против этих идиотипических детерминант (те антиидиотипических антител) Для репликации, гибридные клетки могут быть культивированы как in vitro, как и in vivo Высокий уровень продуцирования in vivo делает этот способ наиболее предпочтительным для целей настоящего изобретения Короче говоря, клетки, взятые от отдельных гибридных штаммов, инъецируют внутрибрюшинно пристан-премированным BALB/c-мышам для продуцирования асцитической жидкости, содержащей высокие концентрации нужных моноклональных антител Моноклональные антитела изотипов 1дМ или 1gG могут быть очищены от культуральных супернатантов с использованием колоночной хроматографии, хорошо известной специалистам Антитела настоящего изобретения являются особенно ПОДХОДЯЩИМИ для использования в иммуноанализах, где они могут быть использованы в жидкой фазе или связаны с твердофазным носителем Кроме того, в этих иммуноанализах, антитела могут быть обнаружимо помечены различными способами Существует много различных меток и способов мечения, хорошо известных специалистам Примерами различных типов меток, которые могут быть использованы в настоящем изобретении (при этом, указанные примеры не ограничивают объемы изобретения), могут служить ферменты, радиоизотопы, флуоресцентные соединения, хемилюминесцентные соединения, биолюминесцентные соединения и металлические хелаты Любому специалисту известны и другие подходящие метки для связывания антител, либо они могут быть найдены специалистом посредством традиционного экспериментирования Кроме того, связывание этих меток с антителами может быть осуществлено в соответствии со стандартной техникой, хорошо известной каждому специалисту Одним из таких методов, в котором антитела настоящего изобретения могут обнаружимо помечены, является связывание антитела с ферментом Этот фермент, который, в свою очередь, может быть подвергнут воздействию его субстрата, будет реагировать с субстратом таким образом, что в результате этой реакции будет продуцироваться химическая молекула или группа, которая может быть обнаружена, например, с помощью спектрофотометрии или флуорометрии Примерами таких ферментов, которые могут быть использованы для обнаружимого мечения антител, являются малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза, дельта-\/-стероид-изомераза, дрожжевая алкогольдегидрогеназа, альфа-глицерофосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомера 35 О 14~ 51-~г 36,-,, 57~„ 58~„ 59 С „ ,, 75 о „ S , С, Сг, СІ, Со, Со, Fe u Se Связывание меченных антител может быть также обнаружено, если эти антитела мечены с помощью флуоресцентного соединения Если флуоресцентно меченное антитело подвергнуть облучению светом соответствующей длины волны, то его присутствие может быть обнаружено благодаря флуоресценции красителя Среди наиболее часто используемых для флуоресцентного мечения соединений являются такие, как флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальдегид и флуорескамин Антитела настоящего изобретения могут быть также помечены флуоресцирующими металлами, такими, как 152 Еи, или другими металлами ряда лантанидов Эти металлы могут быть связаны с молекулой антитела с помощью групп, образующих хелатные комплексы с металлами, например, таких, как диэтилентераминопентауксусная кислота (DTPA) или этилендиаминотетрауксусная кислота (EDTA) Антитела настоящего изобретения могут быть также обнаружены путем их связывания с хемилюминесцентным соединением Присутствие такого маркированного с помощью хемилюминесцентного соединения антитела может быть затем обнаружено посредством определения наличия люминесценции, которая возникает во время химической реакции Примерами таких хемилюминесцентных соединений являются люминал, изолюминал, сложный эфир теро мати чес кого акридиния, соли акридиния, сложный эфир щавелевой кислоты и диоксетан Таким же образом, для мечения антител настоящего изобретения может быть использовано биолюминесцентное соединение Биолюминесцентные соединения представляют собой типы хемилюминесцентных соединений, обнаруживаемых в биологических системах, в которых каталитический белок способствует повышению эффективности хемилюминесцентной реакции Присутствие антител, меченных биолюминесцетным соединением, обнаруживается благодаря наличию люминесценции Для целей настоящего изобретения могут быть использованы такие биолюминесцентные соединения, каклюциферин, люцифераза-экворин Антитела и, в основном, очищенный антиген настоящего изобретения, являются идеальными материалами для изготовления набора Такой набор может содержать носитель, который подвергают компартментализации для по 13 41870 ны известные ингибиторы протеазы (обычно при 0,01-10 мкг/мл) Существует множество твердофазных иммуносорбентов, которые могут быть использованы в целях настоящего изобретения Хорошо известными иммуносорбентами являются стекло, полистирол, полипропилен, декстран, найлон и другие материалы, которые могут быть использованы в виде трубочек, шариков, а также для покрытия или изготовления планшетов для микротитрования и т п Иммобилизованные антитела могут быть либо ковалентно, либо физически связаны с твердофазным иммуносорбентом с помощью такой техники, как ковалентное связывание посредством амидной или сложноэфирной связи или с помощью абсорбции Любому специалисту хорошо известны и многие другие твердофазные иммуносорбенты, а также способы иммобилизации антител, либо они могут быть установлены самим специалистом путем рутинного экспериментирования Согласно настоящему изобретению, для in vivo, in vitro или in situ-диагноза, метки, такие, как радионуклеиды могут быть связаны с антителами либо непосредственно, либо посредством промежуточных функциональных групп Промежуточной группой, которая часто используется для связывания радиоизотопов (существующих в виде катионов металлов) с антителами, является диэтилентриаминопентауксусная кислота (DTPA) Типичными примерами металлических катионов, которые могут быть связаны вышеуказанным образом, являются 99mTc, 1 2 3 I , 111 IN, 1 3 1 I , 97 Ru, 67 Cu, 67Ga и 68Ga Антитела настоящего изобретения могут быть также мечеными (если они используются для диагноза) и нерадиоактивными изотопами Особенно предпочтительными элементами для этих целей являются 157 Gd, 55 Mn, 162Dy, 52Cr и ^Fe Антиген настоящего изобретения может быть выделен, в основном, в чистом виде с использованием антител, описанных выше Таким образом, в одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится, в основном, к очищенной Т-клеточно-рецепторной, В-клеточно-рецепторной или Fc-рецегтгорной химере, причем указанный антиген отличается тем, что он распознается посредством связывания с антителами настоящего изобретения В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу выделения или очистки химерного рецепторного антигена посредством образования комплекса указанного антигена с одним или несколькими антителами, направленными против рецепторной химеры В основном, чистые химерные антигены настоящего изобретения, полученные на основе Тклеточного рецептора, В-клеточного рецептора или Fc-рецептора, в свою очередь, могут быть использованы для обнаружения или количественного измерения антитела против химеры в образце, таким, как сыворотка или моча Таким образом, один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к способу обнаружения присутствия или измерения количества антитела к рецепторному химерному антигену в образце, заключающемуся в том, что лучения их тесного контаїсга с одним или несколькими емкостями, например, такими, как колбы, пробирки и т п , причем каждый из указанных емкостей содержит отдельные элементы используемого анализа Примерами типов анализов, которые могут быть проведены с использованием указанных наборов, могут служить многие анализы, а в частности, такие, как конкурентный и неконкурентный анализы Типичными примерами анализов, в которых могут быть использованы антитела настоящего изобретения, могут служить радиоиммуноанализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и иммунометрический или "сэндвич"-анализ Термин "иммунометрический анализ" или "сэндвич"-анализ означает и включает в себя одновременный "сэндвич"-, прямой "сэндвич"- и обратный "сэндвич"-иммуноанализы Эти термины хорошо понятны любому специалисту При этом следует отметить, что, согласно настоящему изобретению, могут быть использованы и другие варианты и формы анализов, которые уже известны или могут быть разработаны в будущем И эти формы и варианты также входят в объем настоящего изобретения В предпочтительном варианте осуществления указанных анализов, важным является тот факт, что в инкубационной среде присутствуют некоторые "ингибиторы" (обычно добавляемые вместе с меченным растворимым антителом) Эти ингибиторы добавляются для гарантии того, что неспецифические белки, протеаза или человеческие антитела к мышиным иммуноглобулинам, присутствующие в экспериментальном образце, не будут перекрестно связываться или разрушать антитела на твердофазном носителе, или антитела, радиоактивно меченные индикатором, в результате чего может продуцироваться ложноположительный или ложноотрицательный ответ Поэтому отбор "ингибиторов" может значительно повысить специфичность анализов, описанных в настоящей заявке Было установлено, что в качестве "ингибиторов" могут быть использованы нерелевантные (т е , неспецифические) антитела того же класса или подкласса (изотипа), что и антитела, используемые в анализе (например, 1gGi, 1gG2a, 1gM и т п ) Концентрация этих ингибиторов (или "блокаторов") (обычно 1-100 мкг/мкл) является важным параметром для поддержания нужной чувствительности анализа, поскольку необходимо ингибировать любое нежелательное взаимодействие, происходящее между взаимно и перекрестно реагирующими белками в человеческой сыворотке Кроме того, буферную систему, содержащую ингибиторы, необходимо оптимизировать Предпочтительными являются буферы на основе слабых органических кислот, например, такие, как имидазол, HEPES1, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TPIS и T п с рН, имеющим физиологическое значение Несколько менее предпочтительными являются неорганические буферы, такие, как фосфат, борат или карбонат И наконец, к буферу, содержащему "ингибиторы", должны быть добавле 14 41870 образец, содержащий антитело к химерному антигену, подвергают взаимодействию с обнаружимо меченной рецегтгорной химерой, с последующим обнаружением указанной метки Следует отметить, что при этом могут быть использованы иммунореактивные фракции и иммунореактивные аналоги указанной химеры Под термином "иммунореактивная фракция" подразумевается любая часть химерного антигена, которая продуцирует эквивалентный иммунный ответ на антитело, направленное против рецепторной химеры Под термином "иммунореактивный аналог" подразумевается белок, который отличается от вышеуказанного рецепторного химерного белка одной или несколькими аминокислотами, но который при этом обнаруживает эквивалентный иммуноответ к антителу настоящего изобретения инфицированной патогеном, опухолевой или раковой клетки или аутореактивной клетки) или к разрушению инфицирующего агента (например, вируса) Термин "вирус иммунодефицита" относится к ретровирусу, который в своей дикой форме обладает способностью инфицировать клетки Т4 хозяина-примата, и имеет вирусный морфогенез и морфологию, характерную для подсемейства лентивирусов Этот термин включает в себя все варианты (но не ограничивается ими) ВИЧ и SIV, включая ВИЧ-1, в ВИЧ-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand и SIVcpz Термин "ГКГ-независимый" означает, что для клеточного цитолитического ответа не требуется присутствия антигена ГКГ класса II на поверхности клетки-мишени Термин "функциональное цитолитическое сигнал-передающее производное" означает функциональное производное (определенное выше), которое способно продуцировать, по крайней мере, 10%, предпочтительно 40%, более предпочтительно 70%, или наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% биологической активности молекулы дикого типа В контексте настоящего описания "функциональное цитолитическое сигнал-передающее производное" может действовать путем непосредственной подачи сигнала терапевтической клетке на разрушение связанного с рецептором агента или клетки (например, в случае внутриклеточной области химерного рецептора), либо оно может действовать опосредованно путем стимуляции олигомеризации с цитолитическими сигнал-трансдуцирующими белками терапевтической клетки (например, в случае трансмембранного домена) Указанное производное может быть затем исследовано на эффективность, например, с помощью in vitro анализа, описанного в настоящей заявке Термин "функциональное производное, связывающееся с оболочкой ВИЧ" относится к функциональному производному (определенному выше), которое обладает способностью к связыванию с оболочечным белком ВИЧ Функциональные производные могут быть идентифицированы, например, с помощью m vitro-анализа, описанного в настоящей заявке Терапевтическое введение Трансформированные клетки настоящего изобретения могут быть использованы для лечения ряда заболеваний Современные методы введения указанных трансформированных клеток применяются при адаптивной иммунотерапии или терапии путем переноса клеток Эти методы позволяют возвращать в кровоток трансформированные клетки иммунной системы Термин "специфически распознает и связывается" относится к антителу, которое распознает и связывается с полипептидом химерного рецептора, но которое, в основном, не распознает и не связывается с другими молекулами в образце, например, в биологическом образце, содержащем полипептид рецептора Термин "аутореактивная клетка" означает клетки, продуцирующие антитела, которые реагируют с тканью хозяина, или эффекторные Т-клетки, которые являются аутореактивными, причем такие клетки включают в себя антитела против ацетилхолиновых рецепторов (вызывающие, например, миастению gravis) или анти-ДНК, антиэритроцитные и антитромбоцитные аутоантитела (вызывающие, например, красную волчанку) Термин "терапевтическая клетка" означает клетку, трансформированную химерой настоящего изобретения таким образом, что она приобретает способность к распознаванию и разрушению специфического инфицирующего агента, клетки, инфицированной специфическим агентом, опухолевой или раковой клетки, или аутореактивной клетки, причем предпочтительными терапевтическими клетками являются клетки гем ато поэтической системы Термин "внеклеточный" относится, по крайней мере, к части молекулы, которая расположена на клеточной поверхности Термин "внутриклеточный" относится, по крайней мере, к части молекулы, которая расположена в цитоплазме терапевтической клетки Термин "трансмембранный" относится, по крайней мере, к части молекулы, которая проходит через плазматическую мембрану В контексте настоящего описания, "внеклеточная часть", "внутриклеточная часть" и "трансмембранная часть" могут включать в себя фланкирующие аминокислотные последовательности, которые могут простираться до клеточных перегородок и примыкать к ним Термин "олигомеризация" относится к комплексам с другими белками с образованием димеров, тримеров, тетрамеров, или других олигомеров более высокого порядка Такими олигомерами могут быть гомоолигомеры или гетероолигомеры Термин "олигомеризирующая часть" означает часть молекулы, которая участвует в образовании комплекса (т е , олигомера) Термин "цитолитический" определяет способность к разрушению клетки (например, клетки, 15 41870 Подробное описание изобретения Ниже приводится описание рисунков Краткое описание рисунков Рис 1 Характеризация СО4-химер На рис 1А представлена аминокислотная последовательность возле места сшивки CD4 (остатки 1-369) и различными цепями рецептора Подчеркнутые последовательности означают положения аминокислот, кодируемых в ВА т Н1 сайте, использованного для конструирования гибрида Начало трансмембранного домена показано вертикальной чертой Эта у-последовательность идентична дзета ^-последовательности у амино-конца, но они различаются у карбоксильного конца (Tin и др, Natl Acad Sci USA, 87 3319-3323(1990)) На рис 1В представлен анализ (с помощью проточной цитометрии) на поверхностную экспрессию CD4, CD4 4 C D 4 У и C D 4 Л в клетках > CD1 Эти клетки были инфицированы вирусом, экспрессирующим СО4-химеры или CD16FI, инкубированы в течение 9 часов при 37°С и окрашены (фикоэритрин-конъюгированным анти-СО4 моноклональным антителом) MAT Leu ЗА На рис 3 показана иммунопреципитация меченных CD4 ^ ,CD4 у или нативных CD4, экспрессированных в CD1-клетках Дорожки (R) - с восстанавливающим агентом, (NR) - без восстанавливающего агента Молекулярная масса выражена в кДа и указана слева Рис 2 Поверхностная экспрессия CD16TH после совместного инфицирования одним CD16TH (плотный пунктир) или совместного инфицирования с вирусом, экспрессирующим CD4 у (штриховой пунктир) или CD4 '% (сплошная линия) Пунктир из редких точек относится к клеткам, инфицированным только CD4 £, окрашенными 3G8 (Fleit и др, Proc Natl Acad Sci USA, 79 3275-3279 (1972)) (анти-СО16 MAT) Рис 3 Мутантные CD4 % -химерные рецепторы, в которых отсутствует Asp-15 £, не поддерживают совместную экспрессию CD16™ На рис ЗА представлена авторадиограмма иммуноосажденных мутантных химер после их электрофореза, проводимого либо с восстановлением (R), либо без восстановления (NP) На рис ЗВ детально показана поверхностная экспрессия CD16TH после совместного инфицирования вирусами, экспрессирующими CD16TH, и следующими ^-химерами CD4 % (жирная линия), CD4 % C11G (сплошная линия), CD4 % (штриховой пунктир), CD4 ^C11G/D15G (плотный точечный пунктир), без совместного инфицирования (лишь CD16™, редкий точечный пунктир) Клетки были инкубированы с анти-СО16 MAT 3G8 и фикоэритрин-конъюгированными Fab'2 козьими антителами против мышиных 1gG Уровни экспрессии ^-химер для проанализированных различных мутантов были, в основном, идентичными, а совместное инфицирование клеток вирусами, экспрессирующими CD16TH и ^-химеры, не дало заметного изменения в поверхностной экспрессии химер (не показано) связыванию мутантных ^-химер в Т-клеточной линии Клетки Jurkat E6 (Weiss и др, Immunol, 133 123-128 (1984)) инфицировали рекомбинантными вирусами коровьей оспы и анализировали с помощью проточной цитометрии Результаты представлены для СО4+-популяций, дающих сигнал выше порогового значения, поскольку анализировали лишь клетки, экспрессирующие релевантный химерный белок Значение отношения фиолетовой и синей флуоресценции Indo-I отражает концентрацию внутриклеточного свободного кальция в популяции в целом, а процент реагирующих клеток соответствует фракции клеток, которая превышает заранее определенное пороговое отношение (такое, что 10% необработанных клеток являются положительными) На рис 4А и 4В показаны клетки Jurkat экспрессирующие CD4 ^ (сплошная линия) или CD16 '% (штриховой пунктир), которые были экспонированы анти-СО4 моноклональным антителом (МАТ) І_еЗа (конъюгированным с фикоэритрином) с последующим перекрестным связыванием с козьим антителом к мышиному 1gG Точечный пунктир иллюстрирует ответ неинфицированных клеток на анти-СОЗ МАТ ОКТЗ На рис 4С и 4D показаны клетки Jurkat экспрессирующие CD4 % D15G (сплошная линия), CD4 % C11G/D (штриховой пунктир), или CD4 % C11G (точечный пунктир), которые были обработаны и проанализированы, как показано на рис 4А и 4В Рис 5 CD4 %, CD4 т] и CD4 у-рецепторы стимулируют цитолитические Т-лимфоциты (CTL) к разрушению мишеней, экспрессирующих др120/41 ВИЧ-1 Рис 5А сплошные кружки (CTL), экспрессирующие CD4 4 инкубированные с HeLa-клетками, > экспрессирующими др120/41, незаштрихованные кружки (CTL), экспрессирующие CD4 т|, инкубированные с неинфицированными HeLa-клетками, заштрихованные квадраты неинфицированные CTL, у инкубированные с HeLa-клетками, экспрессирующими др120/41, незаштрихованные квадраты неинфицированные CTL, инкубированные с неинфицированными HeLa-клетками Рис 5В заштрихованные кружки CTL, экспрессирующие CD4 т|, инкубированные с HeLaклетками, экспрессирующими др120/41, незаштрихованные кружки CTL, экспрессирующие CD4 у, инкубированные с HeLa-клетками, экспрессирующими др120/42, незаштрихованные квадраты CTL, экспрессирующие C11G/D15G -двойную мутантную CD4 ^-химеру, инкубированную с HeLaклетками, экспрессирующими др120/41 Рис 5С анализ на СО4-экспрессию цитолитическими Т-лимфоцитами (CTL), проведенный с помощью проточной цитометрии, как показано на рис 5В Для коррекции мишени в соответствии с эффекторными отношениями процент клеток, экспрессирующих СО4-химеры, определяли путем вычитания вычисленной негативной (неинфицированной) популяции путем наложения гистограмм В целях сравнения на этом рисунке неинфицированным клеткам приписывали произвольный Рис 4 Увеличение внутриклеточных свободных ионов кальция приводит к перекрестному 16 41870 пирог, который давала (по грубой оценке) аналогичная фракция, являющаяся позитивной для других клеточных популяций, как было определено путем наложения гистограмм Рис 6 Специфичность СО4-направленного цитолиза Рис 6А заштрихованные кружки CTL, экспрессирующие CD4 £, инкубированные с HeLaклетками, экспрессирующими CD16PI, незаштрихованные кружочки CTL, экспрессирующие CD4, инкубированные с HeLa-клетками, экспрессирующими др120, заштрихованные квадраты CTL, экспрессирующие CD16 4 инкубированные с HeLa> клетками, экспрессирующими др120/41, незаштрихованные квадраты, CTL, экспрессирующие CD16PI, инкубированные с HeLa-клетками, экспрессирующими др120/41 Рис 6В заштрихованные кружки CTL, экспрессирующие CD4 4, инкубированные с Paji (ГКГ класса 11+)-клетками, незаштрихованные кружки неинфицированные CTL-клетки, инкубированные с RJ2 2 5 (ГКГ класса 11 - Ра]і-мутант)-клетками, заштрихованные квадраты неинфицированные CTL, инкубированные с Paji (ГКГ класса 11+)-клетками, незаштрихованные квадраты CTL, экспрессирующие CD4 4, инкубированные с RJ2 2 5 (ГКГ класса 11 )-клетками Масштаб оси ординат увеличен Рис 7 Характеризация CD16 ^-химерного рецептора На рис 7А схематически показан CD16^гибридный белок Внеклеточная часть фосфатидилинозитол связанной формы мономерного CD16 присоединяли к димеру с внешней стороны трансмембранного домена Внизу показана последовательность белка в месте сшивки Рис 7В иллюстрирует цитометрический анализ мобилизации кальция после перекрестного сшивания CD16 ^-химеры, либо в TCR-позитивной или TCR-позитивной, либо в TCR-негативной клеточной линии Показано среднее отношение фиолетовой и синей флуоресценции (критерий относительной концентрации ионов кальция) для клеточных популяций, обработанных антителами во время 0 Заштрихованные квадраты ответ клеток Jurkat на анти-СОЗ МАТ ОКТЗ, заштрихованные треугольниками ответСО16 ^ на перекрестное связывание анти-СО16 MAT 3G8 в REX33ATCR-мутанте, незаштрихованные квадраты ответ на перекрестное сшивание CD16 '% в Jurkat TCR-мутантной линии JRT3 ТЗ 5, незаштрихованные треугольники ответ на перекрестное связывание CD16 % в клетках Jurkat, крестики ответ на нехимерные CD16 в клетках Jurkat, и точечный пунктир ответ на нехимерные CD16 в клеточной линии REX33A-TCR Рис 8 Делеционный анализ цитолитического потенциала На рис 8А показано расположение конечных делеций % Кроме того, на рисунке показаны мутации в 4, обозначенные общепринятым способом "первоначальный остаток - расположение - мутантный остаток", так, например, Asp66 означает замену остатка Asp-66 стоп-кодоном На рис 8В показаны результаты цитолитического анализа неделетированных CD16 % и % с характерными делециями Гибридомные клетки, экспрессирующие поверхностное антитело к CD16, были загружены 51Сг и инкубированы с возрастающими количествами человеческих цитолитических лимфоцитов (CTL), инфицированных вирусными (коровьей оспы) рекомбинантами, экспрессирующими CD16 ^-химеры Затем строили кривую зависимости высвобожденного 51Сг от клеточного отношения эффекторных клеток (CTL) к клеткам-мишеням (гибридомам) (e/t) Заштрихованные кружки цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими CD16 % (ср кв прирост 18,7), заштрихованные квадраты цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими CD16 % Asp66* (ср кв пр 940,2), незаштрихованные квадраты цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими CD16 % С1и60* (ср кв пр 16,0), незаштрихованные кружки цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими CD16 % Туг51 (ср кв пр 17,4), заштрихованные треугольники цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими CD16 % Phe34* (ср кв пр 17,8), и незаштрихованные треугольники цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими нехимерный CD16 (ср кв пр 591) Хотя в этих экспериментах, экспрессия CD16 % Asp66 не согласуется с экспрессией других гибридных белков, однако цитолиз с помощью клеток, экспрессирующих CD16 % н а эквивалентных уровнях в том же самом эксперименте, дает результаты, в основном, идентичные тем, которые получены для клеток, экспрессирующих CD16 Asp66 (не показаны) Рис 9 Устранение возможных трансмембранных взаимодействий с помощью короткого %сегмента, обладающего способностью опосредовать цитолиз На рис 9А представлена диаграмма, схематически изображающая мономерные химеры, состоящие из двух и трех частей Вверху показана CD16 ^-конструкция, усеченная в остатке 65 и не содержащая трансмембранные остатки Cys и Asp Ниже показаны CD16CD5^ и CD16 CD7 ^-конструкции и соответствующий контроль Еще ниже показаны пептидные последовательности внутриклеточных доменов На рис 9В показаны цитолитические активности мономерных делеционных химер-мутантов Цитолитическую активность клеток, экспрессирующих CD16 % (заштрихованные кружки, ср кв пр 495), сравнивали с цитолитической активностью клеток, экспрессирующих CD16 % Asp66* (заштрихованные квадраты, ср кв пр 527), или мутантов CD16^ Cys 11Gy/Asp 15GG1y/Asp6 (незаштрихованные квадраты, срквпр338) и CD16 % Cys 11G1y/Asp-15G1y/G1u60* (заштрихованные треугольники, ср кв пр 259) На рис 9С проиллюстрирована цитолитическая активность опосредованная гибридными белками, состоящими из трех частей Заштрихованные треугольники CD16 % Asp66*, незаштрихованные квадраты CD16 5 % (48-65), заштрихованные квадраты CD16 7 ^ (48-65), незаштрихо 17 41870 трансмембранному домену CD16 7/ -химеры Последовательности внутриклеточных доменов показаны ниже, где общие остатки обведены рамкой, а родственные остатки обозначены звездочками На рис 11В проиллюстрирована цитолитическая активность трех подобластей % Заштрихованные кружки клетки, экспрессирующие CD16 % (срквпр 476), заштрихованные квадраты CD16 7 ^ (33-65) (срквпр 68), незаштрихованные квадраты CD16 7 % (17-104) (срквпр 114), и заштрихованные треугольники CD167 % (104-138) (срквпр 104) На рис 12 представлена схематическая диаграмма CD16 FcPy11-химер На рис 13 проиллюстрирована мобилизация кальция после перекрестного сшивания химер CD4FcRy11 HCD16FRy11 На рис 13А показана относительная флуоресценция (фиолетовая синия), излучаемая клетками, нагруженными кальций-восприимчивым флуороформ Indo-I, и представленная как функция времени после перекрестного связывания внеклеточного домена CD16 с антителами На рис 13В проиллюстрированы аналогичные анализы увеличения отношения фиолетовой флуоресценции к синей флуоресценции для клеток, несущих CD4 FcRyH-химеры, после перекрестного связывания с антителами Рис 14 Цитолитический анализ химер CD4FcRy11 HCD16FcRy11 На рис 14А показан процент 51Сг, высвобожденного из клеток-гибридом (мишеней) против CD16 после их экспонирования возрастающими количествами цитотоксичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD16 FcRyii-химеры (эффекторные клетки) На рис 14В показаны аналогичные анализы цитотоксичности, опосредованной CD4 FcRy11-химерами против клеток-мишеней, экспрессирующих оболочечные гликопротеины ВИЧ Рис 15 Идентификация остатков в FcRy 11А-конце, которые играют важную роль в цитолизе На рис 15а представлена схематическая диаграмма делеционных конструкций На рис 15В и 15С проиллюстрированы мобилизация кальция и цитолиз, обусловленные вариантами CD16FcRy11A, имеющими С-концевые делеции На рис 15D и 15Е проиллюстрированы мобилизация кальция и цитолиз, опосредованные химерами, состоящими из трех частей, и несущие значительно уменьшенный в амино-конце внутриклеточ ную хвостовую часть CD16 FcRyl 1А На рис 16 (SEQ 1D № 24) представлена аминокислотная последовательность СОЗ-дельтарецепторного белка, последовательность, обведенная рамкой, представляют собой предпочтительную область, транедуцирующую цитолитический сигнал На рис 17 (SEQ 1D № 25) представлена аминокислотная последовательность ТЗ-гаммарецепторного белка, последовательность, обведенная рамкой, представляет собой предпочтительную область, транедуцирующую цитолитический сигнал ванные треугольники CD16 7 £ (48-59), незаштрихованные кружки CD16 5, заштрихованные кружки CD16 7 На рис 9D показана мобилизация кальция благодаря мутантным и состоящим из трех частей химерам в TCP-негативной линии мутантных клеток Jurkat JRT3 ТЗ 5 Незаштрихованные кружки ответ клеток, экспрессирующих димер CD16 Asp66, твердые квадраты ответ клеток, экспрессирующих CD16 Cys 11G1y/Asp 15G1y/Asp66*, незаштрихованные квадраты ответ клеток, экспрессирующих CD16 % Cys 11G1y/Asp 15G1y/G1u60*, заштрихованные треугольники ответ клеток экспрессирующих CD16 7 ^ (48-65), и незаштрихованные треугольники ответ клеток, экспрессирующих CD16 І; (48-59) Рис 10 Вклад отдельных аминокислот в активность элемента, трансдуцирующего цитолитический сигнал и состоящего из 18 остатков На рис 10А и 10В показана цитолитическая активность, а на рис ЮС показана мобилизация ионов кальция, опосредованная химерами, несущими точечные мутации близ С-концевого тирозина (У62) На рис 10А и 10В представлены данные, полученные для клеток, экспрессирующих низкие и высокие количества, соответственно, CD16 '% гибридных белков Аналогичные символы использовались для анализов на мобилизацию кальция и на цитолиз (показаны одним буквенным кодом, справа) Заштрихованные кружки клетки, экспрессирующие CD16 % (срквпр в А, 21, В, 376), заштрихованные квадраты клетки, экспрессирующие CD16 7 % (48-65) (срквпр А, 31, В, 82), незаштрихованные квадраты CD16 7 ^ (48-65) G1u G0G1n (ер кв пр А, 33, В, 92), крестики CD16 7 % (48-65) Asp-63Asn (ер кв пр А, ЗО, В 74), заштрихованные треугольники CD16 7 ^ (48-65) Туг 62 Phe (ер кв пр А, 24, В, 88), незаштрихованные кружки CD16 7J; (48-65) G1u G1G1n (срквпр А, 20, В, 62) и незаштрихованные треугольники CD16 7 ^ (48-65) Туг 62 Ser (ер кв пр В, 64) На рис 10D и 10Е показана цитолитическая активность, а на рис 10F показана мобилизация ионов кальция, опосредованная химерами, несущими точечные мутации возле амино-концевого тирозина (У51) Аналогичные символы использовались для анализов на мобилизацию кальция и цитолиз (эти символы показаны справа) Заштрихованные кружки клетки, экспрессирующие CD16 ^ (ср кв пр в D, 21, 2, в Е, 672), заштрихованные квадраты клетки, экспрессирующие CD16 7'%(48-65) (ср кв пр D, 31, З, Е, 179), заштрихованные треугольники CD16 7 ^ (48-65) Asn 48 Ser (ср кв пр D, 22, 4, Е, 209), незаштрихованные квадраты CD16 7 % (48-65) Leu 50 Ser (срквпр D, 25, 0, Е, 142), незаштрихованные треугольники CD16 7 % (48-65) Туг 51 Phe (ср кв пр D, 32, З, Е, 294) Рис 11 Сравнительный анализ первичной структуры повторов % и сравнение их способности поддерживать цитолиз На рис 11а схематически показаны химеры, образованные путем деления внутриклеточного домена % н а Т Р И части и присоединения их к 18 41870 На рис 18 (SEQ 1D № 26) представлена аминокислотная последовательность mb1 -рецепторного белка, последовательность, обведенная рамкой, представляет собой предпочтительную область, трансдуцирующую цитолитический сигнал На рис 19 (SEQ 1D № 27) представлена аминокислотная последовательность В29-рецепторного белка, последовательность, обведенная рамкой, представляет собой предпочтительную область, трансдуцирующую цитолитический сигнал Пример 1. Конструирование химер "чел 1gG1 рецептор" Последовательности тяжелой цепи человеческого 1gG1 получали путем соединения последовательностей в домене СнЗ с фрагментом кДНК, происходящим из З'-конца трансмембранной формы мРНК антитела З'-концевой фрагмент получали путем полимеразноцепной реакции с использованием библиотеки кДНК миндалины в качестве субстрата и олигонуклеотидов, имеющих последовательности CGC GGG GTG ACC GTG ССС ТСС AGC TTGGGC(SEQ1D№ 7) CGC CGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT GGG CCT CA (SEQ 1D № 8), соответствующие 5'- и З'-концами нужных ДНК-фрагментов соответственно 5'-олиго является комплементарным участку в домене Сн1 человеческого 1gG1, а З'-олиго является комплементарным участку непосредственно 5'-конца последовательностей, кодирующих трансмембранный домен PCR-продукт переваривали BstX1 и ВатН1 и между RstX1- и ВатН1- сайтами гена полусинтетического антитела (1gG1), несущего вариабельную и константную области После инсерции BstX1 - BamH1-фрагмента, амплифицированные части конструкции помещали до Sma1-сайта в СнЗ путем замены рестрикционного фрагмента так, чтобы только часть между Sma1-сайтом и З'-олиго происходила из PCR-реакции Для получения человеческого 1gG1 -химерного рецептора, ген тяжелой цепи, кончающийся в ВатН1-сайте, присоединяли к ВатН1-сайту ^-химеры, описанной ниже, так, чтобы последовательность антитела образовывала внеклеточную часть Проточная цитометрия COS-клеток, трансфецированных плазмидой, кодирующей химеру, показывала высокий уровень экспрессии детерминант антитела в том случае, когда совместно трансфецировали экспрессирующую плазмиду, кодирующую кДНК легкой цепи, и невысокий уровень экспрессии детерминант антитела, если экспрессирующая плазмида легкой цепи отсутствовала Аналогичные химеры, содержащие чел 1gG1, сшитый с г\ или '% (см ниже), или любую сигнал-трансдуцирующую область Т-клеточного рецептора, или Fc-рецептора, могут быть сконструированы, в основном, как описано выше, с использованием стандартной техники молекулярной биологии Для создания транскрипционной единицы, которая должна способствовать экспрессии как тяжелой, так и легкой цепи от одного промотора, конструировали плазмиду, кодирующую бисцистронную мРНК, из последовательностей, кодирующих тяжелую и легкую цепи, и 5'-нетранслированной части мРНК, кодирующей 78 кДа-глюкозо-регулируемый белок, который еще известен как grp 78 или BiP Последовательности grp 78 были получены с помощью РСР из геномной ДНК человека с использованием праймеров, имеющих последовательности CGC GGG CGC CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG САС (SEQ 1D № 9) и CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ 1D № 10) у 5'- и З'-концов, соответственно Полимеразноцепную реакцию с использованием этих олигонуклеотидов осуществляли в присутствии 10% диметилсульфоксида Фрагмент, полученный путем PCR, переваривали Not1 и Нте 11 и вставляли между Not1- и Нра1-сайтами ниже последовательностей, кодирующих чел 1gG1 Последовательности, кодирующие кДНК легкой каппа-цепи 1gG человека, затем вставляли ниже (в направл 5 ^ 3 ) лидера grp 78 с использованием Нте11-сайта и другого сайта в векторе Экспрессирующая плазмида, полученная с помощью описанных манипуляций, содержала полусинтетический ген тяжелой цепи, следующие за ним лидерные последовательности grp 78, затем кДНК-последовательности легкой каппа-цепи, затем сигналы полиаденилирования, происходящие из ДНК-фрагмента SV 40 Трансфекция COS-клеток экспрессирующей плазмидой давала значительное увеличение экспрессии детерминант тяжелой цепи по сравнению с трансфекцией лишь одной плазмидой, кодирующей детерминанты тяжелой цепи Для конструирования бицистронного гена, включающего гены химеры тяжелой цепи/рецептора и легкой цепи, последовательности выше тяжелой цепи могут быть заменены любыми химерным геном тяжелой цепи/рецептора, описанным в настоящей заявке Пример 2. Конструирование СО4-рецепторных химер кДНК чел % (Weissman и др, Proc Natl Acad Sci USA, 85 9709-9713 (1988b)) и у (Kuster и др , J Biol Chem , 265 6448-6452 (1990)) выделяли с помощью полимеразно-цепной реакции из библиотек, полученных из опухолевой клеточной линии HPB-ALL (Aruffo и др, Proc Natl Acad Sci USA, 84 8573-8577 (1987b)) и из природных клеток-киллеров человека, а кДНК r\ (Tin и др , Proc Natl Acad Sci USA, 87 3319-3323 (1990)) выделяли из библиотеки мышиныхтимоцитов кДНК 4, л и у присоединяли к внеклеточному домену сконструированной формы CD4, обладающей ВатН1-сайтом непосредственно выше трансмембранного домена (Aruffo и др , Proc Natl Acad Sci USA, 84 8573-8577 (1987o), Zettlmeissl и др , DNA Cell Biol , 9 347-353 (1990)), который присоединяли к природному BamH1-сайту, присутствующему в кДНК ^ и г\ при аналогичном размещении 19 41870 нескольких остатков выше трансмембранного домена (SEQ1D№№ 1, 3, 4 и 6) Для получения гибридного белка с у, в последовательности конструировали ВатН1-сайт примерно при том же размещении (рис 1, SEQ 1D № 2 и 5) Генные гибриды вводили в экспрессирующую плазмиду вируса коровьей оспы, несущую ген gpt Е Coli в качестве селектируемого маркера (М Amiot и В S , неопубл ), и вставляли в геном штамма WR вируса коровьей оспы путем гомологичной рекомбинации и селекции на рост в микрофеноловой кислоте (Falkner и др , J Virol , 62 1849-1854 (1988), Boyle и др , Gene, 65 123-128 (1988) Проточный цитометрический анализ показал, что рекомбинанты коровьей оспы способствуют обильному продуцированию CD4 '% и CD4 угибридных белков на клеточной поверхности, тогда, как экспрессия CD4 г\ была значительно слабее (рис 1) Этот факт соответствует появившемуся недавно сообщению о том, что трансфекция экспрессирующей плазмиды кДНК г\ в клеточную линию мышиной гибридомы давала значительно меньшую экспрессию, чем трансфекция сравнимой экспрессирующей плазмиды '% (Clayton и др , J Exp Med , 172 1243-1253(1990)) Иммунопреципитация клеток, инфицированных рекомбинантами вируса коровьей оспы, выявила, что гибридные белки образуют ковалентные димеры в отличие от природного антигена CD4 (рис 1) Молекулярные массы мономерных CD4 % и CD4 у -гибридных белков и нативного CD4 составляют 63, 55 и 53 кДа, соответственно Большие массы гибридных белков приблизительно соответствуют большим длинам внутриклеточной области, длина которой превышает длину нативного CD4 на 75 (CD4 Q или на 5 (CD4 у) остатков Пример 3. СО4-химеры могут ассоциироваться с другими цепями рецептора Кпеточно-поверхностная экспрессия чел FcyR111 (СО16тн)-клетоктипа макрофагов/природных киллеров на трансфектантах может быть облегчена путем совместной трансфекции с мышиным (Kurosaki и др , Nature, 342 805-807 (1989)) или человеческим (Hibbs и др , Science, 246 16081611 (1989)) у, а также с человеческим'%(Lamer и др , Nature, 342 803-805) 1989)) В соответствии с указанными отсчетами, экспрессия химер также способствует поверхностной экспрессии CD16TH, при его доставке в клеткимишени либо путем совместной трансфекции, либо путем совместного инфицирования с рекомбинантными вирусами коровьей оспы (рис 2) Стимулирование поверхностной экспрессии (CD16TH) С использованием % было более ярко выражено, чем стимулирование посредством у (рис 2) в рассматриваемых клеточных линиях, тогда, как нативный CD4 (данные не показаны) не усиливал поверхностную экспрессию CD16TH Пример 4 Asp-^-мутанты не ассоциируются с Fc-peцептором Для создания химер, которые не могут ассоциироваться с имеющимся антигеном или Fc-pe цепторами, получили мутантные ^-гибридные белки, в которых отсутствуют либо внутримембранный Asp-остаток, либо внутримембранный Cys-остаток, либо оба Проточная цитометрия показала, что интенсивность клеточно-поверхностной экспрессии, опосредованной различными мутантными химерами, заметно не отличалась от экспрессии с немутированным предшественником (данные не приводятся), а эксперименты при помощи иммунопреципитации показали, что в целом экспрессия посредством химер является одинаковой (рис 3) Как и ожидалось, мутантные химеры, в которых отсутствовал трансмембранный цистеиновый остаток, не образовывали дисульфид-связанных димеров (рис 3) Две мутантные химеры, в которых отсутствовал Asp, были неспособны поддерживать поверхностную экспрессию CD16TH, тогда, как мономерные химеры, в которых отсутствовал Cys-остаток, но в которых присутствовал Asp, поддерживали коэкспрессию CD16TH, НО С более низкой эффективностью, чем родительский димер (рис 3) Пример 5. Мутантные рецепторы сохраняют способность инициировать кальциевый ответ Для того, чтобы определить, способствует ли перекрестное связывание гибридных белков накоплению внутриклеточного кальция так же, как это имеет место, как известно, в случае Т-клеточного рецептора антигена, клетки Т-клеточной линии лейкоза человека, Jurkat E6 (АТСС, номер допуска Т1В 152, Американская коллекция типовых культур, Роквил, MD) инфицировали рекомбинантами вируса коровьей оспы, и определяли относительную концентрацию цитоплазм этического кальция после перекрестного связывания внеклеточного домена с антителами Измерения с помощью проточной цитометрии осуществляли с использованием клеток, нагруженных кальций-чувствительным красителем lndo-1 (Grenkiewicz и др , J Biol Chem , 260 33403450 (1985), Rabmovitch и др , J Immunol , 137 952961 (1986)) На рис 4 показаны результаты экспериментов по переносу кальция с использованием клеток, инфицированных CD4 % и Asp и Cys -мутантами % Перекрестное связывание химер способствовало воспроизводимому увеличению внутриклеточного кальция Аналогично, CD4 г\ и CD4 у способствовали аккумуляции внутриклеточного кальция в инфицированных клетках (данные не приводятся) Клетки Jurkat экспрессировали низкие уровни CD4 на клеточной поверхности, однако перекрестное связывание CD4 в присутствии или в отсутствие CD16 £ (С R и B S , неопубл) (Рис 4, данные не приводятся) не показало изменения уровней внутриклеточного кальция Пример 6. CD4 4, Л и у-химеры опосредуют цитолиз мишеней, экспрессирующих др120/41 ВИЧ Чтобы определить, будут ли химерные рецепторы стимулировать цитолитические эффекторные программы, конструировали систему мишень эффектор, основанную на СО4-распознавании оболочечного комплекса gp120/gp41 ВИЧ 20 41870 Клетки HeLa инфицировали рекомбинантными вирусами коровьей оспы, экспрессирующими gp/120gp41 (Chakseabar и др , Nature, 320 535-537 (1986), Earl и др, J Virol 64 2448-2451 (1990)) и метил хромом ( 1Сг) Меченные клетки инкубировали с клетками из линии аллоспецифических (CD8+, CD4) цитотоксичных Т-лимфоцитов человека, которые были инфицированы рекомбинантами вируса коровьей оспы, экспрессирующими CD4 £., CD4 г\ или CD4 у-химеры, или двойные мутантные CD4 Е Cys . 11G1y Asp 15G1 у-химеры На рис 5 показано, что клетки HeLa, экспрессирующие др120/41, были специфически лизированы цитотоксичными Т-лимфоцитами (CTL), экспрессирующими СО4-химеры Неинфицированные клетки HeLa не атаковались CTL-"вооруженными" CD4 Е-химерами, а клетки HeLa, экспрессирующие др120/41, не распознавались неинфицированными CTL Для сравнения эффективности различных химер, отношения эффектора к мишени были корректированы на фракции CTL, экспрессирующих СО4-химеры, и на фракции HeLa-клеток, экспрессирующих др120/41, как было измерено с помощью проточной цитометрии На рис 5С показан цитометрический анализ СО4-экспрессии цитотоксичными Т-лимфоцитами, использованными в эксперименте на цитолиз (см рис 4А и 4В) Хотя средняя плотность поверхностных CD4 Е. значительно превышает среднюю плотность CD4 т|, однако цитолитические эффективности клеток, экспрессирующих эти формы, оказались одинаковыми После внесения поправки на фракции мишеней, экспрессирующих др120, эффективность цитолиза, опосредованного CD4 Е и CD4 у-белками была сравнимой с наилучшими результатами эффективности, полученными для специфических Тклеточно-рецегтгорных пар (мишень эффектор) (среднее отношение эффектор мишень для 50% высвобождения Т-клетками, экспрессирующими CD4 % составляло 1,9+0,99, п = 10) Гибрид CD4 у был менее активен, как и CD4 ^-гибрид, в котором отсутствовали трансмембранные Asp и Cys-остатки Однако в обоих случаях наблюдался значительный цитолиз (рис 5) Чтобы проверить, может ли инфекция вируса коровьей оспы стимулировать ложное распознавание цитотоксичными Т-лимфоцитами, осуществляли аналогичные эксперименты на цитолиз с использованием клеток-мишеней, инфицированных рекомбинантами вируса коровьей оспы, экспрессирующими фосфатид ил инозитол-связанную форму CD16 (CD16PI) и меченными хромом (51Сг), а также с использованием CTI, инфицированных контрольными рекомбинантами, экспрессирующими либо CD16RI, либо CD16 Е . На рис 6А показано, что Т-клетки, экспрессирующие химеры, в которых отсутствует CD4, не распознают нативные HeLa-клетки или HeLa-клетки, экспрессирующие др120/41, и аналогично, Тклетки, экспрессирующие СО4-химеры, не распознают HeLa-клетки, экспрессирующие другие поверхностные белки, кодированные вирусом коровьей оспы Кроме того, СТІ-клетки, экспрессирующие химеры без CD4, не обнаруживают заметного лизиса HeLa-клеток, экспрессирующих др120/41 (рис 6А) Пример 7. Клетки-несущие ГКГ класса II не являются мишенями для химер В литературе указывалось, что CD4, очевидно, взаимодействует с неполиморфной последовательностью, экспрессированной антигеном ГКГ класса II (Gay и др , Nature, 328 626-629 (1987), Sleckman и др , Nature, 328 351 -353 (1987 ) Хотя специфического взаимодействия между CD4 и антигеном класса II никогда не было зафиксировано с использованием очищенных белков, однако при определенных условиях адгезия между клетками, экспрессирующими CD4, и клетками, экспрессирующими молекулы класса II, может быть продемонстрирована (Dayle и др, Nature, 330 256-259 (1987), Clayton и др , J Exp Med , 172 1243-1253 (1990), Lamarre и др , Science, 245 743-746(1989)) После этого проверяли, может ли наблюдаться уничтожение клеток, несущих ГКГ класса II На рис 6В показано, что специфического цитолиза, стимулируемого CD4 ^-химерами против В-клеточной линии Raji, которая экспрессирует обильное количество антигена класса II, не наблюдалось Однако, хотя и наблюдался очень скромный цитолиз («5%), все же класс ll-негативный мутант Raji, RJ2 2 5 (Accolla R S , J Exp Med , 157 10531058 (1983) показал такую же восприимчивость, что и клетки Raji, инкубированные с неинфицированными Т-клетками Пример 8. Требования к последовательностям, преъявляемые для индуцирования цитолиза, стимулируемого дзета-цепью-Т-клеточного антигена/Fcрецептора Хотя химеры между CD4 и Е могут стимули. ровать цитотоксичные Т-лимфоциты (CTL) на уничтожение клеток-мишеней, экспрессирующих др120 ВИЧ, однако для точной и недвусмысленной сравнительной оценки свойств дзета-химер, введенных в Т-клеточные линии человека, были проведены поиски альтернативы к CD4 Эти линии могут экспрессировать CD4, что затрудняет конкретное определение соотношения между типов и степенью кальциевой мобилизации и цитотоксичного потенциала различных химер Для преодоления этих трудностей, были сконструированы химеры между Е и CD16, в которых . внеклеточный домен С 16 был присоединен к трансмембранной и внутриклеточной последовательностям Е (рис 7А) Генные гибриды вводили в экспрессирующую плазмиду вируса коровьей оспы, несущую ген gpt Е Соїі в качестве селектируемого маркера, и вводили в геном штамме WR вируса коровьей оспы посредством гомологичной рекомбинации и отбора на рост в микрофеноловой кислоте (Falkner и Moss, J Virol, 62 1849 (1988), Bayle и Coupar, Gene, 65 123(1988)) Т-клеточные линии были инфицированы рекомбинантами вируса осповакцины, а затем после перекрестного связывания внеклеточных доменов 21 41870 Для определения минимальных требований к последовательностям Е, представляемых для цитолиза, был получен ряд делеционных мутантов, в которых из карбокси-конца удаляли последовательно все большую часть внутриклеточного домена Е (рис 8А) Большая часть внутриклеточного домена дзета-цепи может быть удалена с незначительными последствиями для цитолитического потенциала, и полная химера CD16 Е имела, в основном, такую же эффективность, что и химера, делетированная до остатка 65, CD16 Е Asp66* (рис 8В) Значительное уменьшение цитотоксичности наблюдалось при делеции до остатка 59 Е (химера CD16 Е G1u 60*), а делеция до остатка 50 приводила к небольшому уменьшению активности Однако при этом полной потери активности не наблюдалось даже, если внутриклеточный домен уменьшали до трансмембранного домена из трех остатков (рис 8В) Поскольку Е является дисульфид-связанным димером, то может быть лишь одно объяснение сохранения цитолитической активности, которое заключается втом, что эндогенная Е образует гетеродимеры с делетированной химерной Е, способствуя тем самым восстановлению активности Для проверки этого объяснения, остатки Е 11 и 15 Asp и Cys были заменены соответственно на G1y (Cys 11G1y/Asp 15G1y), после чего осуществляли иммунопреципитацию следующим образом Приблизительно 2 х 106 клеток CVI было инфицировано (в течение 1 часа, в DME-среде, не содержащей сыворотку) рекомбинантным вирусом осповакцины при множественности инфекции (mei), составляющей, по крайней мере, 10 Через 6-8 часов после инфицирования клетки выделяли из чашек с PBS/1 мМ EDTA, и подвергали поверхностному мечению 0,2 мКи I на 2 х 106 клеток с использованием лактоперексидазы и Н2О2 методом Bclark и Emfeld (Leukocute Typing 11, стр 155-167, Springer - verlag, NV, 1986) Меченные клетки собирали путем центрифугирования и подвергали лизису в 1% NP-40, 0,1% ДСН, 0,15 М NaCI, 0,5 М Трис, рН 8,0, 5 мМ MgCI2, 5 мМ KCI, 0,2 М иодоацетамида и 1 мМ PMSF Ядра удаляли путем центрифугирования, а СО16-белки подвергали иммунопреципитации с антителом 3G8 (Fleit и др, см выше, 1982, Medarex) и агарозой антимышиного IgG (Cappel, Durham, NC) Образцы подвергали электрофорезу на 8% полиакриламидном/ДСН-геле в невосстановительных условиях, либо на 10% геле в восстановительных условиях Проведенная иммунопреципитация подтвердила тот факт, что CD16 Cys 11G1y/Asp 15(31у-химера не ассоциируется в дисульфид-сшитых димерных структурах Оценивали также цитолитическую активность мутантных рецепторов Мутантную химеру делетировали до остатка 65 (CD16 Е Cys 11G1y/Asp 15G1y/Asp 66*), в результате чего, в зависимости от условий анализа, наблюдалось 2-8кратное снижение активности цитолиза по сравнению с немутированной химерой (CD16 Е Asp 66*), с антителами измеряли относительные концентрации цитоплазматических свободных ионов кальция Были проведены как спектрофлуорометрические (объемная популяция), так и цитометрические (отдельные клетки) измерения с использованием клеток, нагруженных красителем Indo-I (Grynkiewicz и др, J Biol Chem 260 3440 (1985), Rabinowitch и др , J Immunol 137 952(1986)) На рис 7В показаны данные анализов, полученные от клеток Т-клеточной линии Jurkat лейкоза человека, инфицированных рекомбинантами вируса осповакцины, экспрессирующими CD16 Егибридный белок Перекрестное связывание химер способствовало воспроизводимому увеличению внутриклеточного кальция тогда, как аналогичная обработка клеток, экспрессирующих нехимерный CD16, давала незначительный эффект или вовсе не давала никакого эффекта Если химера экспрессировалась в мутантных клеточных линиях, в которых отсутствовал рецептор антигена, либо в REX33A (Breitmeyer и др , J Immunol 138 726 (1987), Sancho и др , J Biol Chem 264 20760 (1989)) либо в мутанте JPT3 ТЗ 5 Jurkat (Weiss и др , J Immunol 135 123 (1984)), то наблюдался сильный ответ на связывание CD16 с антителом Аналогичные данные были получены для мутантной клеточной линии РЕХ20А (Breitmeyer и др , см выше, 1987, Blumberg и др , J Biol Chem 265 14037 (1990)) и СОЗ/Ті-негативного мутанта клеточной линии Jurkat, полученной в данной лаборатории (данные не приводятся) Инфицирование рекомбинантами, экспрессирующим CD16 Е не способствовало восстановлению ответа к анти-СОЗ антителу, что указывает на то, что гибридный белок действует не путем "спасения" внутриклеточных цепей СОЗ-комплекса (данные не показаны) Для оценки способности химер к переориентации клеточно-опосредованного иммунитета, цитотоксичные Т-лимфоциты (CTL) инфицировали рекомбинантами вируса осповакцины, экспрессирующими СО16-химеры и использовали для специфического лизиса гибридомных клеток, экспрессирующих мембрано-связанные анти-СО16 антитела (см ниже) Этот анализ представляет собой расширенный анализ на цитотоксичность к гибридоме, первоначально разработанный для анализа эффекторного механизма клеток, несущих Fc-рецепторы (Graziano и Fauger, J Immunol , 138 945, и 139 3536 (1987), Shen и др , Мої Immunol 26 959, (1989), Fanger и др , Immunol Taday, 10 92, (1989) На рис 8В показано, что экспрессия CD16 Е в цитотоксичных Т-лимфоцитах (CTL) стимулирует "вооруженных" таким образом CTL к уничтожению 3G8 (анти-СО16, Fleit и др , Proc Natl Acad Sci USA, 79 3275, 1982) - гибридомных клеток, тогда, как CTL, экспрессирующие фосфатидилинозитол-связанную форму CD16, являются неактивными CTL, "вооруженные" CD16 Е также не уничтожают гибридомные клетки, экспрессирующие нерелевантное антитело (данные не приводятся) 22 41870 или тирозин заменяли фенил-аланином), которые были сделаны на участке 59-63 остатков, давали умеренное снижение цитолитической активности, однако эти варианты в целом сохраняли свою способность к мобилизации кальция Однако все эти остатки, очевидно, составляют важный субэлемент, ввиду того, что их делеция приводит к элиминированию цитолитической активности Замена Туг 62 на Phe либо на Ser приводит к элиминации цитотоксичного и кальциевого ответа Замена Туг 51 на Phe в амино-конце фрагмента из 18 остатков способствует элиминации цитолитической активности и мобилизации кальция, а замещение Leu на Ser в положении 50 отменяет кальциевый ответ, и лишь частично снижает цитолиз Не претендуя на какую-либо конкретную теорию, можно подозревать, что неспособность Leu 50 Ser-мутанта к мобилизации кальция в течение непродолжительного анализа с помощью проточной цитометрии не полностью отражает его способность опосредовать значительное увеличение ионов свободного внутриклеточного кальция в течение более продолжительного времени проведения цитолитического анализа Однако кальций - нечувствительная цитолитическая активность уже отмечалась для некоторых линий цитолитических Т-клеток, и не исключается возможность того, что в основе полученных результатов лежит аналогичный феномен Замена Asp 48 на Ser частично ухудшала цитотоксичность в некоторых экспериментах, хотя в других экспериментах этот эффект был очень незначительным Для исследования роли избыточных элементов последовательности внутриклеточный домен ^-цепи делили на три сегмента, а именно от 33 до 65 остатка, от 71 до 104 остатка и от 104 до 138 остатка Каждый из этих сегментов присоединяли к CD16 СО7-химере с помощью М1и1-сайта, введенного непосредственно с внешней стороны от мембранно-связывающих последовательностей внутриклеточного домена CD7 (см ниже, рис 11 А) Сравнение цитолитической эффективности трех элементов показало, что они являются, в основном, равносильными (рис 11В) Сравнение последовательностей показало (рис 11 А), что второй элемент содержит 11 остатков между тирозинами, тогда как первый и третий элементы содержат 10 остатков Хотя точную оценку способа Т-клеточной активации не проводили, однако, совершенно ясно, что мобилизация кальция, высвобождение цитокина и гранул и появление поверхностно-клеточных маркеров активации стимулируются агрегацией антигенного рецептора или рецепторных химер, содержащих внутриклеточные последовательности % Активный сайт ^-цепи, который представляет собой короткую линейную пептидную последовательность, вероятно, слишком мал, чтобы иметь собственную ферментную активность, и, по всей вероятности, он взаимодействует с одним или, в лучшем случае, с несколькими белками, опосредуя тем самым клеточную активность аісгивность которой в два раза меньше или вовсе не отличается от активности CD16 '% (см рис 9В) Снижение активности мутантных химер было сравнимо со снижением активности, наблюдаемым для СО4-химер с аналогичной структурой (см выше), и с высокой долей вероятности, это снижение может быть объяснено более низкой эффективностью ^-мономеров по сравнению с димерами В противоположность этому, Asp, Cys-мутантная химера, делегированная до остатка 59, не показала цитолитической активности (рис 9В), что подтверждает гипотезу о том, что ассоциирование с другими белками, опосредуемое трансмембранными Cys и/или Asp-остатками, является ответственным за слабую устойчивость цитолитической активности при амино-концевых делециях до более, чем 65 остатка Исследования с помощью проточной цитометрии показали, что делеционные мутанты, в которых отсутствуют трансмембранные остатки Asp и Cys, все же могут стимулировать увеличение свободных внутриклеточных ионов кальция в ответ на перекрестное связывание с антителом в TCR-мутантной клеточной линии (на рис 9D) Аналогичные результаты были получены для химер, экспрессированных в родительской линии Jurkat (не показано) В случае CD16 % Cys 11G1y/Asp 15G1y/Glu60*, эти данные свидетельствуют о том, что способность к стимулированию кальциевых ответов может быть независимой от способности к поддержанию цитолиза с помощью мутаций Для надежного устранения возможного воздействия трансмембранных остатков £, трансмембранные и первые 17 цитоплазматических остатков % были заменены последовательностями, кодирующими трансмембранные и первые 14 или 17 цитоплазматических остатка CD5- или CD7-3Hтигенов, соответственно (рис 9А) Полученные и состоящие из трех частей гибридные белки CD16 5 % (48-65) и CD16 7 ^ (48-65) не образовывали дисульфид-сшитых димеров, как это делали более простые CD16 ^-химеры, поскольку в них отсутствовал цистеиновый остаток в трансмембранной области '% Эти обе трехчленные химеры обладали способностью к мобилизации кальция в Jurkat и TCRнегативных клеточных линиях (рис 9) и к продуцированию цитолитического ответа в CTL (рис 9С, данные не приводятся) Однако усечению части % до остатка 59 в химера CD16 7 % (48-59) элиминирует способность трехчленного гибрида к стимулированию кальциевого ответа в ТСР-позитивных или негативных клетках Jurkat или цитолиза в зрелых CTL (рис 9С и 9D) (и данные не приводятся) Для оценки влияния отдельных остатков внутри элемента, состоящего из 18 остатков, с помощью сайт-направленного мутагенеза получали ряд мутантных вариантов и оценивали их способность опосредовать сайт-направленный киллинг в условиях низкой (рис 10А и 10D) или высокой (рис 10В и 10Е) экспрессии химерного рецептора На рис 10 показано, что хотя ряд относительно консервативных замещений (те кислотные остатки заменяли их родственными амидами, 23 41870 Совершенно очевидно также, что мобилизации свободного кальция самой по себе недостаточно для клеточной активации, поскольку способность опосредовать цитолиз может быть отделена с помощью мутаций от способности опосредовать накопление кальция Как показано в настоящем описании, добавление 18 остатков из внутриклеточного домена '%цепи к трансмембранному и внутриклеточному домену двух неродственных белков приводит к образованию химер, способствующих переадресации цитолитической активности против клеток-мишеней, которые связываются с внеклеточной частью гибридных белков Хотя химеры, несущие элемент из 18 остатков, имеют примерно в 8 раз меньшую активность, чем химеры, полученные на основе полной 4 од> нако это понижение активности может быть отнесено за счет потерь трансмембранных взаимодействий, которые обычно способствуют образованию дисульфид-сшитых димеров у % дикого типа га) % (называемой "эта" (г\)) и др , см выше, 1990, Clayton и др , Proc Natl Acad Sci USA, 88 5202, 1991) отсутствует карбокси-концевая половина третьего элемента Поскольку удаление карбоксильной половины первого элемента способствует потере активности, то, очевидно, большую часть биологической активности г\ можно приписать первым двум элементам Хотя различные измерения показали, что г\ обладает такой же активностью, как '% в стимулировании антиген-опосредованного высвобождения цитокина (Bauer и др , Proc Natl Acad Sci USA, 88 3842, 1991) или переориентированном цитолизе (см выше), однако г\ не обнаруживает фосфорилирования в ответ на стимуляцию рецептора (Bauer и др , см выше, 1991) Таким образом, либо присутствие всех трех элементов необходимо для фосфорилирования, либо третий элемент представляет собой предпочтительный субстрат для неидентифицированной тирозин-киназы Пример 9. Трансдукция цитолити чес ко го сигнала Fcрецептором человека Для оценки действия различных подтипов человеческого Fc-рецегтгора, конструировали химерные молекулы, в которых внеклеточный домен чел CD4, CD5 или СО16-антигенов был присоединен к трансмембранному и внутриклеточному доменам рецепторов подтипов FcR11yA, В1, В2 и С (номенклатура Raveten и Kmet, Ann , Rev Immunol , 9 457, 1991) В частности, кДНК-последовательности, соответствующие трансмембранному и цитоплазматическому доменам ранее описанных изоформ FcR11A, В1 и В2, амплифицировали из предварительно полученного клона РС23 или из кДНК-библиотеки миндалины человека (сконструированной в соответствии со стандартной техникой) с использованием олигонуклеотидных праймеров ССС GGA ТСС CAGCAT GGG САС СТС ТТ (SEQ 1D № 18, - FcR11А впереди), CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT АТТ ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ 1D № 19, FcR11A сзади), GCG GGG GGA ТСС САС TGT CCA AGG TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ 1D № 20, FcR11B1 и FcR11B2 впереди), и GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGC TTC TGG TC (SEQ 1D № 21, FcR11B1 и FcR11B2 сзади) Эти праймеры содержали рестрикционные сайты для ферментов ВатН1 и Not1, соответственно, находящиеся на расстоянии 6 остатков от 5'-конца Not1 -сайт находился непосредственно за антисмысловым стоп-кодоном либо СТА либо ТТА Все праймеры содержали 18 или более остатков, комплементарных 5'- и З'-концам нужных фрагментов кДНК-фрагмент, соответствующий цитоплазматическому домену FcR11yC, который отличался от изоформы 11А лишь одним аминокислотным остатком (L вместо Р в положении 268) генерировали с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием перекрывающейся PCR и праймеров, имеющих последовательности То есть делетированные % -конструкции, которые имеют такой же карбоксильный конец, что и указанный элемент, и в которых отсутствуют трансмембранные остатки Cys и Asp, обычно обнаруживают немного меньшую активность, чем химеры, содержащие лишь элемент из 18 остатков Рассматриваемый цитолити чес ко-компетентный элемент содержит два тирозина и не содержит серинов или треонинов, что ограничивает возможный вклад фосфорилирования в активность Однако мутация любого тирозина уничтожает активность, и хотя предварительно эксперименты не показали значительного фосфорилирования после перекрестного связывания поверхностных химерных антигенов, несущих элемент из 18 остатков, все же не исключена возможность участия такого фосфорилирования хотя бы на низком уровне В дополнение к вышеуказанным действиям в отношении двух тирозиновых остатков, следует отметить, что ряд аминокислотных замещений у амино- и карбокси-концов элемента может ослаблять активность в условиях низкой плотности рецепторов Последовательности, аналогичные активному элементу 4. могут быть обнаружены в цитоплазматических доменах некоторых других трансмембранных белков, включая а- и у -молекулы CD3, поверхностно- lgM-ассоциированные белки mbl и А29, и р- и у-цепи высокоаффинного рецептора к 1дЕ, FeG R1 (Reth, Nature, 338 383, 1989) Хотя функции этих последовательностей еще не изучены, однако, при эффективной экспрессии, каждый из них способен к активации Тклеток, и такая активность может быть объяснена остаточной TCR-реактивностью, обнаруживаемой в дзета-негативной мутантной клеточной линии (Sussman и др , Cell, 52 85, 1988) Дзета сама по себе содержит три таких последовательности, приблизительно равные по длине, и эти, по грубой оценке, три части внутриклеточного домена обнаруживают (каждая из них) способность инициировать цитолитический ответ В укороченной изоформе (в результате сплайсин 24 41870 TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA АСА A (SEQ 1D № 22) и TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ 1D № 23) PCR-фрагменты вставляли в экспрессирующие векторы, содержащие внеклеточные домены CD16 или CD4, соответственно, а затем вставляли в вирус коровьи оспы дикого типа путем рекомбинации в локусе тимидин-киназы, используя при этом селекцию на коинтеграцию gpt E coh для облегчения идентификации нужных рекомбинантов Идентификация всех изоформ (показано на рис 12) была подтверждена путем дидезокси-секвенирования Продуцирование химерных рецепторных белков было затем подтверждено путем анализа с помощью иммунопреципитации Примерно 107 клеток JRT3 ТЗ 5 было инфицировано (в течение 1 часа, в 1 MDM-среде, не о содержащей сыворотку) рекомбинантами вируса осповакцины при множественности инфекции, составляющей, по крайней мере, 10 Через 12 часов после инфицирования, клетки собирали и подвергали поверхностному мечению 0,5 мКи 125І на 107 клеток с использованием лактоперексидазы/глюкозо-оксидазы по методу (Clark и Emfeld см выше) Меченные клетки собирали путем центрифугирования и подвергали лизису в 1% NP-40, 0,1 мМ MgCI2, 5 мМ KCI, 0,2 М иодоацетамида и 1 мМ PMSF Ядра удаляли путем центрифугирования, а СО16-гибридные белки подвергали иммунопреципитации с использованием антитела 4G8 и агарозы антимышиных 1gG Образцы подвергали электрофорезу в восстановительных условиях Все иммуноосажденные химерные рецепторные молекулы имели предсказанные молекулярные массы Для оценки способности химерных рецепторов опосредовать увеличение ионов свободного цитоплазматического кальция, рекомбинантные вирусы использовали для инфицирования TCRмутантной Jurkat-клеточной линии JRT3 ТЗ 5 (как описано в данной заявке), а затем после перекрестного связывания внеклеточных доменов рецептора с моноклональным антителом 3G8 или Leu-ЗА (как описано в настоящей заявке) измеряли цитоплазматический свободный кальций Эти эксперименты показали, что внутриклеточные домены FcRy11A и С обладают способностью опосредовать увеличение цитоплазматического свободного кальция после перекрестного связывания внеклеточных доменов, тогда, как внутриклеточные домены FcRy11 В1 и В2 являются неактивными в аналогичных условиях (см рис 13Аи 13В) комбинантами вируса коровьей оспы, экспрессирующими CD16FcRy11A, В1, В2 и С-химеры Инфицированные клетки затем культивировали вместе с 51Сг-нагруженными гибридомными клетками (те клетки 10-2 3G8), которые экспрессировали клеточно-поверхностное антитело к CD16 В этом анализе CTL, несущие СО16-химеры, уничтожали гибридомные клетки-мишени (способствуя высвобождению свободного 51Сг) в том случае, если внеклеточный домен СО16-химеры был присоединен к внутриклеточному сегменту, способному к активации эффекторной программы лимфоцитов (этот анализ на цитолиз подробно описан ниже) На рис 14А показано, что CTL, "вооруженные" CD16 FcRy11A и С (но не FcRy11 В1 или В2) обладают способностью к лизису клеток-мишеней, экспрессирующих клеточно-поверхностные антиCD16 антитело Для того чтобы исключить возможность того, что специфический цитолиз может быть приписан взаимодействию с сЬіб-частью, проводили эксперимент на цитолиз, в котором внутриклеточные домены FcR11 были присоединены к внеклеточному домену CD4 В этом случае клетками-мишенями были клетки HeLa, экспрессирующие оболочечные др120/41 ВИЧ (конкретно, HeLa-клетки были инфицированы вектором вируса коровьей оспы vPE16) (депонированного в Национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний) особенно СПИДа, Bethesela, MD Как и в СОІб-системе, клетки-мишени, экспрессирующие оболочку ВИЧ, были восприимчивыми к лизису Т-клетками, экспрессирующими CD4 FcRyiiA-химеру, но не FcRy11 В1 или В2 (рис 14В) Внутриклеточные домены FcRy11A и С не имеют заметной гомологии в последовательности с любым другим белком, включая членов обширного FcRy/TCR^-семейства Для определения, какие именно элементы последовательности ответственны за индуцирование цитолиза, получали 5'- и З'-концевые делеции в последовательностях, кодирующих внутриклеточный домен (описанные ниже и показанные на рис 15А), и проводили анализ на эффективность в отношении мобилизации кальция и цитолиза (как описано в настоящей заявке) В тех экспериментах, в которых удаляли амино-концевую часть внутри-клеточного домена, трансмембранный домен FcRy11 заменяли на трансмембранный домен неродственного CD7-3Hтигена, чтобы устранить возможное влияние взаимодействий, опосредованных трансмембранным доменом Из рис 15В и 15С видно, что удаление 14 Сконцевых остатков, включая тирозин 298, приводит к полной потере цитолитической способности и к значительному снижению уровня мобилизации кальция Добавочная делеция непосредственно от тирозина 282 (не включая тирозин 282) дала идентичный фенотип (рис 15В и 15С) Делеция от Nконца внутриклеточного домена до остатка 268 не оказала существенного влияния ни на профиль высвобождения кальция, ни на цитолитическую активность, тогда, какделеция до остатка 275 за CD4-, CD5- и СО16-гибриды FcRy11A обладают, в основном, одинаковой способностью стимулировать кальциевый ответ (рис 13, данные не показаны) Другие клеточные линии (от моноцитных и лимфоцитных линий дифференцировки) обладали способностью реагировать на сигнал, инициированный перекрестным связыванием внеклеточных доменов (данные показаны) Для оценки участия внутриклеточных доменов различных FcRy11 в цитолизе, цитотоксичные Т-лимфоциты (CTL) человека инфицировали ре 25 41870 метно ухудшила высвобождение кальция, но не оказала значительного влияния на цитолиз (рис 1 5 D H 15E) Дальнейшая делеция, до остатка 282, дала FcRy11 -хвосты, которые утратили либо способность к мобилизации кальция, либо к стимулированию цитолиза (рис 15D и 15Е) "Активный элемент", определенный благодаря этим приближенным оценкам, является относительно большим (36 аминокислот) и содержит два тирозина, разделенные 16 остатками Пример 10. Другие внутриклеточные и трансмембранные сигнал-трансдуцирующие домены настоящего изобретения могут быть получены из Т-клеточно-рецепторных белков СОЗ-дельта и ТЗ-гамма и В-клеточно-рецепторных белков mbl и В29 Аминокислотные последовательности этих белков показаны на рис 16 (СОЗ-дельта, SEQ 1D № 24), на рис 17 (ТЗ-гамма, SEQ 1D № 25), на рис 18 (mbl, SEQ 1D № 26) и на рис 19 (В29, SEQ 1D № 27) Части последовательностей, присутствие которых является достаточным для трансдукции цитолитического сигнала (а поэтому они были включены как предпочтительные в химерный рецептор настоящего изобретения), показаны в рамках Химерные рецепторы, которые содержат эти домены белка, конструировали и использовали в терапевтических методах настоящего изобретения, описанных выше Пример 11. Экспериментальные методы Инфицирование вирусом коровьей оспы и радиоиммунопреципитация Приблизительно 5 х 106 клеток CVI инфицировали в течение 1 часа в DME-среде, не содержащей сыворотки, рекомбинантным вирусом осповакцины при множественности инфекции (тої), составляющей, по крайней мере, 10 (титрование проводили на клетках CVI) Эти клетки, после инфицирования, помещали в свежую среду и метаболически метили 200 Зо CD16TH, с экспрессией в клетках, коинфицированных вирусами, кодирующими CD16 и '% или у -химерами После инфицирования и инкубирования в течение 6 часов или более, клетки выделяли из чашек с PBS, 1 мМ ЭДТК и оценивали экспрессию CD16TH или химер путем непрямой иммунофлуоресценции и проточной цитометрии Анализ на перенос кальция Клетки Jurkat сублинии Е6 (Weiss и др , J Immunol, 133 123-128 (1984)) инфицировали рекомбинатными вирусами коровьей оспы в течение 1 часа в бессывороточной IMDM-среде при множественности инфекции 10, и инкубировали в течение 3-9 часов в IMDM, 10% FBS Клетки собирали путем центрифугирования и ресуспендировали при 3 х 106 кл/мл в полной среде, содержащей 1 мМ lndc-1, ацетометоксиэфира (Gynkcewiez и др , J Biol Chem 260 33403450 (1985) (Molecular Probs) и инкубировали 45 минут при 37°С -1-нагруженные клетки осаждали и ресуспендировали при 1 х 106/мл в безсывороточной 1М М-среде и хранили в темноте при комнатной температуре Затем клетки анализировали на свободные ионы кальция путем одновременного измерения фиолетового и синего флуоресцентного излучения с помощью проточной цитометрии (Rabinovith и др , S Immunol , 137 952-961 (1986)) Для инициации переноса кальция, к клеточной суспензии либо добавляли фикоэритрин (РЕ)конъюгированного -ЗА (анти-С 4) ( ) при 1 мкг/мл с последующим добавлением 10 мкг/мл неконъюгированного козьего антимышиного 1gG при времени 0, либо к клеточной суспензии добавляли неконъюгированное моноклональное (анти-СО16) антитело 3G8 при 1 мкг/мл с последующим добавлением 10 мкг/мл РЕ-конъюгированного Fab'2-козьего антимышиного 1gG при времени 0 Гистограммы отношения фиолетового/синего излучения получали от РЕ-положительной (инфицированной) популяции клеток, которые обычно составляют 40-80% от всех клеток Ответ Тклеточного рецептора антигена в неинфицированных клетках стимулировался антителом ОКТЗ без перекрестного связывания Для экспериментов с использованием CD16химерных рецепторов, образцы, обнаруживающие смещение исходных данных в сторону более низкого значения внутриклеточного кальция (без антитела), исключали из анализа Затем данные гистограмм анализировали путем преобразования из двоичных данных в ASC11 с использованием программного обеспечения Write Hard Man (Cooper City, FL), с последующим анализом с использованием пакета программ FORTRAN Отношение "фиолетовое/синее излучение", полученное до добавления реагентов, содержащих второе антитело, использовали для установления нормализованного начального отношения, которое принимали заединицу, а пороговое отношение для покоящихся клеток устанавливали так, что 10% покоящейся популяции должно превышать порог Цитолитический анализ Линию чел Т-клеток WH3 (линия с ограниченным цитолизом CD8+ CD4 HLA B44) поддерживали в 1М М, 10% чел сыворотки с 10 ед /мл 1L-2, 35 мкКи/мл S-метионина + цистеина (Тгап S-метка, ICN, Costo Mesa, CA) в среде DMEM, но содержащей метионана и цистеина (Cibco, Grand Island, N Y), в течение 6 часов Меченные клетки выделяли с помощью PBS, содержащего 1 мМ ЭДТК, собирали путем центрифугирования, и подвергали лизису в 1% NP-40, 0,1% ДСН, 0,15 М NaCI, 0,05 М Трис, рН 8,0, 5мМ ЭДТК и 1 мМ PMSF Ядра удаляли путем центрифугирования, и С 4-белки подвергали иммунопреципитации с использованием антитела ОКТ4 и агарозы анти мышиных 1gG (Coppol, Durham, NC) Образцы подвергали электрофорезу на 8% полиакриламидном/ДСН геле в невосстановительных условиях (NR) и в восстановительных условиях (R) Гели, содержащие 353-меченные образцы, насыщали En Hance (New England Nuclear, Boston, MA), после чего проводили авторадиографию Экспрессию трансмембранной формы CD16, CD16TH, оценивали путем сравнения ее экспрессии в клетках CVI, отдельно инфицированных 26 41870 и периодически стимулировали либо неспецифически с использованием облученных (3000 рад) HLA-несингенных лимфоцитов периферической крови и 1 мкг/мл фитогемаггютинина, либо специфические с использованием необлученных В44несущих одноядерных клеток Через один день после неспецифической стимуляции, РНА разводили до 0,5 мкг/мл путем добавления свежей среды, а через три дня эту среду меняли Клетки культивировали, по крайней мере, 10 дней, а затем перед проведением анализа на цитотоксичность, клетки стимулировали Клетки инфицировали рекомбинатным вирусом коровьей оспы при множественности заражения, составляющей, по крайней мере, 10, в течение 1 часа в безсывороточной среде, с последующей инкубацией в течение 3 часов в полной среде Клетки собирали путем центрифугирования, и ресуспендировали при плотности 1 х 107 кл/мл Затем к каждой лунке планшета для микротитрования с U-образным дном, содержащей 100 мкл/лунка, добавляли 100 мкл Клетки разводили путем постадийного двухкратного серийного разведения Две лунки для каждого образца не содержали лимфоцитов для создания условий спонтанного высвобождения хрома, и для полной оценки поглощения хрома Клетки-мишени (от сублинии S3 HeLa) инфицировали в 6,0 или 10,0-см планшетах приблизительно при множественности инфекции 10 в течение 1 часа в безсывороточной среде, с последующей инкубацией в полной среде в течение 3 часов Затем клетки выделяли из чашек с PBS, 1 мМ ЭДТК, и подсчитывали Аликвоту 106 клетокмишеней (HeLa, Raji или RJ2 2 5-клетки для экспериментов с СО4-химерным рецептором, и клетки 10-2 3G8, Shen и др , Мої Immunol , 26 959 (1989) для экспериментов с CD16-XHмерным рецептором) центрифугировали и ресуспендировали в 50 мкл стерильного 51Сг-натрийхромата (1 мКи/мл, Dupont Wilmigoton, DE) в течение 1 часа при 37°С, периодически размешивая, а затем три раза промывали PBS Затем к каждой лунке добавляли 100 мкл меченных клеток, ресуспендированных в среде при 105 кл /мл Клетки-мишени Raji и RJ2 2 5 были мечены так же, как и клетки HeLa Планшет для микротитрования центрифугировали при 750 х г в течение 1 минуты, и инкубировали при 37°С в течение 4 часов По истечении инкубационного периода, н клетки в каждой лунке ресуспендировали посредством мягкого пипетирования, брали пробу для определения полного числа отсчетов, а планшет для микротитрования центрифугировали при 750 х г в течение 1 минуты 100 мкл-аликвоту супернатанта удаляли и подсчитывали на сцинтиляционном гамма-счетчике > 70% для экспериментов с СО16-химерным рецептором) m vitro-мутагенез последовательности Для создания точечных мутаций в аминокислотных остатках 11 и/или 15 последовательности 4, получали синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от ВатН1-сайта выше трансмембранного домена 4 г Д е нативный ос> таток ^ в положении 11 (Sys) заменяли на Cly (C11G) или остаток 15 (Asp) заменяли на Gly (D15G), либо заменяли и той и другой, и использовали в РСР-реакциях для генерирования мутированных фрагментов, которые затем снова вводили в конструкцию CD4 '% дикого типа Для создания делеций в £, кДНК-последовательности % амплифицировали посредством PCR с использованием олигонуклеотидных праймеров, сконструированных с созданием стоп-кодона (UAG) после остатков 50, 59 или 65 Эти праймеры содержали рестрикционный сайт для фермента Not1, отстоящий на 5 или 6 остатков от 5'-конца, обычно в последовательности вида CGC CGG CCG CCG СТА (SEQ 1D № 11), где последние три остатка соответствуют стоп-антикодону За последовательностями Not1 и стоп-антикодона следуют 18 остатков, комплементарных нужному З'-концу фрагмента А затем конструировали химеры CD16 % Y61*, CD16 % Е60* и CD16 4 D66*, соответственно ВатН1-сайт выше трансмембранного домена и Noti-сайт использовали для генерирования фрагментов, которые затем снова вводили в конструкцию CD16 ^ дикого типа Мономерные химеры конструировали путем выделения трансмембранной и ближайшей к мембране внутриклеточной последовательностей 4 путем ВатН1- и Sacl-переваривания Asp и Cys CD4 -конструкции, описанной выше, и введения фрагмента в CD16 % Е60*- и CD16 % 66*-конструкцию, соответственно Конструирование трехчленных химер CD16 7 (48-65) и CD16 7 (48-59) Для получения конструкции CD16 4 D66*, кДНК-последовательность, соответствующую трансмембранному домену 4. и последующие 17 остатков цитоплазм этического домена заменяли соответствующим трансмембранным и цитоплазматическим доменом, полученным от кДНК CD5 и CD7 CD5- и СО7-фрагменты генерировали с помощью PCR-реакции с использованием передних олигонуклеотидов, содержащих ВатН1-сайт рестрикции, и соответствующих области, расположенной непосредственно выше трансмембранного домена CD5 и CD7, соответственно, и последующих задних олигонуклеотидов, перекрывающих CD5- и СО7-последовательности, соответственно и последовательность 4 которая содержала Sad-сайт > рестрикции CD5 % CGC GGG СТС GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ 1D № 12), CD7 CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT АТС CCG (SEQ 1D№13) CD5 и CD7-PCR-npoflyKTbi переваривали BamH1 и S a d и лигировали с BamH1 и Sad-переваренной CD16 ^ Е60*-конструкцией, а ^-после В процент цитолиза вносили поправку на фракцию инфицированных клеток-мишеней (обычно 50-90%), измеренных путем проточной цитометрии Для инфицированных эфекторных клеток отношение "эффектор мишень" корректировали на процент инфицированных клеток (обычно 20-50% для экспериментов с СО4-химерным рецептором и 27 41870 дователыность из BamH1-Sac1 заменяли на CD7фрагмент Для конструирования CD16CD5 и CD16CD7, получали CD5- и CD7-фрагменты с помощью PCR с использованием олигонуклеотида, содержащего Noti-сайт рестрикции и кодирующий стоп-кодон (UAA) после остатков G1n 416 и Ala 193 CD5 и CD7, соответственно CD5- и СО7-РСР-фрагменты переваривали ВатН1 и Not1 вставляли в CD16 '% Asp 66*-конструкцию m vitro-мутагенез N-концевых остатков внутри элемента 4. трансдуцирующего цитолитический сигнал Синтезировали синтетические олигонуклеотидные праймеры, расположенные от Sad-сайта внутри ^-элемента, и в которых нативный остаток Asn 48 был превращен в Ser (N48S), остаток Leu 50 был превращен в Ser (L50S), а остаток Туг 51 был превращен в Phe (Y51F), и эти олигонуклеотиды использовали в PCR-реакции для построения фрагментов, которые затем были вновь введены в конструкцию CD16 7 % (48-65) дикого типа In vitro-мутагенез С-концевых остатков внутри элемента % трансдуцирующего цитолитический сигнал Синтезировали олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от З'-концевого Noti-сайта до стоп-кодона, и в котором нативный остаток Glu 60 был заменен на G1n (E60Q), остаток Glu 61 был заменен на G1n (E61Q), остаток Туг 62 был заменен на Phe или Ser (Y62F или Y62S), а остаток Asp 63 был заменен на Asp (D53N), после чего эти олигонуклеотиды были использованы в PCRреакции для генерирования фрагментов, которые затем субклонировали в CD16 % О66*-конструкцию дикого типа от BamHI-сайта до Not1-сайта Конструирование химер CD16 7 % (33-65), CD16 7 І; (71-104), CD16 7 І; (104-137) СО7-трансмембранный фрагмент, содержащий М1и1 и Not1-сайты в месте сшивки между трансмембранными и внутримембранными доменами, получали с помощью PCR, используя олигонуклеотид со следующей последовательностью способом, что и конструкции с полной длиной, но с заменой последовательностей, кодирующих тирозин в положениях 282 и 298 на стоп-кодоны (ТАА) N-концевые делеции генерировали путем амплификации фрагментов, кодирующих последовательно меньший внутриклеточный домен, посредством PCR и с использованием олигонуклеотидов, а затем полученные фрагменты вставляли между М1и1 и Not1-сайтами рестрикции в предварительно сконструированную экспрессирующую плазми ду кодирующую внеклеточный домен CD16, сцепленный с трансмембранным доменом CD7, причем последний заканчивался в М1и1-сайте в месте стыка между трансмембранным и внутриклеточным доменом Другие варианты осуществления настоящего изобретения Описанные выше примеры показали, что агрегации 4. Л и л и у-химер достаточно для инициации цитолитического эффекторного клеточного ответа в Т-клетках Экспрессия 4. Л и У в Р я Д е клеток, включая Т-лимфоциты, натуральные клетки-киллеры, безофильные гранулоциты, макрофаги и тучные клетки, дает основание предположить, что консервативные элементы последовательностей могут взаимодействовать с сенсорным аппаратом, который является общим у клеток гем ато поэтического происхождения, и что важный фактор защиты хозяина в иммунной системе может быть опосредован агрегацией рецепторов Способность к цитолитическому ответу и отсутствие ответа на клетки-мишени, несущие рецепторы ГКГ класса II, свидетельствуют о том, что химеры, полученные на основе £, т| или у образуют базис для осуществления генетических построений в целях борьбы против СПИДа посредством адаптивной терапии Широкий спектр распределения эндогенных ^ и у и тот факт, что Fc-peцепторы, ассоциированные с у, опосредуют цитотоксичность в различных типах клеток (Fanger и др , Immunol , Today, 10 92-99 (1989)) дают основание для конструирования в этих целях ряда клеток Полученный РСР-фрагмент переваривали ВатН1 и Not1, и снова вставляли в CD16 7 % (4865)-конструкцию ^-фрагменты, кодирующие остатки 33-65, 71-104 и 104-137, были получены с помощью PCR-реакции с использованием пар праймеров, содержащих М1 и1 -сайты и 5'-конца передних праймеров и стоп-кодоны, расположенные за Not1-сайтами у 5'-конца задних праймеров В каждом случае, сайты рестрикции отстояли на 6 остатков от 5'-конца праймера для гарантии рестрикции ферментами % 33 CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT ССТ CGC CAG САС АСА (SEQ1 11 № 15), % 71 CGC CGG ACG CGT CAG ССТ GAG ATG GGGGGAAAG (SEQ1D№16), и і; 104 CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA CGC GAG CGC (SEQ № 17) Конструирование делеционных мутантов FcRy11A Делеционные мутанты в С-конце FcR11A были получены с помощью PCR-реакции тем же Например, нейтрофильные гранулоциты, которые имеют очень короткий период полужизни (4 час) в кровотоке и обладают высокой степенью цитолитичности, являются привлекательными объектами для использования их в качестве клетокмишеней для экспрессии химер Инфицирование нейтрофилов вирусом ВИЧ, очевидно, не приводит к высвобождению вируса, а обилие этих клеток (наиболее широко распространенных из лейкоцитов) должно способствовать иммунной защите хозяина Другими привлекательными объектами для ретровирусной инженерии являются популяции зрелых Т-клеток благодаря их доступности (Rosenberg S А , Sci Am , 262 62-69 (1990)) С помощью рекомбинанта IL-2, Т-клеточные популяции могут быть увеличены с относительной легкостью при культивировании, и эти популяции имеют ограниченный период полужизни для повторного внедрения (Rosenberg и др, J Engl J Мео, 323 570-578(1990)) В соответствующих условиях, распознавание ВИЧ клетками, экспрессирующими СО4-химе CGC GGG GCG CCC ACG CGT ССТ CGC CAG САС АСА (SEQ 1D № 14) 28 41870 ры, также обеспечивает митогенное стимулирование, что допускает возможность того, что "вооруженная" клеточная популяция будет динамически реагировать на вирусную нагрузку Хотя в данном описании рассматривалось лишь поведение гибридных белков в цитотоксических Т-лимфоцитах, однако экспрессия химер в хелперных лимфоцитах может дать ВИЧ-мобилизованный источник цитокинов, которые будут противодействовать коллапсу субпопуляции хелперных клеток при СПИДе Недавно появившиеся описания нескольких схем для обеспечения резистентное™ к инфекции не на стадиях пенетрации вируса (Friedman и др , Nature, 335 452-454 (1988), Green и д р , Cell 58 215-223 (1989), Mahm и др , Cell, 58 205-214 (1988), Trono и д р , Cell 59 113-120 (1989), Buonocore и др , Nature, 345 625-628 (1990)) позволяют предположить, что клетки, несущие CD4-XHмеры, могут быть использованы для предотвращения продуцирования вируса путем экспрессии соответствующих агентов, имеющих внутриклеточный активный участок Способность автономных химер опосредовать передачу сигналов Т-лимфоцитам также дает возможность регулировать in vivo лимфоциты, полученные с помощью ретровирусной инженерии Стимулирование перекрестного связывания, опосредованное, например, специфическими 1дМ-антителами, сконструированными с удалением комплемент-связы вающихся доменов, может способствовать in situ увеличению числа таких лимфоцитов, хотя обработка аналогичными специфическими антителами 1gG (например, распознающими аминокислотную вариацию, сконструированную в химерной цепи) может привести к селективному истощению сконструированной популяции Кроме того, анти-СО4 1дМ-антитела не требуют дополнительного перекрестного связывания для мобилизации кальция в клетках Jurkat, экспрессирующих CD4 ^-химеры (данные не показаны) увеличить диапазон и эффективность использования генетически сконструированных Т-клеток Конструирование других химер, состоящих из внутриклеточных последовательностей 4. Л или у, кДНК или геномных последовательностей, кодирующих внеклеточный домен рецептора, может быть осуществлено с помощью введения сайта рестракции в место, непосредственно предшествующее выбранному трансмембранному домену Фрагмент внеклеточного домена, завершающийся рестрикционным сайтом, может быть затем и л и присоединен к последовательностям 4. Л У Типичные внеклеточные домены могут происходить из рецепторов, которые распознают комплемент, карбогидраты, вирусные белки, бактерии, протозойный и метазойный паразитов, или продуцируемые ими белки Аналогично, лиганды или рецепторы, экспрессированные патогенами или опухолевыми клетками, могут быть присоединены к 4. Л. и л и у -последовательностям для адресации иммунных ответов против клеток, несущих рецепторы, узнающие эти лиганды Несмотря на проиллюстрированные и описанные выше конкретные варианты осуществления изобретения, подразумевается, что настоящее изобретение не ограничивается изложенными вариантами или отдельными их деталями и что возможно внесение в него отдельных отклонений или модификаций, не выходящих, однако, за пределы существа и объема изобретения, изложенных в нижеследующей формуле изобретения (2) Данные последовательности SeQ 1D № 1 (I) Характеристики последовательности (A) Длина 1728 п о (B) Тип нуклеиновая кислота (C) Цепочечность двухцепочечная (D) Топология линейная (м) Тип молекулы ДНК (геномная) (xi) Описание последовательности Seg 1D № 1 Возможность регулировать клеточные популяции не прибегая к многократной экстракорпорально амплификации позволяет значительно АТОЛАССОСЮ QAQTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGOTOC TOCAACTGGC 50 GOCAAAAAAQ 100 GOAACTQACC TOTACAOCTT CCCAGAAQAA OAGCATACAA 150 TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAOAXAAAQ АТТСТвООАА A2CAGGGCTC 200 CTTCTIAACT AAACHJTCCAT CCAAGCXGAA TGATCQCQCT OACTCAAOAA 250 GAAOCCTTTQ OGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300 ATAOAAOACT САОАТАСГГА CATCTGTGAA GTGGAGGACC Л0ААОСА0ОА 350 OOTOCAATTO СТАОТОТТСа OATTOACTGC СААСХСТаАС ACCCACCTGC 400 TTCAGGOGC* OAGCCTGACC CTGACCTTGG AOAGCCCCCC TOGXAGTAOC 450 CCCTCAOTGC AATQTAGGAQ ICCAAGGGGT AAAAACATAC AOGGOOGOAA 500 ОСХССХСССЛ OCAGCCACTC AQGGAAACAA AGTGGTGCXG ооалтлелат 29 41870 OACCCTCTCC QTOTCTCAQC TOGAGCTCCA GGATAOTGGC ACCTGGACAT 550 OCACTQTCTT OCAQAACCAO AAOAAGGTGO AOTTCAAAAT AOACAXCGTG 600 GTOCTAOCTT TCCAOAAQGC CTCCAOCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 6S0 ACAOGTOGAO TXCTCCTTCC CACTCOCCTT TACAQTTQAA AAGCTGACGG 700 GCAGXGGCGA GCXGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGOAA GTGTCTQTAA AACGOQTTAC 800 CCAOGACCCT AAOCTCCAGA TGGGCAAOAA OCTCCCOCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAOOC CTTGCCTCAO TAXGCTGOCT CTGGAAACCT CACCCTGOCC 900 CTTGAAOGGA AAACAOOAAA OTTOCATCAG GAAGTaAACC TGGTGGTGAT 950 GAGAGCCACX CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTO XGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTXGAAAC GGAGGCAAAG 1050 GTCTCOAAOC GGGAGAAGCC GGTOTGGGTG CTGAApCCTG AGGCGGGGAT 1100 GTGGCAGTGX CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCOGA TCCCAAACTC 1200 TGCTACTTGC TAGAXGGAAT TCATCACAGC 1250 CCTGTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAGAGACT OCTGCCAACC 1300 TGCAOGACCC CAACCAGCTC TACAATGAGC TCAATCTAGO GCGAAGAGAG 1350 TCTTGQAOAA GAAGCGGGC7 CGGGAXCCAG AGATGGGAGG 1400 QAAXATGACQ TGGAGAACAA CCTCTTCATC TACGGAGTCA CAAACAOCAO AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGXATAC AATGCACTOC 1450 AOAAAGACAA OATOCCAGAA GCCTACAGTG AGAICGGCAC AAAAGGCGAO 1500 AGGGGGAGAO GCAAGGGGCA CGAXGGCCTT TACCAGGACA GCCACTTCCA 1550 AGCAGTGCAG TTCGOGAACA GAAGAGAGAG AGAAGGTTCA GAACTCACAA 1600 OQACCCTTOG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT 1650 AGCCAATCCX OTGCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTOX GGAGTCCATO 1700 OCCACCGAGT AOCAGCTCCC AGCTCTAA 172B (2) Данные последовательности SEQ 1D №2 (1) Хараісгеристики последовательности (A) Длина 1389 пар оснований (B) Тип нуклеиновокислотная (C) Цепочечность двухцепочечная (D) Топология линейная (11) Тип молекулы ДНК (геномная) (Х1) Описание последовательности SEQ 1D №2 30