Спосіб культивування одноклітинної зеленої мікроводорості dunaliella salina для отримання біомаси

Реферат: Заявлений спосіб культивування одноклітинної зеленої мікроводорості Dunaliella salina для отримання біомаси, у якому використовують квазібезперервний режим культивування. Культуру, вирощену на модифікованому поживному середовищі Тренкеншу методом -1 накопичувальних культур до щільності 1,5-3 г ОР·л , переводять у квазібезперевний режим культивування. Подальше вирощування здійснюють при питомій швидкості протоку -1 середовища близько 0,3 доби , при цілодобовому освітленні з поверхневою освітленістю 80 -2 -1 -1 Вт·м , безперервній продувці газоповітряною сумішшю зі швидкістю 1 л суміші·хв ·л культури, яка містить 3 % СО2, і температурі 26-28 °С, на модифікованому поживному середовищі Тренкеншу. UA 102272 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології мікроводоростей і може бути використаний при промисловому одержанні біомаси мікроводорості Dunaliella salina. Зелена одноклітинна водорість Dunaliella salina - об'єкт масового промислового культивування для отримання вітамінів, ліпідів, спиртів (зокрема, етанолу) та антибіотиків. Біомаса активно зростаючої мікроводорості D. salina, за даними багатьох авторів, має збалансований біохімічний склад (вміст білка до 60 %, вуглеводів - 8,40-12,70 %, ліпідів - 7,7010,80 %). Вміст цінного пігменту хлорофілу а може досягати понад 5 % на абсолютно суху масу. Крім того, біомаса зеленої мікроводорості D. salina є джерелом біоактивних речовин, які мають антиоксидантні властивості, таких як ліпіди (поліненасичені жирні кислоти), каротиноїди (каротин, лютеїн, зеаксантин та ін), вітаміни (токоферол) і ін. На відміну від інших водоростей, клітини D. salina позбавлені целюлозної або пектинової оболонки і оточені лише тонкою еластичною протоплазматичною мембраною (плазмалемою), що істотно полегшує засвоєння біомаси водорості. Завдяки цим цінним якостям біомаса D. salina широко застосовується у світовій практиці як кормова добавка. Промислові технології, які використовують в цей час, орієнтовані на отримання біомаси D. salina, збагаченої -каротином за умов використання збіднених середовищ, тому ще саме в таких умовах відбувається накопичення вторинних каротиноїдів. Склад поживного середовища Тренкеншу дозволяє отримувати щільну культуру Дуналіелла, яка характеризується високими продукційними характеристиками. На практиці застосовуються такі методи культивування D. salina: накопичувальний, безперервний, непропорційно-проточний, квазібезперервний. Проте найчастіше для вирощування D. salina використовують накопичувальний режим культивування, який є найбільш розробленим і вивченим. Можливості квазібезперервної культури (особливо щільної) реалізовані слабо. Відомо спосіб квазібезперервного культивування D. salina, при якому вирощування мікроводорості відбувається у відкритих резервуарах, [див. Garcia-Gonzalez M., Moreno J., Canavate J. P., Anguis V., Prieto A., Manzano C, Florencio F. G., Guerrero M.G. Conditions for openair outdoor culture of Dunaliella salina in southern Spain // J Appl. Phycol.-2003.-15. - P. 177-184]. Культивування здійснюють при природній освітленості і температурі. У способі водорість вирощують методом квазібезперервної культури на живильному середовищі з вмістом NaNO3 5 мМ і 2 М NaCl при природному освітленні, додаванні свіжого середовища кожні 2 доби до 6 -1 початкової щільності культури 0,7-0,910 клмл . Водорості вирощують в овальних пластикових 2 басейнах з площею поверхні 3 м і глибиною 0,3 м при природному рівні освітленості і температурі. При такому режимі культивування середня продуктивність складає 1,65 г сухої речовини (СР), а -каротину - 0,1 г з 1 м на добу. Зазначена робота має принципове значення, тому що підтверджує можливість отримання біомаси D. salina при вирощуванні в квазібезперервному режимі. Однак запропонований режим культивування має деякі обмеження для використання в промислових масштабах. Найбільш важливими з них є: а) складність в регулюванні ступеня розбавлення до первісної щільності культури; б) більш низька продуктивність з одиниці об'єму в порівнянні із запропонованим способом. В основу винаходу Спосіб культивування зеленої мікроводорості Dunaliella salina поставлено задачу підвищення ефективності способу шляхом зростання продуктивності культури при використанні концентрованого поживного середовища і квазібезперервного режиму вирощування. Спосіб культивування зеленої мікроводорості Dunaliella salina для отримання біомаси засновано на використанні квазібезперервного режиму, а підбір умов культивування, що сприяють накопиченню в клітинах пігментів і білка, виконали автори в лабораторних експериментах. Поставлена задача вирішується тим, що культуру, вирощену на модифікованому поживному середовищі Тренкеншу (Тренкеншу Р. П., Белянин В. Н. Влияние элементов минерального питания на продуктивность водоросли Platymonas viridis Rouch. // Биология моря.-1979. - № 51. -1 - С. 41-46.) методом накопичувальних культур до щільності 1,5-3 г OВ - л (грам органічної речовини на 1 літр), переводять на квазібезперевний режим культивування. Квазібезперервну культуру отримують шляхом періодичної (з інтервалом у 24 години) заміни частини суспензії мікроводорості рівноцінним об'ємом свіжоприготованого поживного середовища. Кожні 24 -1 години з культиваторів відбирають 12, 14, 32 і 42 % обсягу культури ( = 0,12-0,42 доба ) і замінюють його рівноцінним об'ємом свіжого поживного середовища. Вирощування D. salina -1 здійснюють з питомою швидкістю протоки поживного середовища близько 0,1-0,4 доба ; при цілодобовому освітленні люмінесцентними лампами денного світла, які забезпечують 1 UA 102272 C2 -2 5 10 15 поверхневу освітленість 80 Вт-м ; безперервної продувці газоповітряною сумішшю: на 1 літр -1 -1 культури мікроводорості - 1 літр газоповітряної суміші в 1 хвилину (1 лхв л культури), що містить 3 % СО2 (за об'ємом) і температурі 26-28 °C. Спільним для прототипу і способу, що заявляється, є застосування квазібезперервного режиму культивування. Основна відмінність від прототипу полягає в тому, що у заявленому способі при культивуванні використовують метод квазібезперевної культури зі швидкістю -1 протоки близько 0,3 доби . Винахід пояснюється кресленнями Фіг. 1 - Динаміка щільності накопичувальної і квазібезперевної культури Dunaliella salina при різній швидкості протоки поживного середовища (пунктирна лінія - границя між накопичувальним і квазібезперервним культивуванням). Фіг. 2 Залежність відносного вмісту пігментів в клітинах Dunaliella salina від питомої швидкості протоки поживного середовища в квазібезперевній культурі. Фіг. 3 - Залежність відносного вмісту білка в клітинах Dunaliella salina від питомої швидкості протоки поживного середовища в квазібезперевній культурі. Спосіб культивування одноклітинної зеленої водорості Dunaliella salina реалізується наступним чином: Для культивування може бути використаний будь-який штам Dunaliella salina, наприклад IBSS-1, IBSS-2, IBSS-3. їх колекційне зберігання здійснюють на поживному середовищі BenAmotz, і температурі 15-18 °C з пересівом кожні 1,5-2 місяці. 20 Таблиця 1 Склад модифікованого поживного середовища Тренкеншу для квазібезперервного культивування Dunaliella salina -1 Компонент Морська сіль NaNO3 NaH2PO4 × 2H2O Na2EDTA FeC6H5O7 × 7H2O MnCl2 × 4H2O CoCl2 × 6H2O (NH4)6Mo7O24 × 4H2O K2Cr2(SO4)4 × 24H2O 25 30 35 40 Маса, гл 120 2,139 0,30 0,037 0,042 0,0040 0,0031 0,0009 0,0017 Отримання інокуляту. Для отримання інокуляту культуру водорості з музею 5-7 днів вирощують методом накопичувальної культури на модифікованому середовищі Тренкеншу, яке -2 розводять водою 1:1, при освітленні 24 Втм . Потім культуру переносять у нерозведене модифіковане середовище Тренкеншу і продовжують культивувати при штучному освітленні -2 люмінесцентними лампами денного світла 80 Втм в накопичувальному режимі при -1 -1 безперервному барботажі газоповітряною сумішшю (1 лхв л культури), що містить 3 % СО2 (за об'ємом). Для засіву культиваторів використовують культуру, яка активно ділиться, взяту на лінійній стадії зростання, коли її продуктивність максимальна. Суспензію клітин вносять у культиватори з такого розрахунку, щоб початкова щільність культур становила не менше 0,1-0,2 -1 гл сухої речовини. Процес культивування. Живильним середовищем для пропонованого способу культивування служить модифіковане середовище Тренкеншу. Модифікація полягає у збільшенні солоності середовища за рахунок додавання хлориду натрію або морської солі до концентрації 120 г/л. Вирощування водорості здійснюють при поверхневій освітленості -2 -1 -1 культиваторів близько 80 Втм , швидкості продування газоповітряною сумішшю 1 лхв л культури, яка містить 3 % СО2 і температурі поживного середовища 26-28 °C. Спочатку D. salina культивують в накопичувальному режимі на модифікованому середовищі Тренкеншу до -1 щільності культури 1,5-3 г ОРл . Далі культуру переводять на квазібезперервний режим, тобто з інтервалом в 24 години з культиваторів відбирають 10-40 % обсягу культури, замінюючи його рівноцінним об'ємом свіжого середовища. Для встановлення умов культивування, що сприяють накопиченню в клітинах пігментів і білка, автори проводили культивування D. salina в чотирьох варіантах квазібезперервного режиму у 6-літрових культиваторах на модифікованому поживному середовищі Тренкеншу при 2 UA 102272 C2 -2 5 цілодобовій поверхневій освітленості 80 Втм , швидкості продування газоповітряною сумішшю -1 -1 зі швидкістю 1 л сумішіхв л культури, яка містить 3 % СО2 і температурі 26-28 °C. Об'єм -1 культури в культиваторах становив 5 л, початкова щільність культури - 0,12 г ОРл . Кожні 24 -1 години з культиваторів відбирали 12, 14, 32 і 42 % об'єму культури ( = 0,12-0,42 доби ) і замінювали його рівноцінним об'ємом свіжого середовища. При квазібезперервному режимі відбувається систематичне внесення біогенів в культуру, і зі збільшенням питомої швидкості протоку кількість азоту і фосфору, внесеного в культуру, пропорційно збільшується. При цьому щільність культури змінюється і досягає стаціонарної динамічної рівноваги (Фіг. 1, табл. 2). 10 Таблиця 2 Відносний вміст фотосинтетичних пігментів і білка в клітинах квазібезперервної культури Dunaliella salina при різних питомих швидкостях протоку поживного середовища. Питома швидкість -1 протоку, доба 0,12 0,14 0,32 0,42 15 Щільність культури, -1 г ОРл 2,96±0,15 2,39±0,15 1,42±0,11 1,14±0,11 ХЛ а, %ОР ХЛ b, % ОР Каротиноїди, % ОР Білок, % ОР 2,89±0,23 3,25±0,41 2,77±0,15 2,34±0,24 0,62±0,060 0,74±0,182 0,60±0,065 0,52±0,060 0,95±0,100 1,08±0,193 0,92±0,069 0,79±0,141 44,3±2,85 54,6±3,93 55,9±5,78 54,7±5,57 Крім того, спостерігається зміна і стабілізація відносного вмісту фотосинтетичних пігментів і білка у зв'язку зі зміненими умовами по мінеральному забезпеченню і освітленості (на фоні зміни щільності культури) (Фіг. 2, Фіг. 3, табл. 2). Загальний вихід біомаси D. salina при квазібезперервному культивуванні складається з щоденних 10-40 % відборів біомаси і біомаси, яка збирається з культиваторів після завершення технологічного циклу. Дані, що характеризують продуктивність культури D. salina по біомасі, пігментам та білка при квазібезперервному режимі культивування представлені в табл. 3. Таблиця 3. Продуктивність культури Dunaliella salina по біомасі, пігментах і білку при квазібезперервному режимі культивування. Продуктивність Питома швидкість біомаса, г ОРл- хл а, мгл- хл b, мгл-1доба- каротиноїди, -1 1 -1 1 -1 -1 1 -1 протоку, доба ·доба мгл доба доба 0,12 0,35±0,011 9,61±0,690 2,20±0,205 3,17±0,235 0,14 0,33±0,009 10,82±0,691 2,48±0,217 3,43±0,372 0,32 0,46±0,024 12,42±0,626 2,72±0,218 4,15±0,379 0,42 0,48±0,036 11,22±1,022 2,39±0,245 3,96±0,295 білок, мгл 1 -1 доба 157,9±10,11 181,8±13,09 252,7±23,46 263,5±24,42 20 25 30 35 Щоденне внесення нітратів і фосфатів забезпечує підтримку клітин в культурі у вегетативному стані. У запропонованому способі культивування величина швидкості протоку -1 знаходиться в діапазоні 0,1-0,4 доби , але за результатами проведених експериментів найбільша продуктивність по пігментах та білку зареєстрована при питомій швидкості протоку -1 поживного середовища близько 0,3 доби (щоденний 30 % обмін середовища). У цьому випадку -1 -1 продуктивність культури D. salina по біомасі складає 0,45 г ОРл -доба , по хлорофілу а -12, -1 -1 каротиноїдах - 4, а білку - 250 мгл -доба . Приклад. Для культивування використовували штам IBSS-2, який характеризується більш високим вмістом каротиноїдів у клітинах, у порівнянні зі штамами IBSS-1 і IBSS-3. Для отримання інокуляту штам протягом 7 діб вирощували методом накопичувальної культури в культиваторах плоскопаралельного типу об'ємом 6 л з робочою товщиною шару 5 см -2 при поверхневому освітленні 80 Втм на модифікованому поживному середовищі Тренкеншу. Отриману культуру використовували як інокулят. Культуру переносили в аналогічні культиватори зі свіжим модифікованим поживним середовищем Тренкеншу і продовжували 3 UA 102272 C2 5 10 15 вирощувати протягом 10 діб при тих же умовах, при безперервному барботажі газоповітряної -1 -1 сумішшю зі швидкістю 1 л сумішіхв л культури, що містить 3 % СО2 і температурі 26-28 °C до -1 -1 щільності культури 1,5-3 г OPл -доба . Далі культивування D. salina проводили в квазібезперервному режимі в 6-літрових культиваторах на модифікованому поживному середовищі Тренкеншу при цілодобовій -2 поверхневій освітленості 80 Втм , швидкості продування газоповітряної сумішшю 1 л сумішіхв 1 -1 л культури, яка містить 3 % СО2 і температурі 26-28 °C. Об'єм культури в культиваторах -1 становив 5 л, початкова щільність культури - близько 0,12 г ОРл . Кожні 24 години з -1 культиваторів відбирали близько 30 % обсягу культури ( = 0,30 доба ) і замінювали його рівноцінним об'ємом свіжого поживного середовища. Отримана біомаса становила близько 0,5 г OP з 1 л культури в добу з відносним вмістом каротиноїдів у біомасі не менше 0,9 % ОР, хлорофілу а - 2,8 % ОР і білку - 55 % ОР. У запропонованому способі продуктивність по біомасі в 25 разів вище, ніж у відомому. Спосіб ефективний і може бути покладений в основу промислового культивування одноклітинної зеленої водорості Dunaliella salina та отримання сировини для виробництва БАД з підвищеною біодоступністю каротиноїдів і хлорофілів як біологічно активних сполук. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 Спосіб культивування одноклітинної зеленої мікроводорості Dunaliella salina для отримання біомаси, у якому використовують квазібезперервний режим культивування, який відрізняється тим, що культуру, вирощену на модифікованому поживному середовищі Тренкеншу методом -1 накопичувальних культур до щільності 1,5-3 г ОР·л , переводять у квазібезперевний режим культивування та здійснюють подальше вирощування при питомій швидкості протоку -1 середовища близько 0,3 добу , при цілодобовому освітленні з поверхневою освітленістю 80 -2 -1 -1 Вт·м , безперервній продувці газоповітряною сумішшю зі швидкістю 1 л суміші·хв ·л культури, яка містить 3 % СО2, і температурі 26-28 °С, на модифікованому поживному середовищі -1 Тренкеншу, яке має склад, г·л : морська сіль 120 NaNO3 2,139 NaH2PO4×2H2O 0,30 Na2EDTA 0,037 FeC6H5O7×7H2O 0,042 MnCl2×4H2O 0,0040 CoCl2×6H2O 0,0031 (NН4)6Мо7О24×4Н2О 0,0009 K2Cr2(SO4)4×24Н2О 0,0017. 4 UA 102272 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5