Спосіб кількісного визначення гемоглобіну

Реферат: Винахід належить до аналітичної хімії, зокрема до люмінесцентного визначення біологічноактивної речовини - гемоглобіну, що включає розчин проби та вимірювання її інтенсивності люмінесценції при еміс =545 нм, при цьому як люмінесцентний зонд використовують розчин комплексної сполуки тербію(III) з 1-етил-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової UA 102332 C2 (12) UA 102332 C2 кислоти (4-метил-піридин-2-іл)-амідом при рН 8.0, опромінювання проводять УФ-світлом при збудж=317нм. UA 102332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до аналітичної хімії, а саме до люмінесцентного визначення біоактивної речовини гемоглобіну (Гем). Гемоглобін - складний залізовмісний білок еритроцитів тварин і людини, здатний оборотно зв'язуватися з киснем, забезпечуючи його перенесення до тканин. Головна функція гемоглобіну полягає в транспорті дихальних газів. При опромінюванні світлом гемоглобін проявляє власну люмінесценцію. У зв'язку з низькою ефективністю збудження інтенсивність такої люмінесценції незначна, що не дозволяє використовувати її для високочутливого визначення Гем. Тому для флуоресцентного аналізу актуальна задача підвищення чутливості визначення гемоглобіну завдяки застосуванню люмінесцентних зондів, емісія котрих значно змінюється в присутності гемоглобіну (збільшується або гаситься). Лантанідні комплекси широко вживають для визначення біоактивних речовин (білків, ферментів, нуклеїнових кислот, лікарських препаратів та ін.). Основними вимогами до комплексних сполук лантанідів для їх вживання як зондів в біоаналізі є: високий квантовий вихід, висока кінетична стабільність, добра розчинність у воді при оптимальних фізіологічних значеннях рН. Відомий спосіб визначення гемоглобіну, який полягає у реакції гідразиду родаміну В з гемоглобіном у міцелярному середовищі, що призводить до появи родаміну В та збільшенню інтенсивності люмінесценції (Ілюм) [див. Xiao-Feng Yang, Xiang-Qun Guo, Hua Li. Fluorimetric determination of hemoglobin using spiro form rhodamine В hydrazide in a micellar medium // Talanta.2003. - V. 61. - P. 439-445.]. Спосіб передбачає додавання компонентів у наступній -5 послідовності: 1.5 мл розчину гідразиду родаміну В (1.0 × 10 моль/л); 0.8 мл розчину -3 додецилбензолсульфонату натрію (5.0 × 10 моль/л); Гем (0.2-12.0 нмоль/л) та 2.0 мл цитратно-фосфатного буферного розчину (рН = 5.0). Далі цю суміш залишають на 5 хвилин і потім додають 4.0 мл фосфатного буферного розчину (рН = 8.0), доводять до 10.0 мл водою та реєструють Ілюм при λзбудж = 556 нм та λеміс= 574 нм, межа виявлення Гем 0.086 нмоль/л. Недоліками даного способу є: залежність люмінесцентного сигналу від наявності міцелярного середовища, у зв'язку з чим визначення І люм необхідно проводити тільки у присутності додецилбензолсульфонату натрію, а також використання двох буферних розчинів (рН=5.0 та рН=8.0), що ускладнює аналіз. Найбільш близьким є спосіб люмінесцентного визначення гемоглобіну [див. Shihui Qin. New fluorimetric determination of hemoglobin used as a substitute of mimietic peroxidase // Annali di Chimica.-2007. - V. 97. - P. 59-67], в якому до 0.1 мл розчину 4,4',4",4"'-тетразаміщеного 4 -11 -8 амінофталоціаніну алюмінію (1 × 10- моль/л) додають розчин гемоглобіну (5.0 × 10 -1.2 × 10 -2 моль/л), 0.1 мл розчину пероксиду водню (1 × 10 моль/л), 1.0 мл фосфатного буферного розчину рН=11.4, перемішують, залишають на 40 хвилин, далі додають 1.0 мл розчину хлористоводневої кислоти (0.1 моль/л), доводять до 10.0 мл водою та записують люмінесценцію при λзбудж = 606 нм та λеміс = 673 нм. Інтенсивність люмінесценції комплексу органічного барвника значно зменшується. Цей спосіб визначення гемоглобіну застосовує гасіння люмінесценції зонда (4,4',4",4'"- тетразаміщеного амінофталоціаніну алюмінію), яке є наслідком його каталітичного окиснення пероксидом водню в присутності гемоглобіну. Даний спосіб вибрано прототипом: Прототип та спосіб, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - приготування проби; - встановлення заданого рН водного середовища; - опромінювання утвореної системи світлом; - вимірювання гасіння інтенсивності люмінесценції розчину. Але спосіб за прототипом вимагає використання каталітичного окиснення пероксидом водню органічного барвника (гемоглобін виступає у ролі каталізатора), тобто визначення гемоглобіну є посереднім, що призводить до необхідності залишати аналізуємий розчин на 40 хвилин для проведення каталітичної реакції. У прототипі використовують фосфатний буферний розчин із значенням рН=11.4, що значно перевищує рН біоридин. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб кількісного визначення гемоглобіну за ефектом гасіння люмінесценції комплексної сполуки тербію(Ш), в якому шляхом використання нового органічного реагенту забезпечується просте та швидке визначення гемоглобіну. Поставлена задача вирішена в способі визначення гемоглобіну, що передбачає приготування проби для аналізу, взаємодію її з розчином люмінесцентного зонда при заданому рН, опромінювання утвореної системи УФ-світлом та вимірювання інтенсивності люмінесценції, тим, що як люмінесцентний зонд використовують комплексну сполуку тербію(Ш) з 1-етил-4 1 UA 102332 C2 5 10 15 20 гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової кислоти (4-метил-піридин-2-іл)-амідом (L) при рН 8.0, опромінювання проводять УФ-світлом при λзбудж = 317 нм та вимірювання інтенсивності люмінесценції при λеміс = 545 нм. Новим у винаході, що заявляється, є наявність наступних ознак: - як люмінесцентний зонд використовують комплексну сполуку тербію(Ш), з 1 -етил-4гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3 -карбонової кислоти (4-метил-піридин-2-іл)-амідом; - опромінювання утвореної системи Тb(III)-L-гемоглобін проводять УФ-світлом при λзбудж = 317 нм та вимірювання інтенсивності люмінесценції при λеміс = 545 нм; - застосування уротропінового буферного розчину. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю суттєвих ознак, що заявляються, і технічним результатом, що досягається, полягає в наступному: - зменшення часу визначення гемоглобіну; - уротропіновий буферний розчин з р№=8.0 дозволяє проводити визначення в біоридинах. Визначення стало можливим завдяки використанню нового люмінесцентного зонда комплексу тербію(Ш) з новим лігандом 1-етил-4-гідрокси-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3 -карбонової кислоти (4-метил-піридин-2-іл)-амідом [див. Українець І. В., Ель Каянь С. А., Горохова О. В., Сидоренко Л. В. Синтез та протитуберкульозна активність метилзаміщених піридил-2-амідів 1БІ-2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонових кислот // Фарм. журн.-2004, № 4, С. 47-53]. Це можна пояснити наступним. Органічний ліганд належить до похідних піридиновмісних амідів оксохінолінкарбонової кислоти і має таку структурну формулу: CH3 OH O N H N O C2H5 25 30 35 40 45 N . Обробка розчину солі тербію(III) водним розчином реагенту посилює люмінесценцію Тb(ІІІ). Цей реагент має в ультрафіолетовій області спектра смугу поглинання з високим молярним -1 -1 коефіцієнтом екстинкції (ε313=24900 лмоль см ), що обумовлює ефективне поглинання енергії -1 збудження. Ця енергія передається з триплетного рівня ліганду (Е т = 22220 см ) на 3+ 5 -1 енергетичний рівень Tb (E D4=20500см ), що призводить до значного зростання Ілюм тербію. Взаємодія гемоглобіну з люмінесцентним зондом-комплексом Тb(ІІІ)- L відбувається при рН 4.5-10.0, максимум люмінесценції спостерігається при рН 7.5-8.5 (див. Фіг.1, де наведено залежність інтенсивності люмінесценції (відн. од.) системи Tb-L-Гем від рН розчину (СTb(III) = 6 CL=1 × 10- моль/л; СГем = 20 мкг/мл)). У запропонованому способі для утворення оптимального рН середовища використовується 40 % уротропіновий розчин (рН=8.0). Максимальний ефект гасіння спостерігається при співвідношенні Tb: L=1:1, оптимальна 3+ 6 концентрація іонів Тb та реагенту становить 1 × 10- моль/л (див. Фіг.2, де наведено залежність інтенсивності люмінесценції (відн. од.) системи Тb(III)-b-Гем від концентрацій L (а) та Тb(ІІІ) (б) (СГем = 20 мкг/мл)). Гасіння Ілюм тербію в комплексі Тb(III)-L-Гем спостерігається при опромінюванні утвореного комплексу УФ-світлом з λзбудж - 317 нм (див. Фіг.З, де наведено спектри люмінесценції комплексу Тb(ІІІ)-L в присутності різних концентрацій гемоглобіну 6 (СTb=CL=1 × 10- моль/л; СГем= 0.6-36.0 мкг/мл)). Інтенсивність люмінесценції тербію в системі Тb(III)-L-Тем пропорційна в інтервалі концентрацій гемоглобіну - 0.6-36.0 мкг/мл (див. Фіг.4, де наведено залежність інтенсивності люмінесценції комплексу Tb(III)-L від концентрації Гем (а) і градуювальний графік у координатах 6 Штерна-Фольмера для визначення Гем (б) (СTb=CL=1 × 10- моль/л)). Процес гасіння 4f-люмінесценції комплексу Tb(III)-L гемоглобіном можна пояснити передачею енергії від Tb(III)-L (донора) на Гем (акцептор). Про резонансний перенос енергії електронного збудження (FRET) в цьому випадку свідчить перекривання спектра поглинання гемоглобіну із спектром люмінесценції комплексу Tb(III)-L. Час життя люмінесценції комплексу Тb(ІІІ)-L в присутності різних концентрацій Гем суттєво змінюється (див. Фіг.5, де наведено криві затухання 4f-люмінесценції комплексу Tb(III)-L в 6 присутності різних концентрацій гемоглобіну (СТb=СL=1 × 10- моль/л)). 2 UA 102332 C2  Значення ферстеровського радіуса (R0=47 -1 5 10 15 20 25 30 35 -1 4 A ) та інтегралу перекривання ( Over =2.91013  М см нм ) спектра люмінесценції Tb(III)-L зі спектром поглинання Гем розраховано в програмі SetaFret з урахуванням розподілення квантової інтенсивності випромінювання вспектрі люмінесценції донору і молярного коефіцієнта поглинання акцептора. Значення інтегралу перекривання та ферстеровського радіуса дозволяють характеризувати гемоглобін, як ефективний гасник 4f-люмінесценції іонів Тb(ІІІ). Приклад. Визначення проводили на модельних розчинах шляхом введення відомої кількості гемоглобіну. Кількісне визначення гемоглобіну проводили за градуювальним графіком. За допомогою одержаних результатів будують градуювальний графік залежності І о/І від концентрації гемоглобіну (мкг/мл) у координатах Штерна-Фольмера (див. Фіг. 4) в інтервалі концентрацій білків 0.6-36.0 мкг/мл. Градуювальний графік будують наступним чином: у мірні колби місткістю 10 мл вносять по 0.05; 0.10; 0.20; 0.30; 0.40; 0.50; 0.60; 0.90; 1.50; 2.00; 3.00 мл робочого розчину Гем (120 мкг/мл) -5 (5 паралельних вимірів). В кожну колбу додають по 1.0 мл 1 × 10 моль/л розчину хлориду -5 тербію, 1.0 мл 1 × 10 моль/л розчину L, 0.4 мл 40 %-ного розчину уротропіну. Доводять водою до 10.0 мл та перемішують. Паралельно готують розчин контрольної проби, який містить усі компоненти, крім білків. Через 5 хв вимірюють інтенсивність люмінесценції за λ еміс = 545 нм (λзбудж - 317 нм) у кожній точці (І) та інтенсивність люмінесценції контрольної проби (І 0). Визначення гемоглобіну в зразках крові. Методика. Робочий розчин крові. 0.5 мл зразка крові вносили в мірну колбу місткістю 50.0 мл, доводили об'єм розчину водою до мітки і перемішували. 5.0 мл отриманого розчину поміщали в мірну колбу місткістю 50.0 мл, доводили об'єм розчину водою до мітки і перемішували. У мірні колби об'ємом 10 мл вносили по 2.0 мл робочого розчину крові (5 паралельних -5 вимірювань). У кожну колбу додавали по 1.0 мл 1*10 моль/л розчину хлориду тербію, 1.0 мл lxl 5 О" моль/л розчину L та 0.4 мл 40 %-ного розчину уротропіну. Паралельно готували розчин контрольної проби, який містить всі компоненти, окрім робочого розчину крові. Розчини доводили до 10.0 мл водою і перемішували. Через 5 хвилин вимірювали І люм при λеміс = 545 нм (λзбудж = 317 нм). Концентрацію гемоглобіну в зразках крові встановили по градуювальному графіку (з урахуванням розведення). Правильність люмінесцентної методики перевірена зіставленням отриманих результатів визначення гемоглобіну в зразках крові (таблиця) з даними, отриманими фотоколориметричним геміглобінціанідним методом [див. СМ. Льюис, Б. Бэйн, И. Бэйтс //Практическая и лабораторная гематология / пер. с англ. под ред. А.Г. Румянцева. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009.-672 с.]. Таблиця Результати визначення гемоглобіну методом "введено-знайдено" в зразках і крові (n=5, Р = 0.95) № зразка №1 №2 40 Люмінесцентний метод Знайдено гемоглобіну, г/л 145±8 122±6 Sr 0.046 0.037 Геміглобінціанідний метод Знайдено гемоглобіну, г/л 139±7 126±5 Sr 0.041 0.032 Отримані дані указують на задовільне узгодження результатів, отриманих двома різними методами. На підставі отриманих даних можна зробити висновок про те, що введення в систему Tb(III)L гемоглобіну приводить до значного гасіння Ілюм тербію(III), що дозволяє використовувати вказаний комплекс як аналітичну форму для визначення Гем. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 50 Спосіб кількісного визначення гемоглобіну, що включає одержання проби для аналізу, проведення взаємодії з розчином люмінесцентного зонда при заданому рН, опромінення одержаної системи УФ-світлом та вимірювання інтенсивності люмінесценції реакційного розчину, який відрізняється тим, що як люмінесцентний зонд використовують розчин комплексної сполуки тербію(III) з 1-етил-4-гідроксі-2-оксо-1,2-дигідрохінолін-3-карбонової 3 UA 102332 C2 кислоти (4-метил-піридин-2-іл)-амідом при рН 8.0, опромінення проводять УФ-світлом при збудж=317 нм та вимірювання інтенсивності люмінесценції при еміс=545 нм. 5 4 UA 102332 C2 5 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5