Спосіб виявлення днк yersinia enterocolitica за допомогою “напівгніздового” методу полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Спосіб виявлення ДНК бактерії YERSINIA ENTEROCOLITICA за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) збудника за допомогою "напівгніздового" варіанта полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) - ферментативної реакції і трьох штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів, які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК інфекційного агента при певних температурних і часових параметрах та кількості циклів, причому для проведення "напівгніздового" варіанта ПЛР проводять два етапи реакції, використовуючи для кожного етапу певну пару праймерів, на першому етапі використовують пару олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: 16SYOF1 (5'-TAGTAGGTGGGGTAATGGCTC-3') О16SmdR1 (5'-CCTCCTCGCTGAAAGTGCT-3'), на другому етапі використовують пару штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: 16SYOF1 (5'-TAGTAGGTGGGGTAATGGCTC-3') 16SYOR1 (5'-gTAACgTCAATCCAACAACCTAT-3'), довжина фрагмента ДНК, що синтезується, - 191 п. н. UA 103102 U (12) UA 103102 U UA 103102 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної бактеріології, зокрема до лабораторної діагностики, призначений для виявлення специфічних фрагментів нуклеїнових кислот (ДНК) бактерій виду Yersinia enterocolitica, може бути використаний для індикації та ідентифікації ієрсиній в патологічному матеріалі, продуктах харчування, об'єктах довкілля, об'єктах ветеринарно-санітарного нагляду, в науково-дослідних роботах, в навчальних процесах. Проблема ієрсиніозів привертає все більше уваги ветеринарних та медичних працівників. Це обумовлено поширеністю ієрсиній у природі (ґрунт, вода, каналізація, рослини, пил), збільшенням кількості хворих на ієрсиніоз людей та недосконалими та трудомісткими методами лабораторної діагностики цих захворювань. За даними ВООЗ поширеність ієрсиніозу носить глобальний характер, цю хворобу реєструють більш ніж у 30 країнах світу, але частіше в країнах з більш прохолодним кліматом. Ієрсиніозні інфекції, зумовлені патогенними для людини та тварин Yersinia pseudotuberculosis і Yersinia enterocolitica, відносяться до широко розповсюджених у світі гострих кишкових захворювань. Біологічне споріднення збудників псевдотуберкульозу й кишкового ієрсиніозу забезпечує подібність клінічних форм, цей факт обґрунтовує необхідність розробки експрес способів індикації та ідентифікації ієрсиній. Останнім часом ієрсиніози стали відносити до сапрозоонозів - групи інфекцій, збудники яких тісно пов'язані як з навколишнім середовищем, так і з організмом теплокровних. Між цими екологічними нішами здійснюється безперервна циркуляція збудника. Характерними особливостями збудників сапрозоонозів є їх психрофільність і значна термотолерантність, що має дуже важливе значення вважаючи на існуючі технології виробництва і низькотемпературного зберігання м'ясних продуктів. Аналогами до об'єкта, що заявляється, є ідентифікація Yersinia enterocolitica за бактеріологічним способом або ретроспективне виявлення реконвалесцентів за допомогою реакції аглютинації, ІФА, тощо. Спільним недоліками зазначених способів є те, що вони потребують значного часу для проведення досліджень, наявності відповідних поживних середовищ для культивування, специфічних сироваток для ідентифікації та відповідних наборів для серологічної діагностики. Прототипом є використання для виявлення ДНК молекулярно-біологічних методів, зокрема "Тест-системы "Энтерол" для выявления возбудителя иерсиниоза Yersinia enterocolitica методом полимеразной цепной реакции" виробництва компанії "Амплисенс" (РФ). Недоліком зазначених способів є те, що вони регламентують використання праймерів, які схильні до утворення димерів та мають низьку температуру відпалу, що впливає на специфічність реакції. Враховуючи різноманіття біотипів бактерії виду Yersinia enterocolitica, а також численних типів, що не культивуються, актуальним питанням є розробка ефективного, специфічного і швидкого методу детекції збудника на основі "напівгніздового" варіанта ПЛР. Як мішені було вибрано ген, що кодує субодиницю 16S rRNA та. В основу корисної моделі, що передбачається, поставлено задачу створити новий спосіб виявлення Yersinia enterocolitica в зразках біологічного матеріалу при проведенні прижиттєвої та постмортальної діагностики, продуктах харчування тваринного і рослинного походження, інших об'єктах ветеринарно-санітарного та епідеміологічного нагляду, що відрізняється тим, що в досліджуваних зразках виявляють специфічні фрагменти ДНК за допомогою "напівгніздового" варіанта ПЛР - ферментативної реакції і трьох штучно синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки кДНК інфекційного агента при температурних і часових параметрах та кількості циклів наведених в таблиці 1: Для проведення "напівгніздового" варіанта ПЛР проводять два етапи реакції, використовуючи для кожного етапу певну пару праймерів, зокрема - на першому етапі використовують пару штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: 16SYOF1 (5'-TAGTAGGTGGGGTAATGGCTC-3') О16SmdR1 (5'-CCTCCTCGCTGAAAGTGCT-3'), а на другому етапі - використовують пару штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: 16SYOF1 (5'-TAGTAGGTGGGGTAATGGCTC-3') 16SYOR1 (5'-gTAACgTCAATCCAACAACCTAT-3'). Праймери 16SYOF1, O16SmdR1 та 16SYOR1 забезпечують синтез фрагмента ДНК довжиною 191 п.н. Приклад 1. Методи відбору матеріалу для проведення досліджень. Для прижиттєвої діагностики ієрсиніозу в лабораторію направляють матеріал від хворих тварин, яких не піддавали лікуванню антибактеріальними препаратами, відібраний у стерильні пробірки (флакони) з гумовими пробками: 1 UA 103102 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 а) фекалії в кількості (2-3) г, відібрані безпосередньо з прямої кишки за допомогою попередньо прокип'яченого гумового катетера або в момент дефекації; 3 б) молоко в кількості (10-15) см , взяте вибірково від (15-20) корів стада після санітарної обробки шкіри і здоювання перших порцій молока, - одна збірна проба. Залежно від поголів'я корів на фермі кількість збірних проб молока може варіювати в межах від 3 до 5. Молоко має бути доставлено в лабораторію для дослідження в день відбирання проби. За відсутності такої 3 можливості молоко консервують кристалічною борною кислотою (0,1 г на 10 см ). Консервоване молоко придатне для дослідження протягом 10 днів. Для посмертної (постмортальної) діагностики в лабораторію направляють матеріал від загиблих або вимушено забитих тварин, бажано, яких не піддавали лікуванню антибактеріальними засобами. Трупи дрібних тварин (поросят, хутрових звірів, птахів та ін.) направляють цілими (2-4 тушки). Від великих тварин відбирають наступний матеріал: серце, перев'язане лігатурою поблизу розрізу судин і аорти; селезінку; частку печінки з жовчним міхуром; нирку; уражені ділянки тонкого або товстого відділу кишечнику з вмістом, перев'язані з двох кінців лігатурою, разом з мезентеріальними лімфатичними вузлами (в окремому посуді або поліетиленовому пакеті); голову; трубчасту кістку; підщелепні лімфатичні вузли; у свиней і поросят ще й зіскрібки з задньої стінки глотки, з поверхні кореня язика і глоткових мигдалин, взяті стерильним скальпелем. Для діагностики ієрсиніозу птахів з неблагополучних секцій пташника направляють по (3-5) свіжих трупів або (3-5) птахів з клінічними ознаками діареї. Хвору птицю забивають у лабораторії і піддають патологоанатомічному і бактеріологічному дослідженню. Проби м'ясної сировини, молока і вершків для бактеріологічного дослідження відбирають згідно з правилами і в кількостях, передбачених наступними ДСТУ: - ДСТУ ISO 707-2002 (ISO 707:1997, IDT) Молоко та молочні продукти. Настанови з відбирання проб, - ДСТУ ISO 5538:2004 (ISO 5538:1987, IDT) Молоко та молочні продукти. Відбирання проб. Контроль за якісними ознаками, - ДСТУ ISO 8197:2004 (ISO 8197:1988, IDT) Молоко та молочні продукти. Відбирання проб. Контроль за кількісними ознаками, - ГОСТ 7702.0-74 Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы оценки качества (М'ясо птиці. Методи відбору зразків. Органолептичні методи оцінки якості), - ГОСТ 7702.2.0-95 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям", - ДСТУ ISO 10273:2007 Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення умовно патогенних Yersinia enterocolitica (ISO 10273:2003, IDT) Коренеплоди, що зберігаються в овочесховищах або буртах, піддають дослідженню не раніше ніж через 30 днів після їх закладки. Проби рослинних кормів для дослідження на наявність в них бактерій виду Yersinia enterocolitica відбирають згідно з такими ДСТУ: - ДСТУ ISO 6497:2005 Корми для тварин. Методи відбирання проб - ДСТУ 4984:2008 Буряки цукрові. Методи відбирання та готування проб коренеплодів для визначання технологічних показників їхньої якості - ДСТУ ISO 874-2002 Фрукти та овочі свіжі. Відбирання проб - ГОСТ 27262-87 Корма растительного происхождения. Методы отбора проб. Приклад 2. Виділення ДНК із зразку. Встановити в штатив необхідну кількість одноразових пробірок (використовують пробірки 3 ємністю 1,5 см ) - з розрахунку одна пробірка на кожен досліджуваний зразок та одна - для негативного контролю виділення (НКВ) та маркують їх. Буфер для лізуючого розчину та розчин для відмивки № 1 (якщо вони зберігались за температури від 2 до 8 °C) прогріти за температури 60-65 °C до повного розчинення кристалів осаду. 3 У пробірку з НКВ вносять 0,1 см стерильної деіонізованої води. До кожної пробірки з біоматеріалом чи 50 % гомогенатом біоматеріалу, а також у пробірку з НКВ, окремими 3 наконечниками з аерозольним бар'єром вносять по 0,3 см лізуючого буферу, ретельно перемішують та інкубують за температури (65±0,5)°С протягом 5 хвилин, періодично струшуючи на вортексі. Після чого проводять центрифугування (5 тис. об./хв. протягом 1 хвилини) з метою осадження нерозчинених частинок. Надосадову рідину відбирають окремими наконечниками та переносять в нові пробірки. Проби центрифугують протягом 5 секунд за частоти 5 тис.об./хв на мікроцентрифузі для осадження крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки. Ретельно 2 UA 103102 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ресуспендують сорбент на вортексі. У кожну пробірку окремим наконечником вносять по 3 0,025 см сорбенту, струшують на вортексі тричі з інтервалом 2-3 хв., після чого сорбент осаджують центрифугуванням (5 тис. об.хв. - 1 хв). Надосад видаляють, а у пробірки вносять по 3 0,3 см розчину для відмивки № 1; ресуспендують сорбент на вортексі, центрифугують (1 хв. - 5 3 тис.об./хв.) на мікроцентрифузі, надосадок видаляють. В пробірки вносять по 0,5 см розчину для відмивки № 2, ресуспендують на вортексі, після чого центрифугують (1 хв. - 5 тис. об./хв), надосадок видаляють, процедуру повторюють ще раз. Потім пробірки вміщують в термостат за температури (65±0,5)°С на 5-7 хвилин для підсушування сорбенту (кришки пробірок мають бути 3 відкритими). В пробірки вносять по 0,05 см ТЕ-буфера для елюції ДНК, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, змішують на вортексі і вміщують пробірки в термостат за температури 65 °C на 5-10 хвилин, періодично струшуючи на вортексі. Після чого центрифугують пробірки (12-14 тис.об./хв) протягом 1 хвилини. Надосадова рідина містять очищену ДНК. Очищену ДНК можна зберігати протягом 1 тижня за температури (2-8)°С та до 1 року за t° мінус 20 °C! Приклад 3. Постановка реакції ампліфікації Підготовка до роботи: Пробірку з воском вміщують у термостат за температури 95 °C до повного розплавлювання; 3 3 у мікропробірки для ПЛР по 0,005 см ПЛР-суміші № 1А, нашарувати зверху по 0,015 см розплавленого воску так, щоб він повністю накрив рідину, закрити кришки. Якщо віск покрив рідину нерівно чи утворилися міхурці, прогріти пробірки у термостаті 1-2 хв. за температури 95 °C і охолодити. У такому вигляді пробірки зберігаються за температури мінус 20 °C кілька місяців. Доцільно приготувати відразу 50 пробірок. Підготувати, за аналогічною схемою пробірки з ПЛР-сумішшю № 1Б. Постановка першої реакції ампліфікації "напівгніздового" варіанта ПЛР: Підготувати необхідну кількість кількість пробірок із ПЛР-сумішшю № 1А для дослідження невідомих проб, одну пробірку для позитивного контролю (ДНК бактерії Yersinia enterocolitica, ATCC 23715) та дві пробірки для негативних контролів. Нанести відповідне маркування на всі 3 пробірки. Внести в усі пробірки на поверхню застиглого воску по 0,01 см ПЛР-суміші № 2, після чого додати по 1 краплі мінерального масла. У пробірки для аналізу невідомих зразків (під 3 масло) внести по 0,01 см виділеної ДНК; в пробірку негативного контролю виділення внести 3 3 0,01 см негативного контрольного зразку, в пробірку позитивного контролю - 0,01 см позитивного контрольного зразку. Всі пробірки закрити й центрифугувати (5 секунд – 1000 об/хв). Після чого перенести пробірки в нагрітий до температури 94 °C програмний термостат (ампліфікатор) і провести ампліфікацію. Постановка другої реакції ампліфікації "напівгніздового" варіанта ПЛР. Вийняти з холодильника потрібну кількість пробірок із ПЛР-сумішшю № 1Б і нанести відповідне маркування на відібрані пробірки. Внести в усі пробірки на поверхню застиглого 3 воску по 0,015 см ПЛР-суміші № 2. Зверху розкапати по 1 краплі мінеральної олії (приблизно 3 3 0,025 см ). У відповідні пробірки (під олію) внести по 0,005 см ДНК (продукту першої реакції ампліфікації). У випадку значної концентрації ампліфікованої в першій реакції ДНК, зразок попередньо розвести в 100 разів ТЕ-буфером або стерильною деіонізованою водою. Перенести пробірки в нагрітий до температури 94 °C програмний термостат (ампліфікатор) і провести ампліфікацію за програмою. Після закінчення реакції зібрати всі задіяні в дослідженні пробірки в пакет і передати у зону № 3 (кімнату для аналізу продуктів ПЛР), з метою проведення електрофоретичного аналізу фрагментів ДНК в агарозному гелі. Проби після ампліфікації можна зберігати протягом 16 годин за кімнатної температури, та протягом тижня за температури 2-8 °C (перед проведенням електрофорезу необхідно нагріти пробірки до кімнатної температури для розм'якшення воску). Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР. - Приготування робочого розчину буфера (ТБЕ) для електрофорезу. В мірну колбу ємністю 3 1,0 дм внести вміст флакона з концентрованим розчином буфера для електрофорезу, довести до мітки дистильованою водою та ретельно перемішати до повного розчинення. - Приготування агарозного гелю. 3 3 У конічну колбу, ємністю 0,25 дм внести вміст одного пакета з агарозою, додати 0,1 дм робочого розчину буфера ТБЕ і поставити колбу на електричну плитку або в мікрохвильову піч. Довести вміст колби до кипіння і після того, як агароза повністю розтопиться, колбу з розтопленою агарозою зняти з плитки. (Якщо використовується електроплитка, вміст колби необхідно періодично перемішувати скляною паличкою, щоб запобігти карамелізації агарози). 3 UA 103102 U 5 10 15 20 25 Отриманий розчин агарози повинен бути прозорим і не вміщувати окремих нерозчинених часток. Розтоплену агарозу за кімнатної температури охолодити до температури 65 °C. - Підготовка електрофоретичної камери. Зібрати платформу для заливання гелю. Встановити гребінку або кілька, залежно від кількості проб для аналізу, на платформу. Гребінки розміщують на відстані не ближче 3 см одна від одної. Охолоджену до температури 65 °C агарозу залити на платформу. Товщина шару агарози повинна бути 5-6 мм. Після застигання агарози (приблизно через 25-30 хв.) обережно витягнути гребінки, щоб не пошкодити при цьому лунок; платформу з агарозним гелем перенести до електрофоретичної камери. Залити необхідну кількість розчину буфера ТБЕ в електрофоретичну камеру так, щоб він покривав агарозний гель шаром товщиною 4-5 мм. Виставити пробірки з продуктами ампліфікації у штатив послідовно. У відповідну лунку 3 агарозного гелю, під шар буфера ТБЕ, внести по 0,010-0,012 см ПЛР-суміші з продуктом ампліфікації, так щоб вміст одного кармана агарозного гелю не перетікав у інший. Можливо використовувати один наконечник, промиваючи його 3-4 разовим піпетуванням буфером з камери після внесення кожної проби. Встановити кришку на камеру, підключити електрофоретичну камеру до джерела живлення, дотримуючи полярності (лунки агарозного гелю повинні бути зі сторони катода ("-"). Якщо немає порушення контактів, то при проходженні струму від електродів (катод) повинні підніматися пухирці. Електрофорез проводять у градієнті напруги 10 В/см до того моменту, як барвник відійде від старту на 1,0-1,5 см. Через 20-30 хвилин електрофоретичну камеру відключити від джерела живлення і тільки після цього зняти кришку з електрофоретичної камери. Вийняти платформу з агарозним гелем з електрофоретичної камери, дати рідині стекти з гелю. Довжина ампліфікованого після другої реакції специфічного фрагмента ДНК Yersinia enterocolitica-191 п.н. Приклад 4. Результати перевірки колекції штамів та ізолятів бактерій виду Yersinia enterocolitica за допомогою "напівгніздового" методу полімеразної ланцюгової реакції Таблиця Результати перевірки колекції штамів та ізолятів бактерій виду Yersinia enterocolitica Штам Код Біотип Yersinia enterocolitica, ub.enteroYersinia enterocolitica, ub.enteroYersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica Yersinia pseudotuberculosis Yersinia pseudotuberculosis ATCC 23715 ATCC 27729 46/15-09 2/15-09 13/15-10 2/15-08 12/15-08 21/15-09 29/15-09 44/15-09 44/15-08 9610 3/15-08 14/15-07 18/15-07 44/15-08 20/15-09 22/15-09 23/15-08 9610 121 632 1 8 О:6,30 О:3 О:3 О:4,32 нд О:5,27 О:3 O:3 О:3 О:8 О:6,30 О:6,30 О:6,30 О:3 О:3 О:6,30 О:6,30 О:8 нд нд 4 Ген 16S rRNA (п.н.) 2-реакція 191 191 191 191 191 191 191 191 191 191 191 191 191 191 191 191 191 191 191 191 UA 103102 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб виявлення ДНК бактерії YERSINIA ENTEROCOLITICA за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) збудника за допомогою "напівгніздового" варіанта полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) - ферментативної реакції і трьох штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів, які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК інфекційного агента при певних температурних і часових параметрах та кількості циклів, який відрізняється тим, що для проведення "напівгніздового" варіанта ПЛР проводять два етапи реакції, використовуючи для кожного етапу певну пару праймерів, на першому етапі використовують пару олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: 16SYOF1 (5'-TAGTAGGTGGGGTAATGGCTC-3') О16SmdR1 (5'-CCTCCTCGCTGAAAGTGCT-3'), на другому етапі використовують пару штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: 16SYOF1 (5'-TAGTAGGTGGGGTAATGGCTC-3') 16SYOR1 (5'-gTAACgTCAATCCAACAACCTAT-3'), довжина фрагмента ДНК, що синтезується, - 191 п. н. 20 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5