Спосіб виявлення днк бактерії coxiella burnetii збудника ку-лихоманки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Спосіб виявлення ДНК бактерії Coxiella burnetii збудника Ку-лихоманки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (НК) гену соm l, який кодує висококонсервативний білок зовнішньої мембрани з М.м 27kDа збудника Ку-лихоманки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для проведення ПЛР використовують штучно синтезовані вироджені олігонуклеотидні праймери. UA 100232 U (12) UA 100232 U UA 100232 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до ветеринарної вірусології, зокрема до лабораторної діагностики, призначена для виявлення специфічних фрагментів нуклеїнових кислот (ДНК) бактерії Coxiella burnetii збудника Ку-лихоманки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, може бути використана для проведення діагностики Ку-лихоманки, в науково-дослідних роботах, для виявлення носіїв С burnetii та природних резервуарів, в навчальних процесах. Відомий спосіб виділення та культивування бактерії Coxiella burnetii збудника Ку-лихоманки на культурах клітин фібробластів легенів ембріону людини (HEL). Принцип способу полягає у виділенні вірусу на моношарових перещеплюваних культурах клітинах і у подальшій імунологічній ідентифікації (біопроба, імуноферментний аналіз, метод імунофлуоресценції, ПЛР тощо). Недоліками способу є довготривалість досліджень, висока вартість, постійна необхідність наявності чутливої культури клітин. Робота з культурою Coxiella burnetii допускается у лабораторіях, які мають умови для роботи із збудниками II групи патогенності [1, 2]. Найближчим аналогом є ПЛР в режимі реального часу з використанням комерційних наборів "Coxiella burnetii-Real time", Genekam Biotechnology AG, Німеччина або "Real-time PCR kit "LSI VetMAX Screening Pack-Ruminant Abortion", Франція. Недоліком рекомендованих наборів є те, що при ПЛР в режимі реального часу використовують короткі праймери та зонд, що не дає можливість проводити генетичну характеристику ампліфікованого фрагменту з використанням рестрикційного аналізу. Також недоліком є цінова політика та необхідність використовувати дороге спеціалізоване обладнання (ампліфікатори). В зв'язку з тим, що комерційні набори для ПЛР в режимі реального часу дуже дорогі, актуальним питанням є розробка ефективного і швидкого методу детекції збудника. Правильний вибір олігонуклеотидних праймерів визначає ефективність і відтворюваність ПЛР. Задачею корисної моделі є створення нового способу виявлення ДНК Coxiella burnetii збудника Ку-лихоманки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції у біологічному матеріалі. Поставлена задача вирішується тим, що cпосіб виявлення ДНК бактерії Coxiella burnetii збудника Ку-лихоманки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (НК) гену соm 1, який кодує висококонсервативний білок зовнішньої мембрани з М.м 27kDа збудника Ку-лихоманки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), згідно з корисною моделлю, для проведення ПЛР використовують штучно синтезовані вироджені олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю нуклеотидів: CoxF2-5'- ACYGCAGGCGTGGCGATAG-3' CoxR4-5'- TGAAGGTTTTGTTGTGAGGTGGC-3' де:У=С/Т. Параметри ампліфікації для ПЛР наведено у таблиці. Таблиця Ампліфікатори з активним регулюванням температури (усередині реакційної пробірки або по математичному алгоритму) 1 цикл - при 95 °C - 4 хвилини 2 цикл - при 94 °C - 30 секунд при 60° С - 30 секунд при 72° С - 30 секунд Цикл 2 повторюють 35 разів 3 цикл - при 72 °C - 4 хвилини 4 цикл - при 4 °C - зберігання Ампліфікатори з регулюванням температури по матриці (термоблока) 1 цикл - при 95 °C - 4 хвилин 2 цикл - при 94 °C - 1 хвилина при 60 °C - 1 хвилина при 72 °C - 1 хвилина Цикл 2 повторюють 35 разів 3 цикл - при 72 °C - 4 хвилин 4 цикл - при 4 °C - збереження 40 45 Праймери CoxF2 та CoxR4 специфічні консервативній ділянці гену соm l, який кодує висококонсервативний білок зовнішньої мембрани з М.м 27kDa збудника Ку-лихоманки та забезпечують синтез фрагменту ДНК розміром 689 п.н. при температурі відпалу 60 °C. Виродженість олігонуклеотидних праймерів підвищує специфічність та враховує відмінності нуклеотидного складу гену соml, який кодує висококонсервативний білок зовнішньої мембрани з- М.м 27kDа збудника Ку-лихоманки різних генотипів. Приклад: пробу (гомогенат патологічного матеріалу тощо) (1г) поміщають у пластикову 3 3 пробірку ємністю 1,5 см і додають 0,5 см деіонізованої води. Суміш струшують і центрифугують, після чого проводять виділення ДНК набором реагентів для виділення ДНК. 3 3 3 Отриману кДНК (0,003-0,005 см ) поміщають у пробірку ємністю 0,5 см і додають 0,02 см (5Х) 1 UA 100232 U 3 5 10 15 20 25 30 3 ПЛР-буфера, 0,001см dNTP, по 0,00015 см кожного з праймерів, 0,0005 см Taq-полімерази та 1 краплю мінерального масла. Вміст пробірки струшують і центрифугують, а потім переносять в термоциклер з активною регуляцією температури, наприклад "Терцик" (Росія), якому задають вищевказану програму. Аналіз результату ПЛР проводять в 1,5 % гелі агарози з барвником - бромистим етидієм. В лунки агарозного гелю вносять 0,010-0,012 см ампліфікованої суміші. Після проведення електрофорезу фрагменти ДНК виявляють під ультрафіолетовим світлом. Результат ПЛР може бути оцінено візуально - по наявності смужок, що відповідають продуктам реакції. Використана Джерела інформації: 1. Методичні рекомендації щодо методів лабораторної діагностики Ку-лихоманки [Л.А. Дедок, Л.В. Марущак, Ж.М. Дрожже, М.І. Сушко, О.В. Литвинчук, Кравченко А. Л. та інші] - К., ДНДІЛДВСЕ, 2012. - с.26. 2. Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю. Державні санітарні правила ДСП 9.9.5.-080-2002 - К., 2002. 3. Detection of Coxiella burnetii in Complex Matrices by Using Multiplex Quantitative PCR during a Major Q Fever Outbreak in The Netherlands [Text] / A. de Bruin, A. de Groot, L. de Heer, J. Bok, P. R. Wielinga, M. Hamans, B. J. van Rotterdam, I. Janse // J ournal Applied and Environmental Microbiology.- 2011.- Vol.77 - №.18. - P.6516-6523. 4. Differentiation of Coxiella burnetii by sequence analysis of the gene (coml) encoding a 27-kDa outer membrane protein / G.Q. Zhang, To Η Yamaguchi, Η Fukushi, K. Hirai [Text] // J. Microbiol Immunol.. - 1997-Vol. 41. -P.871. 5. Hendrix L.R. Cloning and sequencing of Coxiella burnetii outer membrane protein gene coml /L.R Hendrix, L.P. Mallavia, J.E. Samuel //Journal Infect. Immun. - 1993. -Vol.61-P. 470. 6. Hendrix L. R. Differentiation of Coxiella burnetii isolates by analysis of restriction-endonucleasedigested DNA separated by SDS-PAGE / L.R. Hendrix, J.E. Samuel, L.P. Mallavia // J Gen Microbiol. - 1991. - Vol. 137. -P. 269-276. 7. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines / Office International des Epizootic (ΟΙΕ), 2010. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб виявлення ДНК бактерії Coxiella burnetii збудника Ку-лихоманки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (НК) гену соm l, який кодує висококонсервативний білок зовнішньої мембрани з М.м 27kDа збудника Ку-лихоманки за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), який відрізняється тим, що для проведення ПЛР використовують штучно синтезовані вироджені олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю нуклеотидів: CoxF2- 5'- ACYGCAGGCGTGGCGATAG -3' CoxR4- 5'- TGAAGGTTTTGTTGTGAGGTGGC -3' де:У=С/Т. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2