Спосіб виявлення днк вірусу ринопневмонії коней 4 типу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб виявлення ДНК вірусу ринопневмонії коней 4 типу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) збудника за допомогою "гніздового" варіанта полімеразної ланцюгової 3 30960 циклів (Таблиця), з проведенням двох етапів, що підвищує чутливість системи індикації. На першому етапі використовують першу пару штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: Feq4 (5'-CTGCTGTCATTATGCAGGGA-3') RN2 (5'-CGCTAGTGTCATCATCGTCG-3') На другому етапі використовують другу пару штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: Feq4 (5'-CTGCTGTCATTATGCAGGGA-3') Req4 (5'-CGTCTTCTCGAAGACGGGTA-3') Відпрацьована кількість циклів з певними температурними та часовими режимами при першому і другому етапі однакові. Приклад: пробу (сироватка крові, змиви з носової порожнини, біомаса, гомогенат патологічного матеріалу тощо) (1г) поміщають у пластикову пробірку ємністю 1,5мл і додають 500мкл дистильованої води. Суміш струшують на вортексі і центрифугують, після чого проводять виділення ДНК набором реагентів для виділення ДНК. Отриману чисту ДНК (3-5мкл) поміщають у пробірку ємністю 0,5мл і додають 20мкл ПЦРбуфера, 1мкл dNTP, по 0,25мкл праймерів (для першого етапц- першу пару, для другого етапу – другу пару), 0,5мкл Tag-полімерази та 1 краплю мінерального масла. Вміст пробірки струшують і центрифугують, а потім переносять в термоциклер з активною регуляцією температури, наприклад "Терцик" (Росія), якому задають вищевказану програму (Таблиця). Після першого етапу вносять другу пару праймерів і повторюють реакцію. Аналіз результату ПЛР проводять в 1,5% гелі агарози з барвником - бромистим етідієм. В лунки агарозного геля вносять 10-12мкл ампліфікованої суміші і одна проба контрольна (маркер). Після проведення електрофорезу фрагменти ДНК згруповуються в смужки, які виявляють флуоресцентно при опроміненні ультрафіолетом. Результат ПЛР може бути оцінено візуально по наявності смужок, що відповідають продуктам реакції. Промислове застосування - для виявлення вірусу ринопневмонії коней з родини Herpesviridae типу Herpes virus equi type 4 у патологічному матеріалі, крові, культуральній рідині, змивах із носової порожнини, виготовлення вірусних вакцин. 4 1. Діагностика вирусных болезней животных: Справочник / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусов, Н.В. Фомина. – М.: Агропромиздат, 1991. – 528с. 2. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. – 2-е издп., перераб. и доп. – М.: Колос, 1999. – 272с. 3. Стегній Б.Т., Герілович А.П. та інші. Полімеразна ланцюгова реакція у практиці ветеринарної медицини. – Харків, ННЦ «ІЕКВМ», 110с. Таблиця Дані програми термоцикл еру № циклу 1 2 3 4 5 Використана література Температура 95°С 94°С 60°С 72°С 94°С 60°С 72°С 72°С 10°С Час 4хв 1хв 1хв 1хв 0,5хв 0,5хв 0,5хв 7хв Зберігання Кількість циклів 1 5 35 1