Спосіб виявлення днк вірусу ринопневмонії коней і типу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб виявлення ДНК вірусу ринопневмонії коней 1 типу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) збудника за допомогою "гніздового" варіанту полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) - ферментативної реакції і двох пар штучно синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово U 1 3 30959 синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК інфекційних агентів при певних температурних і часових параметрах та кількості циклів (таблиця 1), з проведенням двох етапів, що підвищує чутливість індикації. На першому етапі використовують першу пару штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: Feq1 - 5'-ААGАGGАGС АСGТGТТGGАТ-3' RN1 - 5'-АGТАGGТС АGGССGАТGСТТ-3' На другому етапі використовують другу пару штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: Feq1 - 5'-ААGАGGАGС АСGТGТТGGАТ-3' Req1 - 5'-ТТGААGGАСGААТАGGАСGС-3' Приклад: пробу (сироватка крові, змиви з носової порожнини, біомаса, гомогенат патологічного матеріалу тощо) (1г) поміщають у пластикову пробірку ємкістю 1,5мл і додають 500мкл дистильованої води. Суміш зтр ушують і центрифугують, після чого проводять виділення ДНК набором реагентів для виділення ДНК. Отриману чисту ДНК (3-5мкл) поміщають у пробірку ємкістю 0,5мл і додають 20мкл ПЦРбуфера, 1мкл dNTR, по 0,25мкл праймерів (відповідно до етапу відповідну пару праймерів), 0,5мкл Tag-полімерази та 1 краплю мінерального масла. Вміст пробірки струшують і центрифугують, а потім переносять в термоциклер з активною регуляцією температури, наприклад "Терцик" (Росія), якому задають вищевказану програму (таблиця 1). Аналіз результата ПЛР проводять в 1,5% гелі агарози з барвником - бромистим етідієм. В лунки агарозного геля вносять 10-12мкл ампліфікованої суміші. Після проведення електрофорезу фрагменти ДНК згруповуються в смужки, які виявляють флуоресцентно при опроміненні ультрафіолетом. Результат ПЛР може бути оцінено візуально по наявності смужок, що відповідають продуктам реакції. Промислове застосування - для виявлення вірусу ринопневмонії коней з родини Herpesviridae типу Herpes virus equi type 1 у патологічному матеріалі, крові, культуральній рідині, змивах із носової порожнини, виготовлення вірусних вакцин. 4 2. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И.Троценко, Р.В .Белоусова, Э.А. Преображенская.-2-е издп., перераб. и доп.-М.: Колос, 1999.-272с. 3. Стегній Б.Т., Герілович А.П. та інші, Полімеразна ланцюгова реакція у практиці ветеринарної медицини.-Харків, ННЦ "ІЕКВМ", 110с. Таблиця 1 Параметри програмування термоцикл еру № циклу 1 2 3 5 Температура 95°С 95°С 60°С 72°С 72°С 10°С Використана література 1. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В.Фомина.-М.: Агропромиздат, 1991.-528с. Час 4хв 0,5хв 0,5хв 1хв 7хв Зберігання Кількість циклів 1 40 1