Спосіб визначення стану риб в умовах хронічного забруднення середовища органічними ксенобіотиками

Реферат: Винахід належить до біології, екології, екотоксикології і може бути використаний для характеристики стану риб в умовах забруднення середовища. Запропонований спосіб визначення стану риб в умовах хронічного забруднення середовища органічними ксенобіотиками включає одержання контрольних проб білків головного мозку риб, які мешкають в умовно чистих водоймах, та експериментальних проб білків головного мозку риб, які мешкають у забруднених водоймах. Далі проводять імунохімічний аналіз (вестернблот) одержаних проб для визначення вмісту водорозчинного білка S100β та його поліпептидних фрагментів з молекулярними масами від 37 кДа і нижче, здійснюють порівняльний аналіз, і за відмінностями інтенсивності забарвлення відповідних поліпептидних зон між контрольними та експериментальними пробами роблять висновок про інтенсивність розвитку астрогліозу, після чого оцінюють ступінь несприятливого впливу середовища на стан риб. UA 106866 C2 (12) UA 106866 C2 UA 106866 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біології, екології, екотоксикології, зокрема до дослідження нейроглії риб, і може бути використаний для характеристики стану популяцій риб в умовах хронічного забруднення середовища органічними речовинами. Відомий спосіб кількісного визначення кальцієзв'язуючого білка S100 [1]. В останні роки білок астроглії S100 все частіше використовується як маркер пошкоджень мозкової тканини людини. У тварин S100 здатен виявляти як трофічну, так і токсичну дію. Зокрема, наномолярні концентрації білка іn vitro стимулюють зростання аксонів, підвищують життєздатність нейронів, запобігають апоптозу. У той же час, мікромолярні концентрації білка S100 мають протилежну дію: стимулюють експресію прозапальних цитокінів та індукцію апоптозу, що підтверджує поліфункціональність S100 і його участь у різних функціях нервової тканини [2]. Недоліком аналога є те, що вміст S100 не пов'язують з функціями гліальних клітин, які спрямовані на захист нейронів ЦНС від дії пошкоджуючих факторів. Відомо, що гліальні клітини надзвичайно чутливі до змін нейрональної активності та є головними клітинними типами, які мають метаболічні та фізіологічні властивості щодо підтримки життєздатності і функціонування нейронів. На зростання активності нейронів клітини нейроглії відповідають підвищенням внутрішньоклітинної концентрації кальцію, що призводить до виходу з глії медіаторів, які викликають зворотну регуляцію активності нейронів. Однак, різке підвищення у цитозолі та ядерному матриксі концентрації вільного Са2+ сприяє наступному розвитку клітинної патології [3]. Найближчим прототипом винаходу є відомий спосіб визначення вмісту водорозчинної фракції гліального фібрилярного кислого білка (ГФКБ) мозку риб [4]. Спосіб використовується у діагностиці стану природного середовища та включає одержання контрольних проб цитозольних білків головного мозку риб, що мешкають в умовно чистих водоймах, імунохімічний аналіз для визначення вмісту ГФКБ, проведення досліджень з біологічним матеріалом, який отримало з головного мозку риб з забруднених водойм, виконання порівняльного аналізу, визначення ступеня забруднення природного середовища за змістом ГФКБ у контрольних та експериментальних пробах. В основу винаходу поставлено задачу розширити спектр молекулярних маркерів нейроглії риб для підвищення достовірності визначення метаболічних порушень у мозку риб на різних стадіях інтоксикації. Поставлена задача вирішується тим, що заздалегідь отримують контрольні проби цитозольних білків головного мозку риб, які мешкають в умовно чистих водоймах, проводять імунохімічний аналіз для визначення вмісту білка, потім ті ж самі дослідження проводять з біологічним матеріалом, який отриманий з головного мозку риб з водойм, що забруднені органічними ксенобіотиками, виконують порівняльний аналіз цих проб, визначають рівень розвитку реактивного гліозу. При проведенні імунохімічного аналізу як молекулярний біомаркер використовують водорозчинний білок S100 і його поліпептидні фрагменти з молекулярними масами від 37 до 23 кДа, по забарвленню відповідних поліпептидних зон між контрольними та експериментальними пробами судять про вміст білка, за яким оцінюють ступінь несприятливого впливу середовища на стан риб. Запропонований спосіб пояснюється кресленнями: Фіг. 1. Відносний вміст S100 в мозку бичка-пісочника із незабрудненої ділянки іхтіологічного заповідника - 1; бичка-пісочника - 2 із забруднених нафтопродуктами ділянок бухти Керченська (колонка 1 прийнята за 100 % відносно колонки 2); Фіг. 2. Імуноблотинг S100 фракцій цитозольних білків з мозку бичка-пісочника. 1 незабруднена ділянка іхтіологічного заповідника; 2 – забруднена ділянка б. Керченська. Фіг. 3. Відносний вміст S100 в мозку карася контрольної групи - К та за умов хронічного забруднення хлорбензолом - ХБ. Фіг. 4. Імуноблотинг S100 фракцій цитозольних білків з мозку карася контрольної групи - К та за умов хронічного забруднення хлорбензолом - ХБ. Фіг. 5. Відносний вміст S100 в мозку сонячного окуня контрольної групи - К та за умов хронічного забруднення мазутом - М. Фіг. 6. Імуноблотинг S100 фракцій цитозольних білків з мозку сонячного окуня контрольної групи - К та за умов хронічного забруднення мазутом - М. Запропонований спосіб здійснюють наступним чином. Проводять відбір екземплярів риб з водного середовища, забрудненого органічними речовинами. Біологічний матеріал отримують декапітацією за методикою, яка використовується для роботи з дрібними тваринами. Після декапітації головний мозок риб гомогенізують (на холоді) в 10-ти кратному об'ємі 50 мМ трис-буфера рН 7,8, що містить 2 мМ 1 UA 106866 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 етилендіамінтетроацетат (ЕДТА), 1 мМ 2-меркаптоетанол, 0,1 мМ фенілметилсульфонілфторид (PMSF) і 5 мМ соєвого інгібітора трипсину. Гомогенат центрифугують 50 хв при 60000 g. Після центрифугування відбирають надосадову фракцію, що містить цитозольні білки. Визначення поліпептидного складу проводять за допомогою імуноблотингу. На першому етапі білки поділяють методом електрофорезу в градієнті поліакриламідного гелю (5-20 %) з 0,1 % додецилсульфатом натрію. На другому етапі - переносять білкові зони з гелю на нітроцелюлозну мембрану і виявляють специфічні білки в імунохімічній реакції з використанням поліклональної моноспецифічної антисироватки в розведенні 1:1500. Відносну інтенсивність забарвлення поліпептидних зон виявляють за допомогою комп'ютерної обробки сканованих результатів імуноблотингу. Кількісний аналіз вмісту білка S100 проводять шляхом порівняння інтенсивності забарвлення відповідних поліпептидних зон між експериментальними і контрольними пробами, які віднесені до кількості загального білка у фракціях. Вміст загального білка визначають методом Лоурі в модифікації Міллера. Обробку отриманих даних проводять методом математичної статистики для малих вибірок. Відносний вміст білка S100 виражають у вигляді середньої величини ± стандартна похибка середньої, достовірну відмінність між групами оцінюють із застосуванням t-критерію Стьюдента (Р