Спосіб визначення стану популяцій риб в умовах забруднення середовища іонами металів

Реферат: Винахід належить до біології, екології, екотоксикології, зокрема до дослідження реактивного астрогліозу в мозку риб, і може бути використаний для характеристики стану популяцій риб в умовах забруднення середовища. Заявлено спосіб визначення стану популяцій риб в умовах забруднення середовища іонами металів, що включає відбір і проведення аналізу біологічного матеріалу, при цьому попередньо одержують контрольні проби цитоскелетних білків головного мозку риб з умовно чистих водойм, які екстрагують з біологічного матеріалу за допомогою 4-и кратного об′єму трис-буфера, що додатково містить 4М сечовину, ті ж самі проби цитоскелетних білків одержують з головного мозку риб, що мешкають у забруднених іонами металів водоймах - експериментальні проби, проводять імунохімічний аналіз проб для визначення вмісту водонерозчинної (цитоскелетної) форми гліального фібрилярного кислого білка з молекулярною масою 49 кДа і його поліпептидних фрагментів з молекулярними масами від 37 до 49 кДа та виконують порівняльний аналіз за відмінностями інтенсивності забарвлення відповідних поліпептидних зон між контрольними і експериментальними пробами. UA 106145 C2 (12) UA 106145 C2 UA 106145 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до біології, екології, екотоксикології, зокрема до дослідження нейроглії риб, і може бути використаний для характеристики стану популяцій риб в умовах забруднення середовища іонами металів. Найбільш близьким об'єктом того ж призначення до винаходу, що заявляється, є спосіб оцінки виливу забруднювачів водного середовища на стан популяцій риб, який ґрунтується на біологічному аналізі, в ході якого візуально спостерігаються фенотип риб, аналізуються морфологічні характеристики, виявляються екземпляри з різними морфологічними та фізіологічними абераціями. Суттєвим недоліком прототипу є те, що морфологічні аномалії не виявляються на ранніх стадіях дії забруднювачів і не можуть служити біомаркерами ступеня впливу іонів металів на стан популяцій риб в умовах забруднення ними середовища [1, 2]. В основу винаходу поставлено задачу розробити такий спосіб визначення метаболічних порушень, який дозволить диференціювати міру несприятливого впливу іонів металів на стан популяцій риб на різних, у тому числі і ранніх, стадіях інтоксикації. Поставлена задача вирішується тим, що заздалегідь отримують контрольні проби цитоскелетних білків головного мозку риб, які мешкають в умовно чистих водоймах, проводять імунохімічний аналіз для визначення вмісту ГФКБ з молекулярною масою 49 кДа і його поліпептидних фрагментів з молекулярними масами від 37 до 49 кДа, потім ті ж самі дослідження проводять з біологічним матеріалом, який отриманий з головного мозку риб з водойм, що забруднені іонами металів, виконують порівняльний аналіз, за інтенсивністю забарвлення відповідних поліпептидних зон між контрольними і експериментальними пробами судять про вміст і склад ГФКБ, визначають інтенсивність розвитку астрогліозу, за яким оцінюють міру несприятливого впливу середовища на стан риб. Запропонований спосіб полягає в наступному. Проводять відбір екземплярів риб з водного середовища, забрудненого іонами металів. Біологічний матеріал отримують декапітацією за методикою, яка використовується для роботи з дрібними тваринами. Після декапітації головний мозок риб гомогенізують (на холоді) в 10-ти кратному об'ємі 50 мМ трис-буфера рН 7,8, що містить 2 мМ етилендіамінтетроацетат (ЕДТА), 1 мМ 2-меркаптоетанон, 0,1. мМ фенілметилсульфонілфторид (PMSF) і 5 мМ соєвого інгібітору трипсину. Гомогенат центрифугують 50 хв при 60000 g. Після центрифугування відбирають з надосадової рідини фракцію водорозчинних білків. Для екстракції цитоскелетних білків до отриманого осаду додають 4-и кратний об'єм трис-буфера, що додатково містить 4М сечовину. Після центрифугування впродовж 60 хв при 60000 g відбирають фракцію водорозчинних білків. Білки розділяють методом електрофорезу в градієнті поліакриламідного гелю (7-18 %) з 0,1 % додецилсульфатом натрію. Визначення поліпептидного складу гліальних філаментів проводять за допомогою імуноблотингу з використанням поліклональної моноспецифічної антисироватки в розведенні 1:2500. Відносну інтенсивність щільності забарвлення поліпептидних зон виявляють за допомогою комп'ютерної обробки сканованих результатів імуноблотингу. Кількісний аналіз ГФКБ проводять шляхом порівняння інтенсивності забарвлення відповідних поліпептидних зон між експериментальними і контрольними пробами, які віднесені до кількості загального білка у фракціях. Вміст загального білка, визначають методом Лоурі в модифікації Міллера. Обробку отриманих даних проводять методом математичної статистики для малих вибірок. Відносний вміст ГФКБ виражають у вигляді середньої величини ± стандартна похибка середньої, достовірну відмінність між групами оцінюють із застосуванням t-критерію Стьюдента (Р