Спосіб прогнозування перебігу хронічного гломерулонефриту

Реферат: Спосіб прогнозування перебігу хронічного гломерулонефриту включає дослідження HLAфенотипу. В сироватці крові додатково досліджують вміст прозапальних цитокінів. UA 107452 U (12) UA 107452 U UA 107452 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб належить до медицини, а саме до нефрології, і може бути використаний для визначення факторів ризику перебігу хронічного гломерулонефриту з нефротичним синдромом. Збільшення числа хворих з хронічною хворобою нирок і пошук способів запобігання її розвитку, а також уповільнення прогресування лишається однією з найбільш сучасних проблем медицини. Актуальними та такими, що мають важливу практичну спрямованість, є дослідження механізмів розвитку імунних уражень нирок, і великий інтерес викликають питання їх генетичної детермінованості, що обґрунтовує необхідність визначення предикторів виникнення гломерулонефриту та формування його хронічного перебігу. Відомо, що антигени головного комплексу гістосумісності (HLA) грають важливу роль в підвищенні ризику деяких захворювань. Виявлення таких асоціацій спонукає до розробки нових підходів до профілактики і лікування хронічного гломерулонефриту. Відомий спосіб (1), який включає тестування HLA-A і HLA-B антигенів у дітей з хронічним гломерулонефритом та виявлена більша частота HLA-B12 в порівнянні з контрольною групою здорових дітей, і у них рецидив захворювання був частішим, ніж в групі без цього антигену. Недоліком способу є визначення антигенів-провокаторів для виникнення та рецидивування хронічного гломерулонефриту у дітей, а не дорослих осіб, без урахування особливостей фенотипів як хворих, так і групи порівняння здорових донорів саме української популяції (імуногенетики вважають необхідним визначати асоціації між системою HLA і патологічним станом в рамках популяцій і етнічних груп, частота розподілу антигенів в яких може суттєво відрізнятися). Відомий також спосіб прогнозування виникнення захворювання нирок (2), взятий за прототип, який включає виявлення асоціацій HLA-антигенів з хронічною хворобою нирок, що дозволяє прогнозувати виникнення хронічного гломерулонефриту та пієлонефриту, показано також, що антигени-провокатори хронічного гломерулонефриту - А23, А24, А28, А29, В8, 38, 44, протектори - В12 та В16, в той же час, HLA забезпечують функціональну взаємодію практично всіх імунокомпетентних клітин, і зв'язок системи HLA з захворюваннями обумовлений в тому числі асоціацією між певними генами цього комплексу і станом імунітету. Недоліком способу є те, що автори не враховують асоціації HLA з системою цитокінів і тому не надають можливості комплексної оцінки прогнозування не тільки виникнення хронічного гломерулонефриту, але й виявлення, на основі додаткових прогнозонегативних предикторів, пацієнтів з ризиком незадовільної відповіді на лікування та, відповідно, хронічного торпідного перебігу захворювання. На сьогодні, на генетично-молекулярному рівні, визначено новий рівень контролю варіабельності функціонування імунної системи, а саме антиген-неспецифічної регуляції імунної відповіді, показано також, що у формуванні імунної відповіді, окрім генів HLA, важливе місце займають поліморфні гени цитокінів, їх рецепторів та антагоністів. Взаємозв'язок між HLAфенотипом і схильністю до синтезу імунокомпетентними клітинами цитокінів є підставою для прогнозу перебігу захворювання та індивідуалізованого підходу до призначення терапевтичних препаратів, таким чином, особливість фенотипу системи HLA у пацієнта визначає схильність не тільки до хвороб нирок, в тому числі гломерулонефрит, але й до його хронічного перебігу з особливостями реакції на лікування. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб прогнозування перебігу хронічного гломерулонефриту шляхом визначення HLA і рівня прозапальних цитокінів крові та у разі наявності в HLA-фенотипі антигенів А23, А24, А28, В8, В38, В41, В44 і високого фонового рівня прозапальних цитокінів IL-17, TNF- і МСР-1, що не знижуються в процесі терапії, відносять хворих до групи ризику негативної відповіді на лікування з більш складним перебігом хронічного гломерулонефриту. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб прогнозування перебігу хронічного гломерулонефриту, який включає дослідження HLA-фенотипу, згідно з корисною моделлю, в сироватці крові додатково досліджують вміст прозапальних цитокінів та у разі наявності в HLAфенотипі одного (або більше) з антигенів А23, А24, А28, В8, В38, В41, В44 і високого фонового рівня хоча б одного з прозапальних цитокінів IL-17 (>25 пкг/мл), TNF- (>60 пкг/мл) і МСР-1 (>250 пкг/мл), що не знижуються в процесі терапії, прогнозують незадовільну відповідь на лікування з більш складним перебігом хронічного гломерулонефриту. Запропонований спосіб виконують наступним чином: проводять типування лімфоцитів крові і визначення розподілу комплексу антигенів І і II класів - HLA-A, В антигенів у хворих за методом стандартного лімфоцитотоксичного тесту на планшетах Терасакі із застосуванням спеціальної панелі анти-HLA сироваток (3), лімфоцити периферичної крові вилучають за методом А. Воуum, забір крові об'ємом 5-10 мл здійснюють шляхом венепункції у скляні силіконовані пробірки, в які містять розчин гепарину, розведеного середовищем 199 у відношенні 1:9, або антикоагулянт 1 UA 107452 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ЕДТА, об'єм венозної крові розводять середовищем 199 у співвідношенні 1:1, м'яко піпетують для одержання однорідної консистенції розчину й акуратно нашаровувають на розчин фіколверографіну (=1,077), весь об'єм розведеної венозної крові (10-20 мл) нашаровують на фіколверографін, розлитий у дві центрифужні пробірки об'ємом 4-5 мл, після центрифугування за швидкості 1500 об./хв. на центрифузі ОПН-3 протягом 25 хвилин акуратно відбирають пастерівською піпеткою весь лімфоцитарний шар в інтерфазі та обробляють 0,83 % розчином NH4Cl протягом 10 хвилин для повного лізису еритроцитів, одержані лімфоцити відмивають двічі середовищем 199 в об'ємі 8-10 мл, центрифугують 10 хвилин за v=1500 об./хв., одержаний лімфоцитарний осад розводять 3-5 мл середовища 199, клітини підраховують у камері Горяєва 6 та доводять до концентрації 2-4×10 /мл, HLA-фенотип хворих визначають за стандартним методом лімфоцитотоксичного тесту на планшетах Терасакі із застосуванням спеціальної панелі анти-HLA сироваток (20 антигенів локусу А, 31 - В і 9-DR), гістотипуючі сироватки розкапують в лунки планшетів Терасакі під вазелінове масло по 1 мкл та зберігають при t=20 °C, лімфоцитарну суміш мікрошприцом закапують у планшетки по 1 мкл в кожну лунку та інкубують при t+37 °C 30 хвилин, потім у кожну лунку добавляють по 5 мкл кролячого комплементу та витримують 1 годину при t+37 °C, після інкубації вазелін витряхують і в кожну лунку закапують по 3 мкл 5 % трипанового синього, через 3 хв. закапують 5 мкл 40 % формальдегіду та через 15 хв. під мікроскопом проводять облік інтенсивності цитотоксичної реакції. Результати реакції трактують шляхом підрахунку % "мертвих" (профарбованих) лімфоцитів в кожній лунці. Інтерпретація результатів реакції. 0-15 % "мертвих"- негативний результат; 16-20 % -"- слабо позитивний результат (+); 21-50 %- " - позитивний результат (+ +); 51-75 % - " - виражений позитивний результат (+ + +); 76-100 %-" - різко позитивний результат (+ + + +). Для виявлення антигенів-провокаторів достовірність різниці у частоті визначення HLAантигенів, що порівнюють, оцінюють за допомогою критерію хі-квадрат для таблиць 2×2. Величину відносного ризику захворювання (RR) визначають за коефіцієнтом: RR=аб/вг, де а кількість хворих, позитивних за даним антигеном, б - кількість осіб у контролі, негативних за даним антигеном, в - кількість хворих, негативних за даним антигеном, г - кількість осіб у контролі, позитивних за даним антигеном. При цьому значимими вважають показники RR>2,0 (3). Етіологічну фракцію (атрибутивний ризик, σ) підраховують за формулою: σ=х-у/1-у, де х - частота антигену у хворих, а у - частота у здорових. Даний показник дає можливість об'єктивно оцінити причинну роль у етіопатогенезі захворювання одного з декількох антигенів-провокаторів, для яких RR складав >2,0. Достовірним вважають показник σ>0,1 (3). У хворих також досліджують рівні прозапальних цитокінів крові IL-17, TNF- і МСР-1 у сироватках методом ІФА з тест-системами наступним чином: до 96-лункових планшет додавали: по 100 мкл стандартів в відповідні лунки для побудови калібрувальної кривої, в інші лунки вносять по 100 мкл сироватки, що досліджувалася, в усі лунки додають по 50 мкл відповідних антицитокінових антитіл, планшети інкубують при кімнатній температурі протягом 2 годин, потім лунки 5 разів ретельно промивають буфером і видаляють залишки рідини, далі в кожну лунку вносять по 100 мкл кон'югату (стрептовідін-пероксидазу), включаючи "нульову" пробу, після чого проби інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хвилин, повторюють промивку планшети 5 разів та вносять до всіх лунок по 100 мкл ТМВ-субстрату (хромогену) агента, що утворює кольори, після інкубації протягом 12-15 хвилин зупиняють ферментативносубстратну реакцію, додаючи в кожну лунку по 100 мкл H2SO4, далі проводять визначення оптичної щільності стандартів та зразків сироваток на аналізаторі при 405-620 нм, на підставі показників оптичної щільності стандартів з відомими концентраціями речовини автоматично проводять перерахунок показників у одиниці концентрації. Результати виражають в одиницях маси (пкг) на одиницю об'єму (мл). Апробація способу, що заявляється, проведена у відділі нефрології та діалізу і лабораторії імунології ДУ "Інститут нефрології АМН України" у 96 пацієнтів віком від 27 до 48 років з попереднім діагнозом гломерулонефрит, нефротичний синдром, які підтверджено морфологічно. Дослідження прозапальних цитокінів у хворих на хронічний гломерулонефрит з нефротичним синдром дозволили виявити їх вплив на перебіг захворювання і показати, що у 2 UA 107452 U 5 10 15 20 25 30 хворих з повною або частковою клініко-лабораторною ремісією середні рівні IL-17 до лікування достовірно нижче (р60 пкг/мл, що в 2 рази перевищує норму) увійшло 72 хворих, а в 2 гр. з більш низьким рівнем - 24. Різниця між групами достовірна відповідно, 88,21 [72,8,5; 102,6] проти 47 [25,5; 55] пкг/мл (р250 пкг/мл, що в 2 рази вище норми) проти 132,8±15,5 пкг/мл в 2 гр. (р