Спосіб інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран

Реферат: Спосіб інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран включає визначення перекисної резистентності еритроцитів, проникності еритроцитарних мембран, перекисного гемолізу еритроцитів та активності каталази у сироватці крові. Додатково розраховують індекс інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран як суми співвідношення показників перекисної резистентності еритроцитів, проникності еритроцитарних мембран, перекисного гемолізу еритроцитів та активності каталази сироватки крові хворих до аналогічних показників контролю (середні значення), поділеної на кількість доданків. Якщо величина індексу інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран дорівнює 1,0, це свідчить про відсутність порушень резистентності еритроцитарних мембран. Якщо цю величину реєструють вищою за 1,0 - про наявність як функціональних, так і структурних порушень резистентності еритроцитарних мембран та необхідність корекції лікувальних заходів. UA 108929 U (12) UA 108929 U UA 108929 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб належить до галузі медицини, зокрема до лабораторної діагностики (клінічної біохімії), і може бути використаним для інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран як в клініці, так і в експерименті, як у дорослих, так і у дітей та прогнозування на цій підставі перебігу хвороби та оптимізації лікувальних заходів. Нефрогенна анемія є одним із серйозніших ускладнень хронічної хвороби нирок, яке характеризується, з одного боку, прискореним руйнуванням еритроцитів зі зниженням гемоглобіну, гематокриту, сироваткового заліза та трансферину, а з іншого - зменшеною продукцією еритропоетину нирками, яка неспроможна нормалізувати кількість еритроцитів. Анемія негативно впливає на перебіг основної хвороби, якість життя хворих та серцеву функцію. Однак тільки поповненням недостатності еритропоетину та усунення дефіциту заліза не є достатнім, необхідні заходи, що підвищують резистентність еритроцитів та зменшують в такий спосіб їх гемоліз. Резистентність - це властивість еритроцитів протистояти руйнуванню. Еритроцити, як відомо, приймають безпосередню участь у системі гомеостазу організму, а еритроцитарна ланка крові перша реагує на патологічний процес у разі різних захворювань. На сьогодні активно ведеться пошук інтегрального показника для оцінки резистентності еритроцитарних мембран як у відношенні узагальненої міри їх метаболічної відповіді на патологічний процес (наприклад в нирках), так і у відношенні розробки об'єктивних показань щодо застосування протианемічної та мембраностабілізуючої терапії. Відомий спосіб визначення проникності і перекисного гемолізу еритроцитів в одній пробі крові (1), значення яких відображають графічно у вигляді кривої, а діагностична значущість результатів залежить від тієї частини кривої, де реєструють відхилення від нормальних значень. Недоліком способу є його трудомісткість, а також те, що дослідження дозволяє оцінити тільки два показники, що характеризують стан еритроцитарних мембран, що виключає комплексну та узагальнену оцінку цього стану, тобто відсутня його інтегральна оцінка. Крім цього, автори основну увагу приділяють технічному удосконаленню визначення цих показників шляхом детального описування методу їх визначення в одній пробі крові. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб комплексної оцінки резистентності еритроцитів у хворих на хронічну хворобу нирок УД стадії з анемією, які лікуються діалізною нирковозамісною терапією різної модальності, взятий нами за прототип (2), який включає визначення комплексу показників: перекисну резистентність, проникність еритроцитарних мембран, перекисний гемоліз еритроцитів та активність каталази сироватки крові як об'єктивних та інформативних показників стану еритроцитарних мембран. Недоліком способу є те, що визначають чотири різноспрямовані показники (при порушенні резистентності еритроцитів перекисна резистентність еритроцитів зменшується, а проникність еритроцитарних мембран, перекисний гемоліз та активність каталази сироватки крові, навпаки, збільшуються), що затруднює узагальнену інтерпретацію одержаних результатів, тобто відсутня спроба дати інтегральну оцінку резистентності еритроцитарних мембран в цілому. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран шляхом визначення перекисної резистентності еритроцитів, проникності еритроцитарних мембран, перекисного гемолізу еритроцитів та активності каталази у сироватці крові як компонентів функціонального (за показником проникності еритроцитарних мембран) та структурного стану еритроцитарних мембран (за показниками перекисної резистентності еритроцитів, перекисного гемолізу еритроцитів та активності каталази сироватки крові) та для більш вираженої інформативності та індивідуалізації дослідження - введення математичного розрахунку інтегрального показника, що дорівнює сумі співвідношень перелічених показників особи, що досліджується, до аналогічних показників контролю (середні значення), поділеної на кількість доданків, що, в свою чергу, може бути підґрунтям щодо використання цього показника залежно від його кількісних величин як інтегрального параметра для своєчасної діагностики порушень резистентності еритроцитарних мембран, оцінки на цій підставі перебігу та прогнозу хвороби, ефективності лікувальних заходів, тобто використовувати цей показник, з одного боку, як діагностичний критерій, а з іншого - як критерій ефективності лікування. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран, що включає визначення перекисної резистентності еритроцитів, проникності еритроцитарних мембран, перекисного гемолізу еритроцитів та активності каталази у сироватці крові, згідно з корисною моделлю, додатково розраховують індекс інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран як суму співвідношень показників перекисної резистентності еритроцитів, проникності еритроцитарних мембран, перекисного гемолізу еритроцитів та активності каталази сироватки крові хворих до аналогічних показників контролю (середні значення), поділеної на кількість доданків, та, якщо величина індексу інтегральної 1 UA 108929 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 оцінки резистентності еритроцитарних мембран дорівнює 1,0, то це свідчить про відсутність порушень резистентності еритроцитарних мембран, якщо ця величина реєструється вищою за 1,0 - про наявність як функціональних, так і структурних порушень резистентності еритроцитарних мембран та необхідність корекції лікувальних заходів. Спосіб інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран виконують наступним чином: - для визначення перекисної резистентності еритроцитів проводять підготовку біоматеріалу для аналізу: венозну кров з антикоагулянтами попередньо центрифугують при 1500g, видаляють плазму, для аналізу використовують еритроцити, які тричі промивають фізіологічним розчином; хід визначення: для дослідної проби 1 у центрифужні пробірки на 10 мл вносять 1 мл суспензії еритроцитів, додають 0,08 мл 0,2 % розчину азиду натрію, 1 мл 0,68 % розчину пероксиду водню; для дослідної проби 2 - визначення 100 % гемолізу еритроцитів - у центрифужні пробірки на 10 мл вносять 1 мл суспензії еритроцитів, додають 0,08 мл 0,2 % розчину азиду натрію, 1 мл 0,68 % розчину пероксиду водню та 0,1 мл 4 % розчину сапоніну; контрольна проба - для визначення спонтанної перекисної резистентності еритроцитів - у центрифужні пробірки на 10 мл вносять 1 мл суспензії еритроцитів, додають 0,08 мл 0,2 % розчину азиду натрію, 1 мл 0,1М фосфатного буферу, рН 7,4; усі проби інкубують при 37° С протягом 1 години, після чого проби центрифугують 10 хв при 2000 об/хв, до 0,3 мл супернатанту додають 2,7 мл 0,02 % розчину калію залізосиньородистого, вимірюють оптичну щільності проб на КФК-3 при 541 нм відносно розчину калію залізосиньородистого. . Розраховують за формулою: А = 100 (Е1 - Е3)/(Е2 - Е3) та виражають в умовних одиницях, де Е 1 дослідна проба 1, Е2 - дослідна проба 2, Е3 - контрольна проба; визначення проникності еритроцитарних мембран (осмотичної стійкості еритроцитів), для чого готують а) розчин хлориду натрію (ізотонічний) 0,15 моль/л, який отримують розчиненням 9 г хлористого натрію віл дистильованої води та б) розчин сечовини (ізотонічний) 0,3 моль/л, для чого 18 г сечовини розчиняють віл дистильованої води; з двох основних розчинів готують ряд розведень відповідно до схеми: розчин 1-40 мл розчину сечовини и 60 мл розчину NaCl, розчин 2 - відповідно 45 та 55 мл, розчин 3-50 та 50 мл, розчин 4-55 та 45 мл, розчин 5-60 та 40 мл, розчин 6-65 мл розчину сечовини і 35 мл розчину NaCl, розчин 7-100 мл розчину сечовини первинної концентрації; хід визначення: еритроцити тричі відмивають охолодженим ізотонічним розчином хлористого натрію, для чого до осаду еритроцитів додають подвійний об'єм фізіологічного розчину, пробу центрифугують та відбирають надосадову рідину; визначену процедуру повторюють тричі; до 0,3 мл суспензії еритроцитів додають 0,6 мл ізотонічного розчину; до семи центрифужних пробірок додають по 5,0 мл розчинів сечовини різної концентрації (виготовлених за вищезазначеною схемою), до змісту кожної пробірки додають по 0,1 мл отриманої суспензії еритроцитів, перемішують та через 10 хвилин центрифугують на протязі 10 хвилин при 1500 об/хв. Вимірюють оптичну щільність центрифугату по відношенню до дистильованої води при 540 нм в кюветі з довжиною оптичного шляху 1 см; розрахунок результатів отримують, беручи абсорбцію змісту 7-ої пробірки (первинний розчин сечовини) за 100 % гемоліз; ступінь гемолізу у кожній пробірці (у %) розраховують по відношенню до оптичної щільності еталону (вмісту 7-ої пробірки, тобто розчину сечовини первинної концентрації) шляхом розв'язання пропорції за "трійним" правилом; результат виражають у відсотках; визначення перекисного гемолізу еритроцитів, хід визначення: 0,1 мл свіжої крові вносять у центрифужну пробірку, що містить 7,5 мл охолодженої буферної суміші (ОДМ фосфатний буфер, рН 7,4 з 17 % NaCl), центрифугують, виділяють осад, який розводять ще раз 7,5 мл буфера і по 1 мл цієї суспензії еритроцитів розливають у дві пробірки, що містять по 4 мл буферу й одну з 4 мл дистильованої води (контрольна проба - абсолютний гемоліз). Усі проби піддають термостатуванню при t=37±0,1 °C протягом 4±0,25 годин, після чого центрифугують при 1500 об/хв протягом 10 хв і вимірюють оптичну щільність надосадової рідини на фотоелектроколориметрі - ФЕК (540нм, кювети 10 мм); величину гемолізу у відсотках розраховують за формулою: [(екстинкція проби 1 + екстинкція проби 2) / 2 екстинкції контрольної проби] × 100 %, де: екстинкція - це оптична щільність досліджуваної або контрольної проби; визначення активності каталази у сироватці крові, хід визначенні. в пробірку (дослід) вносять 0,1 мл сироватки крові, додають 2 мл розчину пероксиду водню, перемішують та залишають стояти 10 хв при кімнатній температурі, потім додають 1 мл молібдату амонію та відразу ж визначають оптичну густину суміші на СФ-26 при λ 410 нм проти контролю, який містить 0,1 мл води замість сироватки крові; активність каталази розраховують за формулою: А = (Ак - Ад)·V·t·K, де 2 UA 108929 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 А - активність каталази в мкат/л (кат = моль /сек); Ак та Ад - екстинції контрольної та дослідної проб; V - об'єм проби (0,1 мл); t - час інкубації (600 с); К - коефіцієнт ммолярної 3 -1 -1 екстинції Н2О2=22,2·10 мM : cм ; розрахунок індексу інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран (ІРЕМ) як сума співвідношень показників перекисної резистентності еритроцитів, проникності еритроцитарних мембран, перекисного гемолізу еритроцитів та активності каталази сироватки крові хворих до аналогічних показників контролю (середні значення), поділеної на кількість доданків, за формулою: ІРЕМ = [(ПРХ/ПРК + ПЕМХ/ПЕМК + ПГУПГК + КТХ/КТК): 4], де ІРЕМ - індекс резистентності еритроцитарних мембран; ПР Х - перекисна резистентність еритроцитів хворого, ПРК - перекисна резистентність еритроцитів контролю (середнє значення); ПЕМХ - проникність еритроцитарних мембран хворого; ПЕМ К - проникність еритроцитарних мембран контролю (середнє значення); ПГ Х - перекисний гемоліз хворого; ПГК - перекисний гемоліз контролю (середнє значення); КТ Х - активність каталази сироватки крові хворого; КТ К активність каталази сироватки крові контролю (середнє значення); 4 - кількість доданків. Необхідність визначення та використання у запропонованій формулі розрахунку індексу інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран показника проникності еритроцитарних мембран викликана тим, що саме цей показник характеризує функціональний стан мембран еритроцитів - їх проникність для іонів та інших речовин, а визначення та використання у формулі, що пропонується, показників перекисної резистентності еритроцитів та перекисного їх гемолізу дозволяє констатувати структурний стан мембран еритроцитів стійкість до факторів, що викликають гемоліз. Враховуючи той факт, що каталаза є ферментом антипероксидного захисту, міститься переважно в еритроцитах (в сироватці крові в незначній кількості) і відповідає за утилізацію пероксиду водню, суттєве підвищення її активності обумовлено перш за все вивільненням ферменту з еритроцитів при їх руйнації. Ось чому даний показник може також використовуватися як один із маркерів резистентності (стійкості) еритроцитів, а його збільшення характеризує підвищення гемолітичних процесів. Отже, перелічені показники є представниками різних ланок системи резистентності еритроцитарних мембран та у сумі дають узагальнюючу відповідь цієї системи на вплив різних патологічних чинників в цілому. Урахування ж загальної відповіді захисної системи резистентності еритроцитарних мембран на накопичення токсичних метаболітів у сироватці крові з обчисленням кількості доданків слугує для більш вираженої об'єктивізації способу, що заявляється, тобто надає отриманим результатам більшої інформативності в інтегральній оцінці стану резистентності еритроцитарних мембран у кожного хворого. Апробація способу, що заявляється, проведена у відділі нефрології та діалізу, у відділі еферентних технологій та у лабораторії біохімії ДУ "Інститут нефрології НАМН України" у 30 практично здорових осіб віком від 19 до 63 років з нормальними аналізами крові та сечі та без захворювань нирок в анамнезі (група контролю) та у 54 пацієнтів того ж віку із верифікованим діагнозом - хронічна хвороба нирок УД стадії. Всіх пацієнтів поділено на наступні групи: 1 група 29 хворих, яких лікують методом гемодіалізу, 2 група - 25 хворих, яких лікують методом перитонеального діалізу. Отримані результати показали, що в групі контролю (К) перекисна резистентність еритроцитів за середніми значеннями становить 42±7,8 ум. од., проникність еритроцитарних мембран - 10,0±1,0 %, перекисний гемоліз еритроцитів -2,07±0,46 %, активність каталази сироватки крові - 16,6±1,5 мкат/л. Застосування запропонованого способу показало, що індекс інтегральної оцінки резистентності еритроцитарних мембран (ІРЕМ) в групі контролю за середніми значеннями дорівнює 1,03±0,023, в 1 групі пацієнтів - 2,36±0,24; в 2 групі - 1,37±0,13 (р1-к