Спосіб виявлення дезоксирибонуклеїнової кислоти (днк) шигатоксинпродукуючих бактерій е. coli (stec)

Реферат: Спосіб виявлення дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) шигатоксинпродукуючих бактерій E. coli (STEC) включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) за допомогою мультиплексного варіанта полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для проведення ПЛР використовують штучно синтезовані олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю нуклеотидів: для гена токсину stx2 dF1-stx2 5'-CCATGACAACGGACAGC AGT-3' dR3-stx2 5'-ATCTGACATTCTGGTTGACTCTCTTC-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується, - 466 пар нуклеотидів; для гена токсину stxl dstxl-r3 5'-CGCACTGAGAAGAAGAGACTGAAG-3' dF-stx1 5'-ATGTAATGACTGCTGAAGATGTTGAT-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується, -512 пар нуклеотидів; для гена інтиміну еае dF2-eae 5'-CGCTCTTGGTATSGCTRGYA-3' (R=A/G, Y=C/T, S=C/G) dR2-eae 5'-GTCTCGCCAGTATTCGCCAC-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується - 325 пар нуклеотидів. UA 112623 U (12) UA 112623 U UA 112623 U 5 10 15 20 25 Корисна модель належить до мікробіології (медичної та ветеринарної), зокрема до лабораторної діагностики, призначений для виявлення специфічних фрагментів нуклеїнових кислот (ДНК) шигатоксинпродукуючих бактерій E. coli (STEC-Shiga toxin-producing E. соli), може бути використана в діагностичних дослідженнях по виявленню та ідентифікації ентерогеморагічних ізолятів E. coli, як лабораторний тест по виявленню забруднення сировини в харчовій промисловості, в науково-дослідних роботах, в біотехнологічному виробництві. Кишкова паличка (E. coli) - бактерія, яка зазвичай знаходиться в кишечнику людей і теплокровних тварин. Більшість штамів кишкової палички нешкідливі. Однак деякі штами, зокрема STEC, продукують шигатоксин, який є одним з найсильніших токсинів, відомих людині. До складу STEC входять високопатогенні серовари E. coli: O157:H7 O26, O45,055, О103, O111, O113, О117, O121, O145, які можуть спричиняти тяжкі хвороби харчового походження. На міжнародному рівні існує вимога щодо тестування STEC для забезпечення безпечності харчових продуктів (Орган з безпечності харчових продуктів у США (FSIS) та Європейська асоціація з безпечності харчових продуктів (EFSA) [1, 3]. У той же час, в Україні швидкі методи ідентифікації STEC на даний час відсутні. Високоспецифічні, швидкі, високочутливі методи виявлення збудників інфекційних захворювань надзвичайно важливі як для охорони здоров'я населення так і з економічної точки зору. Тому існує потреба в розробці нових методів та способів виявлення та диференціації патогенних мікроорганізмів для дослідження харчових продуктів, продовольчої сировини, а також ідентификації патогенів, в біологічному зразку для виявлення причини захворювання. Маркерами патогенності STEC є гени шигатоксину 1 (Stx1) і шигатоксину 2 (Stx2), а також ген інтимін (еае), який відповідає за адгезію збудника до епітеліальних клітин кишечнику. Отже фактори патогенності STEC детермінуються, відповідно, генами stx1, stx2 та еае. Найбільш вірулентні штами STEC мають одночасно усі вказані гени. Штами STEC здатні продукувати або тільки токсини першої (Stx1) чи другої групи (Stx2), або обидві групи токсинів (Stx1) і (Stx2) одночасно, або інші комбінації із перерахованих трьох генів вірулентності [1, 3]. Зустрічаються 7 різних варіантів штамів STEC - за різної комбінації генів вірулентності (таблиця 1). Таблиця 1 Типи штамів STEC - за наявністю різних комбінацій генів stx1, stx2, еае Тип 1 2 3 4 5 6 7 Вірулентність штамів +++++ +++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ Stx1 + + + + stx2 + + + + еае + + + + Примітка: +++++ - сильновірулентний; ++++ - вірулентний; +++ - середнього ступеня вірулентності 30 35 40 Відомий бактеріологічний спосіб висіву із зразка досліджуваного об'єкта (фекалії, вміст шлунково-кишкового тракту, проби м'яса, м'ясопродуктів) на середовище Ендо або спеціальні середовища для E. соli. Висіви інкубують 18-24 години за температури 37-38 °C (при відсутності росту витримують за тієї ж температури ще 48 годин) [2]. Недоліком є те, що він потребує значного часу для проведення аналізу, трудоємний і зменшує рівень біобезпеки в цілому. Прототипом запропонованої корисної моделі є спосіб детекції шигатоксинпродукуючих бактерій E. coli (STEC) шляхом виявлення присутності одного або декількох факторів вірулентности у досліджуваному зразку, у якому передбачається уміст одного або більше мікроорганізмів, що належать до STEC [3] в мультиплексному варіанті полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням для цього декількох олігонуклеотидних праймерів, специфічних для одного або декількох факторів вірулентности, що мають наступну послідовність: для гена токсину stx2 dF1-stx2 5'-CCATGACAACGGACAGCAGT-3' 1 UA 112623 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 dR3-stx2 5'-ATCTGACATTCTGGTTGACTCTCTTC-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується, - 466 п.н.; для гена токсину stx1 dstx1-r3 5'-CGCACTGAGAAGAAGAGACTGAAG-3' dF-stx1 5'-ATGTAATGACTGCTGAAGATGTTGAT-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується, - 512 п.н.; для гена інтиміну еае dF2-eae 5'-CGCTCTTGGTATSGCTRGYA-3' (R=A/G, Y=C/T, S=C/G) dR2-eae 5'-GTCTCGCCAGTATTCGCCAC-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується, - 325 п.н. Вищезгаданий спосіб є найбільш близьким аналогом. Недоліком зазначених праймерів є те, що вони містять паліндроми та петлі, а також, схильні до утворення численних гомо- та гетеродимерів, що в цілому впливає на специфічність реакції. Одночасне використання вказаних праймерів в мультиплексному варіанті ПЛР не є ефективним. Правильний вибір олігонуклеотидних праймерів визначає ефективність і відтворюваність ПЛР. В зв'язку з цим, актуальним питанням є розробка специфічного та швидкого способу виявлення та ідентифікації шигатоксинпродукуючих бактерій E. coli (STEC). В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення існуючого способу виявлення дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) шигатоксинпродукуючих бактерій E. coli (STEC) шляхом зміни композицій послідовності нуклеїнових кислот в олигонуклеотидних праймерах для підсилення специфічності показника вірулентности у конкретних нуклеїнових кислот та їх фрагментів. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі виявлення дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) шигатоксинпродукуючих бактерій E. coli (STEC), що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних праймерів ДНК за допомогою мультиплексного варіанта полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), згідно з корисною моделлю, для проведення ПЛР використовують штучно синтезовані праймери з наступною послідовністю нуклеотидів: для гена токсину еае dF1-stx2 5'-CCATGACAACGGAC AGC AGT-3' dR3-stx2 5'-ATCTGACATTCTGGTTGACTCTCTTC-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується, - 466 пар нуклеотидів; для гена токсину stx1 dstx1-r3 5'-CGCACTGAGAAGAAGAGACTGAAG-3' dF-stx1 5'-ATGTAATGACTGCTGAAGATGTTGAT-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується, - 512 пар нуклеотидів; для гена інтиміну еае dF2-eae 5'-CGCTCTTGGTATSGCTRGYA-3' (R=A/G, Y=C/T, S=C/G) dR2-eae 5'-GTCTCGCCAGTATTCGCCAC-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується, - 325 пар нуклеотидів. Виконання способу, який заявляється, з усіма суттєвими ознаками, включаючи відмінні, дозволяє використовувати вищеперелічені варіанти пар праймерів, високоспецифічних до таких факторів вірулентності STEC як stx1, stx2, еае з підсиленими цільовими послідовностями нуклеїнових кислот в олігонуклеотидних праймерах, які можуть бути використані для мультиплексної ГТЛР, що позитивно впливає на її ефективність і відтворюваність. Суть корисної моделі пояснюється кресленням, де на фіг. 1 зображено використання пари штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів для гена токсину stx2 з наступною послідовністю нуклеотидів: dF1-stx2 5'-CCATGACAACGGACAGCAGT-3' dR3-stx2 5'-ATCTGACATTCTGGTTGACTCTCTTC-3'. На фіг. 1 показано як праймери dF1-stx2 та dR3-stx2 фланкують ділянку гена токсину stx2 і забезпечують синтез фрагмента ДНК розміром 466 п.н. при температурі відпалу 62 °C. На фіг 2 зображено використання пари штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів для гена токсину stxi з наступною послідовністю нуклеотидів: Dstx1-r3 5'-CGCACTGAGAAGAAGAGACTGAAG-3' dF-stx1 5'-ATGTAATGACTGCTGAAGATGTTGAT-3'. На фіг. 2 показано як праймери dF-stx1 та dstx1-r3 фланкують ділянку гена токсина stxl і забезпечують синтез фрагмента ДНК розміром 512 п.н. при температурі відпалу 62 °C. 2 UA 112623 U 5 10 На фіг. 3 зображено використання пари штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів для гена інтиміну еае з наступною послідовністю нуклеотидів: dF2-eae 5'-CGCTCTTGGTATSGCTRGYA-3' (R=A/G, Y=C/T, S=C/G) dR2-eae 5'-GTCTCGCCAGTATTCGCCAC-3'. На фіг. 3 показано як праймери dF2-eae та dR2-eae фланкують ділянку гена еае (інтиміну) і забезпечують синтез фрагмента ДНК розміром 325 п.н. при температурі відпалу 62 °C. Праймер dF2-eae є виродженим і враховує поліморфізм гена інтиміну. У заявленому способі виявлення специфічних фрагментів ДНК (stxl, stx2 та еае) шигатоксинпродукуючих бактерій E. coli (STEC) в досліджуваних зразках за допомогою мультиплексного варіанта полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і двох пар штучно синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК шигатоксинпродукуючих бактерій E. coli (STEC) при визначених температурних і часових параметрах та кількості циклів (таблиця 2). Таблиця 2 Температурний профіль мультиплексного варіанту ПЛР з ДНК бактерій E. coli (STEC) з парами олігонуклеотидних праймерів dF1-stx2/dR3-stx2 та dF2-eae/dR2-eae № циклу 1 2 3 4 Температура 95 °C 95 °C 62 °C 72 °C 72 °C 10 °C Час 3 хв 0,5 хв 0,5 хв 0,5 хв 4 хв Зберігання Кількість циклів 1 35 1 15 20 25 30 35 40 45 Праймери з наведеною послідовністю можуть бути використані, як для індивідуального так і для мультиплексного варіантів ПЛР. Спосіб здійснюють наступним чином: пробу (окрему колонію бактеріальної культури) 3 поміщають у пластикову пробірку ємністю 1,5 см з 0,3 см лізуючого буферу. Суміш струшують і центрифугують, після чого проводять наступне виділення ДНК набором реагентів для виділення 3 3 3 ДНК. Отриману ДНК (0,003 см ) поміщають у пробірку ємністю 0,5 см і додають 0,005 см (5Х) 3 3 ПЛР-буфера, 0,001см dNTP, по 0,00015 см праймерів dF-stx1 і dstx1-r3 (фіг. 2), та по 0,00010 3 3 см праймерів dF1-stx2 і dR3-stx2 (фіг. 1), dF-еае і dR2-eae (фіг. 3), 0,0005 см Taq-полімерази, 3 0,0115 см DEPC-води та 1 краплю мінерального масла. Вміст пробірки струшують і центрифугують, а потім переносять в термоциклер з активною регуляцією температури, наприклад "Терцик" (ДНК-технлогії, Росія), якому задають вищевказану програму. Аналіз результату ПЛР проводять в 1,5 % гелі агарози з барвником - бромистим етидієм. В 3 лунки агарозного гелю вносять 0,010 см ампліфікованої суміші. Після проведення електрофорезу фрагменти ДНК виявляють під ультрафіолетовим світлом. Результат ПЛР може бути оцінено візуально по наявності смужок, що відповідають продуктам реакції. Промислове застосування для проведення діагностики шигатоксинпродукуючих бактерій E. coli (STEC), на виробництві в харчовій промисловості, в науково-дослідних роботах, в біотехнологічному виробництві. ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ: 1. Бергілевич О.М. Маркери патогенності E. coli 0157: Н7 та основні гени-мішені для діагностики цього мікроорганізму в яловичині ПЛР тест-системою /О.М. Бергілевич., В.В. Касянчук, О.М. Єфімова зб. наук. праць Харків, держ. зоовет. акад.: //Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини - 2014. - Вип. 28. - 4.2. - С. 188-192. 2. ISO/ТС 34/SC 9/WG Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia colі (STEC) belonging to О157, O111, О26, O103 and 0145 serogroups-Qualitative Method. 3. Puttalingamma V., Shylaja R., Batra H.V., Bawa A.S. A novel multiplex PCR system for the detection of virulence associated genes of E. coli O157:H7 from food system. /Recent Research in Science and Technology, 2012, 4(5): 36-40. 3 UA 112623 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 20 Спосіб виявлення дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) шигатоксинпродукуючих бактерій E. coli (STEC), що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (ДНК) за допомогою мультиплексного варіанта полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), який відрізняється тим, що для проведення ПЛР використовують штучно синтезовані олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю нуклеотидів: для гена токсину stx2 dF1-stx2 5'-CCATGACAACGGACAGC AGT-3' dR3-stx2 5'-ATCTGACATTCTGGTTGACTCTCTTC-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується, - 466 пар нуклеотидів; для гена токсину stxl dstxl-r3 5'-CGCACTGAGAAGAAGAGACTGAAG-3' dF-stx1 5'-ATGTAATGACTGCTGAAGATGTTGAT-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується, - 512 пар нуклеотидів; для гена інтиміну еае dF2-eae 5'-CGCTCTTGGTATSGCTRGYA-3' (R=A/G, Y=C/T, S=C/G) dR2-eae 5'-GTCTCGCCAGTATTCGCCAC-3' розмір фрагмента ДНК, що синтезується, - 325 пар нуклеотидів. 4 UA 112623 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5