Спосіб виявлення плазмід pхо1 та pхо2 в складі бактерій bacillus anthracis за допомогою мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції

Спосіб виявлення ДНК плазмід рХО1 та рХО2 в складі бактерій Bacillus anthracis, що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних 3 55775 біопроба на лабораторних тваринах, серологічні дослідження). Головними недоліками традиційних лабораторних методів діагностики В. anthracis є довготривалість, трудомісткість, складність детекції атипових форм бактерій та необхідність в культитуванні збудника, що в свою чергу негативно впливає на рівень біобезпеки. На сьогодні найбільш надійними тестами ідентифікації В. anthracis є визначення чутливості до -фагу, виявлення галактозо-N-ацетилглюкозамін полісахариду та поліD-глютамінової кислоти, а також, виявлення наявності генів токсину та капсули методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Аналог корисної моделі, близький за технічним рішенням до об'єкту, що заявляється, є бактеріологічний метод висіву із зразка патматеріалу в м'ясо-пептонний бульйон і на м'ясо-пептонний агар, та на агар Хоттінгера (рН 7,4). Одночасно роблять висіви на диференціально-діагностичне середовище з 0,01% фенолфталеїнфосфату натрію, желатиною, на кров'яний бульйон та агар, середовище ГКІ (60% стерильного розчину Хенкса без антибіотиків і 40% стерильної не консервованої сироватки великої рогатої худоби, інактивованої при 56°С протягом 30хв, рН 1,2-1,А). Висіви інкубують 18-24 години за температури 37-38°С (при відсутності росту витримують за тієї ж температури ще 48 годин). Спільним недоліками зазначених методів є те, що вони потребують значного часу для проведення аналізу, трудоємні і зменшують рівень біобезпеки в цілому. Прототипом корисної моделі є спосіб детекції плазмід рХО1 та рХО2 в складі бактерій Bacillus 4 anthracis методом ПЛР з використанням для цього олігонуклеотидних праймерів, що мають наступну послідовність [4,5]: для плазміди рХОІ (ген протективного антигена) РА5 - 5'-TCCTAACACTAACGAAGTCG-3' РА8 - 5'-GAGGTAGAAGGATATACGGT-3' для плазміди рХО2 (ген капсули) 1234-5'-CTGAGCCATTAATCGATATG-3' 1301 - 5'-TCCCACTTACGTAATCTGAG-3' Недоліком зазначених праймерів є те, що вони схильні до утворення димерів та мають низьку температуру віджигу, що впливає на специфічність реакції. Одночасне використання праймерів в мультиплексному варіанті ПЛР не ефективне. В зв'язку з цим, актуальним питанням є розробка специфічного і швидкого методу детекції бактерії Bacillus anthracis та виявлення в її складі плазмід рХО1 та рХО2. Правильний вибір олігонуклеотидних праймерів визначає ефективність і відтворюваність ПЛР. Задача: створити новий спосіб виявлення плазмід рХО1 та рХО2 в складі бактерій Bacillus anthracis. Завдання досягається тим, що в досліджуваних зразках виявляють специфічні фрагменти нуклеїнових кислот (ДНК) за допомогою мультиплексного варіанту полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) - ферментативної реакції і двох пар штучно синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК інфекційного агенту при визначених температурних і часових параметрах та кількості циклів (таблиця 2): Таблиця 2 Температурний режим мультиплексного варіанту ПЛР з ДНК Bacillus anthracis з парами олігонуклеотидних праймерів CPS9R/CPS3F та OPA1F/OPA5R4 № циклу 1 2 3 4 Температура 95° С 95° С 60° С 72° С 72° С 10° С Використовують дві пари штучно синтезованих олігонуклеотидних праймерів з наступною послідовністю нуклеотидів: OPA1F - 5'-TCCAGACCGTGACAATGATG-3' OPA5R4 - 5'-CACGTTGTAGATTGGAGCCG-3' CPS3F - 5'-CACCAACCATCGTCATCG-3' CPS9R - 5'-TTATCCTGTTATGCCATTTGAG-3' Праймери OPA1F та OPA5R4 фланкують ділянку гена протективного антигена (плазміда рХО1) і забезпечують синтез фрагменту ДНК розміром 607н.з. при температурі віджигу 60°С. Праймери CPS3F та CPS9R фланкують ділянку гена капсули (плазміда рХО2) і забезпечують синтез фрагменту ДНК розміром 377н.з. при температурі віджигу 60°С. Час 4 хв 0,5 хв 0,5 хв 0,5 хв 4 хв Зберігання Кількість циклів 1 35 1 Праймери з наведеною послідовністю можуть бути використані для мультиплексного варіанту ПЛР (Фігура 1). Приклад: пробу (окрему колонію бактеріальної культури) поміщають у пластикову пробірку ємністю 1,5см3 з 0,3см3 лізуючого буферу. Суміш струшують і центрифугують, після чого проводять наступне виділення ДНК набором реагентів для виділення ДНК. Отриману ДНК (0,003см3) поміща3 3 ють у пробірку ємністю 0,5см і додають 0,005см 3 (5Х) ПЛР-буфера, 0,001см dNTP, по 0,00015см3 праймерів OPA1F і OPA5R4, та по 0,00010см3 праймерів CPS3FM і CPS9R, 0,0005см3 Taqполімерази, 0,0115см3 DEPC-води та 1 краплю мінерального масла. Вміст пробірки струшують і центрифугують, а потім переносять в термоциклер 5 55775 з активною регуляцією температури, наприклад "Терцик" (Росія), якому задають вищевказану програму. Аналіз результату ПЛР проводять в 1,5% гелі агарози з барвником - бромистим етидієм. В лунки агарозного гелю вносять 0,010см3 ампліфікованої суміші. Після проведення електрофорезу фрагменти ДНК виявляють під ультрафіолетовим світлом. Результат ПЛР може бути оцінено візуально по наявності смужок, що відповідають продуктам реакції. Промислове застосування - для проведення діагностики сибірки, в науково-дослідних роботах, в біотехнологічному виробництві вакцин. Джерела інформації: 1. Vietri N.J. Identification and characterization of trans-activator involved in the regulation of encapsulation by Bacillus anthracis / Vietri N.J., Marrero R., Hoover T.A. - Gene, 1995. - Vol.152, P. 1-9. Комп’ютерна верстка М. Ломалова 6 2. Makino S. Molecular characterization and protein analysis of the cap region, which is essential for encapsulation in Bacillus anthracis / Makino S., Uchida I., Terakado N. - J.Bacteriol, 1989. - Vol.171, P.722-730. 3. Makino S. Effect of the lower molecular capsule release from the cell surface of Bacillus anthracis on the pathogenesis of anthrax / Makino S., Watarai M., Cheun HJ. - J.Infect.Dis, 2002. -Vol.186, P.227-233. 4. Hutson R.A. The development and assessment of DNA and oligonucleotide probes for the specific detection of Bacillus anthracis / Hutson R.A., Duggleby C.J., Lowe J.R. - J. Appl.Bacteriol., 1993. - Vol.75, P.463-472. 5. Beyer W. A nested PCR and DNAamolification-fmgerprinting method for detection and identification of Bacillus anthracis in soil samples from formes tanneries / Beyer W., Gloeckner P., Otto J., Bohm R. - Salisbury Med.Bull.,1996. - Vol.87, P.4749. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601