Спосіб прогнозування розвитку раку грудної залози у жінок з обтяженою спадковістю

Реферат: Спосіб прогнозування розвитку раку грудної залози включає клініко-генеалогічний аналіз. Після визначення обтяженості родоводу, здійснюють забір біологічної рідини та виконують молекулярно-генетичне дослідження поліморфізму G1934A гена CYP2D6 і при наявності генотипу *4*4 (А1934А) гена CYP2D6 свідчать про підвищення ризику розвитку раку грудної залози. UA 75385 U (54) СПОСІБ ПРОГНОЗУВАННЯ РОЗВИТКУ РАКУ ГРУДНОЇ ЗАЛОЗИ У ЖІНОК З ОБТЯЖЕНОЮ СПАДКОВІСТЮ UA 75385 U UA 75385 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до молекулярної генетики та онкології й може бути використана у практиці для прогнозування розвитку раку грудної залози у жінок з обтяженою спадковістю. Рак грудної залози (РГЗ) є найбільш частою онкологічною патологією, в економічно розвинених країнах він уражає, як мінімум, кожну десяту жінку. Серед основних причин зростання числа хворих на РГЗ, частіше за все називають старіння населення, пролонговану дію естрогенів і порушення в системі підтримання стабільності геному. Серед відомих способів прогнозування РГЗ слід відмітити проведення клінічних обстежень, визначення кластерів диференціювання лейкоцитів, імунорегуляторного індексу, визначення домінантних і рецесивних ознак людини [Патент № 39342 U UA, МПК А61В 8/00. Опубл. 25.02.2009, бюл. № 4] та використання генно-інженерних конструкцій [Патент № 39342 С2 UA, МПК C12Q 1/68 G01N 33/574. Опубл. 25.02.200925.02.2009, бюл. № 3]. Недоліками вищезазначених методів є їх трудоємність, висока вартість досліджень та потреба в спеціалістах, що мають високу кваліфікацію. Як прототип вибраний спосіб прогнозування ризику розвитку злоякісних новоутворень [Патент № 68920 U UA, МПК(2012.01) А61В 10/00. Опубл. 10.04.2012, бюл. № 7], що включає проведення клінічних обстежень, клініко-генеалогічного та генетико-математичного аналізу родоводів у хворої на рак ендометрію і визначення ризику розвитку злоякісних новоутворень у сібсів пробанда. Ознаками, які збігаються з істотними ознаками запропонованого у прототипі способу, є використання клініко-генеалогічного аналізу. Причинами, які перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату, є високий ступінь суб'єктивізму, адже основою способу є опитування вже хворої жінки, і має цінність, як діагностичний критерій, лише для її родичів, так як автори не приводять даних по застосуванню цього способу у здорових жінок. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб прогнозування розвитку раку грудної залози у жінок з обтяженою спадковістю шляхом визначення генотипу за поліморфним варіантом G193 4А (алель *4) гена CYP2D6, що дозволяє оцінити на ранньому етапі (ще до виникнення РГЗ чи захворювань, що йому передують) ризик розвитку даної патології та використовувати превентивні міри для його запобігання чи виявлення на ранніх стадіях. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, що включає клінікогенеалогічний аналіз, згідно з корисною моделлю, після визначення обтяженості родоводу, здійснюють забір біологічної рідини та виконують молекулярно-генетичне дослідження поліморфізму G1934A гена CYP2D6 і при наявності генотипу *4*4 (А1934А) гена CYP2D6 свідчать про підвищення ризику розвитку раку грудної залози. До даного рішення автори прийшли, досліджуючи внесок генетичної компоненти в ризик розвитку РГЗ. Виявлено, що велика кількість досліджень присвячена пошуку асоціацій ризику виникнення РГЗ й індивідуальних особливостей системи ферментів, що приймають участь в метаболізмі канцерогенів. Перспективними є дослідження, присвячені генетичному поліморфізму ферментів, що приймають участь в метаболізмі гормонів, оскільки доведено спадкову природу гормонального портрету кожної конкретної жінки і незаперечну роль гіперестрогенії в розвитку РГЗ. Одним з ферментів, який приймає участь в метаболізмі естрогенів є дебризокін-4гідроксилаза (CYP2D6) - фермент І фази детоксикації ксенобіотиків, що кодується геном CYP2D6, який локалізований на хромосомі 22q13.1. (OMIM * 124030). Серед білого європейського населення в гені CYP2D6 найбільш часто виявляють заміну G1934A (алель *4) на межі інтрона 3 і екзона 4, наявність якої приводить до некоректного сплайсингу мРНК, в результаті чого відбувається здвиг рамки зчитування, передчасне завершення трансляції й утворення дефектного білкового продукту, позбавленого ферментативної активності. Спосіб здійснюється таким чином: Проводиться клініко-генеалогічне дослідження методом опитування з наступним аналізом родоводів для визначення обтяженої спадковості. У осіб з обтяженістю родоводів онкологічною патологією проводиться подальше молекулярно-генетичне дослідження алелей поліморфної ділянки G1934A гена CYP2D6. Для проведення молекулярно-генетичних досліджень використовується біологічний матеріал, а саме венозна кров, що зберігається в закритих системах з ЕДТА при температурі 20 °C. Виділення геномної ДНК проводиться з лейкоцитів замороженої крові з використанням комерційного набору "ДНК-сорб-В" (ЦНДІ Епідеміології Міністерства охорони здоров'я РФ) або 1 UA 75385 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 за альтернативними методиками виділення нуклеїнових кислот. Об'єм біологічного матеріалу для виділення ДНК - 0,1 мл. Процедуру виділення ДНК проводять поетапно, згідно з інструкцією виробника. Генотипування за алельним варіантом G1934A (*4) гена CYP2D6 проводили методами полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і рестрикційного аналізу (поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів - ПДРФ). Алельний варіант *4 гена CYP2D6 досліджували з використанням послідовностей праймерів: 5'-GCCTTCGCCAACCACTCCG-3' і 5'AAATCCTGCTCTTCCGAGGC-3'. Умови ПЛР: ДНК денатурували протягом 3 хв при +94 °C і 30 циклів: плавлення - 94 °C - 40 сек., відпал 60 °C - 40 сек., синтез 72 °C - 40 сек.; пролонгований синтез 72 °C - 5 хв. Реакцію ампліфікації проводили в термоциклері фірми Applied Biosystems (Великобританія). Продукти ампліфікації, довжиною 421 пара нуклеотидів (п.н.), піддавали рестрикції шляхом додавання в рестрикційну суміш аліквот продуктів ПЛР об'ємом 2,5 мкл і 7 одиниць активності ендонуклеази рестрикції BstNI (Mval) з подальшою інкубацією при 37 °C протягом 2-х годин. Детекцію продуктів ампліфікації та ПДРФ проводили в 2 % агарозному гелі, що містив 18 мкл етидію броміду. Візуалізацію результатів здійснювали в ультрафіолетовому світлі за допомогою автоматичної системи відеозчитування. Довжини фрагментів аналізували шляхом порівняння з маркерною ДНК. Гомозиготи за CYP2D6*4 (A1934A - *4*4) діагностували за наявністю двох фрагментів довжиною 77 і 344 пар нуклеотидів (п.н.), а гомозиготи за "диким типом" (G1934G - *1*1) - за наявністю трьох фрагментів довжиною 77, 161 і 183 п.н. Гетерозиготи (G1934A - *1*4) мали чотири фрагменти довжиною 77, 161, 183 і 344 п.н. Після отримання результатів генотипування, генотип за алельним варіантом G1934A гена CYP2D6 зіставляють з даними генеалогічного аналізу і прогнозують ризик виникнення РГЗ. Запропонованим способом було обстежено 85 пацієнток у віці від 18 до 80 років (середній вік - 45,25±13,26 років) з гістологічно підтвердженим діагнозом РГЗ І і II стадій, які проходили лікування в Київській міській онкологічній лікарні. Всім хворим проводили клініко-генеалогічне дослідження методом опитування з наступним аналізом родоводів. За результатами клінікогенеалогічного дослідження всіх хворих на РГЗ було розділено на 2 підгрупи. Група Іа - 67 хворих, які мали серед родичів І-II ступеня спорідненості 2 і більше хворих на РГЗ (спадковість обтяжена). Група Ів - 18 хворих, які не мали родичів з онкологічними захворюваннями (спадковість не обтяжена). Контрольна група була представлена жителями України (n=637, середній вік 50,73±19,3 років). Результати було проаналізовано з використанням пакету статистичних програм Statistica 6.0. Для визначення вірогідності різниці частот генотипів в групах, що порівнювались 2 використовували стандартний критерій хі-квадрат ( ). Відношення шансів Odds Ratio (OR) оцінювалось для розрахунку відносного ризику розвитку хвороби для кожного генотипу. Для всіх видів аналізу статистично значимими вважали значення р