Спосіб прогнозування перебігу есенціальної артеріальної гіпертензії

Реферат: UA 118591 U UA 118591 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі клінічної медицини, а саме до внутрішніх хвороб, кардіології та медичної генетики, і може бути використана з метою прогнозування перебігу та профілактики есенціальної артеріальної гіпертензії (АГ). Поширеність артеріальної гіпертензії (АГ) на теперішній час в Україні становить 35 % дорослого населення [Артеріальна гіпертензія. Оновлена та адаптована клінічна настанова, заснована на доказах. - Додаток до Наказу МОЗ України № 384 від 24.05.2012- К., 2012.]. При цьому адекватного контролю артеріального тиску (AT) у масштабі популяції вдається досягти не більше ніж у 30 % пацієнтів, у країнах з високим рівнем розвитку охорони здоров'я - у 30-50 % [Edmonton Obesity Staging System: association with weight history and mortality risk / A.M. Sharma, R. Padwal, X. Sui [et al.] // Appl. Physiol. Nutr. Metab.-2011. - Vol. 36. - P. 570-576.], а в Україні менше ніж у 15 % осіб [Артеріальна гіпертензія. Оновлена та адаптована клінічна настанова, заснована на доказах. - Додаток до Наказу МОЗ України № 384 від 24.05.2012. - К., 2012.]. Найчастіше причинами неконтрольованої АГ є низька прихильність пацієнтів до лікування, неадекватний режим терапії, недостатня модифікація способу життя, що супроводжується зростанням серцево-судинного ризику і є можливим чинником розвитку резистентного перебігу артеріальної гіпертензії. Встановлено, що високі рівні артеріального тиску (AT) супроводжуються більш вираженим ураженням органів-мішеней, зокрема гіпертрофією лівого шлуночка, потовщенням комплексу інтима-медіа, поглибленням виявів гіпертензивної нефропатії, що сприяє формуванню резистентності до лікування та погіршує віддалений прогноз. Для більшості пацієнтів з високими рівнями AT характерні складні коморбідні стани, що потребують індивідуального підходу в лікуванні [Обертинська О. Г. Клінічні аспекти резистентної артеріальної гіпертензії / О.Г. Обертинська / Український кардіологічний журнал. - 2014. - № 3. С. 30-36]. Злоякісний перебіг АГ виникає переважно в осіб молодого віку, і характеризується тяжкими серцево-судинними ускладненнями. Проте своєчасні індивідуалізація й інтенсифікація лікування за несприятливого перебігу АГ, а також можливість прогнозування такого перебігу дозволить відокремити групи ризику хворих і здійснювати серед них профілактичні заходи, тим самим знизити частоту небезпечних ускладнень. На сьогодні визнано, що профілактика - найбільш ефективний, а в деяких випадках - єдино можливий спосіб боротьби зі зростанням кількості хворих на АГ та таких, що мають ускладнення, які можуть призвести до інвалідизації чи смерті. Публікації останніх років демонструють дані про роль спадковості як фактора, що визначає рівень AT людини. Дослідження поліморфізму генів-кандидатів АГ по праву є одним з найбільш перспективних і затребуваних молекулярно-генетичних досліджень. Велике значення має вивчення поліморфізму генів, продукти яких забезпечують різні ланки близько сполучених метаболічних ланцюгів. Розуміння генетичної природи АГ, визначення молекулярно-клітинних механізмів ураження органів-мішеней і розвитку ускладнень представляється актуальним і важливим для виділення серед хворих груп високого серцево-судинного ризику. Велику увагу приділяють дослідженню С825Т поліморфізму гена GNB3, основною функцією якого є передача сигналів від мембранних рецепторів до внутрішніх структур [Siffert W. G-protein В3 subunit 825T allele and hypertension / W. Siffert // Cur. Hypertens. Rep.-2003. - Vol. 1. - № 5. - P. 47-53.174]. Таким чином, визначення генотипів за С825Т поліморфізмом гена GNB3 дає можливість прогнозування розвитку АГ до клінічних проявів хвороби та ранньої профілактики у групі ризику. Встановлено, що молоді пацієнти-носії мінорного алеля мали більш злоякісний перебіг захворювання і потребували раннього призначення гіпотензивної терапії [Sartory М. G-protein beta 3 subunit gene 825T allele and hypertension: a longitudinal study in young grade I hypertensives / M. Sartory, A. Semplicini, W. Siffert // Hypertension.-2003. - Vol. 42. - № 5. - P. 909-914.]. Відомий спосіб прогнозування перебігу АГ [Пат. № 64589 U, UA, МПК (2006) А61В 5/021, А61В 10/00, опубл. 16.02.2004, бюл. № 2], що полягає у прогнозуванні тяжкості перебігу артеріальної гіпертензії шляхом визначення стійкого порушення добового ритму AT у хворих на гіпертонічну хворобу, що включає проведення добового моніторування артеріального тиску (ДМАТ) двічі, визначення добового індексу AT та здійснення висновку про стійке порушення добового ритму AT. Недоліком цього способу є неможливість прогнозувати у здорових осіб; даний метод діагностики не простий для виконання. Крім цього метод ДМАТ дає деякі ускладнення у вигляді петехіальних крововиливів, порушення лімфо- та крововідтоку на кінцівці. Аналіз щоденників 1 UA 118591 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 самонагляду, заповнені пацієнтами в період ДМАТ для виявлення порушень добового ритму AT може нести хибну інформацію. Найбільш близьким до запропонованого, а тому прийнятим за прототип, є спосіб прогнозування перебігу АГ, що включає проведення молекулярно-генетичних та клінічних досліджень поліморфного варіанта А1166С гена судинного рецептора до ангіотензину II (пат. № 8535, U, UA, МПК А61В 5/00, опубл. 15.08.2005, бюл. № 8). Недоліком вибраного прототипу можна назвати прогнозування перебігу хвороби лише у випадку ренопаренхіматозної АГ, тобто за наявності тубулоінтерстиціального ураження нирок, що не дає прогнозу перебігу у випадку есенціальної АГ. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб прогнозування перебігу есенціальної АГ шляхом визначення генотипів за С825Т поліморфізмом гена GNB3, що дозволяє прогнозувати формування злоякісного перебігу АГ, ґрунтуючись на асоціації певних генотипів із показниками систолічного та діастолічного AT з метою індивіалізації гіпотензивної терапії для підвищення ефективності лікування. Поставлена задача вирішується тим, що включає проведення молекулярно-генетичних та клінічних досліджень у хворих на артеріальну гіпертензію, згідно із корисною моделлю, дослідження проводять на підставі визначення генотипу за поліморфним варіантом С825Т гена GNB3 шляхом виділення геномної ДНК із цільної крові хворого за допомогою реагенту поліморфних ДНК-локусів методом полімеразної ланцюгової реакції на ампліфікаторі з наступною детекцією ампліфікованих фрагментів із використанням електрофорезу в 2,5 %-ному агарозному гелі, забарвленому бромистим етидієм, потім шляхом вивчення зв'язку показників артеріального тиску та частоти гіпертензивних кризів у хворого із наявністю у нього генотипів гомо- та гетерозигот за даним алелем гена GNB3, а саме при наявності у хворого фрагмента ДНК розміром 267 пар нуклеотидів (п.н.) та трьох фрагментів довжиною 267 п.н., 115 п.н., і 152 п.н., який свідчить про присутність мінорного Т алеля в генотипі, роблять висновок відносно несприятливого прогнозу перебігу есенціальної АГ у хворого, що супроводжується підвищеним рівнем артеріального тиску та частими і ускладненими гіпертонічними кризами. Виконання способу прогнозування перебігу АГ, що заявляється, з усіма суттєвими ознаками, включаючи відмінні, дозволяє за оцінкою зв'язку генотипів з присутнім мінорним Т алелем сформувати групи ризику серед пацієнтів щодо більш злоякісного перебігу, на підставі чого одразу корегувати гіпотензивну терапію для профілактики ускладнень даного захворювання. Спосіб виконують наступним чином. Перебіг АГ прогнозують шляхом оцінки зв'язку показників AT та частоти гіпертензивних кризів із наявністю генотипів - гомо- та гетерозигот за Т апелем. Дослідження генотипів проводять методом виділення геномної ДНК із цільної крові за допомогою реагенту поліморфних ДНК-локусів методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) на ампліфікаторі з наступною детекцією ампліфікованих фрагментів шляхом електрофорезу в 2,5 %-ому агарозному гелі, забарвленому бромистим етидієм. Полімеразну ланцюгову реакцію проводили з використанням послідовностей праймерів: прямого 5' TGACCCACTTGCCACCCGTGC 3' і зворотного – 5' GCAGCAGCCAGGGCTGGC 3'. ПЛР проводили в термоцикл ері Gene Amp PCR System 2700 ("Applied Biosystems", США). Ампліфікація фрагмента 10-го екзону складалася з 33 циклів: денатурація - 94 °C (50 с), гібридизація праймерів - 64,5 °C (45 с) і елонгація - 72 °C (1 хв). Потім 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при 55 °C протягом 18 годин з 3 ОД рестриктази BseDI (BsaJI) ("Thermo Scientific", США) у буфері Tango такого складу: 33 мМ трис-ацетату (рН 7,9), 10 мМ ацетату магнію, 66 мМ ацетату калію, 0,1 мг/мл альбуміну. Якщо у 825-й позиції гена GNB3 містився тимін, то рестриктаза BseDI розщеплює ампліфіковану ділянку (довжина - 267 пар азотистих основ) на два фрагменти - 115 і 152 пар основ. Ампліфікати після рестрикції розділяли в 2,5 % агарозному гелі, що містив 10 мкг/мл бромистого етидію. Горизонтальний електрофорез (0,1 ЗА; 200V) проводили протягом 40 хв. Візуалізацію ДНК після електрофорезу здійснювали за допомогою трансілюмінатора ("Біоком", Росія). При дослідженні С825Т поліморфізму гена GNB3 наявність фрагмента ДНК розміром 267 пар нуклеотидів (п.н.) відповідає генотипу Т825Т, наявність трьох фрагментів довжиною 267 п.н., 115 п.н. і 152 п.н. - генотипу С825Т, а наявність двох фрагментів довжиною 115 п.н. і 152 п.н. - генотипу С825С. Наявність фрагментів розміром 267 пар нуклеотидів (п.н.) та трьох фрагментів довжиною 267 п.н., 115 п.н. і 152 п.н. свідчить про присутність мінорного Т апеля в генотипі та вказує на ризик розвитку АГ. 2 UA 118591 U 5 10 15 Запропонованим способом було проведено обстеження 155 пацієнтів із верифікованим діагнозом АГ II стадії, 1, 2 та 3 ступенів (основою діагностики АГ є рекомендації адаптованої клінічної настанови "Артеріальна гіпертензія" (2012) та уніфікованого протоколу МОЗ України та локального протоколу (клінічного маршруту) медичної допомоги хворим на АГ уведеного наказом МОЗ України № 384 від 24.05.2012 року.) за результатами детального клінікоінструментального обстеження хворих) та 50 практично здорових осіб. Пацієнти основної групи розподілені залежно від ІМТ наступним чином: І група - 35 пацієнтів із нормальною масою тіла (ІМТ 18,5-24,9); II група - 38 пацієнтів із надлишковою масою тіла (ІМТ 25-29,9); III група - 82 пацієнта із аліментарним ожирінням (ІМТ  30). Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою програми SPSS Statistics 21,0. Для порівняння розподілу алельних варіантів між групами хворих та контролю 2 використовували критерій  -Пірсона. Про асоціацію генотипів та алеля зі схильністю до захворювань оцінювали за величиною відношення шансів (ВШ) з 95 % довірчим інтервалом (ДІ). Статистично достовірними вважали відмінності при р (показник вірогідності відмінностей) < 0,05. Аналіз залежності показників систолічного артеріального тиску (CAT), діастолічного артеріального тиску (ДАТ) та перебігу АГ (з неускладненими гіпертонічними кризами, з безкризовим перебігом, із частими ускладненими гіпертонічними кризами) від генотипів за С825Т поліморфізмом гена GNB3 наведено в таблицях та на кресленні. Таблиця 1 Рівень систолічного артеріального тиску залежно від С825Т поліморфізму гена 3-субодиниці Gбілка (мм рт. ст.) Генотип С825С С825Т Т825Т р (КраскелаУолліса) Група контролю 120 (110-128) (n=20) 120 (115-135) (n=27) І група 167 (160-173) (n=16) 165 (160-171) (n=14) Основна група II група 160 (150-165) (n=11) 170 (165-175) (n=23) 135 (135-137) (n=3) 170 (160-175) (n=5) 182 (168-185) (n=4) р=0,046 р=0,881 р=0,002 III група 165 (160-170) (n=22) 175 (170-175) (n=49) 180 (175-185) (n=11) р