Спосіб удосконалення методу виявлення спор збудника bacillus anthracis у ґрунті

Реферат: Спосіб удосконалення методу виявлення спор збудника Bacillus anthracis у ґрунті шляхом приготування суспензії з ґрунту. При цьому ґрунт беруть у кількості 2,5 г, додають сахарозутритон Х-80 та БСА/ФСБ (1 % бичачий сироватковий альбумін у фосфатно-сольовому буфері). UA 119282 U (12) UA 119282 U UA 119282 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до ветеринарної медицини, і може бути використана для удосконалення методу виявлення спор збудника Bacillus anthracis у ґрунті при встановленні його безпечності за лабораторної діагностики сибірки тварин, індикації збудника з біологічного матеріалу та об'єктів навколишнього середовища у бактеріологічних відділах державних лабораторіях ветеринарної медицини. За результатами цього методу можна отримати якісні та кількісні показники для удосконалення методу виявлення спор збудника Bacillus anthracis у ґрунті. Аналогом корисної моделі є спосіб виявлення чисельності мікроорганізмів у ґрунті методом посіву на тверде (агаризоване) живильне середовище згідно з ДСТУ 7847:2015 [1], який базується на особливості приготування розведень суспензії (1:10). Із кожної проби ґрунту 3 проводять посів не менше двох об'ємів по 0,1 чи 0,2 см на поверхню живильного середовища у бактеріологічні чашки. Шпателем розтирають по всій поверхні середовища. Культивують чашки з посівами за температури 28-30 °C протягом 72 год. Результати отримують шляхом підрахунку колоній на чашках, враховуючи розведення суспензії ґрунту. Недоліком даного методу є те, що він довготривалий, громіздкий, дозволяє виявити малу кількість спор, має значні затрати на живильне середовище, посіви містять велику кількість спор сторонньої мікрофлори. Крім цього, даний метод дає похибку від 15 до 25 %. Прототипом корисної моделі є метод виявлення збудника Bacillus anthracis у об'єктах навколишнього середовища, ґрунті [2], у якому застосовують великий об'єм ґрунту (50-70 г) для приготування вихідної суспензії (15-20 см), яка готується з додаванням фізіологічного розчину, дистильованої води чи пірофосфату натрію. Недоліком даного методу є те, що він громіздкий, потребує проведення декількох послідовностей досліджень, має недостатнє збагачення досліджуваної суспензії, проби містять велику кількість сторонньої спорової сапрофітної мікрофлори, потребує велику кількість живильного середовища. Крім цього, даний метод дає похибку у 35-40 %. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб удосконалення методу виявлення спор збудника Вас. anthracis у ґрунті шляхом приготування суспензії з використанням ґрунту, сахарози-тритону Х-80, БСА/ФСБ (1 % бичачого сироваткового альбуміну), що забезпечить очищення спор в осаді, їх кількість, скорочення часу виявлення. Спосіб полягає у наступному: беруть 2,5 г ґрунту і заливають розчином для екстракції (100 3 3 см дистильованої води, 1,22 г/см сахарози-тритону Х-80). Потім струшують протягом 1 хв., після чого збовтують на шейкері протягом 15 хв. за 75 об./хв. для осадження піни з поверхні суспензії. 3 3 Відбирають 3 см рідини з поверхні надосадової рідини у стерильну пробірку, додають 6 см 3 БСА/ФСБ (фільтрованого 1 % бичачого сироваткового альбуміну у 0,01 моль/см фосфатносольовому буфері, рН 7,2) - для забезпечення осадження спор шляхом центрифугуванням. Зразки відцентрифуговують за 5100 об./хв. протягом 10 хв. 3 Надосадову рідину зливають та знищують, а до осаду додають 1 см БСА/ФСБ. Інкубують на водяній бані за температури 63 °C протягом 20 хв. Потім проводять посів на середовище PLET (polymyxin, lysozyme, ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA), tallous acetate) чи диференційно-діагностичне середовище з 0,01 % фенолфталеїнфосфатом натрію. Посіви розміщують у термостаті за температури 36±1 °C протягом 18-20 год. Ріст на бактеріологічних чашках із PLET-агаром враховують через 48 год. Етапи вирішення даної задачі наведено у нижче зазначених прикладах. Приклад 1. Для розробки методу використовували дослідну суспензію із 30,0 г ґрунту, яку 3 поміщали у скляну колбу і заливали 20 см розчину натрію хлориду з масовою концентрацією 0,85 %. Потім струшували зразок протягом 10 хв. та відстоювали 3 хв. Відбирали 10 см рідини з поверхні надосадової рідини у стерильну пробірку, для забезпечення осадження спор проводили центрифугування. Зразки центрифугували за 4000 об./хв. протягом 5 хв. Надосадову рідину зливали та знищували. Інкубували осад на водяній бані за температури 70 °C протягом 40 хв. У подальшому проводили посів на 5 чашок (у трьох послідовностях) методом Дригальського на середовище МПА з 0,01 % фенолфталеїнфосфатом натрію. Посіви розміщували у термостаті за температури 38 °C на 18 год. Приклад 2. Для розробки методу використовували дослідну суспензію із 15,0 г ґрунту, який 3 3 поміщали у скляну колбу і заливали 15 см розчину для екстракції (100 см дистильованої води, 3 1,22 г/см сахарози-тритону Х-80). Потім струшували зразок протягом 5 хв., після чого збовтували на шейкері протягом 10 хв. за 75 об./хв. для осадження піни з поверхні суспензії. 3 3 Відбирали 7 см рідини з поверхні надосадової рідини у стерильну пробірку, додавали 10 см 3 БСА/ФСБ (фільтрованого 1 % бичачого сироваткового альбуміну у 0,01 моль/см фосфатносольовому буфері, рН 7,2) - для забезпечення осадження спор шляхом центрифугуванням. 1 UA 119282 U 5 10 15 20 25 Зразки центрифугували за 4500 об./хв. протягом 10 хв. Надосадову рідину зливали та знищували, а до осаду додавали 1 см БСА/ФСБ. Інкубували на водяній бані за температури 60 °C протягом 30 хв. Потім проводили посів на середовище МПА з 0,01 % фенолфталеїнфосфатом натрію і PLET (polymyxin, lysozyme, ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA), tallous acetate). Посіви культивували у термостаті за температури 36±1 °C протягом 20 год. Ріст на бактеріологічних чашках із PLET-агаром враховували через 48 год. Приклад 3. В основу даної корисної моделі поставлено задачу - розробити спосіб удосконалення методу виявлення спор збудника Bacillus anthracis у ґрунті шляхом зміни 3 кількості досліджуваної проби (2,5 г ґрунту), яку поміщали у скляну колбу і заливали 12 см 3 3 розчину для екстракції (100 см дистильованої води, 1,22 г/см сахарози-тритону Х-80. Потім струшували зразок протягом 1 хв., після чого збовтували на шейкері протягом 15 хв. за 75 3 об./хв. для осадження піни з поверхні суспензії. Відбирають 3 см рідини з поверхні надосадової рідини у стерильну пробірку, додають 6 см БСА/ФСБ (фільтрованого 1 % бичачого 3 сироваткового альбуміну у 0,01 моль/см фосфатно-сольовому буфері, рН 7,2) - для забезпечення осадження спор шляхом центрифугуванням. Зразки центрифугують за 5100 об./хв. протягом 10 хв. Надосадову рідину зливають та 3 знищують, а до осаду додають 1 см БСА/ФСБ. Інкубують на водяній бані за температури 60 °C протягом 20 хв. Потім проводять посів на середовище PLET (polymyxin, lysozyme, ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), tallous acetate), диференційно-діагностичне середовище з 0,01 % фенолфталеїнфосфатом натрію. Посіви культивують у термостаті за температури 36±1 °C протягом 18-20 год. Ріст на бактеріологічних чашках із PLET-агаром враховують через 48 год. Порівняльна оцінка результатів випробування вищезазначених способів удосконалення методу виявлення спор збудника Bacillus anthracis у ґрунті до прототипу наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Порівняння способів удосконаленого методу виявлення спор збудника Вас. anthracis у до прототипу № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Показники, що порівнюються Приготування дослідної суспензії: 1.1 Кількість ґрунту, г Прототип 1 Приклади 2 3 50-70 30 15 2,5 0,9 %-ний розчин натрію хлориду, дистильована вода 0,85 %-ний 1.2 Розчин для розчин для розчин для або 0,5 %-ний розчин натрію отримання екстракції екстракції розчин хлориду пірофосфату натрію 3 1.3 Кількість розчину, см 20 15 12 Час струшування, хв. 25 10 5 1 Час відстоювання, хв. 5-8 3 10 (шейкер) 15 (шейкер) Кількість суспензії для 15-20 10 7 3 3 дослідження, см Додаткове підвищення фільтрування через 3 3 10см БСА/ФСБ 6 см БСА/ФСБ ефективності марлевий фільтр Час центрифугування, хв. 15 5 10 10 Центрифугування, об./хв. 3000 4000 4500 5100 осад із осад із Матеріал для посіву осад осад додаванням 1 додаванням 1 3 3 см БСА/ФСБ см БСА/ФСБ Очищення проби: прогрівання на водяній 65 70 60 60 бані за температури, °C 80 40 30 20 час прогрівання, хв. 2 UA 119282 U Продовження таблиці 1 Порівняння способів удосконаленого методу виявлення спор збудника Вас. anthracis у до прототипу № п/п Показники, що порівнюються Кількість бактеріологічних чашок із 10. середовищем для посіву, шт. 11. Середовище для культивування Температура культивування, °C 13. Час культивування, год. Концентрація спор, при якій виділяється спори 14 Bacillus anthracis із 1 г ґрунту 12. 1 3-4 17. 18. 19 5 3 43 33 МПА, МПА з 0,01 % МПА з 0,01 % МПА з 0,01 % Хоттінгера, МПА з фенолфталеїн- фенолфталеїн- фенолфталеїн0,01 % фосфатом фосфатом фосфатом фенолфталеїннатрію натрію і PLET натрію, PLET фосфатом натрію 37±1 38 36±1 36±1 18-24 18 20/48 20/48 35 50 15 5,7 колонії білого, сіро-білого кольору, що не змінили колір після обробки парами аміаку колонії білого, сіро-білого кольору, що не змінили колір після обробки парами аміаку 21±1 21±1 84,5 99,9 76,3-80,2 98,9-99,5 83,7-85,1 98,2-99,6 не менше 10 Ідентифікація: колоній: матово15. 15.1. Кількість відібраних сірих, шорстких, Rколоній із МПА, шт. форми 16. Приклади 2 53 Прототип колонії білого, 15.2. Кількість типових колонії білого сіро-білого відібраних колоній із МПА кольору, що не кольору, що не із 0,01 % змінили колір після змінили колір фенолфталеїнфосфатом обробки парами після обробки натрію аміаку парами аміаку Швидкість проведення 21-26 19±2 досліду, год. Стабільність показників по удосконаленому методу виявлення спор 93,7 75,0 збудника Вас. anthracis у ґрунті, % Співвідношення результатів досліджень щодо визначення 87,0-93,6 85,4-87,0 наявності патогенних ентеробактерій у ґрунті, у% Співвідношення результатів досліджень щодо визначення 84,9-87,8 87,3-89,8 наявності нітрофікуючих бактерій у ґрунті, у % Дані табл. 1 свідчать, що більш достовірні дані у порівнянні з результатами досліджень щодо визначення наявності способів удосконалення методу виявлення ентеробактерій у ґрунті у 98,9-99,5 % [3] та до результатів досліджень щодо визначення наявності нітрофікуючих бактерій у ґрунті - у 98,2-99,6 % [4] були отримані при застосуванні методу за прикладом № 3. Також найвища стабільність показників по удосконаленню методу виявлення спор збудника Bacillus anthracis у ґрунті була за прикладом № 3-99,9 %. 3 UA 119282 U Використовуючи метод за прикладом № 3, ми провели виявлення спор збудника Bacillus anthracis у ґрунті удосконаленим методом на 70 пробах: ґрунт стерильний із додаванням спор 30 проб; ґрунт не стерильний - 40 проб. Результати наведені у табл. 2. Таблиця 2 Показники виявлення удосконаленого методу виявлення спор збудника Bacillus anthracis у ґрунті за прикладом № 3 № п/п Перелік видів досліджуваних проб ґрунту Ґрунт стерильний із 1 додаванням спор Bacillus anthracis, n=30 2 Ґрунт не стерильний, n=40 Виявлення спор збудника Bacillus anthracis у ґрунті за забарвленням колоній за прикладом №3 Відсутність колоній Кількість Наявність колоній збудника Кількість збудника Bacillus проб Bacillus anthracis проб anthracis через 20 год. до обробки парами 25 % аміаку білі, сіро-білі, випуклі, R-форми; n=15 n=15 відсутність росту через 20 год. після обробки парами 25 % аміаку - білі, сіро-білі, випуклі, R-форми. через 20 год. до обробки парами 25 % аміаку всі колонії білі, сіро-білі, випуклі, R-форми; n=20 через 20 год. після n=20 всі колонії рожеві. обробки парами 25 % аміаку колонії Bacillus anthracis білі, сіро-білі, випуклі, R-форми. 5 10 15 20 25 30 Встановлено типові колонії збудника Bacillus anthracis у ґрунті через 20 годин за температури 36 °C. Ці дані були стабільними та достовірними, отже, ці показники можна використовувати при оцінюванні безпечності ґрунту. Крім того, слід зазначити, що метод є економним, простим у виконанні, а його результати дають конкретні якісні показники по незабарвленню типових колоній білі, сіро-білі, випуклі, Rформи. Метод за прикладом № 3 нами пропонується як якісний та кількісний спосіб удосконалення методу виявлення спор збудника Bacillus anthracis у ґрунті поряд з іншими методами визначення їх безпечності (визначення загальної кількості мікроорганізмів (КМАФАнМ), визначення бактерій групи кишкової палички (БГКП), визначення перфрингенс-титру, нітрофікуючих бактерій та ін.) [5]. Метод має перевагу перед існуючими якісними методами визначення безпечності ґрунту тому, що результати мають достовірні показники за не забарвленням типових колоній Bacillus anthracis. Джерела інформації: 1. ДСТУ 7847:2015 Якість ґрунту. Визначення чисельності мікроорганізмів у ґрунті методом посіву на тверде (агаризоване) живильне середовище [Текст]. Чинний від 2016-07-01. - Київ: УкрНДНЦ, 2016. - III, 12 с. - (Національний стандарт України). -Бібліогр.: с. 11. 2. Інструкції з лабораторної діагностики сибірки у людей, в сировині тваринного походження та об'єктах довкілля: Наказ МОЗ України від 21.08.2002, № 321. 3. Ветеринарна санітарна мікробіологія / A.M. Головко, І.О. Рубленко. - Київ, 2010. - 67-68 с. 4. Г.Г. Жарикова Микробиология продовольственных товаров. Санитария и гигиена / Г.Г. Жарикова. - 2-е изд., М.: "Академия". - 2007. - С. 173-176. 5. Кочермасова З.Н. Санитарная микробиология и вирусология / З.Н. Кочермасова, С.А. Ефремова, A.M. Рыбакова. - М., Медицина. - 1987. - С. 118-134. 4 UA 119282 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб удосконалення методу виявлення спор збудника Bacillus anthracis у ґрунті, що полягає у приготуванні суспензії з ґрунту, який відрізняється тим, що ґрунт беруть у кількості 2,5 г, додають сахарозу-тритон Х-80 та БСА/ФСБ (1 % бичачий сироватковий альбумін у фосфатносольовому буфері). Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5