Спосіб визначення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином

Реферат: Спосіб визначення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином, при 3 якому використовують робочий розчин резазурину-натрієвої солі у кількості 1,2-1,4 см та 10,03 10,2 см досліджуваної проби молока, витримуючи їх за температури (37,5±0,5) °С у редуктазнику протягом 40 хвилин та 1 год. 10 хвилин для відновлення резазурину окисновідновлювальними ферментами мікроорганізмів, які наявні у молоці, визначаючи при цьому забарвлення від сіро-бузкового до бузкового зі слабким сірим відтінком, що відповідає 3 орієнтованій кількості бактерій 100 тис.-500 тис. KУО/см . Основний розчин резазуринунатрієвої солі готують шляхом перенесення 0,10-0,11 г резазурину у мірну колбу ємністю 200,0 3 см і доводять до мітки прокип'яченою і охолодженою до 25 ºС дистильованою водою, ретельно перемішують. Робочий розчин резазурину-натрієвої солі готують шляхом розбавлення 10,0-11,0 3 3 см основного розчину резазурину 20,0-21,0 см дистильованої води. UA 119281 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ БАКТЕРІАЛЬНОГО ОБСІМЕНІННЯ МОЛОКА РЕДУКТАЗНОЮ ПРОБОЮ З РЕЗАЗУРИНОМ UA 119281 U UA 119281 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до ветеринарної медицини, і може бути використаний для визначення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином у виробничих лабораторіях на потужностях з виробництва молока та молочних продуктів, у державних лабораторіях ветеринарної медицини, на пунктах збору сирого коров'ячого молока від суб'єктів господарювання, а також у лабораторіях ветеринарносанітарної експертизи на агропромислових ринках. За результатами цього методу можна отримати кількісні показники при оцінці якості та безпечності молока. Аналогом корисної моделі є метод визначення інгібувальних речовин (антибіотиків, формаліну, хлору, пероксиду водню тощо) у молоці за допомогою органічного барвника резазурину натрієвої солі [1], який відновлюється при розвитку в молоці чутливих до інгібувальних речовин мікроорганізмів виду Streptoccocus thermophilus. Недоліком даного методу є те, що він довготривалий, громіздкий. Крім того, даний метод дає похибку від 20 до 35 %. Прототипом корисної моделі є метод визначення бактеріального обсіменіння молока [2, 3], у 3 3 якому використовують робочий розчин резазурину натрієвої солі у кількості 1 см і 10 см досліджуваного молока і витримують у редуктазнику за температури (37±1) С протягом 1 год. та 1 год. 30 хв. По довготривалості зміни забарвлення оцінюють бактеріальне обсіменіння молока. Недоліком даного методу є те, що він громіздкий, довготривалий. Крім того, даний метод дає похибку у 15-25 %. В основу корисної моделі поставлено задачу - розробити спосіб визначення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином шляхом зміни температури та часу проведення дослідження, концентрації та кількості робочого розчину резазурину-натрієвої солі для його відновлення окисно-відновлювальними ферментами мікроорганізмів, які наявні у молоці, визначаючи при цьому забарвлення від сіро-бузкового до бузкового зі слабким сірим 3 відтінком, що відповідає орієнтованій кількості бактерій 100 тис.-500 тис. КУО/см . Дана корисна модель забезпечить достовірність результатів при визначенні бактеріального обсіменіння молока. Поставлена задача вирішується в способі визначення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином, при якому використовують робочий розчин резазурину3 3 натрієвої солі у кількості 1,2-1,4 см та 10,0-10,2 см досліджуваної проби молока, витримуючи їх за температури (37,5±0,5)°С у редуктазнику протягом 40 хвилин та 1 год. 10 хвилин для відновлення резазурину окисно-відновлювальними ферментами мікроорганізмів, які наявні у молоці, визначаючи при цьому забарвлення від сіро-бузкового до бузкового з слабким сірим 3 відтінком, що відповідає орієнтованій кількості бактерій 100 тис.-500 тис. КУО/см , при цьому основний розчин резазурину-натрієвої солі готують шляхом перенесення 0,10-0,11 г резазурину 3 у мірну колбу ємністю 200,0 см і доводять до мітки прокип'яченою і охолодженою до 25 °C дистильованою водою, ретельно перемішують, а робочий розчин резазурину-натрієвої солі 3 3 готують шляхом розбавлення 10,0-11,0 см основного розчину резазурину 20,0-21,0 см дистильованої води. Етапи вирішення даної задачі наведено у нижчезазначених прикладах. 3 Приклад 1. Для розробки методу використовують 2,0-2,1 см робочого розчину резазурину3 натрієвої солі, що вносять у стерильну пробірку, приливають 8,0-8,2 см досліджуваної проби молока, закривають гумовими корками і змішують, повільно перевертаючи пробірки тричі. Пробірки поміщають у редуктазник за температури води (36,0±1,0) С. Результати редуктазної 3 проби за орієнтованою кількістю бактерій у 1 см молока за кольором враховують через 1 год. 20 хв. та 2 год. і оцінюють бактеріальне обсіменіння молока. Через 1 год. 20 хв. пробірка з молоком, що має забарвлення бузкове з рожевим відтінком, залишається у редуктазнику ще на 40 хв. Готування розчинів резазурину-натрієвої солі: основний розчин: 0,5-0,06 г резазурину 3 переносять у мірну колбу ємністю 150,0 см і доводять до мітки прокип'яченою і охолодженою 3 до 25 С дистильованою водою, ретельно перемішують; робочий розчин: 10,0-11,0 см 3 основного розчину резазурину розбавляють 25,0-26,0 см дистильованою водою. 3 Приклад 2. Для розробки методу використовують 1,8-2,0 см робочого розчину резазурину3 натрієвої солі, що вносять у стерильну пробірку, приливають 9,0-9,2 см досліджуваної проби молока, закривають гумовими корками і змішують, повільно перевертаючи пробірки тричі. Пробірки поміщають у редуктазник за температури води (39,0±1,0) С. Результати редуктазної 3 проби за орієнтованою кількістю бактерій у 1 см молока за кольором враховують через 1 год. 10 хв. та 1 год. 40 хв. і оцінюють бактеріальне обсіменіння молока. Через 1 год. 10 хв. пробірка з молоком, що має забарвлення бузкове з рожевим відтінком, залишається у редуктазнику ще на 30 хв. 1 UA 119281 U 5 10 15 Готування розчинів резазурину-натрієвої солі: основний розчин: 0,10-0,11 г резазурину 3 переносять у мірну колбу ємністю 200,0 см і доводять до мітки прокип'яченою і охолодженою 3 до 25 С дистильованою водою, ретельно перемішують; робочий розчин: 15,0-16,0 см 3 основного розчину резазурину розбавляють 20,0-21,0 см дистильованою водою. 3 Приклад 3. Для розробки методу використовують 1,2-1,4 см робочого розчину резазурину3 натрієвої солі, що вносять у стерильну пробірку, приливають 10,0-10,2 см досліджуваної проби молока, закривають гумовими корками і змішують, повільно перевертаючи пробірки тричі. Пробірки поміщають у редуктазник за температури води (37,5±0,5)°С. Результати редуктазної 3 проби за орієнтованою кількістю бактерій у 1 см молока за кольором враховують через 40 хв. та 1 год. 10 хв. і оцінюють бактеріальне обсіменіння молока. Через 40 хв. пробірка з молоком, що має забарвлення сіро-бузкове до бузкового зі слабким сірим відтінком, залишається у редуктазнику ще на 30 хв. Готування розчинів резазурину-натрієвої солі: основний розчин: 0,10-0,11 г резазурину 3 переносять у мірну колбу ємністю 200,0 см і доводять до мітки прокип'яченою і охолодженою 3 до 25 С дистильованою водою, ретельно перемішують; робочий розчин: 10,0-11,0 см 3 основного розчину резазурину розбавляють 20,0-21,0 см дистильованою водою. Порівняльна оцінка результатів випробування вищезазначених способів визначення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином до прототипу наведені у таблиці 1. 20 Таблиця 1 Порівняння способів визначення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином до прототипу № п/п 1 1 2 3 4 5 6 7 8 25 Показники, що Прототип порівнюються 1 2 3 4 Склад основного розчину резазурину-натрієвої солі: 0,1 0,5-0,6 резазурин, г дистильована 200,0 150,0 3 вода, см Склад робочого розчину резазурину-натрієвої солі: 10,0 10,0-10,1 3 основний розчин, см 25,0 25,0-25,1 ~ дистильована вода, см Складові проби: робочий р1,0 2,0-2,1 н резазурину, см молоко, 10,0 8,0-8,2 3 см Температура води у 37,0±1 36,0±1 редуктазнику, °C Тривалість визначення від 1 год. до від 1 год. 20 хв. досліду, год. 1 год. 30 хв. до 2 год. Стабільність показників визначення бактеріального 96,8 85,2 обсіменіння молока редуктазною пробою, % Співвідношення результатів досліджень щодо 90,5-94,8 71,3-75,0 визначення наявності сальмонел у молоці, у % Співвідношення результатів досліджень щодо 90,1-95,0 72,5-76,3 визначення наявності стафілококів у молоці, у % Приклади 2 5 3 6 0,10-0,11 200,0 0,10-0,11 200,0 15,0-16,0 20,0-20,1 10,0-11,0 20,0-20,1 1,8-2,0 9,0-9,2 1,2-1,4 10,0-10,2 39,0±1 37,5±0,5 від 1 год. 10 хв. до 1 год. 40 хв. від 40 хв. до 1 год. 10 хв. 72,4 99,9 81,0-83,5 97,6-98,8 83,1-85,7 98,5-99,2 Дані таблиці 1 свідчать, що більш достовірні дані у порівнянні з результатами досліджень щодо визначення наявності сальмонел у молоці, молоці - у 97,6-98,8 % [4] та до результатів досліджень щодо визначення наявності стафілококів у молоці - у 98,5-99,2 % [5] були отримані при застосуванні методу за прикладом № 3. Також найвища стабільність показників 2 UA 119281 U 5 щодо визначення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином була за прикладом № 3-99,9 %. Використовуючи метод за прикладом № 3, ми провели виявлення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином за кольором та встановили орієнтовану 3 3 кількість бактерій у 1 см (КУО/см ) на 28 пробах молока. Результати наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Оцінка результатів редуктазної проби при визначенні бактеріального обсіменіння молока за прототипом та методами N п/п 1 2 3 4 10 15 20 25 30 Оцінка редуктазної проби молока, n=28 Приклади Прототип Показники 1 2 3 редуктазної проби Час проведення редуктазної проби через 1 год. 20 через 1 год. 10 через 1 год. через 40 хв. хв. хв. сіро-бузковий до бузковий з бузковий з бузковий з бузкового зі Колір рожевим рожевим рожевим слабким сірим відтінком відтінком відтінком відтінком Орієнтована від 500 тис. до 3 від 500 тис. до 3 від 500 тис. до 3 від 100 тис. до 500 кількість бактерій у млн. млн. млн. тис. 3 молоці, КУО/см Загальний час проведення редуктазної проби через 1 год. 40 через 1 год. 30 хв. через 2 год. через 1 год. 10 хв. хв. сіро-бузковий до бузковий з бузкового зі Колір блідо-рожевий блідо-рожевий рожевим слабким сірим відтінком відтінком Орієнтована від 500 тис. до 3 від 100 тис. до 500 кількість бактерій у понад 3 млн. понад 3 млн. млн. тис. 3 молоці, КУО/см Проведеними дослідженнями визначено, що найбільш стабільний колір при проведенні визначення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином - сіробузковий до бузкового зі слабким сірим відтінком, що відповідає вмісту кількості бактерій 100 3 тис.-500 тис. КУО/см , був у методі за прикладом № 3. Крім того, даний розроблений метод ефективний та скорочує термін проведення редуктазної проби. Метод за прикладом № 3 нами пропонується як кількісний спосіб для визначення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином поряд з іншими методами визначення показників якості та безпечності (визначення загальної кількості мікроорганізмів (КМАФАнМ), визначення бактерій групи кишкової палички, сальмонел, стафілококів) [4-6]. Метод має перевагу перед існуючими методами визначення якості та безпечності молока тому, що результати мають високу достовірність в оцінці кольору та орієнтованій кількості 3 3 бактерій у 1 см (КУО/см ) досліджуваного молока при визначенні бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином. Джерела інформації: 1. Молоко. Методы определения ингибирующих веществ: ГОСТ 23454-79. -М.: Госстандарт СССР. - 1981. - 14 с. 2. Молоко та молочні продукти. Методи мікробіологічного контролювання: ДСТУ 7357:2013. К.: Мінекономрозвитку України, 2014. - 35 с (Національний стандарт України). 3. Молоко коров'яче - сировина. Технічні умови: ДСТУ 3662:2015. -К.: Держстандарт. - 1997. 16 с (Національний стандарт України). 4. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення Salmonella: ДСТУ EN 12824:2004. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. -20 с (Національний стандарт України). 3 UA 119281 U 5 5. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод підрахування коагулазопозитивних стафілококів. Частина 1. Метод з використовуванням агарового середовища Беард-Паркера (ISO 6888-1:1999, ITD): ДСТУ ISO 6888-1:2003. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 10 с (Національний стандарт України). 6. Івченко В.М. Довідник мікробіологічних методів дослідження харчових продуктів і кормів для тварин згідно з міжнародними стандартами [В.М.Івченко, В.В.Шарандак, О.І.Горбатюк та ін.] - Біла Церква, 2006. - 264 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 Спосіб визначення бактеріального обсіменіння молока редуктазною пробою з резазурином, при 3 якому використовують робочий розчин резазурину-натрієвої солі у кількості 1,2-1,4 см та 10,03 10,2 см досліджуваної проби молока, витримуючи їх за температури (37,5±0,5) °С у редуктазнику протягом 40 хвилин та 1 год. 10 хвилин для відновлення резазурину окисновідновлювальними ферментами мікроорганізмів, які наявні у молоці, визначаючи при цьому забарвлення від сіро-бузкового до бузкового зі слабким сірим відтінком, що відповідає 3 орієнтованій кількості бактерій 100 тис.-500 тис. KУО/см , при цьому основний розчин резазурину-натрієвої солі готують шляхом перенесення 0,10-0,11 г резазурину у мірну колбу 3 ємністю 200,0 см і доводять до мітки прокип'яченою і охолодженою до 25 ºС дистильованою водою, ретельно перемішують, а робочий розчин резазурину-натрієвої солі готують шляхом 3 3 розбавлення 10,0-11,0 см основного розчину резазурину 20,0-21,0 см дистильованої води. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4