Спосіб визначення стану інтоксикації організму тварин за охротоксикозу

Реферат: Спосіб визначеним стану інтоксикації організму тварин за охротоксикозу включає дослідження активності ферментів. В тканинах печінки встановлюють активність глутатіон-залежних ензимів (глутатіонтрансферази, глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази) та концентрацію глутатіону. При цьому: - збільшення концентрації глутатіону та активності глутатіон-залежних ферментів вище норми - свідчить про легкий ступінь інтоксикації із залученням компенсаторних реакцій системи антиоксидантного захисту; - зниження концентрації глутатіону та активності глутатіон-залежних ферментів нижче норми - вказує на важку форму мікотоксикозу, що супроводжується виснаженням системи антиоксидантного захисту та незворотними змінами у внутрішніх органах. UA 119354 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ СТАНУ ІНТОКСИКАЦІЇ ОРГАНІЗМУ ТВАРИН ЗА ОХРОТОКСИКОЗУ UA 119354 U UA 119354 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна моделі належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема до токсикології та клінічної біохімії, а саме до способів визначення інтоксикації організму тварин та птиці за охротоксикозу, і може бути застосована у лабораторіях ветеринарної медицини з метою встановлення ступеня ураження організму тварин та птиці за дії охротоксинів. Мікотоксини - це вторинні метаболіти мікроскопічних грибів (плісеней), які мають виражені токсичні властивості. Основна роль мікотоксинів у життєдіяльності грибів полягає в тому, що вони забезпечують умови для виживання продуцента у конкуренції за місце в різних екологічних нішах. Субстратом для грибів, які продукують мікотоксини, є рослини, в т. ч. різні сільськогосподарські культури. Проблема мікотоксикозів взагалі та мікотоксинів зокрема носить глобальний характер. В першу чергу це пояснюється поширенням токсичних грибів у природі, які при сприятливих умовах можуть уражати корми, харчові продукти, промислову сировину та продукувати. З іншого боку - використання контамінованих мікотоксинами кормів та продуктів харчування може супроводжуватись захворюваннями тварин та людей - мікотоксикозами. Мікотоксини відзначаються високою стійкістю до дії кислот, лугів, дезінфектантів, високої температури та інших факторів. Для них, крім безпосередньої біологічної дії, є характерним ряд віддалених ефектів ембріотоксичний, тератогенний, мутагенний та канцерогенний. На сьогодні відомі різні способи визначення мікотоксинів (ГОСТ 28001-88. Методы определения микотоксинов Т-2, зеараленона и охратоксина А. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма; патент RU № 2056044, 2361203, 2514828) у продуктах тваринного та рослинного походження, в тому числі молоці і молочних продуктах. Зокрема для встановлення наявності охротоксину відомі способи включають використання хроматографічного методу дослідження проб. Недоліками відомих способів є те, що вони достатньо складні і трудомісткі, окрім того не підходять для визначення дії самого охротоксину на організм. Інші відомі способи включають діагностику отруєння (Авт. свід. SU № 1717101, 1757643, 356555; патент RU № 209381 1, 2099714, 2324943, 2416824) за дії на організм річних токсичних речовин екзогенного та ендогенного походження. Недоліками відомих способів є те, що вони не придатні для діагностики інтоксикації організму при отруєнні охротоксинами. Найближчим аналогом до способу, що заявляється, є спосіб діагностики отруєнь малими дозами фосфорорганічних отруйних речовин (Патент RU №2484469), який полягає у тому, що визначають каталітичну активність арілестерази плазми крові і оцінюють ефект підвищення каталітичної активності арілестерази плазми крові після прогрівання при температурі 55 °C протягом 5 хв. з використанням як субстрату індофенілацетату. Визначення каталітичної активності зазначеного ферменту і ефекту підвищення його після прогрівання здійснюють одноразово після контакту з фосфорорганічними отруйними речовинами, ефект підвищення каталітичної активності арілестерази плазми крові після прогрівання виражають у %, приймаючи за 100 % каталітичну активність арілестерази плазми крові до прогрівання. У разі, якщо збільшення активності арілестерази плазми крові після прогрівання складає більше 20 %, то діагностують отруєння малими дозами фосфорорганічних отруйних речовин. Використання заявленого способу дозволяє ефективно визначити факт отруєння малими дозами ФОР при відсутності будь-яких клінічних ознак отруєння. Заявлений спосіб і найближчий аналог мають спільні суттєві ознаки, а саме: включає дослідження активності ферментів. Недоліками відомого способу є те, що він не підходить для визначення інтоксикації організму, пов'язаної із отруєнням охротоксинами. Запропонований спосіб усуває недоліки найближчого аналога та дозволяє достатньо точно діагностувати ступінь інтоксикації та визначати стан системи антиоксидантного захисту організму тварин за охротоксикозів. В основу корисної моделі поставлена задача розробити новий, ефективний, надійний спосіб визначення і оцінки ступеня інтоксикації організму тварин за охротоксикозу, зручний у використанні. Технічний результат досягається тим, що в тканинах печінки встановлюють активність глутатіон-залежних ензимів (глутатіонтрансферази, глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази) та концентрацію глутатіону, при цьому: - збільшення концентрації глутатіону та активності глутатіон-залежних ферментів вище норми - свідчить про легкий ступінь інтоксикації із залученням компенсаторних реакцій системи антиоксидантного захисту; 1 UA 119354 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - зниження концентрації глутатіону та активності глутатіон-залежних ферментів нижче норми - вказує на важку форму мікотоксикозу, що супроводжується виснаженням системи антиоксидантного захисту та незворотними змінами у внутрішніх органах. Охратоксини являють собою групу структурно-споріднених сполук ізокумаринів, зв'язаних пептидним зв'язком з L-фенілаланіном. До групи охратоксинів належать три види цього токсину: А, В і С. Найчастіше, природним забруднювачем кормів є охратоксин А, головними продуцентами якого є Aspergillus ochraceus і Penicillium viridicatum. Основним шляхом надходження охратоксинів в організм тварин, які знаходяться у природних умовах, є аліментарний. Встановлено, що охратоксин А, введений per os, вже через 3 год. локалізується переважно в травному каналі, нирках, печінці. Проте, біохімічні ефекти, молекулярні та клітинні механізми дії охратоксинів вивчені недостатньо. Характер клінічних симптомів охратоксикозу залежить від дії токсину і певної дози, тривалості надходження, виду та віку тварини. У хворих тварин, як правило розвивається полідипсія, поліурія, діарея, зневоднення, зниження маси тіла, тромбоцитопенія, гіпокальціємія. У курей знижується яйценосність або зменшується маса яєць. Відомо, що нефропатії свиней, спричинені охратоксинами, у деяких країнах мають ендемічний характер (у нирках хворих тварин, у таких випадках, виявляють охратоксин А. Окрім ураження нирок, у свиней і собак, також спостерігається ураження печінки, кишечнику, селезінки, лімфоїдної тканини. Охратоксин А зокрема також має виражені тератогенні та канцерогенні властивості. На сьогоднішній день на практиці діагностика отруєнь, в тому числі охротоксинами, проводиться на підставі характерних морфологічних змін та виявленні отруйних речовин в сечі, крові, тканинах внутрішніх органів. При цьому ступінь ураження організму при отруєнні визначається за наявності ознак, небезпечних для життя, або тривалості розладу здоров'я. Однак чітких критеріїв, що визначають стан організму тварин, немає. Суть заявленої корисної моделі полягає у тому, що ступінь ураження організму при охротоксикозі визначається за змінами системи антиоксидантного захисту. Глутатіонова антиоксидантна система ферментів, яка включає глутатіонпероксидазу (GPx), глутатіонредуктазу (GR) та глутатіонтрансферазу (GTS) перешкоджає накопиченню токсичних продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), відіграє важливу роль в детоксикації, деградації та виведенні із організму чужорідних органічних субстанцій. Глутатіонтрансфераза каталізує реакції знешкодження вільних радикалів, які проходять за участю глутатіону; глутатіонпероксидаза відновлює окислені водневі молекули, а також ліпідні та інші органічні молекули, окислені радикалами кисню. У всіх цих ферментних реакціях глутатіон виступає як кофермент та центральний гравець. Відновлений глутатіон (GSH) - трипептид, що складається з амінокислот L-глутамату, Lцистеїну і гліцину. Глутатіон є одним з найпотужніших антиоксидантів, основним знешкоджувачем вільних радикалів в клітинах. Він є ключовою ланкою трьох антиоксидантних систем організму з наявних чотирьох. Важливе значення GSН в редокс-залежних процесах визначається його участю в регуляції клітинного редокс-залежного сигналінгу і активності транскрипційних факторів, а також тим фактом, що він є внутрішньоклітинним антиоксидантом, який відіграє роль "пастки" вільних радикалів, косубстрату в реакціях детоксикації пероксидів, що каталізуються глутатіонпероксидазою (GPx) і глутатіонтрансферазою (GST), і виступає як агент, який відновлює окислений глутаредоксин (Grx), необхідний для відновлення дисульфідів. Збереження оптимального для клітини співвідношення відновленого глутатіону до окисленого (CiSSG) - GSH / GSSG є важливою умовою для її життєздатності. Зниження рівня GSН нижче показників норми може служити індикатором порушення клітинного редокс-статусу і зміни редокс-залежної регуляції генів. Порушення внутрішньоклітинного балансу GSН спостерігається при ряді патологій, включаючи злоякісні новоутворення. S-глутатіонілірування білків є важливим регуляторним механізмом в біохімічних процесах завдяки зворотній модифікації сульфгідрильних груп білків і може здійснюватися як неферментативним, так і ферментативним шляхом за участю GST і Grx. Поєднання антиоксидантних властивостей і здатності активувати транскрипцію генів, утому числі деяких антиоксидантних ферментів, а також пригнічувати редокс-залежні шляхи активації апоптозу свідчать про важливий внесок GST і Grx в антиоксидантну захисну систему, що підвищує стійкість клітин до окисного стресу. Істотною перешкодою на шляху розвитку деструктивної дії окисного стресу служить GST, що має високу активність по відношенню до продуктів перекисного окислення ДНК і ліпідів. Дисульфіди і змішані дисульфіди є субстратами Grx, який відіграє важливу роль в тіол-дисульфідному обміні, регулюючи зокрема активність транскрипційних факторів і процес апоптозу. Ізоформи GST і Grx мають велике значення в регуляції клітинного сигналінгу шляхом білок-білкових взаємодій з 2 UA 119354 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ключовими кіназами, контролюючими клітинну відповідь на стрес, проліферацію, розвиток апоптозу. Відомо, що охротоксин А (ОТА) сприяє виробництву вкрай руйнівних гідроксильних радикалів. Одним з кількох можливих наслідків цього процесу с формування перекисів ліпідів. Це породжує радикали супероксиду аніону і, отже, перекису водню (Н2О2). Водночас, внутрішньоклітинний статус GSH у гепатоцитах є чутливим показником загального етапу середовища. При цьому зменшення концентрації GSН пов'язане з безперервним нападом вільних радикалів. Оскільки GSН є важливий антиоксидант, зменшення його внутрішньоклітинної концентрації значно послаблює захист клітини від окиснювальної травми. Інгібування експресії інших ензимів з захисними властивостями може в подальшому збільшувати негативний вплив ОТА опосередкованого зменшення GSН. Багато генів, які регулюються ОТА, беруть участь у детоксикації та транспортних процесах. Вони включають в себе зокрема кілька GST-аз. Наприклад, експресія субодиниці GSTP1 знижується після введення ОТА. GSTP1, як вважають, грає роль в детоксикації продукту перекисного окиснення ліпідів 4-гідроксиноненалу шляхом сполучення з GSH. 4гідроксиноненал є реактивно хімічною сполукою, яка зв'язується з макромолекулами, зокрема ДНК. Зниження експресії GSTPI може призвести до зниження детоксикації та екскреції ОТА. Якщо пероксиди спричиняють внутрішньоклітинне окиснення, то відбувається зменшення окисненого глутатіону (GSSG). Для підтримки окисновідновного стану він утилізується глутатіонпероксидазою (GPX) і активно експортується з клітини. Недостатність адекватних кількостей NADPH і GSH перешкоджає утилізації Н2О2 GSH-залежною GPx і NADPH-залежною глутатіонредуктазою (GR). Пероксид-індуковане зниження GSH, таким чином, пояснюється споживанням нього антиоксиданту і відсутністю субстратів для його синтезу. У дослідах, проведених на лабораторних тваринах, оброблених (ОТА), встановлено зменшення концентрації GSH та рівня антиоксидантних ензимів GPx, GR і GST у порівнянні із контролем (Chakraborty IX, Verma R. // Int. J. Occ. Med. Env. Н. - 2010. - V. 23, № 1. - P. 63-73). При цьому після двох тижнів впливу ОТА в печінці мишей спостерігався апоптоз. Проте активність глутатіонової системи антиоксидантного захисту залежить від дози ОТА. Незначна доза ОТА при потраплянні в організм щурів проявляє стимулюючу дію. Натомість, із підвищенням дози ОТА-функція системи пригнічується. Так, наприклад, у первинних гепатоцитах щура під виливом ОТА в дозі 1,5 мкМ концентрація GSIІ зросла па 35 %, а вже коли доза ОТА була 3 та 6 мкМ кількість GSН знижувалась відповідна па 20 та 45 % (Gavin G. el al. // Toxicol.Sc. - 2007. - V.96, № 1. - P. 30-39.). Отже, наведені інформаційні відомості пояснюють одержання технічного результату заявленого способу. При проведенні патентно-інформаційного пошуку авторами і заявником знайдено технічне рішення (Способ диагностики отравлений малыми дозами фосфорорганических отравляющих веществ, патент RU №2484469), що містить найбільшу кількість суттєвих ознак, спільних із заявленим і включає дослідження активності ферментів для визначення отруєння. Однак, наявність зазначених, спільних з найближчим аналогом ознак недостатня для отримання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які за сукупністю ознак повністю співпадають із заявленим способом, заявником не виявлено. У патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від найближчого аналога і забезпечують досягнення технічного результату тим, що в тканинах печінки встановлюють активність глутатіон-залежних ензимів (глутатіонтрансферази, глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази) та концентрацію глутатіону, при цьому: - збільшення концентрації глутатіону та активності глутатіон-залежних ферментів вище норми свідчить про легку ступінь інтоксикації із залученням компенсаторних реакцій системи антиоксидантного захисту; - зниження концентрації глутатіону та активності глутатіон-залежних ферментів нижче норми вказує на важку форму мікотоксикозу, що супроводжується виснаженням системи антиоксидантного захисту та незворотними змінами у внутрішніх органах. Заявлена корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема до токсикології та клінічної біохімії, а саме до способів визначення інтоксикації організму тварин та птиці за охротоксикозу, і може бути застосована у лабораторіях ветеринарної медицини з метою встановлення ступеня ураження організму тварин та птиці за дії охротоксинів. Заявлений спосіб виконують наступним чином: - для визначення стану інтоксикації тварин та птиці, печінку (при контрольному забої) або біопсійний матеріал печінки після промивання ізотонічним розчином гомогенізують у 3 UA 119354 U 5 10 15 20 25 30 гомогенізаторі Поттера-Елвегейма в 5 мМ трис - НС1 буфері (рН 7,0), який містить 5 мМ EDTA та 1 мМ фенілметилсульфанілфториду та центрифугують при 10000 g 15 хв. при 4 °C та відбирають супернатант для аналізів; - вміст GSH визначають за методом Beutler et al. (Beutler Е., Duron О., Kelly В. М. Improved method for the determination of blood glutathione. J. Lab.Clin.Med., 1963. - Vol. 61, № 5. - Р. 882888); - активність GST (КФ 2.5.1.18) визначають з використанням як субстрату 1 -хлор-2,4динітробензену (CDNB) (Habig W. II., Pabst M.)., Jakoby W. В, Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. J. Biol. Chem., 1974. - Vol. 249, № 22. - Р. 7130-7139), при цьому робочий розчин містить 1 мМ GSН та 1 мМ CDNB в 100 мМ калійфосфатному буфері (pН 6,5); - активність GPx (КФ 1.1 1.1.9) встановлюється за методом Рігіе (Рігіс А. Glutathione peroxidase in lens and a source of hydrogen peroxide in aqueous humour. Biochem. J., 1965. - Vol. 96. - Р. 244-253), реакційна суміш містить 0,1 мМ GSН, 0.2 мМ Н2О2, 1,5 мМ NaN3 та 0,02 мМ EDTA в 100 мМ калійфосфатному буфері (рН 7,0); - активність GR (КФ 1.6.4.2) визначають за методом Carlberg and Mannervik (Carlberg I., Mannervik B. Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione reductasc from rat liver. J. Biol. Chem., 1975. - Vol. 250, № 25. - Р. 5475-5480), реакційна система містить 1 мМ GSSG, 1 мМ NADPН та 0,5 мМ EDTA в 100 мМ калійфосфатному буфері (рН 7,6); - на основі отриманих даних вмісту глутатіону та активності глутатіон-залежних ферментів у порівнянні із нормою, роблять висновок про стан інтоксикації організму при охротоксикозі. Ефективність заявленого способу та його переваги перед прототипом підтверджені прикладом конкретного використання. Дослід проводили на самках морських свинок віком 6 місяців. Тваринам дослідної групи кожного ранку 5 днів перорально вводили розчинений у NaНCО3 ОТА у дозі 1,62 мг/кг живої маси. При забої відбирали печінку. Тканини подрібнювали на гомогенізаторі Поттера-Елвегейма = в 5 мМ трис-НСІ буфері (рН 7,0), який містив 5 мМ ЕДТА і І мМ фенілметилсульфанілфториду, гомогенат відцентрифуговували при 10 000 g. В супернатанті визначали концентрацію GSH, активність GPx, GR і GST. Статистичну обробку результатів досліджень проводили з використанням t-критерію Ст'юдента. Результати проведених досліджень свідчать про те, що концентрація GSH у печінні морських свинок, які одержували ОТА була на 21-25 % меншою, ніжу контролі (таблиця). Ці дані, з виснаження GSН у тканині печінки, підтримують концепцію, що GSН залучений в апоптичний процес. 35 Таблиця Вміст CSII та активність GST, GPx і GR у печінці морської свинки при гострому охротокзикозі (М±m, n=3). Показники GSH, нмоль/мг білка GSM, мкмоль/г тканини GST, нмоль/хвхмг білка GPx, нмоль GSH/хвхмг білка GR, нмоль NADPI [/хвхмг білка 40 45 Печінка Контроль 25,54±0,85 3,62±0,12 675,5±52,15 6,65±0,89 25,26±1,74 Дослід 20,23±1,26 2,73±0,17 545,5±31,55 4,40±0,65 18,98±1,15 р0,05 р