Штам бактерій pseudomonas aureofaciens, імв в-7558 для створення як самостійного діючого агента, так і в складі різноманітних консорціумів мікроорганізмів, біопрепаратів захисту рослин від фітопатогенних грибів

Реферат: Штам бактерій Pseudomonas aureofaciens задепоновано в Депозитарії Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером ІМВ В-7558. Створений як самостійний діючий агент, так і в складі різноманітних консорціумів мікроорганізмів, біопрепаратів захисту рослин від фітопатогенних грибів і бактерій та використання при очищенні від забруднень навколишнього середовища органічними речовинами природного та штучного походження. UA 120439 U (12) UA 120439 U UA 120439 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікробіології та біотехнології та може найти застосування в сільському господарстві для захисту рослин від хвороб та екології при очищенні навколишнього середовища від забруднювачів органічної природи. На теперішній час однією з складних проблем в Україні та і в цілому світі - є проблема забруднення оточуючого середовища від складних речовин ароматичної та аліфатичної природи техногенного походження, до яких відносять такі токсичні речовини, як пестициди, поверхнево-активні речовини (що входять до складу мийних та чистячих засобів), органічні речовини, такі як нафтопродукти (оливи, мастильні матеріали, дизельне паливо, тощо) та різні полі ароматичні речовини. Мікроорганізми виду Pseudomonas aureofaciens входять до складу багатьох біопрепаратів та мають унікальні якості, які сприятливо впливають на природне середовище (Нафтокс, Путидойл). Найбільш популярними є біопрепарати спрямовані на очищення від широкого спектра забруднювачів: нафта, нафтопродукти, жирові відходи виробництв, побутові забруднення, органічні забруднення ставків, водойм і т.п. Найбільш небезпечними забруднювачами навколишнього середовища є такі полютанти як поліциклічні ароматичні вуглеводні, які утворюються внаслідок антропогенної дії (забруднення середовищ важкими фракціями нафти (в результаті аварійних розливів, транспортування та використання нафти та нафтопродуктів) та мають токсичну, мутагенну та канцерогену дію на всі живі організми (рослини, тварин та людину). Поліциклічні органічні вуглеводні найчастіше зустрічаються в повітрі та ґрунті в межах роботи теплоелектро станцій, нафто-хімічного, коксо-, газо-, лакофарбувального виробництв та доволі часто перевищують гранично допустимі концетрації цього показника [Haritash AK, Kaushik CP. Biodegradation aspects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): a review. J Hazard Mater. 2009 Sep 30;169(1-3):1-15.) Kadri T, Rouissi T, Kaur Brar S, Cledon M, Sarma S, Verma M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by fungal enzymes: A review. J Environ Sci (China). 2017 Jan;51:52-74] Відомо, що бактерії роду Pseudomonas мають широкий спектр катаболітичної активності та можуть утилізувати в результаті свого росту різні сполуки вуглеводневої природи, такі як: нафталін, толуол, алкани, камфору, специфічні фенольні сполуки, компоненти нафти в забруднених водах і т.д. Мікроорганізми роду Pseudomonas можуть утилізувати і незвичайні хімічні сполуки - інсектициди, гербіциди та інші ксенобіотики. Синтез мікроорганізмами роду Pseudomonas біоПАР є одним з найважливіших механізмів утилізації вуглеводнів та інших слабо і нерозчинних у воді забруднень. Вони сприяють солюбілізації вуглеводнів і утворенню дрібнодисперсних емульсій, що полегшує контакт бактерій з гідрофобним субстратом. Звідси - їх можливість застосування в сільському господарстві, текстильній і харчовій промисловості, вторинному видобутку нафти. В даний час біоПАР привертають до себе великий інтерес. Їх величезна перевага перед синтетичними ПАР полягає в низькій токсичності і високій ефективності та біодеградабельності. Завдяки цим властивостям біоПАР широко використовуються не тільки для відновлення ґрунтів від різних забруднень, а й знаходять своє застосування в харчовій, косметичній, фармацевтичній промисловості. Для очищення навколишнього середовища, а саме для проведення фіторемедіаціонних технологій, заснованих на використанні рослин і асоційованих з рослиною мікроорганізмів, дуже важливою характеристикою штамів-деструкторів поліциклічних ароматичних вуглеводнів є їх фітостимулюючі властивості. Існують дані про штам Рseudomonas putida [патент RU 2344170, кл. МПК C12N 1/20, 2006.01], який здатний до деструкції нафталіну в ґрунті до нуля за 3 доби та фенантрену в ґрунті - до нуля за 20 діб. Цей штам здатний до синтезу поверхнево-активних речовин, які покращують та прискорюють деструкцію цим штамом нафти та поліциклічних речовин. Недоліком даного патенту є відсутність антагоністичної активності, щодо фітопатогенних мікроорганізмів та грибів. Відомий патент [патент RU 2352629, кл. МПК C12N 1/20, 2006.01], в якому описаний штам бактерій для захисту та покращеню росту рослин, які ростуть на ґрунтах, забруднених поліциклічними ароматичними вуглеводнями. Недоліком патенту є вузький спектр антагоністичної активності штаму відносно фітопатогенних грибів та бактерій. Відомий штам бактерій Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2500 Д для біодеградації поліциклічних ароматических вуглеводнів (Пат. 2396338. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2500 Д для биодеградации полициклических ароматических углеводородов в условиях загрязнения почв арсенитом натрия), який був здатний до деструкціії нафталіну в присутності арсену натрію та показана його дія на ріст рослин (рапсу), недоліком є відсутність антагоністичної дії на фітопатогенні гриби. 1 UA 120439 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відомий штам Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, який мав антагоністичну активність відносно фітопатогених грибів Alternaria alternata, Bipolaris sororiniana, Fusarium oxysporum, Fusarium gibbosum, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium nivale, Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium funiculosum [Патент RU 2203945, кл. МПК C12N 1/20, 2003.05.10], недоліком є відсутність даних щодо біодеградації поліциклічних ароматичних вуглеводнів. Як прототип вибраний штам бактерій Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2500 [патент RU 2396338, кл. МПК C12N 1/26], який був здатний до біодеградації поліциклічних ароматичних вуглеводнів в ґрунтах, при їх забрудненні солями нікелю, а також до покращення росту рослин внаслідок зменшення вмісту поліароматичних вуглеводнів в цих ґрунтах за рахунок їх біодеградації. Задачею корисної моделі є виділення нового штаму, який можливо використовувати і для захисту рослин від фітопатогених грибів та бактерій і для біодеструкції поліароматичних вуглеводнів в ґрунтах, забруднених цими речовинами. Що дозволило б отримувати комплексні біопрепарати широкого спектра дії, та створювати за їх допомогою нових ефективних агро- та екотехнологій. Поставлена задача вирішується тим, що було виділено нового штаму, який можливо використовувати і для захисту рослин від фітопатогених грибів та бактерій і для біодеструкції поліароматичних вуглеводнів в ґрунтах, забруднених цими речовинами. Штам Pseudomonas aureofaciens Мb-17 був ізольований в 2012 р. з ґрунту Черкаського р-ну України забрудненого нафтопродуктами та задепоновано в Депозитарії Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером ІМВ В-7558. На основі культурально-морфологічних досліджень та фізіолого-біохімічних ознак культуру визначили як Pseudomonas aureofaciens [за визначником бактерій Берджи. Москва. Мир, 1997]. Культура депонована в Депозитарій Інституту мікробіології і вірусології НАН України під номером ІМВ В-7558. Штам Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 не є генетично модифікованим штамом. Штам Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 відносять до мікроорганізмів, не патогенних для людини, штам не потребує спеціальних мір поводження. Дуже важливими характеристиками штаму були його фунгіцидні та бактеріоцидні властивості, а також здатність активно перетворювати складні хімічні сполуки органічної природи (широкий спектр пестицидів, актарицидів, інсектицидів, стимуляторів росту хімічного походження, що мають як ароматичну, так і аліфатичну структуру) до нетоксичних та безпечних для навколишнього середовища речовин. Принципіальні специфічні продукти Штам синтезує гетероциклічні феназинові антибіотики (феназин-1-карбонову кислоту, 2оксифеназин-1-карбоновую кислоту и 2-оксифеназин), індоліл-3-оцтову кислоту. Морфолого-культуральні ознаки: Грамнегативні короткі, рухомі палички, розміром 0,5 × 1,0 мкм. При культивуванні 48 год. при 28 °C на м'ясопептонному агарі (МПА) колонії жовто-оранжевого кольору, круглі, гладкі, блискучі непрозорі, діаметр 4-5 мм. Пігмент яскраво-оранжевий. Пігментація на діагностичних середовищах Кінга для флюорисціюючих псевдомонад: Кінг А - пігмент відсутній; Кінг Б утворюється жовто-зелений флюорисціюючий пігмент. У рідких поживних середовищах (МПБ) утворюється рівномірна муть. Аероби, окислювальний тип метаболізму. Температурний діапазон росту: 4-37 °C. Оптимальна для росту температура 28 °C. При 42 °C не ростуть. Та витримує 3 % NaCl при рості на МПБ. Молекулярний азот не фіксує. Пептонізує і згортає молоко. Засвоює з утворенням кислоти глюкозу, ксилозу, сахарозу, арабінозу, рафінозу, фруктозу. Як джерело вуглецю використовує мальтозу, бутанол, гексанол, маніт, гліцерин, бензойну кислоту, пропіонову кислоту, антранілову кислоту, бурштинову кислоту, оскетоглутаровую кислоту, піруват, лактат, цитрат, фенілаланін, серин, лейцин, аргінін, аланін, валін, триптофан, орнітин, пролін, лізин, тирозин. Не засвоює лактозу, етанол, пропанол, сорбіт, ацетамід, малеїнову кислоту, адипінову кислоту, оксалат, ізомасляну кислоту, треонін, метіонін, цистеїн, гексан, декан, октадекан, формальдегід, фенол. Умови культивування: культивується на таких середовищах як сусло-агар, МПА, картопляний агар. Спосіб визначення: Штам культивується на мінеральному середовищі М9 з додаванням різних індивідуальних джерел вуглеводню (нафта та нафтопродукти, фенольні сполуки, поліароматичні вуглеводні тощо). Для дослідження антагоністичних властивостей мікроорганізму проводили спільне культивування методами перпендикулярних штрихів та блочків [Нетрусов А.И., 2005] з 2 UA 120439 U 5 10 15 20 25 30 фітопатогеними грибами та мікроорганізмами. Наявність мікопаразитичних властивостей в культуральній рідині визначали через 7-10 діб, для чого заміряли зону відсутності росту, спостерігали за зміною морфології колонії фітопатогенів. Оцінку рістстимулюючої дії бактеріальної суспензії проводили по показниками енергії проростання та схожості насіння пшениці вівса, ячменю лабораторних і польових умовах Спосіб, умови та склад середовища для довгострокового культивування штаму: зберігається на середовищі сусло-агар, МПА, під шаром стерильного вазелінового масла. Пересів 1 раз в рік. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму та його розмноження можна проводити на середовищах аналогічного складу. Приклад 1. Вирощування штаму Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 та отримання його біомаси. Культивування бактерій Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 здійснювали в колбах місткістю 750 мл з 100 мл рідкого мінерального середовища наступного складу (г/л): Na2HPO4x12H2O-17,2; KН2РО4-3,0; NaCl-0,5, NH4Cl-1,0, глюкоза 2,0, на качалці (220 об/хв.) при 28 °C, оптимальне значення рН 7,0 упродовж 24-36 год. Як посівний матеріал використовували добову культуру вказаного штаму, вирощену на МПА, а також культуру, вирощену на середовищі, яке має приведений вище склад. Як джерело вуглецю і енергії при одержанні посівного матеріалу використовували глюкозу. Посівний матеріал вносили з розрахунку 3-5 об. % культуральної рідини. Приклад 2. Оцінку росту штаму Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 на середовищі з різним субстратами проводили на мінімальному мінеральному агаризованому середовищі (М9) з додаванням індивідуальних субстратів в якості джерела вуглеводню у концентрації 0,25-0,51,0 г/л. Культивування проводили за температури 28 °C впродовж 2-5 діб. Результати наведені в таблиці 1. Штам бактерій Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 добре ріс на середовищах, що містили навіть 1 мг/л глюкози, нафти, гексадекану, дизельному пальному, слабше на сахарозі, ксілозі, мальтозі, бутанолі, фенілаланіні, октані, геннтізаті. Встановлено, що штам Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 добре ріс на середовищах з 0,5 г/л фруктози, мазуту, бутанолу, антрацену. Та зовсім не ріс на середовищі з лактозою, гексаном, сорбітом, піреном, пропанолом та формальдегідом. На відміну від цього він був здатний до росту на середовищі лише у концентрації 0,25 мг/ з такими індивідуальними субстратами як: аценафтен, фенантрен, дибензотіофен та фенол. Таблиця 1 Ріст штаму Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 на мінеральному середовищі з додаванням індивідуальних субстратів як джерела вуглецю Джерело вуглецю сахароза ксілоза мальтоза фруктоза лактоза глюкоза нафта мазут дизельне пальне гексадекан гексан бутанол фенілаланін сорбіт октан гентизат антрацен пірен Концентрація, мг/л 0,5 + + + + ++ ++ + ++ ++ + + + + + 0,25 ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ + + + 3 1,0 + + + ++ ++ ++ ++ + + + + UA 120439 U Джерело вуглецю аценафтен фенантрен дибензотіофен пропанол формальдегід фенол 5 10 15 20 Концентрація, мг/л 0,5 0,25 + + + + 1,0 (-) - відсутність росту; (+) - гарний ріст; (++) - дуже гарний ріст Приклад 3 Вивчення антагоністичної активності нового штаму Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 по відношенню до фітопатогенних грибів Антагоністичну дію нового штаму Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 на фітопатогенні гриби вивчали методом агарових блочків [Нетрусов А. И., 2005]. Культуру бактерій Pseudomonas aureofaciens мб-17 висівали на поверхню поживного агару (МПА з 2 % гліцерину) і вирощували впродовж 2-3 діб при 28 °C. Потім вирізали диски (агарові блочки) з культурою штаму Pseudomonas aureofaciens мб-17 і переносили на поверхню картопляного агару з тесткультурою фітопатогеного гриба (суспензію гриба висівали глибинним способом з розрахунку близько 100 спор на 1 мл середовища) і інкубували 2-3 доби при температурі 28-30C. Наявність антагоністичних властивостей в визначали через 7-10 діб визначали заміряли зону відсутності росту, спостерігали за зміною морфології колонії фітопатогенів. Облік проводили по зонам відсутності або пригнічення росту тест-культури навколо агарового блочка з культурою штаму Pseudomonas aureofaciens мб-17. Результати представлені в таблиці 2 і свідчать про те, що новий штам Pseudomonas aureofaciens мб-17 має широкий спектр антагоністичної дії на фітопатогенні гриби. Встановлено, що штам активно пригнічував ріст фітопатогених грибів видів Gaeumannomyces graminis, Bipolaris sorokiniana, Rhyzoctonia solani, Fusarium nivale, слабше Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium heterosporum, Pythium altum, Altemaria alternate, Altemaria solani, Alternaria infectoria, Alternaria tenuissima, Pythium oligandrum. Таблиця 2 Антагоністична дія штаму Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 на тест-культурі фітопатогенних гибів № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 25 30 Діаметр зони пригнічення росту міцелію, мм 39,3±3,06 23,3±4,16 25,0±5,57 24,3±4,51 22,0±3,46 21,3±2,31 40,7±3,06 23,3±3,06 38,3±6,51 20,0±1,73 26,0±4,00 22,0±2,00 25,3±1,15 22,7±2,31 Вид фітопатогених грибів Gaeumannomyces graminis Fusarium culmorum Fusarium nivale Fusarium oxysporum Fusarium solani Fusarium heterosporum Rhyzoctonia solani Pythium altum Bipolaris sorokiniana Altemaria alternate Altemaria solani Alternaria infectoria Alternaria tenuissima Pythium oligandrum Приклад 4. Вивчення антагоністичної активності нового штаму Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 відносно фітопатогених мікроорганізмів. Як тест-об'єкти використовували наступні штами фітопатогенних мікроорганізмів: Erwinia carotovora, Erwinia amilovora, Erwinia herbicola, Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae. Тестування антагоністичної активності проводили в чашках Петрі методом лунок. Використовували метод двох шарів, при якому нижній шар - голодний агар (в кількості 20 мл на чашку Петрі), а верхній - (10 мл) картопляно-сахарозного поживного середовища, на яке засівали клітини фітопатогенів. Концентрація суспензії тест-культур повинна відповідати 10 ОД 4 UA 120439 U 5 стандарту мутності. Потім роблять лунки діаметром 8-10 мм і вносять в них по 0,1 мл культури штаму Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558, вирощену впродовж 48 годин. Після інкубування при 28 °C впродовж 24 год. візуально реєструють зони пригнічення росту фітопатогенних бактерій навколо лунок з культурою тестованого штаму. За діаметром зон пригнічення росту визначають антагоністичну активність нового штаму Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 (таблиця 3). Таблиця 3 Антагоністична дія штаму Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 на тест-культурі фітопатогенних бактерій № 1 2 3 4 5 6 10 15 Вид фітопатогених мікроорганізмів Erwinia carotovora Erwinia amilovora Erwinia herbicola Xanthomonas campestris Pseudomonas syringae Pseudomonas fluorescens Діаметр зони пригнічення росту мікроорганізмів, мм 41,7±2,08 32,7±3,06 9,3±1,15 24,0±2,00 23,0±2,64 16,3±0,58 Таким чином, показано, що заявлений штам бактерій Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 здатний до деградації поліциклічних вуглеводнів, нафти та нафтопродуктів, та захищає рослини від токсичної дії цих речовин та покращує їх ріст при культивуванні на забруднених ґрунтах. Також встановлено, що штам Pseudomonas aureofaciens ІМВ В-7558 здатний до синтезу речовини фітогормональної та антибіотичної (антимікробної та антифунгальної) природи та може бути використаний складі біопрепаратів для покращення (стимулювання росту) та захисту від бактеріальних та грибкових хвороб аграрно привабливих рослин. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Штам бактерій Pseudomonas aureofaciens, який задепоновано в Депозитарії Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером ІМВ В-7558 для створення як самостійного діючого агента, так і в складі різноманітних консорціумів мікроорганізмів, біопрепаратів захисту рослин від фітопатогенних грибів і бактерій та використання при очищенні від забруднень навколишнього середовища органічними речовинами природного та штучного походження. 25 Комп’ютерна верстка М. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5