Спосіб одержання ентомопатогенного препарату

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к отрасли защиты растений и может быть использовано при производстве энтомопатогенных препаратов для защиты сельскохозяйственных культур от вредных насекомых. Известны способы получения энтомопатогенных бактериальных препаратов в виде сухи х, смачивающих порошков, а также в виде суспензий [1, 2]. Получение препаратов с использованием искусственных питательных сред характерно только для бактериальных препаратов. Однако энтомопатогенные микроспоридии не выращиваются на искусственных питательных средах, т.к. являются внутриклеточными организмами. В то же время известно использование микроспоридий для ограничения вредоносности насекомых-фито фагов [3]. Известен способ получения энтомопатогенного препарата на основе микроспоридий путем выращивания их в гусеницах капустной совки (4). Недостатком способа являются трудности разведения лабораторной культуры капустной совки - хозяина микроспоридий, небольшие линейные размеры и масса совки, а также использование дорогостоящих компонентов ювеноидов, гормонов насекомых, как составная часть питательных сред в процессе выращивания капустной совки, - главные препятствия на пути к массовому получению энтомопатогенного препарата. По этому способу получено небольшое количество препарата для исследовательских целей [4]. Наиболее близким техническим решением по существу поставленной задачи, является способ получения препарата на основе энтомопатогенных микроспоридий, выбранный в качестве прототипа [5]. Формально прототип заявлен как "средство". Однако из сути изобретения, его функционального назначения, следуют элементы, характерные для "способа", т.е. наличие общих существенных признаков прототипа и заявляемого способа. Согласно прототипу, энтомопатогенный препарат получают путем извлечения двух видов спор микроспоридий, действующего начала препарата из инфицированных ими гусениц дубового шелкопряда. Дубовый шелкопряд, породы Полесский тассар, выращивают как промышленную культур у в Украине для получения натурального шелкового сырья. Частые эпизоотии являются причиной гибели популяций шелкопрядов на стадии гусениц старших возрастов, которые обычно утилизировались. Задача, решенная в прототипе, предусматривает использование инфицированных гусениц шелкопряда для получения энтомопатогенного препарата. Препарат в дальнейшем используют для борьбы с вредными насекомыми. Он состоит из спор двух видов микроспоридий - 0,003 0,015вес.%: моно- и диалкиловых эфиров полиэтиленгликоля - 0,02 - 0,03%; сухого молока 0,02 - 0,04% и остальное вода. При проведении целлюлярного гренажа, брюшную часть тела выбракованных бабочек, пораженных микроспоридиями не уничтожают, а хранят. В таком виде споры некоторое время сохраняют жизнеспособность. По мере необходимости, нужное количество инфекционного материала измельчают с водой, центрифугируют, получают концентрат спор микроспоридий, разбавляют водой до концентрации 103 - 108 спор в 1мл жидкости. Для стабилизации суспензии и равномерного нанесения препарата на растения, в рабочие суспензии вводят смесь моно- и диалкиловых эфиров полиэтиленгликоля и сухое молоко. Однако известный способ имеет следующие недостатки: 1. В аналогах и прототипе получают препараты которые не способны храниться продолжительный срок (используются только свежеприготовленные препараты). Следовательно, хранить их в прок, для последующего использования во временном интервале даже текущего года не представляется возможным. 2. Использование дорогостоящих и дефицитных компонентов (сухое молоко, гормоны насекомых - ювеноиды), одна из причин небольшого объема получения препарата, в основном для исследовательских целей. 3. Узкий спектр энтомоцидной активности препарата, поражающего только гусениц лугового мотылька. 4. Отсутствие сведений о таких общепринятых тестовых характеристиках препарата, как величины титра и токсикологических характеристик, что является определяющим при оценке их эффективности. 5. Не установлена эффективность препарата в отношении вредителей садовых насаждений. В основу изобретения поставлена задача получения жидкого энтомопатогенного препарата на основе спор энтомопатогенных микроспоридий с длительным сроком сохранности без потери энтомоцидной активности, экологически безопасного, не уступающего по эффективности существующим препаратам такого класса. Поставленная задача достигается тем, что в предлагаемом способе энтомопатогенные микроспоридии выращивались в гусеницах дубового шелкопряда. После достижения гусеницами 5 - го биологического возраста, когда накапливалось максимальное количество спор микроспоридий, их измельчали тщательно перемешивали с водой и после концентрированна культурной жидкости, определяли концентрацию спор КС микроспоридий, добавляли моно- и диалкиловые эфиры полиэтиленгликоля (ОП-7 или ОП-10), в концентрации 0,04 - 0,16мас.%. Введение эфиров позволяет увеличить технологические и потребительские свойства жидкого препарата, улучшает контакт препарата и смачиваемость поверхности листьев, соцветий или плодов, обрабатываемых растений. Преимуществом жидкой формы препаратов является низкая себестоимость (ввиду того, что при их производстве не применяется дорогостоящая стадия сушки, на которой происходит большая потеря основного продукта). Отсутствие вредной пыли при приготовлении рабочих растворов, легкость приготовления рабочих растворов. Большие преимущества перед сухими порошками в период нанесения рабочих суспензий на растения - идеальные условия покрытия растений. Введение тиомочевины в концентрации 0,04 0,16мас.% способствует увеличению длительности хранения препарата. С сохранением величины титра спор, их вирулентности. Кроме того, сохраняет энтомоцидную активность жидкого препарата. Введение нейтрального красного в количестве 0,004 - 0,010мас.%, усиливает антимикробные свойства предлагаемого препарата, предотвращает развитие сопутствующей, посторонней микрофлоры и придает препарату специфическую, характерную только для него, окраску. Нейтральный красный используется в медицине и в сельском хозяйстве для предохранения продуктов от порчи. Таким образом, предложенный энтомопатогенный препарат содержит следующее соотношение компонентов, мас.%: Споры микроспоридии Vairimorpha amheraeae 0,015 - 0,020 Моно- и диалкиловые эфиры полиэтиленгликоля 0,04 - 0,16 Тиомочевина 0,04 - 0,16 Нейтральный красный 0,004 - 0,10 Вода Остальное или Споры микроспоридии Plistophora schubergi 0,015 - 0,020 Споры микроспоридии Nosema antheraeae 0,002 - 0,010 Моно- и диалкиловые эфиры полиэтиленгликоля 0,04 - 0,16 Тиомочевина 0,04 - 0,16 Нейтральный красный 0,004 - 0,010 Вода Остальное В первом случае, основу препарата составляют споры микроспоридии Vairimipha antheraeae, к которым добавляют сопутствующие компоненты. В другом случае, основу препарата составляет смесь спор двух микроспоридий, каждая в равной пропорции т.е. Plistophora и Nosema, к которым добавляются компоненты. Сопоставительный анализ заявляемого технического решения и прототипа показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что в состав заявляемого препарата вводят два новых компонента, использование которых позволяет получить значительный технический результат. Исключается использование такого дефицитного пищевого компонента, как сухое молоко. Кроме того, кроме микроспоридий, основного действующего начала, используемых в прототипе: Pleistophora schubergi B., и Nosema antheraeae, предложено использовать также и микроспоридию Vairimorha antheraeae. В дальнейшем в тексте приводится русская транскрипция латинских наименований микроспоридий. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию изобретения "новизна". Совокупность перечисленных существенных признаков предлагаемого способа позволяет решить поставленную в изобретении задачу: получить жидкий энтомопатогенный - препарат, экологически безопасный, с длительным сроком хранения, удобный и эффективный в борьбе с вредителями овощных и плодовых культур. Предлагаемый способ получения энтомопатогенного препарата реализован следующим образом. Пример 1.В результате центрифугирования зараженных гусениц 5 - го возраста дубового шелкопряда микроспоридий Вайриморфа, была получена культурная жидкость с титром спор 5,8 × 109спор/мл. После концентрированна на сепараторе была получена КС с титром 15,0 × 109спор/мл. Была определена вирулентность их в отношении гусениц 3 - го возраста розанной листовертки, которая составила 0,028%. Из полученной КС приготовили 5 образцов препарата, отличающихся друг от друга по количеству содержащейся в них тиомочевины. Содержание тиомочевины в КС было: 0,02; 0,04; 0,08; 0,16; 0,25%. Приготовленные образцы ставили на хранение на 3, 6 и 12 месяцев при температуре +10 - 12°C. Во все образцы было добавлено 0,4% ОП-7. Полученные результаты представлены в табл.1. Из представленного примера видно, что цифровые показатели титра препарата и вирулентность в наибольшей степени сохраняется при концентрации тиомочевины в образцах от 0,04 до 0,16%. Граничные концентрации тиомочевины в образцах 0,02 - 0,25%. Как видно, титр спор и вирулентность снижаются пропорционально. В указанных пределах, после года хранения препарата, сохраняется вирулентность и титр препарата и значительно превосходит показатели способа-прототипа. Величина титра заявляемого препарата после года хранения превышала прототип в 2 - 2,5 раза. В эти х же пределах находилась и величина вирулентности. Доведение тиомочевины до 0,04 - 0,16% в присутствии ОП-7 дает благоприятные условия для сохранения титра и вирулентности препарата. Необходимость введения ОП-7 определяется не только проблемами хранения препарата, но и свойствами его при применении. Наличие ОП-7 в препарате при обработке растений, особенно капусты, становится решающим, т.к. способствует удержанию препарата на листьях капусты, имеющих, как известно, специфический восковой налет. Поэтому приводим экспериментальные данные, обосновывающие оптимальное содержание ОП-7 в препарате. Пример 2. В результате получения спор микроспоридии Вайриморфа, была получена культуральная жидкость с титром спор 5,8 × 109спор/мл, как это описано в примере 1. В пробы КС добавлялось ОП-7 в разной концентрации, во все образцы было добавлено 0,08% тиомочевины. Результаты, полученные при хранении образцов, представлены в табл.2. Пример 2 подтверждает для микроспоридии Вайриморфа достижение наибольшей продуктивности при добавлении ОП-7 в пределах концентрации 0,04 - 0,16%. Пример 3. В результате культивирования микроспоридий - Плейстофора шуберги и Нозема антереа на гусеницах дубового шелкопряда, была получена культуральная жидкость с титром 5,5 × 109спор/мл. После концентрирования на сепараторе была получена КС с титром 15 × 109спор/мл и вирулентностью в отношении гусениц розанной листовертки 0,04%. Из полученной КС приготовили образцы по методике описанной в примере 1. Содержание тиомочевины составило: 0,02; 0,04; 0,08; 0,16; 0,25%. Ко всем образцам добавляли 0,04% ОП-7. Образцы хранили при температуре +10 - 12°C в течении 3, 6 и 12 - ти месяцев. Полученные результаты содержания спор и вирулентности сравнивали со способомпрототипом. В табл.3 приведены результаты, которые свидетельствуют, что оптимальное содержание тиомочевины для наибольшей сохранности титра спор и вирулентности находится в пределах 0,04 0,16%, как и в случае, приведенном в примере 1. Обнаружено существенное превышение исследуемых показателей в этих параметрах над способом-прототипом, что и представлено в табл.3. Пример 4. В результате культивирования микроспоридий Плейстофора и Нозема на гусеницах дубового шелкопряда, была получена культуральная жидкость с титром 5,5 × 109спор/мл. После концентрирования на сепараторе была получена КС с титром 15 × 109спор/мл и вирулентностью 0,04%. Из полученной КС приготовляли образцы по методике, описанной в примере 1. Содержание тиомочевины составило 0,08%; ОП-7 - 0,04%. Содержание нейтрального красного определяли, для установления оптимальных концентраций. Препарат оставляли на хранение. Цифровые характеристики снимали после 3, 6 и 12 - ти месяцев хранения. Результаты исследований представлены в табл.4. Как видно из представленных данных, оптимальные концентрации нейтрального красного составляют 0,004 - 0,010%. Именно в этих пределах достигнута наибольшая продуктивность микроспоридий в сравнении с прототипом. Приведенные примеры показывают целесообразность применения всех компонентов. Это подтверждается другими опытами, а также высоким качеством препаратов. Пример 5. Полученные из зараженных гусениц дубового шелкопряда споры микроспоридий, как это описано в примере 1, довели концентрированием титра до необходимой величины, вводили другие, необходимые компоненты. Готовили по 15 образцов каждого из четырех препаратов, а также прототипа, все образцы специально инфицировались после приготовления производственными промывками, содержащими большое количество различной посторонней микрофлоры. Компоновали два образца предлагаемых энтомопатогенных препаратов с оптимальным содержанием компонентов. Состав препаратов представлен в табл.5, варианты 1 и 2 соответствуют заявляемому препарату. Варианты 3 и 4 содержали те же компоненты, за исключением нейтрального красного. Образцы предлагаемых препаратов, а также препарат полученный по способу прототипу, ставили на хранение при температуре +10 - 12°C, определив перед этим токсикологические характеристики препаратов, с использованием гусениц розанной листовертки 3 го возраста. Результаты исследований представлены в табл.5. Как видно, после 12 месяцев хранения заявляемые препараты, варианты 1 и 2, имели высокие, в 1,5 - 2 раза больше прототипа, показатели титра и вирулентности. Кроме того, присутствие в препаратах такого компонента, как нейтральный красный, делает вероятность развития посторонней микрофлоры равной нулю. В вариантах, которые не содержали нейтральный красный, а также в прототипе большинство образцов были засорены посторонней микрофлорой, что показали результаты как микроскопического анализа, так и резкий неприятный запах этих препаратов, что свидетельствует о потере качества этих препаратов и вирулентности. Пример 6. Полученные таким образом энтомопатогенные препараты, содержащие оптимальное количество компонентов, использовались для ограничения численности комплекса садовых листоверток: розанная, смородинная, сетчатая в плодоносящем саду. Обработку проводили в фенофазу окончания цветения яблони, когда преобладали гусеницы листоверток младших возрастов. Использовались химические инсектициды запрещено из-за, массового лета энтомофагов и пчел. Во все х случаях расход препаратов составил 3л/га. Полученные результаты представлены в табл.6. Как видно, биологическая эффективность заявляемых препаратов составила 80,7 - 84,5%, что полностью обеспечило защиту сада от этой группы вредителей. Достигнуто существенное увеличение эффективности в сравнении с прототипом по всем сравниваемым показателям. Если в контроле величина эффективной части популяции оставалась практически на исходном уровне, то вследствие обработок заявляемыми препаратами она составила всего 14,4 - 18,2%, в прототипе 35,6%. Пример 7. Полученные таким образом энтомопатогенные препараты, содержащие оптимальное количеством компонентов, использовались в те хнологии выращивания капусты, позднего срока созревания, сорт Лангендейкер. Препараты использовали против гусениц капустной совки, наиболее опасного вредителя капусты. Популяция совки характеризовалась, как такая, что была в фазе нарастания численности и массового размножения, т.е. отличалась повышенным уровнем жизнеспособности. Это иллюстрируют данные, приведенные в табл.7. В таком состоянии совка отличается высоким уровнем устойчивости к действию стрессовых факторов и большой вредоносностью. Использование предлагаемых энтомопатогенных препаратов (вариант 1 и 2), показало высокий уровень эффективности. Достигнутый технический результат заключался в статистически достоверном увеличении биологической эффективности на 16,6-18,9%, валового урожая на 54 - 67ц/га, а также в снижении поврежденности растений на 11,7 - 11,9%, в сравнении с использованием препарата, полученного по способу-прототипу (табл.7). Совокупный технический результат был на уровне использования высокотоксичного химического препарата дециса - химического эталона, повсеместно используемого в технологиях выращивания капусты. Одним из преимуществ использования энтомопатогенного препарата, полученного по предлагаемому способу, является экологический аспект. Действующее вещество препарата - споры микроспоридии, нетоксичны для теплокровных. Они не являются чужеродными для окружающей среды, а являются ее составной частью. Таким образом, предлагаемые энтомопатогенные препараты на основе микроспоридий отличаются повышенными показателями технологичности, токсикологическими характеристиками после хранения, а также высокой эффективностью при использовании препаратов в агроценозе плодового сада и овощных культур. Составная часть компонентов, входящи х в препараты, доступна, и с учетом того, что действующее начало препаратов - споры микроспоридий получают как отходы от выкормок дубового шелкопряда, экономически использование препаратов вполне приемлемо и целесообразно.