Спосіб оцінки стану клітинного імунітету людини

1. Спосіб оцінки стану клітинного імунітету людини, що включає виділення лімфоцитів людини з крові, проведення реакції між ними і еритро 40141 збираються в осадку. Еритроцити барана (миші) виділяють шляхом лізиса 0,84% розчином хлористого амонію. Потім лімфоцити людини відділяють від уламків еритроцитів барана шляхом центрифугування. Ознаками, які співпадають із суттєвими ознаками способу, є виділення лімфоцитів людини з крові, проведення реакції між ними і еритроцитами барана з подальшим підрахунком розеткоутворюючих клітин. Причинами, які перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату (підвищення достовірності оцінки стану клітинного імунітету людини при різних патологічних процесах), є низька специфічність і чутливість прототипу у визначенні популяційного і субпопуляційного складу лімфоцитів, оскільки, по-перше, розташовані на поверхні лімфоцитів людини рецептори, які забезпечують зв'язування ксеногенних еритроцитів, можуть зникати з поверхні лімфоцитів при ряді захворювань, під впливом деяких медикаментів і in vitro під впливом чинників зовнішнього середовища, а подруге, спонтанне розеткоутворення не дозволяє ідентифікувати усі субпопуляції лімфоцитів людини, зокрема, природні кілери (ПК). В основу винаходу поставлена задача вдосконалення способу оцінки стану клітинного імунітету людини шляхом підвищення його чутливості і специфічності за рахунок зміни типу рецепторів, які забезпечують зв'язування лімфоцитів людини і еритроцитів барана, що дозволяє досягнути очікуваний технічний результат. Поставлена задача вирішується тим, що в способі-прототипі, який включає виділення лімфоцитів з крові, проведення реакції між ними і еритроцитами барана з подальшим підрахунком розеткоутворюючих клітин, згідно з винаходом, еритроцити барана заздалегідь обробляються глютаровим альдегідом та інкубуються у присутності хлористого хрому з моноклональними антитілами проти мембранних фенотипових СО-антигенів лімфоцитів людини у співвідношенні 50-200 мкл моноклональних антитіл до 100 мкл 50% суспензії еритроцитів барана. Між сукупністю суттєвих ознак даного винаходу та очікуваним технічним результатом проявляється наступний причинно-наслідковий зв'язок: попередня обробка еритроцитів барана глютаровим альдегідом для втрати здатності до спонтанного розеткоутворення і подальше приєднання до їх поверхні моноклональних антитіл проти мембранних фенотипових CD-антигенів лімфоцитів людини за допомогою хлористого хрому (у співвідношеннях 50-200 мкл моноклональних антитіл до 100 мкл 50% суспензії еритроцитів барана) дозволяють їм специфічно зв'язуватися з лімфоцитами людини певного фенотипу, що підвищує достовірність і розширює коло субпопуляцій лімфоцитів людини, які визначаються, при збереженні таких переваг феномену розеткоутворення, як економічність, простота обліку результатів дослідження і можливість виділення популяцій (субпопуляцій) лімфоцитів, що дозволяє досягнути очікуваний технічний результат. Дане співвідношення еритроцитів барана і моноклональних антитіл дозволяє отримати найбільшу концентрацію антитіл на поверхні еритроцитів барана. При відхиленні від цьо го співвідношення у будь-який бік спостерігається зниження чутливості методу. Для оцінки достовірності результатів, які отримуються за допомогою даного способу, проводилося паралельне дослідження показників клітинного імунітету людини двома методами: за допомогою прототипу і запропонованим нами способом. У дослідження було включено 32 практично здорових осіб у віці від 17 до 25 років. Як видно з даних, наведених в табл. 1, показники клітинного імунітету, отримані за допомогою даного методу, характеризуються меншим відхиленням від середніх величин в порівнянні з прототипом. Аналіз показників, отриманих при використанні методу-прототипу показав, що сума кількостей популяцій лімфоцитів не дорівнює 100%. Це пов'язано з неможливістю визначення природних кілерів при застосуванні методу спонтанного розеткоутворення, а також зі втратою частиною Тлімфоцитів людини рецепторів, які забезпечують зв'язування ними еритроцитів барана. В той же час, дані запропонованого способу в повній мірі відображали популяційний (субпопуляційний) склад лімфоцитів обстежених осіб. Потрібно відмітити економічність способу, в порівнянні з іншими методами, які засновані на використанні моноклональних антитіл проти мембранних фенотипових CD-антигенів, зокрема, з методом непрямої імунофлюоресценції, оскільки для скріплення лімфоцитів людини і еритроцитів барана потрібна в 6-10 раз менша концентрація моноклональних антитіл на поверхні клітин, ніж для імунофлюоресценції, а також немає потреби в люмінесцентному мікроскопі або цитофлюометрі. Спосіб полягає в наступному. Етап 1. Приготування комплексу: еритроцити барана - моноклональні антитіла. Вихідні матеріали: еритроцити барана; глютаровий альдегід: вихідний 25% розчин перед дослідженням розводять 0,15 М розчином хлориду натрію до робочої 0,25% концентрації; хлористий хром (CrCl´6H2O). Готують вихідний 1% розчин хлористого хрому в 0,15 М розчині хлориду нагрію. Цей розчин можна зберігати, щотижня додаючи 1 М NaOH, вільний від іонів фосфату, преципітуючих іони хрому, так, щоб рН розчину був рівний 5,0. Перед дослідженням розчин розводять 0,15 М розчином хлориду натрію 1:10 до 0,1% концентрації; забуферений фізіологічний розчин (ЗФР). Для приготування 1 літра розчину готують суміш з 8,7 г NaCl, 0,68 г K2HPO4´3H2O, 0,15 г NaH2PO4 в дистильованій воді і доводять pH до 7,4; 0,1% розчин азиду натрію. Моноклональні антитіла: анти-СDЗ, антиСD19, анти-СD4, анти-СD8, анти-СD16 (концентрація білка - 1-2 мг/мл). Еритроцити барана багато разів відмивають фізіологічним розчином до зникнення білка в надосадочній рідині і розводять до 50% суспензії (осадок рівний 100%). До 50% суспензії еритроцитів барана додають трикратний об'єм 0,25% нейтралізованого глютарового альдегіду та інкубують суміш протягом 3 годин при температурі 37°С з постійним помішуванням. Інкубація продовжується ніч при 4°С. Оброблені еритроцити барана відмивають фізіологічним розчином 3 рази. Їх можна зберігати в присутності 0,1% розчину азиду натрію. 2 40141 Після обробки глютаровим альдегідом еритроцити барана втрачають здатність до спонтанного розеткоутворення з лімфоцитами. Далі готують комплекси еритроцити барана - моноклональні антитіла: для визначення Т-лімфоцитів людини використовують анти-СD3-моноклональні антитіла, для визначення В-лімфоцитів людини - анти-СD19, Тхелперів - анти-СD4, Т-супресорів - анти-СD8, ПКлімфоцитів - анти-СD16. 50-200 мкл моноклональних антитіл кожної специфічності, змішують зі 100 мкл 50% суспензії оброблених глютаровим альдегідом еритроцитів барана, доводять об'єм суміші до 250-300 мкл фізіологічним розчином і додають по краплях, помішуючи, 250 мкл 0,1% розчину хлориду хрому. Суміш інкубують 5 хвилин при кімнатній температурі, потім додають 250 мкл ЗФР. Еритроцити барана відмивають ЗФР 3 рази. До осадку, що містить 100 мкл еритроцитів барана, навантажених моноклональними антитілами, додають ЗФР до об'єму 5 мл. Таким чином, готують комплекси еритроцити барана-моноклональні антитіла, які можна зберігати при 4°C протягом 3 тижнів. Етап 2. Виділення лімфоцитів із крові людини. Вихідні матеріали: розчин фікол-верографіну (d=1,077) готують змішуванням двох розчинів: 33,9% розчину верографіну (d=1,2) і 9% розчину фіколу (d=1,025) у співвідношенні 7:16. У центрифужні пробірки заздалегідь наливають 2 мл градієнта фікол-верографіну, на нього поступово нашаровують 5 мл гепаринізованої крові людини (на 1 мл крові 10-20 ЕД активності гепарину). Центрифугують суміш протягом 30 хвилин при 1500 об/хв, після цього збирають фракцію лімфоцитів, яка розміщується у вигляді білого кільця на межі між шаром плазми і градієнта. Суспензію клітин відмивають три рази шляхом центрифугування в ЗФР при 1500 об/хв послідовно 20 хв., 5 хв., 5 хв. Отриману суспензію лімфоцитів обробляють 0,05% розчином азиду натрію для блокування розташованого на їх поверхні рецептора, здатного зв'язувати Fc-частини моноклональних антитіл. Розводять суспензію лімфоцитів до концентрації 2-4 млн/мл. Етап. 3. Проведення реакції розеткоутворення лімфоцитів людини і комплексів еритроцити барана-моноклональні антитіла. У центрифужні пробірки, які містять по 100 мкл еритроцитів барана, навантажених моноклональними антитілами кожної специфічності, додають по 100 мкл лімфоцитів людини, суміш інкубують при 37°С протягом 15 хвилин, потім центрифугують 5 хв., при 500 об/хв та інкубують ніч при 4°C. Етап 4. Приготування мазків і підрахунок розеткоутворюючих клітин кожної специфічності. Виготовлюють мазки, фіксують в метанолі або суміші Никифорова, забарвлюють по Романовському-Гімзе протягом 15-20 хв., промивають дистильованою водою і висушують. Підрахунок розеткоутворюючих клітин на 200-300 лімфоцитів здійснюють при мікроскопії в імерсійній системі мікроскопа. За розеткоутворюючу клітину приймають лімфоцит людини, який зв'язав 3 і більше еритроцитів барана на своїй поверхні. Таким чином, визначають процент кожної досліджуваної популяції і субпопуляції лімфоцитів людини. Абсолютне число лімфоцитів кожної суб популяції обраховують після визначення кількості лейкоцитів і лейкоцитарної формули в загальному аналізі крові. Серед виділених на градієнті щільності фікол-верографіну лімфоцитів зустрічаются також моноцити, які морфологічно відрізняються від них і виключаються із підрахунку. Етап 5. Виділення розеткоутворюючих клітин можливе за вищеописаній методиці Parish і Hayward (1974 p.). Даний спосіб ілюструється наступними прикладами його здійснення Приклад 1. Хвора К, віком 34 роки, поступила в ревматологічне відділення Кримської республіканської клінічної лікарні в зв'язку із загостренням ревматоїдного артриту (РА). К. хворіє РА протягом 2 років, в останній раз лікувалася стаціонарно півроку тому, після виписки постійно приймала преднізолон в дозі 10 мг/доб. і делагіл по 250 мг на ніч. При рентгенографії суглобів кистей рук визначалося звуження суглобових щілин, остеопороз головок п'ясткових кісток і виникнення одиничних ерозій на суглобових поверхнях кісток в порівнянні з рентгенограмами 6-місячної давності. Для з'ясування причин загострення запального процесу було проведене імунологічне дослідження методом спонтанного імунного розеткоутворення. Виходячи з даних імунограми (табл. 2), виконаної методом спонтанного розеткоутворення, залишалася неясною причина прогресування аутоімунного процесу. У хворої спостерігалося зниження показників клітинного імунітету: зменшення кількості в периферичній крові Т-лімфоцитів, В-лімфоцитів, Т-хелперів. У той же час виявилося двократне підвищення титру циркулюючих імунних комплексів (210 од.) і підвищення рівня IgG. Можливе пояснення цьому факту ми знайшли в роботі T.R. Cupps і A.S. Faud (1982 p.), які спостерігали втрату здібності до розеткоутворення у частини лімфоцитів людини під впливом кортикостероїдів. Для з'ясування клінічної ситуації необхідно було проведення дослідження клітинного імунітету, засноване на ідентифікації мембранних CD-маркерів лімфоцитів людини. Отримані дані (табл. 3) корінним чином відрізнялися від показників способу-прототипу і вказували на підвищення рівня Т-лімфоцитів за рахунок Т-хелперів, підвищення імунорегуляторного індексу, помірне підвищення В-лмфоцитів і виражене зниження природних кілерів. Стало ясно, що загострення РА було зумовлено неефективністю базисної терапії та активацією аутоімунного процесу. Хворій К., було призначено комплексне лікування, яке включало нестероїдні протизапальні препарати, внутршньосуглобові ін'єкції дипроспану, фізіотерапію, а також преднізолон 15 мг на добу. В якості базисного препарату був призначений метотрексат в дозі 7,5 мг на тиждень. Було досягнуте значне клінічне покращення. При плановому огляді хворої через 5 місяців спостерігалася клінічна ремісія, доза преднізолону була зменшена до 5 мг/доб, а при рентгенологічному дослідженні не відмічалися ознаки прогресування ерозивного процесу в суглобах. Контрольне імунологічне дослідження за допомогою способу (табл. 4), продемонструвало значний імуносупресивний ефект базисної терапії метотрексатом, який виражався в значному зниженні 3 40141 рівня CD3+- і СD4+-лмфоцитів в крові в порівнянні з вихідним дослідженням. Таким чином, дані дослідження клітинного імунітету, отримані за допомогою даного методу, більш точно відображають стан імунних процесів у хворих з аутоімунною патологією на фоні різних методів лікування в порівнянні з прототипом, повністю узгоджуються з клінічною ситуацією і можуть бути використані в моніторингу напруги аутоімунного процесу і контролі ефективності базисного лікування. Приклад 2. Хворий Д., віком 22 роки, лікувався у ревматологічному відділенні Кримської республіканської клінічної лікарні в зв'язку із затяжним перебігом реактивного артриту, асоційованого з хламідійною інфекцією. Захворювання дебютувало 7 місяців тому з явищ олігоартриту, який розвинувся через місяць після гострого уретрита хламідійної етіології. На момент надходження хворий вже отримав два курси антибіотикотерапії доксицикліном і норфлоксацином (кожний тривалістю в один місяць), по дві внутрішньосуглобові ін'єкції дипроспану в уражені суглоби, практично безперервно приймав нестероїдні протизапальні засоби. Враховуючи затяжний перебіг урогенного реактивного артриту, який, як правило, асоціюється з персистенцією хламідій, хворому було проведено імунологічне дослідження з метою визначення активності клітинних механізмів антихламідійного імунітету. Оскільки метод спонтанного розеткоутворення не дозволяє виявляти лімфоцити - природні кілери, які відіграють важливу роль в імунній відповіді на внутрішньоклітинну інфекцію, було зроблено дослідження в нашій лабораторії за допомогою даного способу. При аналізі показників клітинного імунітету (табл. 5) виявлялися дві тенденції: з одного боку, відмічалося зниження кількості ПК-лімфоцитів і Тхелперів, що, очевидно, створювало сприятливі умови для тривалої персистенції хламідій, а з іншого, - підвищення кількості цитотоксичних Т-лімфоцитів (фенотип - CD8) і В-лімфоцитів, що було проявом аутоімунної агресії відносно синовіцитів уражених суглобів. В якості імуномодулятора нами був вибраний індуктор синтезу ендогенного α-інтерферону циклоферон. Курс циклоферону (в першу добу - 500 мг, у 2, 4, 5, 6 і 8-у - по 250 мг, потім 2 рази в тиждень по 250 мг протягом 3-х місяців) був призначений паралельно з прийомом рокситроміцину (300 мг/доб. в 2 прийоми протягом 2 тижнів). Через три місяці від початку лікування спостерігалася клінічна ремісія артриту і значне покращення показників клітинного імунітету (табл. 6). Таким чином, застосування даного способу допомагає лікарю зробити правильний вибір імуномодулятора, виходячи з особливостей порушень клітинного імунітету. Даний спосіб оцінки стану клітинного імунітету дозволяє значно підвищити достовірність визначення популяцій і субпопуляцій лімфоцитів крові при різних патологічних процесах, а також виділяти лімфоцити повного CD-фенотипу для подальшого вивчення їх властивостей, виявляти лімфоцити, які експресують маркери активації (CD25, CD95 та ін.), визначати наявність на лейкоцитах людини будь-яких інших поверхневих рецепторів, зокрема, системи гістосумісності (DR-антигени), і характеризується значним економічним ефектом. Таблиця 1 Показники клітинного імунітету здорових осіб Популяції і субпопуляції лімфоцитів Спосіб, що пропонується CD3 (Т-лімфоцити), % абс. кількість. 109/л, коефіцієнт варіації, % СD4(Т-хелпери),% абс. кількість, 109/л, коефіцієнт варіації, % CD8 (Т-супресори), % абс. Кількість109/л, коефіцієнт варіації, % CD4/CD8 (Т-хелпери/Т-супресори) коефіцієнт варіації, % СD19 (В-лімфоц.), % абс. кількісіь, 109/л, коефіцієнт варіації, % СD16 (ПК-лімфоц.), % абс. кількісіь 109/л, коефіцієнт варіації, % 72,0±1,7 1,58±0,034 1,1 42,4±1,8 0,93±0,032 1,8 29,3±1,6 0,64±0,013 1,0 1,64±0,12 3,7 12,9±1,1 0,28±0,023 4,1 15,4±1,2 0,34±0,032 4,7 4 Прототип 61,03±2,8 1,4±0,08 2,5 45,73±3,1 1,05±0,14 2,9 19,8±2,6 0,46±0,02 2,2 2,53±0,34 6,7 13,3±1,84 0,31±0,094 15,2 40141 Таблиця 2 Показники клітинного імунітету хворої К., визначені за допомогою способу-прототипу Популяції і субпопуляції лімфоцитів Т-лімфоцити, % абс. кількість, 109/л Т-хелпери, % абс. кількість, 109/л Т-супресори, % абс. кількість, 109/л Т-хелпери / Т-супресори В-лімфоцити, % абс. кількість, 109/л Здорові Хвора К. 61,03±2,8 1,4±0,08 45,73±3,1 1,05±0,14 19,8±2,6 0,46±0,02 2,53±0,34 13,3±1,84 0,31±0,094 54,3 1,3 36,4 0,87 15,3 0,37 2,37 12,3 0,29 Таблиця 3 Показники клітинного імунітету хворої К., визначені за допомогою даного способу Популяції і субпопуляції лімфоцитів Здорові 72,0±1,7 1,58±0,034 42,4±1,8 0,93±0,032 29,3±1,6 0,64±0,013 1,64±0,12 12,9±1,1 0,28±0,023 15,4±1,2 0,34±0,032 CD3, % абс. кількість, 109/л CD4, % абс-кількість, 109/л СD8 % абс. кількість, 109/л CD4/CD8 CD19, % абс. кількість, 109'/л CD16, % абс. кількість 109/л Хвора К. 78,2 1,88 49,9 1,19 28,3 0,68 1,76 14,3 0,34 7,5 0,18 Таблиця 4 Показники клітинного імунітету хворої К на фоні базисної терапії метотрексатом Популяції і субпопуляції лімфоцитів CD3, % абс. кількість, 109/л CD4, % абс. кількість, 109/л CD8, % абс. кількість, 109/л CD4/CD8 CD19, % абс. кількість, 109/л CD16, % абс. кількість, 109/л Здорові Хвора К. (вихідне дослідження) Хвора K. (повторне дослідження) 72,0±1,7 1,58±0,034 42,4±1,8 0,93±0,032 29,3±1,6 0,64±0,013 1,64±0,12 12,9±1,1 0,28±0,023 15,4±1,2 0,34±0,032 78,2 1,88 49,9 1,19 28,3 0,68 1,76 14,3 0,34 7,5 0,18 73,7 1,62 43,8 0,96 29,9 0,66 1,46 15,3 0,34 11,0 0,24 5 40141 Таблиця 5 Показники клітинного імунітету хворого Д. Популяції і субпопуляції лімфоцитів Здорові 72,0±1,7 1,58±0,034 42,4±1,8 0,93±0,032 29,3±1,6 0,64±0,013 1,64±0,12 12,9±1,1 0,28±0,023 15,4±1,2 0,34±0,032 CD3, % абс. кількість, 109/л CD4, % абс. кількість, 109/л CD8, % абс. кількість, 109/л CD4/CD8 CD19, % абс. кількість, 109/л CD16, % абс. кількість, 109/л Хворий Д. 74,2 1,48 40,5 0,81 33,7 0,67 1,2 16,7 0,33 9,1 0,18 Таблиця 6 Показники клітинного імунітету хворого Д. після лікування циклофероном і рокситроміцином Популяції і субпопуляції лімфоцитів CD3, % абс. кількість, 109/л CD4, % абс. кількість, 109/л CD8, % абс. кількість, 109/л CD4/CD8 CD19, % абс. кількість, 109/л CD16, % абс. кількість, 109/л Здорові Хворий Д. (вихідне дослідження) Хворий Д. (повторне дослідження) 72,0±1,7 1,58±0,034 42,4±1,8 0,93± 0,032 29,3±1,6 0,64±0,013 1,64±0,12 12,9±1,1 0,28±0,023 15,4±1,2 0,34±0,032 74,2 1,48 40,5 0,81 33,7 0,67 1,2 16,7 0,33 9,1 0,18 71,2 1,64 42,1 0,97 29,1 0,67 1,45 14,0 0,32 14,8 0,34 __________________________________________________________ ДП “Український інститут промислової власності (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид.арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 6 40141 7