Синтетичне живильне середовище для культивування туберкуліногенних штамів мікобактерій

Синтетичне живильне середовище для культивування туберкуліногенних штамів мікобактерій, яке складається із калію фосфорнокислого двозаміщеного, магнію сірчанокислого семиводного, заліза лимоннокислого аміачного, лимонної кислоти, гліцерину та дистильованої води, яке відрізняється тим, що воно додатково містить глікокол, цинк сірчанокислий, нікотинову кислоту при наступному співвідношенні компонентів, мас % Глікокол 0,4-0,6 Калій фосфорнокислий двозаміщений 0,4-0,6 Магній сірчанокислий семиводний 0,2-0,4 Лимонна кислота 0,2-0,4 Залізо лимоннокисле аміачне 0,001-0,003 Сірчанокислий цинк 0,01-0,03 Нікотинова кислота 0,1-0,3 Гліцерин 2,0-4,0 Вода дистильована решта доЮО.О При рН 7,0+0,2 Винахід, що передбачається відноситься до ветеринарної мікробіологи і може бути використаний для виготовлення живильних середовищ з метою культивування туберкуліногенних штамів мікобактерій Використання винаходу передбачається в галузі ветеринарної медицини та біологічній промисловості для культивування туберкулогенних штамів мікобактерій з метою одержання з них алергенів, які застосовують для прижиттєвої діагностики туберкульозу у сільскогосподарських тварин Метою винаходу є виготовлення синтетичного живильного середовища для культивування туберкуліногенних штамів мікобактерій із вітчизняної сировини Відоме синтетичне живильне середовище Курської бюфабрики для вирощування збудника туберкульозу бичачого виду, яке складається із таких компонентів L-аспарапну, амонія лимоннокислого двозаміщеного, калію фосфорнокислого двозаміщеного, магнію сірчанокислого семиводного, заліза сірчанокислого, лимонної кислоти, сірчанокислого цинку, гліцерину та дистильованої води (Євглевський А О автореферат дис док вет наук 1999 Л ) Існує також живильне середовище для культивування мікобактерій туберкульозу і БЦЖ, до складу якого входять глікокол, амоній лимоннокислий, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий семиводний, залізо лимоннокисле аміачне, гліцерин, вода дистильована (Патент України, № 35036 від 03 08 1999 р кл А61К39/04) Розроблене, також, живильне середовище для вирощування мікобактерій туберкульозу до складу якого входять калій фосфорнокислий однозаміщений, натрій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, залізо лимоннокисле аміачне, L-аспарапн, гліцерин, твін-80, сироваточний бичачий альбумін, ДЛ-метионін, натрій лімоннокислий (А С № 1473343, кл С 12 № 1\20) Недоліком відомих середовищ є їх висока собівартість, пов'язана з тим, що до складу середовищ входить L-аспарапн, який не виробляється промисловістю України при цьому не завжди вдається отримати стабільність росту культур мікобактерій Найбільш близьким за технічною суттю до заявляемого об'єкту (прототипом) є синтетичне живильне середовище Сотона (Кассич Ю Я в кн ю ю Туберкулез животных и меры борьбы с ним Киев, Урожай, 1990-с 299), яке використовується в біологічній промисловості для вирощування збудника туберкульозу бичачого виду До складу середовища входять L-аспарапн, лимонна кислота, магній сірчанокислий семиводний калій фосфорнокислий двозаміщений, залізо лимоннокисле аміачне, гліцерин, вода дистильована Недоліком цього середовища є те, що не завжди накопичується достатня КІЛЬКІСТЬ бактерійної маси культур мікобактерій, що вирощуються В основу винаходу, що передбачається, поставлено завдання виготовити синтетичне живильне середовище для культивування туберкуліногеиних штамів мікобактерій шляхом заміни в складі синтетичного живильного середовища Lаспарапну на глікокол, та введення до складу сірчанокислого цинку і нікотинової кислоти при слідуючому співвідношенні компонентів мас %, Глікокол 0,4 - 0,6 Калій фосфорнокислий двозаміщений 0,4 - 0,6 Магній сірчанокислий семиводний 0,2-0,4 Лимонна кислота 0,2 - 0,4 Залізо лимоннокисле аміачне 0,001 - 0,003 Сірчанокислий цинк 0,01 - 0,03 Нікотинова кислота 0,1 - 03 Гліцерин 2,0-4,0 Вода дистильована решта до 100,0 при рН 7,0 ±0,2 Порівняльний аналіз заявляемого синтетичного живильного середовища і прототипу показує, що заявляемый склад синтетичного живильного середовища відрізняється від відомого заміною Lаспарапну на глікокол, та введенням нових компонентів а саме, сірчанокислого цинку, нікотинової кислоти, що дає можливість підвищити адаптивні і ростові властивості га збільшити вихід бактерійної маси і туберкуліну (алергену) з 1 літра середовища Л Синтетичне живильне середовище для культивування туберкуліногенних штамів мікобактерій готують таким чином В колбу з ХІМІЧНО чистого скла об'ємом 1000 8000см3 наливають 90,0см3 дистильованої води, яку підігрівають до температури 50 - 60°С Потім, у колбу, в указаній ПОСЛІДОВНОСТІ розчиняють слідуючі компоненти (мг) - залізо лимоннокисле аміачне -0,001 - 0,003, глікокол - 0,4 - 0,6, магній сірчанокислий семиводний - 0,2 - 0,4, лимонна кислота - 0,2 - 0,4, калій фосфорнокислий двозаміщений 0,4 0,6, сірчанокислий цинк - 0,01 - 0,003, нікотинову кислоту - 0,1 - 0,3, гліцерин - 2,0 - 4,0 Після розчинення інградіентів у колбу додають дистильовану воду до 100см3, одержаний розчин охолоджують до кімнатної температури і 25% розчином аміаку доводять його рН до 7,0 ± 0,2, Виготовлене таким чином середовище фільтрують при 120°С на протязі 20 хвилин, та зберігають при температурі +4°С не більше 10 -14 діб Перед висівом туберкуліногенних культур мікобактерій збудника туберкульозу бичачого, пташиного видів на живильне середовище, його перевіряють на стерильність шляхом утримання в термостаті при температурі 37°С на протязі 3 - 5 55922 4 діб У колби із стерильним живильним середовищем бактеріологічною петлею (5 - 8бак петлі) на поверхню роздільно висівають плівку туберкуліногенних культур збудника туберкульозу бичачого, пташиного видів мікобактерій, вирощених на картопляному відварі або живильному середовищі Павловського Колби із висівами закривають ватномарлевими пробками, які накривають пергаментним папіром і розміщують в термостаті при температурі 37,5 - 38,5°С За висівами ведуть спостереження на протязі 50 - 60 днів Приклад № 1 Живильне середовище готують як вказано вище, при слідуючому співвідношенні компонентів, мас % Глікокол 0,4 Калій фосфорнокислий двозаміщений 0,4 Магній сірчанокислий семиводний 0,2 Лимонна кислота 0,2 Залізо лимоннокисле аміачне 0,001 Сірчанокислий цинк 0,01 Нікотинова кислота 0,1 Гліцерин 2,0 Вода дистильована решта до 100,0 при рН 7,0 ±0,2 Приклад № 2 Теж, що і в прикладі № 1 в слідуючому співвідношенні компонентів, мас % Глікокол 0,5 Калій фосфорнокислий двозаміщений 0,5 Магній сірчанокислий семиводний 0,3 Лимонна кислота 0,3 Залізо лимоннокисле аміачне 0,002 Сірчанокислий цинк 0,02 Нікотинова кислота 0,2 Гліцерин 3,0 Вода дистильована решта до 100,0 при рН 7,0 + 0,2 Приклад №3 Теж, що і в прикладі №1 при слідуючому співвідношенні компонентів, мас % Глікокол 0,6 Калій фосфорнокислий двозаміщений 0,6 Магній сірчанокислий семиводний 0,4 Лимонна кислота 0,4 Залізо лимоннокисле аміачне 0,003 Сірчанокислий цинк 0,03 Нікотинова кислота 03 Гліцерин 4,0 Вода дистильована решта до 100,0 при рН 7,0 ±0,2 Елективні властивості синтетичного живильного середовища визначають через 50-60 днів після висіву туберкулжногенних культур мікобактерій по ваговому виходу вирощеної сухої баїсгерійної маси і виходу туберкуліна з одного літра середовища Результати проведених досліджень наведеш в таблиці Із матеріалів таблиці ввдно, що при вирощуванні туберкуліногенних штамів мікобактерій на запропонованому середовищі при мінімальній КІЛЬКОСТІ компонентів (приклад № 1) вихід бактерій 55922 6 Результати проведених досліджень свідчать про те, що при вирощуванні туберкулі но генних штамів мікобактерій на розробленому синтетичному живильному середовищі при оптимальному співвідношенні компонентів вихід бактерійної маси був більше у шт М bovis IEKBM-1 на 27,0мг im M avium ІЕКВМ УААН на - 23,0мг, а вихід туберкуліну ВІДПОВІДНО 271,0 51,0см3 з 1л середовища в порівнянні з середовищем Сотона Крім цього, розроблене синтетичне живильне середовище має високі адаптивні, елективні (ростові) властивості, в 3 рази дешевше за прототип і для його виготовлення не має потреби в імпортних препаратах ноі маси у шт М bovis IEKBM-1 бичачого виду становить 19190мг, оптимальній (приклад № 2) -262А максимальній (приклад № 3) - 238,0мг, а у пташиного виду (М avium ІЕКВМ УААН) ВІДПОВІДНО- 230,0 255,0 і 233,0мг, тоді як на середовищі Сотона (прототип) цей показник становив ВІДПОВІДНО 235,0 та 232,0мг/л Що стосується виходу туберкуліну з 1л середовища, то у шт М bovis IEKBM-1 він становив при мінімальному співвідношенні компонентів (прик, № 3 1) -728,0см , оптимальному (прик № 2) - 924,0, 3 максимальному (прик № 3) - 890,0см , а у шт Mavium ІЕКВМ УААН - 720, 840, 797,0смЗ на сере3 довищі Сотона ВІДПОВІДНО - 653,0 789,0см Таблиця Показники КІЛЬКІСТЬ Штам мікробактерій На середовищі, що пропонується при ВМІСТІ ком Середовище Сотона (прототип) Приклад № 1 понентів Приклад №2 Приклад № 3 191,0 262,0 238,0 235,0 728,0 924,0 890,0 653,0 230,0 255,0 233,0 232,0 720,0 840,0 797,0 789,0 бакте- М dovis IEKBM рійної маси мг/л 1 середовища Вихід туберкуліну з 1л середовища см 3 КІЛЬКІСТЬ бакте- М avium IEKBIV рійної маси мг/л УААН середовища Вихід туберкуліну з 1л середовища см 3 Підписано до друку 05 05 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24