Спосіб виділення мікобактерій комплексу m.tuberculosis/bovis із організму олігобацилярних хворих на туберкульоз легень

Спосіб виділення мікобактерій комплексу M.tuberculosis/bovis із організму олігобацилярних хворих на туберкульоз легень, що включає відбір 3 37530 4 ють навіть культуральний метод дослідження, бору зразків мокротиння за допомогою світлової та який є «золотим» стандартом у бактеріології тубелюмінесцентної мікроскопії, проведення ДНКркульозу. Але генетичні методи не дозволяють зондування з подальшим висівом ДНК-зонд позиотримати культуру мікобактерій, яка необхідна для тивних, але негативних за мікроскопією зразків визначення спектру чутли вості цих бактерій до мокротиння на рідке поживне середовище, інкубаантимікобактеріальних препаратів, що є головною цію дослідного матеріалу 2-3 тижні при 37°С та метою роботи спеціалістів бактеріологічних лабооблік результатів [див. Інструкція з бактеріологічраторій [див. Identification of Substrates of the Myної діагностики туберкульозної інфекції [Текст] / cobacterium tuberculosis [Текст] / M.J. Pearce, P. Ю.І. Фещенко, О.А. Журило, М.Т. Клименко, П.С. Arora, R.A. Festa // The EMBO J. - 2006. -V. 25, Трофімова // Наказ МОЗ України №45. - Київ, 2002. №22.-P. 5423-5432]. - 118с.]. Досягти цієї мети дозволяє одночасне викориВ основу корисної моделі поставлене завданстання ДНК-зондування, бактеріоскопічного і кульня удосконалити спосіб виділення мікобактерій турального методів дослідження, що сприяє швидкомплексу M.tuberculosis/bovis із організму олігокій бактеріологічній верифікації діагнозу, ізоляції бацилярних хвори х на туберкульоз легень, в якому пацієнта і своєчасному початку лікування, дозвошляхом 3-х разового збільшення ДНК-зонд позиляє отримати культур у мікобактерій, визначити її тивного дослідного матеріалу шляхом центрифуспектр чутливості, та, таким чином, поліпшити клігування в холодовій центрифузі при 3500об./хв. нічний результат і економічність терапії. Але дуже протягом 20 хвилин та проведення обліку резульважливим є розробка схем комбінованого застосутатів за наявністю росту мікобактерій комплексу М. вання цих методів. Вони є перспективними при tuberculosis/bovis в автоматизованій системі ВАСобстеженні хворих 1-ї категорії, дітей і олігобациТЕС 960, досягається суттєве підвищення точності лярних хворих. Впровадження їх для діагностики виділення мікобактерій даного комплексу. туберкульозу істотно підвищить ранню виявляєПоставлене завдання вирішується тим, що у мість хворих, у тому числі з малими формами туспособі виділення мікобактерій комплексу беркульозу і позалегеневим туберкульозом та M.tuberculosis/bovis із організму олігобацилярних створить основи для організації і проведення моніхворих на туберкульоз легень, що включає відбір торингу за розповсюдженням туберкульозу в Укразразків мокротиння за допомогою світлової та люїні. мінесцентної мікроскопії, проведення ДНКІснує кілька, так званих, рутинних способів визондування з подальшим висівом ДНК-зонд позиділення мікобактерій комплексу М. tuberculoтивних, але негативних за мікроскопією зразків sis/bovis, а саме, спосіб з використанням щільних мокротиння на рідке поживне середовище, інкубапоживних середовищ і спосіб з використанням цію дослідного матеріалу 2-3 тижні при 37°С та рідких поживних середовищ [див. Інстр укція з бакоблік результатів, згідно корисної моделі, перед теріологічної діагностики туберкульозної інфекції висівом здійснюють 3-х разове збільшення дослід[Текст] / Ю.І. Фе щенко, О.А. Журило, М.Т. Клименного матеріалу шляхом центрифугування в холоко, П.С. Трофімова // Наказ МОЗ України №45. довій центрифузі при 3500об./хв. протягом 20 хвиКиїв, 2002. - 118с.]. Облік результатів проводять лин, а облік результатів проводять за наявністю по відсотку або кількості колоній, що виросли. Але росту мікобактерій комплексу М. tuberculosis/bovis відсоток позитивних відповідей у верифікації бакв автоматизованій системі ВАСТЕС 960. теріологічного діагнозу знаходиться в межах - 60Дослідним шляхом встановлено, якщо попе80%. редньо провести відбір зразків мокротиння за доВідомий спосіб виявлення мікобактерій туберпомогою мікроскопії (світлової і люмінесцентної) і кульозу в сечі, в якому збір матеріалу здійснюють ДНК-зондування та відібрати проби, які не містять по мірі виділення свіжої порції сечі. Кожну порцію кислотостійких бактерій, але мають ДНК-зонд посечі обробляють 2,0%-им розчином сірчаної кисзитивну пробу (олігобацилярні хворі), потім здійслоти, потім - 5,0%-им розчином трьох заміщеного нити 3-х разове збільшення дослідного матеріалу фосфорнокислого натрію. Після цього сечу ценшляхом центрифугування в холодовій центрифузі трифугують, а осад нейтралізують 1,0%-им розчипри 3500об./хв. протягом 20 хвилин з наступним ном лимонної кислоти. Мікобактерії, ті що містятьвисівом цього діагностичного матеріалу на рідке ся в осаді, культивують на поживному середовищі поживне середовище, інкубацію його 2-3 тижні при «Новая». Спосіб дозволяє підвищити точність ла37°С у автоматизованій системі з подальшим облібораторної діагностики М. tuberculosis шляхом ком результатів, то суттєво підвищується точність зниження кількісних втрат за рахунок щадної обвиділення комплексу М. tuberculosis/bovis. Це доробки дослідного матеріалу, тобто сечі. Однак, зволяє використати спосіб в практичних бактеріоданий спосіб має такі недоліки: не сприяє швидкій логічних лабораторіях для підвищення відсотку бактеріологічній верифікації діагнозу олігобацілярвиділення мікобактерій комплексу М. них хворих з легеневою формою туберкульозу tuberculosis/bovis із організму, особливо олігоба(ріст культури мікобактерій туберкульозу до 8 тижцилярних хворих, що є дуже важливим, так як різнів) і використовується тверде поживне середоко підвищує відсоток бактеріологічної верифікації вище, яке має низьку чутливість, що знижує точдіагнозу туберкульоз і дає можливість отримати ність дослідження [див. Пат. 2241041 RU, МПК - 7 спектр чутливості мікобактерій до антимікобактеС12Q1/04, G01N33/48, 2004]. ріальних препаратів. Відомий спосіб виділення мікобактерій комСпосіб здійснюють таким чином. плексу М. tuberculosis/bovis із організму олігобациОтриманий патологічний матеріал (мокротинлярних хворих на туберкульоз легень шляхом відня) тестують на наявність кислотостійких бактерій 5 37530 6 за допомогою світлової і люмінесцентної мікроскороскопії клітини мікобактерій світяться золотавопії. Як світлова, так люмінесцентна мікроскопії зеленим кольором на темному чи бур ува тоздійснюються за загальноприйнятим методом, якій червоному тлі. Негативний результат отримуємо відображений в Наказі №45. При отриманні негатоді, коли кислотостійкі бактерії не виявлено в 300 тивного результату після обох видів мікроскопії полях зору. здійснюють ДНК-зондування [див. МолекулярноПри отриманні негативного результату після генетичний метод прямої ДНК-гібридизації з викообох видів мікроскопії здійснюємо ДНКристанням ТАТ ТМ - те хнології для виявлення комзондування. плексу М. tuberculosis/bovis в організмі людини для Частку порції мокротиння попередньо обробшвидкої діагностики туберкульозної інфекції у хволяємо стандартним методом з використанням рих на туберкульоз легень та проведення скринінNALC-NaOH. Після обробки зразків NALC-NaOH їх гових досліджень в Україні [Текст]: методичні рецентрифугуємо при 3500об/хв., а осад ресуспенкомендації / Інститут фтизіатрії і пульмонології ім. дуємо у 67,0мМ фосфа тному буфері (рН 6,6-6,8). Ф.Г. Яновського АМН України. - Київ, 2006. - 19с.]. Безпосередньо перед аналізом клінічні зразки ліПри отриманні позитивної проби здійснюють збізуємо за допомогою 4,0N NaOH. Для цього до льшення мокротиння у 3-й рази. З метою деконта900мкл зразка додаємо 100мкл 4,0N NaOH, перемінації та гомогенізації проводять його передпосімішуємо протягом 1,0 хв. на Вортексі, інкубуємо 5 вну обробку за допомогою N-ацетил-L-цистеїна і хв. при кімнатній температурі, а потім прогріваємо гідроксида натрію, центрифугують в холодовій 20хв. при (100±2)°С. центрифузі при 3500об./хв. протягом 20 хвилин. Для нейтралізації суміші до неї повільно додаОтриманий осад використовують для посіву на ємо 60,0мкл 5,0N НСl і по краплях ще близько рідке поживне середовище бульйон Міддлбрук 7Н 20,0мкл 0,5N НСl до того моменту, коли суміш стає 11 у автоматизованій системі ВАСТЕС 960. Облік яскраво-рожевого або жовтувато-рожевого кольорезультатів проводять за наявністю росту мікобакру (до рН 6,0-6,5). Зразок для аналізу повинен бутерій комплексу М. tuberculosis/bovis у автоматити чистим, без видимої суспензії, тому, при необзованій системі ВАСТЕС 960 [див. Застосування хідності, суміш центрифугуємо 3,0хв. при автоматизованої системи MGIT для діагностики 6000об/хв., а супернатант переносимо у чисту туберкульозу легень і визначення медикаментозпробірку для аналізу. ної стійкості мікобактерій [Текст]: методичні рекоДНК помічаємо шляхом внесення в пробу мендації / Інститут фтизіатрії і пульмонології ім. (50,0мкл зразка) 1,0мкл розчину Люміна, переміФ.Г. Яновського АМН України. - Київ, 2007. - 24с.]. шуємо піпетуванням і поміщаємо безпосередньо Наводимо конкретний приклад здійснення на ультрафіолетову лампу на 30хв. у горизонтальспособу. ному положенні. Приклад. Потім готуємо: Отриманий патологічний матеріал (мокротин- розчин для гібридизації: для кожної проби ня) тестують на наявність кислотостійких бактерій потрібно 100мкл буфера №1 з 1,0мкл ДНК сперми за допомогою світлової і люмінесцентної мікроскооселедця (10,0мг/мл), 2,0мкл Твіну 20 і 32,0мкл пії. Для світлової мікроскопії беруть нове, чисте бідистильованої стерильної води; предметне скельце без подряпин і маркують. Мок- маг-зонд: для кожної проби треба взяти ротиння за допомогою аплікатора або бактеріоло15,0мкл суспензії Маг-зонда, помістити її в магнітгічної петлі переносимо на предметне скельце. ний сепаратор, видалити супернатант і промити Для приготування мазків використовуємо непрозобуфером №1. Відокремити промивний буфер за рі, сіруваті або жовтува ті творожисті маси, які придопомогою магнітного сепаратора, видалити супесутні в мокротинні. Матеріал розподіляємо по рнатант і додати в пробірку 15,0мкл буфера № 1. предметному скельцю тонким шаром на площі Прогріти отриману суспензію при 83°С протягом 5хв. перед проведенням гібридизації. 1,0см´2,0см. Мазок повинен бути достатньо тонПісля цього додаємо 135мкл розчину для гібким, щоб його можна було легко мікроскопіювати. Залишаємо мазок для підсихання на 15хв. при ридизації і додаємо 50,0мкл міченого зразка, перемішуємо піпетуванням, ставимо у електротеркімнатній температурі. Фіксуємо мазок шляхом мостат і прогріваємо суміш при 96 - 100°С проведення скельця через полум'я 3-4 рази. Після протягом 8хв. для денатурації ДНК. цього забарвлюємо мазок за загальноприйнятим Потім додаємо 15,0мкл підготовленого прогріметодом Ціля-Нільсена. Негативний результат отримуємо тоді, коли КСБ не виявлено в 300 полях того протягом 3хв. при 83°С Маг-зонда, після чого негайно переносимо пробірку в електротермостат зору. з температурою 83°С і витримуємо при цій темпеЛюмінесцентна мікроскопія має більш високу ратурі 10хв. для гібридизації ДНК зразка і Магчутливість у виявленні мікобактерій. Згідно метозонда. дики забарвлення препарату за Хагеманом в модифікації Набонна (аураміновий метод) на фіксоНаступним етапом є перенесення пробірки в магнітний сепаратор при 49°С на 3 хв. Обережно ваний мазок (використовуємо той же мазок, що видаляємо піпеткою супернатант, додаємо 500мкл забарвлений за методом Циля-Нільсена) наносять буфера №2 (wash) і обережно перемішуємо протярозчин аураміну 00 на 15хв., потім препарат ретегом 10сек. на Вортексі. Цю процедуру повторяємо льно промиваємо водою, знебарвлюємо солянокислим спиртом 3-5хв., промиваємо водою, забар3 рази. Потім у тест-пробірку до Маг-зонда з гібридизованою ДНК додаємо 100мкл бідистильованої влюємо розчином кислого фуксину протягом 2-х стерильної води і ретельно перемішуємо, перенохв., ретельно промиваємо водою, висушуємо і проводимо мікроскопію. При люмінесцентній мік 7 37530 8 симо суспензію в нову тест-пробірку для визнавикористанні Вертексу швидкість обертання повичення. нна бути помірною. Уникати різкого струшування Для визначення поміщаємо пробірку в люміпробірки, тому що при цьому може відбутися окиснометр і знімаємо показання в RLU/сек (негативні лювання N-ацетил-L-цистеїну і його інактивація. одиниці люмінесценції в секунду). Режим роботи Залишаємо пробірку на 5хв. у штати ві для осалюменометра повинен бути наступним: час виміру дження аерозолів. - 2сек., час затримки для інжектора А-2сек., обсяг Доводимо об'єм зразка в пробірці до 50,0мл розчину для інжектора А-200мкл, час затримки для шляхом додавання холодного стерильного 4°С інжектора Б-2сек., обсяг розчину для інжектора Бфосфа тного буферу (BBL Mycoprep Phosphate 200мкл, загальний час затримки - 4сек. ПопереBuffer). Акуратно перемішуємо на Вортексі. дньо перевіряємо наявність розчинів для інжектоЦентрифугуємо пробірки зі зразками при прирів люменометра: розчин для інжектора А: 1,0мМ скоренні 3500об./хв. протягом 20хв. ВикористовуHNO3+30,0% H2О2 (12,5мкл 16,0 N HNO3+1,7мл ємо центрифугу з о холодженням до 4-16°С. Висо30,0% Н2O2/500мл Н 2O); розчин для інжектора Бка температура (більше 30°С) у приміщенні або у 1,0М NaOH (20,0г NaOH/500мл Н2O). центрифузі може значно знижувати життєздатність Наявність у клінічних зразках специфічної ДНК мікобактерій у зразку. Якщо використовується М. tuberculosis complex визначається по інтенсивцентрифуга без о холодження, необхідно підтриності люмінесценції. Високий рівень вірогідності мувати відповідний 20-24°С температурний режим отриманих результатів дослідження клінічних зрау приміщенні за допомогою кондиціонерів. зків визначається активністю світіння, що складає Після центрифугування дослідний матеріал більш 100 000RLU/sec, що перевищує cut off негапоміщаємо в ламінарний бокс і залишаємо на 5хв. тивного контролю в 2 рази (дорівнює 50 000 ± 15 для осадження аерозолів, що утворилися. 000RLU/sec). Зливаємо супернатант із пробірок у ємність із При отриманні позитивної проби за результавідповідним дезінфікуючим засобом. тами ДНК-зондування здійснюємо 3-х разове збіЗа допомогою одноразової піпетки ємністю льшення мокротиння від хворого. Мокротиння 1,0мл додаємо до осаду 0,8-1,0мл стерильного збираємо в 50,0мл пробірку з кришкою, що закруфосфа тного буферу (BBL Mycoprep Phosphate чується. З метою деконтамінації та гомогенізації Buffer) (загальний об'єм повинен скласти 1,5проводимо його передпосівну обробку. Для цього 2,0мл) і ресуспендуємо осад за допомогою піпетготуємо свіжий розчин для розрідження мокротинки. ня. Для цього розкриваємо ампулу з N-ацетил-LОтриманий матеріал використовуємо для поцистеїном і гідроксидом нарію та переносимо її сіву на рідке поживне середовище (бульйон Міддвміст у флакон з розчином BBL Mycoprep NALCлбрук 7Н11) в пробірки MGIT для наступного кульNaOH. тивування в автоматизованої системі ВАСТЕС Додаємо рівний об'єм свіжо приготованого 960. Облік результатів культивування здійснюєтьрозчину BBL Mycoprep NALC-NaOH в 50,0мл прося в автоматизованому режимі. бірку зі зразком мокротиння. Кінцева концентрація Запропонованим методом було проаналізовалугу (гідроксиду натрію) у зразку повинна становино 480 проб мокротиння. Проби для ДНК-тесту ти 1,0%. відбирали за розробленою нами схемою. Спочатку Перемішуємо вміст пробірки шляхом багатоз проб мокротиння готували препарати, забарвлюразового перевертання протягом 15 - 30сек., при вали за Цилем-Нільсеном та досліджували метоцьому зразок повинен повністю перемішатися з дом світлової мікроскопії. Зразки, які за результарозчином NALC-NaOH. Для цього бажано використами світлової мікроскопії були негативними, товувати Вортекс. досліджувалися за методом люмінесцентної мікІнкубуємо пробірку із сумішшю при кімнатній роскопії. Дані проведених досліджень наведені в температурі протягом 15хв., перемішуючи вміст табл.1. пробірки шляхом перевертання кожні 5хв. При Таблиця 1 Результати дослідження зразків мокротиння за методами світлової та люмінесцентної мікроскопії (М±m)% Методи мікроскопії Світлова «+», люмінесцентна «+» Світлова «-», люмінесцентна «+» Світлова «-», люмінесцентна «-» Всього позитивних за двома методами мікроскопії Всього досліджено зразків мокротиння Примітки: 1. «+» - позитивний результат. 2. «-» - негативний результат. Як видно з табл.1, із 480 зразків мокротиння, які були досліджені методом світлової мікроскопії, 243 проби (50,6%) дали позитивний резуль Кількість зразків Абс. % 243 50,6±2,3 47 9,8±1,4 190 39,6±2,2 290 60,4±2,2 480 100 тат. Слід додати, що кількість кислотостійких бактерій в пробах мокротиння складали від 2 + і більше. Зразки, які при світлової мікроскопії дали 9 37530 10 негативний результат (237 проб) були досліджені Отже, негативними залишилися 190 зразків за методом люмінесцентної мікроскопії. При замокротиння (39,6%). Саме ці зразки були дослістосуванні люмінесцентної мікроскопії кислотоджені за методом ДНК-зондування і посіву на стійкі бактерії були виявлені додатково в 47 вирідке поживне середовище - бульйон Міддлбрук падках (9,8%). Таким чином, використовуючи 7Н11. обидва методи мікроскопії, у 290 випадках Результати дослідження мокротиння хворих з (60,4%) було отримано позитивний результат на вперше діагностованим туберкульозом легень наявність кислотостійких бактерій. методом ДНК-зондування і культуральним метоВсі зразки з позитивними результатами мікдом наведені в табл. 2. роскопії були засіяні на поживне середовище З даних табл.2 видно, що при проведенні поЛевенштейна-Єнсена загальноприйнятим методальшого дослідження 190 зразків мокротиння з дом [див. Інструкція з бактеріологічної діагностинегативними результатами мікроскопії методом ки туберкульозної інфекції [Текст] / Ю.І. Фещенко, ДНК-зондування у 101 пробі мокротиння (53,2%) О.А. Журило, М.Т. Клименко, П.С. Трофімова // дозволило виявити мікобактерії туберкульозу, що Наказ МОЗ України №45. - Київ, 2002. - 118с.]. потім було підтверджено культуральним метоПри цьому слід зазначити, що всі позитивні проби дом. Від загальної кількості зразків мокротиння при мікроскопії дали позитивний ріст. (480 проб) це склало 21,0%. Таблиця 2 Результати дослідження методами ДНК - зондування і посіву на рідке поживне середовище зразків мокротиння, що були негативними за методами мікроскопії (М±m)% Методи дослідження ДНК-зондувння «+», посів «+» ДНК- зондувння «+», посів «-» ДНК- зондувння «-», посів «-» Вего досліджено зразків мокротиння Примітки: 1. «+» - позитивний результат. 2. «-» - негативний результат. Незважаючи на це, слід відзначити, що 62 (32,6%) зразки мокротиння з позитивними даними після ДНК-зондування, не дали ріст на середовищі Левенштейна-Єнсена, або 12,9% від загальної кількості обстежених мазків мокротиння. Ці 62 проби мокротиння були оброблені за допомогою запропонованого способу, тобто здійснювали 3-х разове збільшення дослідного матеріалу шляхом центрифугування в холодовій центрифузі при 3500об./хв. протягом 20 хвилин з наступним висівом цього діагностичного матеріалу на рідке поживне середовище, інкубацію його 2-3 тижні при 37°С у автоматизованій системі ВАСТЕС 960 з подальшим обліком результатів. В результаті проведених досліджень з 62 проб мокротиння, які були негативними по мікроскопії і позитивними по ДНК-зондуванню і які не дали ріст на твердому поживному традиційному середовищі, дозволило додатково виділити ще 49 культур, тобто ще 10,2% від загальної кількості (480 проб) обстежених проб мокротиння. Таким чином, спосіб дозволив отримати додатково 49 культур М. tuberculosis, які не були виявлені за допомогою існуючих методів мікробіологічної діагностики. Це свідчить про те, що в 49 випадках був бактеріологічно виріфікований діагноз туберкульоз легень. Як показують досліди, спосіб необхідно застосовувати у випадках захворювання на туберкульоз легень, коли отримано негативні результати мікроскопії на кислотостійкі бактерії з позитивною пробою при ДНК-зондуванні, або в Кількість зразків Абс. % 101 53,2 ±3,6 62 32,6 ± 3,4 27 14,2 ± 2,5 190 100 складних випадках, що потребують отримання швидкої інформації про збудника до початку лікування. Це є економічним та раціональним підходом до застосування даного методу при проведенні лабораторної діагностики туберкульозу. Запропонований спосіб виділення мікобактерій комплексу M.tuberculosis/bovis із організму олігобацилярних хворих на туберкульоз з патологічного матеріалу хворих, дозволив довести бактеріологічне підтвердження діагнозу «туберкульоз легень» до 91,6%, тоді як класичними методами досягається можливість отримати культур у мікобактерій лише в 60-80% випадків (середньостатистичні показники за даними ВООЗ). Таким чином, перевагою способу, що пропонується, є: - підвищення точності виділення мікобактерій комплексу M.tuberculosis/bovis із організму олігобацилярних хворих на туберкульоз з патологічного матеріалу хворих на 10,2%. Спосіб, що пропонується, може знайти широке застосування в бактеріологічних лабораторіях протитуберкульозних закладів і є розробкою найбільш інформативної прискореної діагностичної технології, спрямованої на виділення мікобактерій комплексу М. tuberculosis/bovis із організму олігобацилярних хворих на туберкульоз з патологічного матеріалу хворих з використанням сучасних гено- і фенотипічних підходів у вивченні біології штамів комплексу M.tuberculosis/bovis. 11 Комп’ютерна в ерстка В. Мацело 37530 Підписне 12 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601