Спосіб діагностики анаплазмозної інфекції шляхом виявлення антигену збудника в реакції непрямої імунофлюоресценції (рніф)

Спосіб діагностики анаплазмозної інфекції шляхом виявлення антигену збудника в реакції непрямої імунофлюоресценції (РНІФ), який відрізняється тим, що як специфічні антитіла першого порядку (Анті) при відтворенні РНІФ застосовуються поліклональні протианаплазмозні імуноглобуліни кролячі, отримані при імунізації тварин повним корпускулярним антигеном штаму Anaplasma marginale ВИЭВ1. (19) (21) u201004219 (22) 12.04.2010 (24) 10.02.2011 (46) 10.02.2011, Бюл.№ 3, 2011 р. (72) ПОХИЛ СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ, ТИМЧЕНКО ОЛЕНА МИКОЛАЇВНА, ЧИГИРИНСЬКА НІЛА АНАТОЛІЇВНА, КИЛИПКО ЛЮДМИЛА ВІТАЛІЇВНА, СЕМЕРЕНСЬКА ЄВГЕНІЯ ІВАНІВНА, КОСТИРЯ ІРИНА АНАТОЛІЇВНА, КОЗЬКО ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ, ЮРКО КАТЕРИНА ВОЛОДИМИРІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ", ПОХИЛ СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ, ТИМЧЕНКО ОЛЕНА МИКОЛАЇВНА, ЧИГИРИНСЬКА 3 Види A. marginale та A. platys є збудниками анаплазмозу великої рогатої худоби (ВРХ) та інших жуйних тварин, вражаючи в якості основних клітин-мішеней еритроцити та моноцити, відповідно [4, 7]. До теперішнього часу роль цих двох видів анаплазм у формуванні патології людини не доведена. Навпроти, вид A. phagocytophilum (раніше Rickettsia phagocytophila, Ehrlichia equi, Ehrlichia phagocytophila, Anaplasma phagocytophila, HGEагент) здатен визивати захворювання як тварин (ВРХ, коней, собак, котів та ін.), так і людей (гранулоцитарний анаплазмоз людини - ГАЛ) з ураженням білих клітин крові - гранулоцитів та макрофагів і неспецифічним клінічним перебігом у формі синдрому гострої інфекційної інтоксикації. Сучасні принципи і критерії діагностики ГАЛ основані на епідеміологічних, клінічних і лабораторних даних. Останнім відводиться вирішальне значення в етіологічній діагностиці ГАЛ, так як клінічний перебіг цього інфекційного захворювання, як правило, не супроводжується специфічними клінічними проявами, в першу чергу, у випадках субклінічних та клінічно слабо виражених формах анаплазмозу. На теперішній час спорадичні і групові випадки ГАЛ зареєстровані на всіх континентах (за винятком Антарктиди) більш ніж в 50 країнах світу. В США, де налагоджена лабораторна етіологічна діагностика ГАЛ і де з 1997 року введена його обов'язкова реєстрація, рівень захворюваності на ГАЛ складає 24-58 випадків на 100 000 населення в рік. При цьому, рівень летальності при субклінічних і легких формах (на які припадає переважна більшість випадків) перебігу анаплазмозу становить 0,5-1,0%, а при середній важкості і важких формах досягає 7-10% [1-3]. Незважаючи на те, що в Європі перший випадок ГАЛ був зареєстрований у Словенії в 1995 році, достовірних статистичних даних щодо рівня захворюваності людей на анаплазмоз у країнах Європи й досі не існує. Проте, крім щорічно зростаючої кількості зареєстрованих випадків ГАЛ у Європі, про поширеність даного захворювання в цьому регіоні свідчить високий рівень (від 2,4 до 45%) інфікованості кліщів Ixodes ricinus анаплазмами та наявність у сироватці крові 2-30 % клінічно здорових людей підвищено титру антитіл проти збудника ГАЛ, що свідчить про ймовірність перенесеного захворювання в минулому [1, 8, 9]. Вперше етіологічну верифікацію випадків ГАЛ в Україні здійснено у 2007 році співробітниками лабораторії трансмісивних вірусних інфекцій Львівського НДІ епідеміології та гігієни МОЗ України. При цьому були використані діагностичні препарати для твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), що містили в якості анаплазмозного антигену клітини А. phagocytophilum, виготовлені в National Center for Zoonotic, Vector-borne, and Enteric Disease, CDC (1600 Clifton Rd., Atlanta, GA 30333, USA). Однак, через відсутність загальнодоступних, простих у застосуванні, ефективних і недорогих діагностичних біопрепаратів і до теперішнього часу випадки ГАЛ у людей діагностуються дуже рідко, хоча на території країни існують чисельні осередки популяцій кліщів та досить часто реєструються інші трансмісивні кліщові інфек 56975 4 ційні захворювання (наприклад, кліщовий бореліоз), природні ареали циркуляції збудників яких співпадають із ареалами циркуляції анаплазм [10, 11]. Робоча група по вивченню Rickettsia, Coxiella, Anaplasma (Ehrlichia) і Bartonella (EVWOG) Європейського товариства з клінічної мікробіології та інфекційних хвороб рекомендувала основні (безсумнівні) та допоміжні (ймовірні) критерії для найбільш широко застосовуваних методів лабораторної діагностики ГАЛ: виявлення з допомогою світлової мікроскопії специфічних інтрацитоплазматичних мікроколоній (морул) збудника в клітинах-мішенях; виділення штамів збудника шляхом вирощування на спеціальних культурах евукаріотичних клітин; індикація специфічних фрагментів геному збудника з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР); виявлення в зразках клінічного матеріалу антигену збудника та (або) визначення рівня антитіл проти збудника в сироватці крові з допомогою імунологічних (серологічних) методів [12]. Завдяки простоті і уніфікованості технології відтворення, достатньо високого рівня специфічності, чутливості та відтворюваності результатів дослідження сьогодні найбільш часто для лабораторної діагностики анаплазмозу застосовуються імунологічні методи: імуноферментний аналіз (ІФА), твердофазний імуноферментний аналіз (ТІФА), імуноблотинг, реакція тривалого зв'язування компліменту (РТЗК), реакція імунофлюоресценції (РІФ), реакція непрямої імунофлюоресценції (РНІФ) та ін. [9, 12-15]. Використання РНІФ дозволяє діагностувати ГАЛ як на ранній стадії захворювання (шляхом виявлення в досліджуваних зразках клінічного матеріалу антигену збудника), так і в період розпалу його клінічних проявів та на стадії видужання (шляхом визначення рівня антитіл проти збудника в сироватці крові). Принцип технології виявлення в досліджуваних зразках клінічного матеріалу антигену збудника ГАЛ методом РНІФ полягає в наступному [14, 15]: препарати із нанесеними і зафіксованими зразками клінічного матеріалу оброблюють антитілами проти анаплазм (поліклональними або моноклональними імунними сироватками, чи імуноглобулінами, які є антитілами першого порядку - Ант1), що зв'язуються (адсорбуються) із антигенами (мікроколоніями і окремими клітинами) збудника ГАЛ за умови наявності останніх в досліджуваному зразку; в послідуючому, адсорбовані на антигенах Ант1 виявляються шляхом додаткової обробки препаратів противидовими (відносно видової приналежності використаних Ант1) флюоресцюючими антитілами (антивидовими сироватками або імуноглобулінами, міченими флюорохромом, які є антитілами другого порядку - Ант2). Таким чином, в досліджуваних зразках клінічного матеріалу на поверхні мікроколоній (морул) і окремо розташованих клітин збудника ГАЛ утворюється двошаровий комплекс із Ант1 і Ант2, який містить флюоресцюючий барвник, що дозволяє при проведенні люмінесцентно-мікроскопічного дослідження препаратів їх виявляти (візуалізувати). Антивидові флюоресцюючі сироватки та імуноглобуліни, які при відтворенні РНІФ виконують 5 функцію Ант2 є універсальними і загальнодоступними імунобіологічними препаратами завдяки налагодженому комерційному їх виробництву та широкому застосуванню в медицині, ветеринарії та біології. Навпроти, протианаплазмозні поліклональні або моноклональні сироватки чи імуноглобуліни, які при відтворенні РНІФ виконують роль Ант1, є дефіцитними і високовартісними імунобіологічними препаратами. Крім того, в розвинутих країнах світу (США, країни Європи) як експериментальні зразки таких препаратів, так і комерційні діагностичні тест-системи до складу яких вони входять (в якості окремого продукту або способу його отримання) захищені чинними документами правової охорони як об'єкти інтелектуальної власності, що робить їх недоступними для використання в Україні з метою лабораторної діагностики ГАЛ. Відомі в теперішній час способи діагностики ГАЛ шляхом виявлення антигену збудника в РНІФ (Патент США №5955359 від 21.09.1999 p.; патент США № 6964855 від 16.10.2003 р.) полягають у застосуванні різних типів діагностичних поліклональних/моноклональних протианаплазмозних сироваток/імуноглобулінів, які отримані із використанням штамів анаплазм виду A. phagocytophilum шляхом імунізації лабораторних тварин (мишей, кроликів, собак та інших тварин) повними корпускулярними (поліклональними) або моноклональними (високоочищеними пептидними) антигенами (відповідно) цих мікроорганізмів, чи моноклональними антигенами, отриманими із використанням гібридомної технології. Застосування таких типів діагностичних препаратів в якості Ант1 при виявленні антигену збудника ГАЛ з допомогою РНІФ є спільними ознаками із способом, що заявляється. Відтворення РНІФ із використанням вказаних типів експериментальних діагностичних препаратів і тест-систем, до складу яких вони входять, в цілому забезпечує задовільну якість діагностики ГАЛ з рівнем чутливості досліджень не нижче 82% (при співставленні із результатами індикації збудника методом ПЛР), специфічності - 83% і відтворюваності результату - 89% [3, 15, 16]. Проте, відомі способи діагностики ГАЛ шляхом виявлення антигену збудника в РНІФ мають ряд суттєвих недоліків. Основними з них, які заважають досягнути бажаного технічного результату, є наступні. Складність вирощування А. phagocytophilum в культурі спеціальних ліній евукаріотичних клітин (HL60) без використання антибіотиків, що потребує освоєння високотехнологічних, дорогих методів культивування цих ліній клітин і може здійснюватись лише в спеціалізованих лабораторіях із забезпеченням належного рівня біобезпеки. Складність і висока працезатратність послідуючих етапів отримання очищеного поліклонального (корпускулярного) або моноклонального (пептидного) антигену A. phagocytophilum як шляхом використання мікробіологічних методів, так із використанням гібридомної технології. Крім того, у відомих колекціях культур мікроорганізмів України відсутні офіційно зареєстровані (задепоновані) штами A. phagocytophilum. 56975 6 Найближчим аналогом (прототипом) корисної моделі, що пропонується є полінуклеотид (фрагмент гену) і поліпептид головного поверхневого білку (Major Surface Protein 5 - MSP5) A. phagocytophilum та методи їх використання для лабораторної діагностики анаплазмозу (Патент США № 7304139 від 04.12.2007 p.). Ознаками прототипу, які збігаються із суттєвими ознаками способу що заявляється, є використання в імунологічних реакціях (ІФА, ТІФА, РІФ, РНІФ) при виявленні збудника ГАЛ у зразках біологічного матеріалу моноклональних антитіл проти MSP5 A. phagocytophilum. Використання препаратів таких антитіл або діагностичних тест-систем, до складу яких вони входять, забезпечує високий рівень специфічності та відтворюваності результатів досліджень, а також (за умов застосування гібридомної технології) виключає необхідність проведення технологічно складних та біологічно небезпечних етапів вирощування A. phagocytophilum у культурі евукаріотичних клітин і послідуючої очистки живих штамів збудника з метою отримання із них антигенів для імунізації тварин. Причинами, що перешкоджають одержанню очікуваного технічного результату з допомогою прототипу є: висока вартість і технологічна складність отримання поліпептидного антигену MSP5 A. phagocytophilum як із допомогою гібридомної технології, так і з використанням мікробіологічних та біохімічних методів. Застосування моноклональних антитіл проти одного поліпептиду MSP5 A. phagocytophilum також значно звужує межі виявлення з допомогою імунологічних реакцій антигенів штамів збудника ГАЛ, які характеризуються природною широкою гетеротипністю. Крім того, в силу мозаїчного характеру інтегрованості MSP5 у зовнішній мембрані клітин А. phagocytophilum і обумовленого цим локального характеру зв'язування відповідних моноклональних антитіл, візуалізовані результати виявлення антигену збудника ГАЛ із допомогою РНІФ характеризуються недостатньою чіткістю важливих диференційних ознак (морфологічних особливостей мікроколоній і клітин анаплазм), що знижує ефективність даного способу діагностики анаплазмозу. В основу корисної моделі поставлено завдання розробити ефективний спосіб лабораторної діагностики ГАЛ шляхом виявлення антигену збудника з допомогою РНІФ, при відтворенні якої б в якості Ант1 застосовувались протианаплазмозні поліклональні антитіла (проти повного корпускулярного антигену анаплазм), отримання яких було б технологічно більш простим, дешевим та біобезпечним і використання яких забезпечувало б отримання чітких диференційних ознак для оцінки результатів досліджень. Поставлене завдання вирішувалось тим, що в способі діагностики ГАЛ шляхом виявлення антигену збудника в РНІФ у якості Ант1, згідно з корисною моделлю, використовують поліклональні протианаплазмозні імуноглобуліни кролячі (або інших видів тварин), отримані при імунізації тварин повним корпускулярним антигеном штамів виду A. marginale, а не штамів - A. phagocytophilum. Використання препаратів поліклональних імуноглобулінів проти А. marginale для виявлення 7 56975 антигену збудника ГАЛ в РНІФ обґрунтовано високим рівень (більше 60 %) антигенної спорідненості між A. marginale і А. phagocytophilum [13, 16]. В Україні та в інших багатьох країнах світу препарати повного корпускулярного антигену A. marginale є загальнодоступними і недорогими. Наприклад, комерційне виробництво такого препарату (у формі біобезпечної, інактивованої ліофілізованої бактерійної маси штаму A. marginale ВИЭВ1) здійснює Всеросійський НДІ експериментальної ветеринарії ім. Я.Р. Коваленко РАСХН (м. Москва; http://www.viev.ru), що, в свою чергу, дозволяє їх широко використовувати в науково 8 дослідних установах і на біотехнологічних виробництвах для отримання за спрощеними технологіями діагностичних протианаплазмозних антитіл (сироваток та імуноглобулінів) із більш низькою собівартістю. З використанням указаного повного корпускулярного антигену штаму A. marginale ВИЭВ1 (ПК АнгА1) нами було виготовлено експериментальні зразки діагностичного препарату протианаплазмозних поліклональних імуноглобулінів кролика (протиAнaпlgKp). Специфікація експериментальних зразків діагностичного препарату протиAнaпlgKp представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Специфікація діагностичного препарату протиAнaпlgKp Помірно-каламутна, напівпрозора, однорідна рідина із незначною опалесценцією та сіро-білим відтінком, яка після струшування не містить помітних неозброєним оком включень і осаду. Колоїдний розчин у фосфатно-сольовому буфері (рН=7,0)  -глобулінової фракції проЗагальна характианаплазмозних поліклональних сироваток крові кроликів, який містить в якості консетеристика рванту 0,05 % азиду натрію. Концентрація білку в препараті протиAнaпlgKp становить (2,213±0,077) мг/мл, робочий титр 1:8. ПротиAнaпlgKp виготовлено із сироваток крові кроликів, імунізованих повним корпускулярним антигеном штаму А. marginale ВИЭВ1 за технологією, яка включає етапи: виготовлення вакцини, імунізацію лабораторних тварин і отримання протианаплазмозних поліклональних сироваток, виділення  -глобулінової фракції (шляхом подвійного осаМетод отримання дження сульфатом амонію з рН=6,8-7,0) при 50% насиченості суміші та послідуючого їх очищення мембранним діалізом), видалення неспецифічних антитіл (методом адсорбції корпускулярним антигеном F. tularensis), стандартизацію рівня активності, хімічну стабілізацію, фасування і маркування препарату. ПротиAнaпlgKp характеризуються високим рівнем специфічності, здатні вступати в імуОсновні біологічні нологічні реакції із антигенами (клітинами і мікро колоніями) анаплазм, адсорбуючись властивості на їх поверхні, що забезпечує отримання чіткої люмінесцентно-мікроскопічної картини для оцінки диференційних характеристик при відтворенні РНІФ. Зовнішній вигляд В експерименті на модельних зразках, зразках клінічного та іншого біологічного матеріалу проведено лабораторно-клінічне випробування діагностичного препарату протиAнaпlgKp, що дозволило встановити рівні чутливості, специфічності та відтворюваності результатів досліджень з використанням запропонованого способу виявлення антигену збудника анаплазмозу в РНІФ. Для створення модельних зразків було використано 9 типів гомологічних і гетерологічних (по відношенню до протиAнaпlgKp) корпускулярних антигенів філогенетичного найбільш близьких до анаплазм видів бактерій та мікроорганізмів інших таксономічних груп Proteobacteria, що є збудниками кліщових бактеріальних інфекцій: -групи Rickettsia prowazekii, R. sibirica, Brucella abortus, Bartonella henselae, B. quintan;  -групи - Borrelia garinii;  -групи - Francisella tularensis, Coxiella burnetii. Модельні зразки являли собою суспензії з визначеною концентрацією корпускулярних анти генів, виготовлені шляхом дозованої контамінації комерційними діагностикумами різного виробництва фізіологічного розчину (з рН=7,0) та клінічного матеріалу (кров людей), який за своїм походженням не містив бактерій роду Anaplasma. В усіх експериментах із використанням модельних зразків, які містили гетерологічні ПК Анг результати виявлення АнгАІ в РНІФ були негативними. Навпроти, позитивні результати були зафіксовані при тестуванні модельних зразків, контамінованих гомологічним АнгАІ за умови, що концентрація корпускул АнгАІ в модельних суспензіях із фізіологічним розчином становить (2,6±1,0)104/мл, а в модельних суспензіях з кров'ю людей - (8,5±3,3)105/мл. При випробуванні діагностичного препарату протиAнaпlgKp було протестовано 81 зразок клінічного та іншого біологічного матеріалу, походження та результати дослідження яких наведено в таблиці 2. 9 56975 10 Таблиця 2 Результати дослідження зразків клінічного та іншого біологічного матеріалу на наявність АнгАІ в РНІФ при випробуванні діагностичного препарату протиAнaпlgKp Походження досліджених зразків Кров і осад центрифугату сироватки осіб укушених кліщем Препарати лінії клітин HL-60, інфікованих: зразками крові (осадом центрифугату сироваток) осіб, укушених кліщем та гомогенатами кліщів Кров клінічно здорових людей Препарати інтактних клітин лінії HL-60 Всього Застосування отриманого препарату протиAнaпlgKp суттєво підвищує рівень співпадання результатів досліджень щодо виявлення антигену збудника ГАЛ запропонованим способом РНІФ і методом ПЛР. При тестуванні зразків крові і осаду центрифугату сироваток осіб, укушених кліщем, не було зафіксовано випадків хибно позитивних результатів РНІФ, а коефіцієнт кореляції (rф) результатів, отриманими з допомогою обох реакцій, становив 1,0. При дослідженні РНІФ і ПЛР препаратів лінії клітин HL-60, інфікованих зразками крові (центрифугатом сироваток) осіб, укушених кліщем, та гомогенатами кліщів rф результатів склав 0,93. Тобто, лише в одному випадку позитивний результат дослідження, отриманий способом РНІФ, не Позитивний результат Кількість досліджевиявлення АнгАІ в РНІФ, них зразків абс.ч., (%) 22 1 (4,5) 27 5 (18,5) 25 7 81 0 0 6 (7,4) співпадав із результатом ПЛР-детекції (останній був негативним). В цілому рівень відтворюваності як позитивних, так і негативних результатів виявлення АнгАІ в РНІФ у модельних, клінічних та зразках іншого біологічного матеріалу при використанні отриманого препарату протиAнaпlgKp становив (94,4±3,4)%. В цілому результати лабораторно-клінічного випробування отриманого препарату протиAнaпlgKp для виявлення АнгАІ в РНІФ (таблиця 3) близькі до результатів досліджень зарубіжних авторів [3, 9, 15], які були отримані останніми із використанням інших діагностичних імунобіологічних препаратів (тест-систем) аналогічного призначення. Таблиця 3 Узагальнені результати випробування отриманого препарату протиAнaпlgKp для виявлення АнгАІ в РНІФ при дослідженні модельних, клінічних та зразків іншого біологічного матеріалу Вивчені показники Рівень узагальнених показників дослідження модельних, клінічних та зразків іншого біологічного матеріалу для виявлення АнгАІ в РНІФ при використанні отриманого препарату про__ Межа чутливості Специфічність Відтворюваність __ тиAнaпlgKp, ( m d ) в модельній системі: АнгАІ + ФСБ (рН=7,0) (2,6+1,0)104 корпускул антигену/мл; в модельній системі: АнгАІ + кров людини (8,5±3,3)105 корпускул антигену/мл (93±5)% (93±5)% Крім того, застосування отриманого препарату протиAнaпlgKp з метою виявлення та ідентифікації АнгАІ (клітин і мікроколоній збудника ГАЛ) в РНІФ при дослідженні модельних, клінічних та зразків іншого біологічного матеріалу дозволило отримати чіткі візуальні диференційні характеристики: характер люмінесценції (колір, ступінь яскравості, морфологічні особливості мікроколоній (морул) і клітин збудника АІ, їх присутність і подібність в декількох полях зору (фігура). Фігура - Люмінесцентно-мікроскопічна картина препаратів мазків клітин HL-60, інфікованих зразками крові осіб, укушених кліщем та гомогенатами кліщів (з морулоподібними утвореннями - мікроколоніями збудника ГАЛ, вказані стрілкою). Таким чином, за результатами проведених досліджень розроблено спосіб діагностики анаплазмозу шляхом виявлення антигену збудника в РНІФ, для відтворення якої запропоновано використовувати в якості Ант1 поліклональні протианаплазмозні імуноглобуліни кролячі, отримані при імунізації тварин повним корпускулярним антигеном штаму A. marginale ВИЭВ1. Список джерел: 1. Васильєва, И. С. Новые болезни, передаваемые иксодовыми клещами (Ixodidae). Эрлихиозы и анаплазмозы человека [Электронный ресурс] /И. 11 С. Васильева /Режим доступу: http:// lib 2005 rat info.ru /files/. 2. Гратц, Н. Трансмиссивные инфекционные заболевания в Европе. Их распространение и влияние на общественное здравоохранение [Текст] /Норманн Гратц; пер. с англ. //ВОЗ. -2005. 130с. - С. 87-118. 3. Dumler, J. S. Anaplazma and Ehrlichia infection [Text] /J. S. Dumler //Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005. - Vol. 1063. - P. 361-373. 4. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology [on line] /D. R. Boone, R. W. Castenholz, D. H. Bergey [et al] /Second edition: "Springer", Volume Two. -2001. -1338 p. - ISBN 0387241450, 9780387241456 /Режим доступу: http://books.google.com.ua/books?id=9cwgo9IyTUC&hl=ru 5. Demma, L. J. Epidemiology of human ehrlichiosis and anaplasmosis in the United States, 2001-2002 [Text] /L. J. Demma, R. C. Holman, J. H. McQuiston [et al] //Am. J. Med. Hyg. - 2005. - Vol. 73, № 2. - P. 400-406. 6. Tate, C. Experimental infection of white-tailed deer with Anaplasma phagocytophilum, etiologic agent of human granulocytic anaplasmosis [Text] /C. Tate, D. Mead, M. Page Luttrell [et al] // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43, № 8. -P. 3595-3601. 7. Fuente, J. Infection of tick cells and bovine erythrocytes with one genotype of the intracellular ehrlichia Anaplasma marginale excludes infection with other genotypes [Text] /J. Fuente, J. C. GarciaGarcia, E. F. Blouin, J. T. Saliki [et al] //Clin. Diagn. Lab. Immunol. -2002. - Vol. 9, № 3. - P. 658-668. 8. Денисов, А. А. Фауна, экология, биология клещей семейства Ixodidae и их роль в эпизоотологии инфекционных болезней в Нижнем Поволжье Российской Федерации [Электронный ресурс]: Дис. ... канд. биол. наук: 03.00.19, 16.00.03: Волгоград, 2005. - 129 с, РГБОД, 61: 05 - 3/1265. Режим доступу: http://www.lib. ua-ru. net / dis / cont / 50641. htm/. 9. Comer, J. A. Serologic testing for human granulocytic ehrlichiosis at a National Referral Center [Text] /J. A. Comer, W. L. Nicholson, J. G. Olson, J. 56975 12 E. Childs //J. Clin. Micobiol. - 1999. - Vol. 37, № 3. P. 558-564. 10. Білецька, Г. В. Гранулоцитарний анаплазмоз (ГАЛ) - нова природно-осередкова інфекція в Україні [Текст] /Г. В. Білецька, О. Ю. Новохатній, І. І. Бень //Матеріали науково-практичної конференції "Актуальні питання епіднагляду за особливо небезпечними інфекціями, санатрона охорона території, біологічна безпека" - Іллічівськ, 8-10 вересня, 2009. - С. 122-123. 11. Приходько, Ю. А. Клещи (Acarina: Ixodidae) - носители и переносчики возбудителей в СевероВосточной части Украины [Текст] /Ю. А. Приходько, О. В. Никифорова, В. А. Наглов //Материалы IV Всероссийского съезда паразитологического общества при РАН "Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения". - Санкт-Петербург, 2008. - Т. 3. - С. 48-53. 12. Малеев, В. В. Обзор Европейских рекомендаций по диагностике клещевых бактериальных инфекций [Текст] /В. В. Малеев //Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. - 2005. - Т. 7, № 2. - С. 130153. 13. Dreher, U. М. Serologic cross-reactivity between Anaplasma marginale and Anaplasma phagocytophilum /U. M. Dreher, J. Fuente, R. Hofmann-Lehmann [et al] //Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2005. - Vol. 12, № 10. - P.I 177-1183. 14. Inokuma, H. Serotyping isolates of Anaplasma phagocytophilum by using monoclonal antibodies [Text] /H. Inokuma, P. Brouqui, J. S. Dumler, D. Raoult // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003. - Vol. 10, № 5. - P.969-972. 15. Walls, J. E. Inter- and intralaboratory comparison of Ehrlichia equi and human granulocytic ehrlichiosis (HGE) agents strains for serodiagnosis of HGE by the immunofluorescent-antibody test [Text] /J. E. Walls, M. Aguero-Rosenfeld, J. S. Bakken [et al] //J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol. 37, № 9. - P. 29682973. 16. Dumler, J. S. Serologic cross-reactions among Ehrlichia equi, Ehrlichia phagocytophila, and human granulocytic Ehrlichia [Text] /J. S. Dumler, K. М. Asanovich, J. S. Bakken [et al] //J. Clin. Micobiol. 1995. - Vol. 33, № 5. - P. 1098-1103. 13 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 56975 Підписне 14 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601