Спосіб розмноження in vitro плюсових дерев бука лісового (fagus sylvatica l.)

Реферат: Спосіб розмноження in vitro плюсових дерев бука лісового (Fagus sylvatica L.) включає ініціацію, намноження, вкорінення та адаптацію до умов відкритого ґрунту. При цьому у продукуванні садивного матеріалу бука лісового застосоване модифіковане тверде поживне середовище WPM для деревних рослин із експериментально підібраними для бука оптимальним вмістом і концентрацією регуляторів росту та рН середовища: Для ініціації в модифіковане тверде поживне середовище WPM додатково залучали 6-ВА. Для намноження в модифіковане тверде поживне середовище WPM додатково залучали 6-ВА , NAA мг та zeatin. Для вкорінення в модифіковане тверде поживне середовище ½WPM додатково залучали NAA та IBA. UA 68765 U (12) UA 68765 U UA 68765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до галузі біотехнології і лісового господарства та може застосовуватися для масового продукування садивного матеріалу плюсових дерев бука лісового (Fagus sylvatica L.) розмноженням in vitro. Аналіз стану питання щодо збереження та відтворення генетичного потенціалу цього деревного виду показав, що розроблення високоефективних технологій розмноження in vitro садивного матеріалу бука лісового із цінними генотипами є актуальною проблемою [1-21,24-30]. Культивування деревного виду рослин різного віку і генотипу потребує диференційованого підходу до розроблення технологій мікроклонального розмноження. Дослідники вже зробили спроби ввести в культуру бук лісовий з цінними генотипами стиглого і перестійного віку [11, 24, 30]. Найкращі результати отримали Vieitez A.M., Ferro E.M., Ballester А. (найбільш близький найближчий аналог пропонованого авторами способу) на середовищі WPM: найвища частка ініціації експлантів залежно від генотипу становила 20 %, вкорінення регенерантів - 65-75 %, намноження не було успішним [30]. На нашу думку, отримана методика не є достатньо ефективною для масового отримання садівного матеріалу плюсових дерев. В основу корисної моделі поставлена задача підвищити частку ініційованих і вкорінених рослин та збільшити коефіцієнт намноження адвентивних пагонів, що дасть змогу прискорити терміни і підвищити ефективність продукування регенерантів in vitro. Апробацію запропонованого способу розмноження здійснювали в лабораторії культури тканин Національного лісотехнічного університету України (м. Львів). Джерелами експлантів слугували плюсові дерева бука лісового № 8/1 і 9/2 віком 115 років, які зростають у Роздільському лісництві ДП "Стрийське лісове господарство" Львівського обласного управління лісового і мисливського господарства. Суть способу полягає у культивуванні бука лісового на модифікованому твердому поживному середовищі WPM для деревних рослин [22, 23]. Як експланти використовували попередньо відібрані в період з кінця лютого по середину березня верхівкові бруньки розміром більше 20 мм із пагонів плюсових дерев останнього року приросту. Бруньки розбирали до конусів наростання з листковими зачатками, деконтамінували [6] та асептично переносили на тверде поживне середовище WPM без фітогормонів. Після отримання стерильних експлантів їх пасажували на модифіковане поживне середовище WPM для ініціації органогенезу. Модифікація середовища WPM полягала у підвищенні вмісту нітрату кальцію 4-водного з 386,0 до 516 мг/л і хлористого кальцію з 72,5 до 112,5 мг/л для оптимального забезпечення потреби бука лісового у кальції. Для ризогенезу застосовували модифіковане середовище WPM зі зменшеною вдвічі концентрацією компонентів. Десятинний логарифм концентрації водневих іонів рН середовища перед автоклавуванням доводили до 5,8 (ініціація, намноження) та 6,3 (вкорінення). На кожному етапі культивування у середовище долучали регулятори росту 6-ВА (6-бензиламінопурин), NAA (-нафтилоцтову кислоту), ІВА (β-індоліл-3-масляну кислоту) та зеатин (2-метил-4-(7Н-пурин-6-іламіно)бут-2-ен-1-ол) у відповідних концентраціях (табл. 1). Експланти вирощували за температури 24 °C вдень і 21 °C вночі, вологості повітря 70 % і тривалості світлового періоду 14 год. Освітлення здійснювали флуоресцентними лампами (ЛБ) з інтенсивністю світла вночі 2400-2800 lх. Протягом всього циклу розмноження регенеранти кожних два тижні переносили на свіже поживне середовище. Активацію меристем зафіксовано на 11-12-ту добу культивування (фіг. 1). Після 28 дня ініціації регенеранти переносили на середовище для намноження. Субкультивування здійснювали 3-4 рази, кожне - по 28 днів (фіг. 2). У кінці кожного нового субкультивування вираховували коефіцієнт намноження k, який визначали як пропорцію кількості експлантів з аксилярними пагонами і середньої кількості нових сегментів на такий експлант. Мікроживці розміром більше 2,0 см пасажували на середовище для ризогенезу (фіг. 3). Укорінені регенеранти відмивали від середовища і переносили для адаптації в ґрунтових умовах у стерильний субстрат міні-теплиці лабораторії, що складався з дезінфікованого темно-сірого лісового ґрунту та агроперліту у пропорції 4:1 (рН=6,0) (фіг. 4, 5). Після адаптації у міні-теплиці регенеранти висаджували у відкритий ґрунт. Зберегли життєздатність 96,2 % рослин. 1 UA 68765 U Таблиця 1 Вміст модифікованого поживного середовища WPM на різних етапах культивування бука лісового Компоненти Концентрація у базовому середовищі, мг/л [23] NH4NO3 Ca(NO3)2×4Н2О СаСl2 MgSO4 KН2РО4 K2SO4 Н3ВО3 MnSO4×H2O Na2MoO4×2H2O ZnSO4×7H2O CuSO4×5H2O Na2EDTA×2H2O FeSO4×7H2O myo-inositol thiamine·HCI nicotinic Acid pyridoxine·HCI glycine glutamine sucrose agar 6-BA NAA IBA zeatin pH 5 Концентрація у модифікованому середовищі, мг/л Ініціація Намноження Вкорінення 400,0 400,0 200,0 516,0 516,0 258,0 112,5 112,5 56,3 180,7 180,7 90,4 170,0 170,0 85,0 990,0 990,0 495,0 6,2 6,2 3,1 22,3 22,3 11,2 0,25 0,25 0,13 8,6 8,6 4,3 0,25 0,25 0,13 37,3 37,3 18,7 27,8 27,8 13,9 100,0 100,0 50,0 1,0 1,0 0,5 0,5 0,5 0,3 0,5 0,5 0,3 2,0 2,0 1,0 2,0 2,0 1,0 30000,0 30000,0 15000,0 7000,0 7000,0 7000,0 0,2 0,3 0,6 1,0 0,2 0,1 1,0 0,4 2,0 5,8 5,8 6,3 400,0 386,0 72,5 180,7 170,0 990,0 6,2 22,3 0,25 8,6 0,25 37,3 27,8 100,0 1,0 0,5 0,5 2,0 2,0 30000,0 3,5-4,5 Дослідження засвідчили (табл. 2), що запропонований спосіб розмноження дає змогу отримати регенеранти плюсових дерев бука лісового за короткі терміни, підвищує частку ініційованих і вкорінених рослин відповідно до 62,9 та 88,3 %, збільшує коефіцієнт намноження k до 4,1, а тому є ефективнішим порівняно з аналогами. Таблиця 2 Регенерація бука лісового in vitro внаслідок запропонованого способу розмноження Етапи клонування Ініціація Намноження Вкорінення 10 15 Вихід регенерованих рослин Запропонований спосіб Найближчий аналог [30] 62,9 % 20,0 % k=4,1 k=0,0 88,3 % 75,0 % Це дає підстави для використання запропонованого способу розмноження in vitro для масового продукування садивного матеріалу плюсових дерев бука лісового. Джерела інформації: 1. Гречаник P.M. Мікроклональне розмноження бука лісового / P.M. Гречаник, О.Ф. Базюк, Ю.Й. Каганяк, Г.Г. Гриник // Науковий вісник "Лісівницькі дослідження в Україні" (VI-і Погребняківські читання). - Львів: РВВ УкрДЛТУ, 2000. - Вип. 10.4. - С. 137-142. - ISSN 19947836. 2 UA 68765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2. Гречаник P.M. Особливості взаємодії бука лісового та ялиці білої в умовах Прикарпаття [Текст]: автореф. дис. … канд. с.-г. наук: 06.03.01 - лісові культури, селекція, насінництво / Руслан Мар'янович Гречаник; УкрДЛТУ. - Львів, 2002. - 21 с. - Бібліогр.: с. 18-19 (13 назв). 3. Гречаник P.M. Підбір експлантатів бука лісового (Fagus silvatica L.) та режиму їх стерилізації в мікроклональному розмноженні [Текст] // Розточанський збір - 2000: Матеріали міжнародної науково-технічної конференції (с. Старичі, 17-18 листопада 2000 p.). - Кн. 2./P.M. Гречаник, Г.Г. Баранецький, О.Ф. Базюк. - Львів: Меркатор, 2001. - С. 195-197. - ISBN966-156305-07. 4. Гречаник P.M. Участь екзометаболітів опаду ялиці білої в мікроклональному розмноженні бука лісового / P.M. Гречаник, А.В. Краснянський, MM. Лісовий // Науковий вісник: Збірник науково-технічних праць. - Львів: РВВ УкрДЛТУ. - 2001. - Вип. 11.4. - С. 78-80. - ISSN 1994-7836. 5. Гузь М.М. Збереження, відтворення і використання цінних генотипів бука лісового [Текст]: практичні рекомендації / М.М. Гузь, P.M. Гречаник, М.М. Лісовий. - Львів: РВВ НЛТУ України, 2010. - 36 с. 6. Гузь М.М. Стерилізація вихідних експлантатів морфологічних форм бука лісового під час розмноження in vitro / М.М. Гузь, P.M. Гречаник, М.М. Лісовий // Науковий вісник: Збірник науково-технічних праць. - Львів: РВВ НЛТУ України, 2009. - Вип. 19.10. - С. 7-10.- ISSN 19947836. 7. Козлов В.Г. Інтродукція видів і форм бука (Fagus L.) у Правобережному Лісостепу України та перспективи використання їх в культурі [Текст]: моногр. / В.Г. Козлов. - Умань: Уманське виробничо-поліграфічне видавництво, 2003. - 132 с. - ISBN 966-7659-34-8. 8. Козлов В.Г. Особливості онтогенезу бука лісового та його декоративних форм при вегетативному розмноженні / В.Г. Козлов. // Вивчення онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах Євразії. - Київ-Львів, 1994. - С. 96-97. 9. Лісовий М.М. Особливості відтворення генотипів декоративних форм бука лісового [Текст]: автореф. дис. … канд. с.-г. наук: 06.03.01 - лісові культури та фітомеліорація / Микола Миколайович Лісовий; НЛТУ України. - Львів, 2010. - 22 с. - Бібліогр.: с. 17-18 (11 назв.). 10. Селекційні основи збереження та відтворення генетичного потенціалу лісотвірних порід мікроклопуванням: Звіт про НДР / Національний лісотехнічний університет України. - ДБ 08.1205-06, № держреєстр. 0105U009088; Облік. № 0209U002539. - Львів, 2008. - 82 с. 11. Ahuja M.R.In vitro induction of organogenesis in juvenile and mature beech/ M.R. Ahuja // Silvae Genetica. - Frankfurt am Main:J.D.Sauerlander's Verlag, 1984. - Vol. 33, № 6. - P. 241-242. ISSN 0037-5349. 12. Ahuja M.R. Tissue culture studies towards clonal propagation of beech [Text]: Symposium of the IUFRO, 31 May-4 Jun1984, Grosshansdorf (Germany, F.R.) / M.R.Ahuja // GrosshansdorfHamburg:Mitteilungen der Bundesforschungsanstalt fuer Forst-und Holzwirtschaft, 1985. - Vol. №. 150. - P. 172-176. - ISSN 0368-8798. 13. Chalupa V.In vitro propagation of European beech (Fagus sylvatica) / V. Chalupa // LesnictviUZPI. - Prague-Suchdol, 1998. - Vol. 44, № 12. - P. 529-534. - ISSN 0024-1105. 14. Chalupa V. In vitro propagation of Larix, Picea, Pinus, Quercus, Fagus and other spieces using adenine-type cytocinins and thidiasuron/V.Chalupa // Commun.Inst.For.Czech. - Prague, 1985. № 14. - P. 65-90. 15. Chalupa V.Vegetativni rozmnozovani dubu (Quercus robur L.), buku (Fagus sylvativa L.) a lipy (Tilia cordata Mill.) fizky a explantatovymi kulturami/V.Chalupa // Lesnictvi-UVTIZ. - Prague-Zbraslav (CSFR), 1990. - Vol. 36, № 7. - P. 589-598. - ISSN 0024-1105. 16. Cuenca B.Adventitious bud regeneration from leaves and internode segments of beech [Text]: International Congress "Applications of Biotechnology to Forest Genetics", Vitoria-Gasteiz (España), 22-25 sep.1999. / В. Cuenca, A.M. Vieitez-Vitoria (España): DAMA, 2000. - P. 299-305. - ISBN 847821-421-6. 17. Cuenca B. In vitro adventitious bud regeneration from internode segments of beech/ B. Cuenca, A. Ballester, A.M. Vieitez // Plant cell, tissue and organ culture. - Springer Science+Business Media B.V., Formerly Kluwer Academic Publishers B.V., 2000. - Vol. 60 (3). - P. 213-220. - ISSN 0167-6857. 18. Cuenca B. Influence of carbon source on shoot multiplication and adventitious bud regeneration in vitro beech cultures/ B. Cuenca, A.M. Vieitez // Plant grows regulations. - Kluwer Academic Publishers (Netherlands): Springer, 2000. - Vol. 32, № 1. - P. 1-12. - ISSN 0167-6903. 19. Dujickova M. In vitro reproduction in broadleaves forest trees, oak (Quercus petraea) and beech (Fagus sylvatica) / M. Dujickova, J. Mala // Prace Vyzkumneho Ustavu Lesniho Hospodarstvi a Myslivosti. - Jiloviste-Strnady (Czech Republic), 1995. - Vol. 80. - P. 41-51. - ISSN 0139-5807. 3 UA 68765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 20. Joergemen./. Embryogenesis in Quercus petraea and Fagus sylvatica/J.Joergensen // Journal of Plant Physiology. - Netherlands:Elsevier BV, 1988. - Vol. № 132(5) - P. 638-640. - ISSN 01761617. 21. Kraj W.The influence of PPM upon the sterility of the in vitro cultures in European beech (Fagus sylvatica L.) / W.Kraj, A. Dolnicki // Acta societatis botanicorum Poloniae. Warsaw:Panstwowe Wydawn.Nauk., 2003. - Vol. 72, № 4. - P. 303-307. - ISSN 0001-6977. 22. Lloyd G.Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia by use of shoot tip culture/G. Lloyd, B.H. McCown // Combined proceedings of the International plant propagators society. - Hawthorn Court Carlisle (USA), 1980. - Vol. 30 - P. 421-427. - ISSN 0538-9143. 23. McCown B.H.Woody plant medium (WPM) - a mineral nutrient formulation for microculture for woody plant species/ B.H. McCown, G.B. Lloyd // Hortticultural Science. -Praha:Czech Academy of Agricultural Sciences, 1981. - Vol. 16. - P. 453. - ISSN 0862-867X. 24.Meier K.Factors controlling micropropagation of mature Fagus sylvatica/K.Meier, G. Reuther // Plant cell, tissue and organ culture. - Springer: Kluwer Academic Publishers (Netherlands), 1994. Vol. 39, № 3. - P. 231-238. - ISSN: 0167-6857. 25. Nadel B.L. In vitro development of mature Fagus sylvatica L. Buds I:T he effect of medium and plant growth regulators on bud growth and protein profiles/B.L.Nadel, A. Altman, S. Pleban, A. Huettermann // Journal of plant physiology. - Leipzig (Germany), 1991a. - Vol. 138(5). - P. 596-601. ISSN 0176-1617. 26. Nadel B.L. In vitro development of mature Fagus sylvatica L. Buds II: Seasonal changes in the response to plant growth regulators./ B.L. Nadel, A. Altman, S. Pleban, R. Kocks, A. Huettermann // Journal of plant physiology. - Leipzig (Germany), 1991b. - Vol. 138(6). - P. 136-141. - ISSN 01761617. 27. Vieitez F.Javier.Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cell suspension a cultures of Fagus sylvatica L. / F.Javier Vieitez, A. Ballester, Ana M Vieitez // Plant cell reports. Springer-Verlag, 1992. - Vol. 11, № 12. - P. 609-613. 28. Vieitez A.M. Adventitious shoot regeneration from Fagus sylvatica leaf explantsin vitro/ A.M. Vieitez, M.C. San-Jose // In vitro cellular & developmental biology-Plant. - Society for in vitro biology: Cabi Publishing, 1996. - Vol.32, № 3. - P. 140-147. - ISSN: 1054-5476. 29. Vieitez A.M. Micropropagation of Fagus spp. / A.M.Vieitez, M.C.San-Jose, M.C. Sanchez, A. Ballester // In: Jain S.M., Ishii K. (eds.) Micropropagation of woody trees and fruits. - Dordrecht (Netherlands): Kluwer Academic Publishers-Springer, 2003. - P. 181-215. - ISBN 1-4020-1135-0. 30. Vieitez A.M.Micropropagation of Fagus sylvatica L. / A.M.Vieitez, E.M. Ferro, A. Ballester // In vitro cellular & developmental biology-Plant. - Society for in vitro biology:Cabi Publishing, 1993. - Vol. 29P, № 4. - P. 183-188. - ISSN: 1054-5476. 31. Weisgerber H. Micropropagation of forest trees:Research and perspectives in forestry/ H. Weisgerber, K. Gebhardt // Allgemeine Forst-und Jagdzeitung, 1995. - Vol. № 166(5). - P. 99-105. ISSN 0002-5852. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб розмноження in vitro плюсових дерев бука лісового (Fagus sylvatica L.), який охоплює ініціацію, намноження, вкорінення та адаптацію до умов відкритого ґрунту, який відрізняється тим, що у продукуванні садивного матеріалу бука лісового застосоване модифіковане тверде поживне середовище WPM для деревних рослин із експериментально підібраними для бука оптимальним вмістом і концентрацією регуляторів росту та рН середовища: NH4NO3 - 400,0 мг/л, Ca(NO3)2×4Н2О - 516,0 мг/л, СаСl2 - 112,5 мг/л, MgSO4 - 180,7 мг/л, KН2РО4 - 170,0 мг/л, K2SO4 - 990,0 мг/л, Н3ВО3 - 6,2 мг/л, MnSO4×Н2О - 22,3 мг/л, Na2MoO4×2Н2О - 0,25 мг/л, ZnSO4×7Н2О - 8,6 мг/л, CuSO4×5Н2О - 0,25 мг/л, Na2EDTA×2Н2О - 37,3 мг/л, FeSO4×7Н2О - 27,8 мг/л, myo-inositol - 100,0 мг/л, thiamine·HCI - 1,0 мг/л, nicotinic acid - 0,5 мг/л, pyridoxine·HCl - 0,5 мг/л, glycine - 2,0 мг/л, glutamine - 2,0 мг/л, sucrose - 30000,0 мг/л, agar - 7000,0 мг/л, для ініціації в модифіковане тверде поживне середовище WPM (рН=5,8) додатково залучали 6-ВА - 0,2 мг/л, NAA - 0,6 мг/л, IВА - 0,1 мг/л, zeatin - 0,4 мг/л, для намноження в модифіковане тверде поживне середовище WPM (рН=5,8) додатково залучали 6-ВА - 0,3 мг/л, NAA - 1,0 мг/л, zeatin - 2,0 мг/л, для вкорінення в модифіковане тверде поживне середовище ½ WPM (agar - 7000,0 мг/л, рН=6,3) додатково залучали NAA - 0,2 мг/л, IBA - 1,0 мг/л. 4 UA 68765 U Комп’ютерна верстка M. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5