Спосіб компенсації негативного впливу гербіцидів на коропа (cyprinus carpio l.) за використання пробіотичного препарату

Реферат: Спосіб компенсації негативного впливу гербіцидів на коропа (Cyprinus carpio L.) полягає у тому, що у воду додають пробіотичний препарат для підвищення захисних функцій організму коропа. Як пробіотичний препарат використовують препарат бацилярний субтиліс і доза препарату становить 125 млн. мікробних клітин на 1 дм води, для ікри та личинок коропа препарат вносять одноразово, для дорослих особин один раз на 5-10 днів. UA 69721 U (12) UA 69721 U UA 69721 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі екології та гідробіології і може бути використана у діяльності систем охорони природи, дослідницьких та рибогосподарських організаціях з метою підвищення захисних функцій організму риб в умовах гербіцидного забруднення. Відомо, що у сучасних лісовому та сільському господарствах широко використовуються засоби хімічного походження, в тому числі гербіциди. Надходження їх до водойм у вигляді аерозолей, при знесенні повітряною хвилею під час обробки об'єктів, що знаходяться поблизу водойм, а також, внаслідок змиву дощовими водами з рослин та ґрунту згубно впливає на риб, призводячи до зниження захисних функцій їхнього організму, появи захворювань і патологій. Упродовж тривалого часу для лікування риб застосовуються антибактеріальні препарати (антибіотики, нітрофурани, сульфаніламіди). Безконтрольне використання цих речовин призвело до різкого зниження їх ефективності [Юхименко Л. Н. Химиотерапия бактериальных болезней рыб, достоинства и недостатки / Л. Н. Юхименко, К. В. Гаврилин, Л. И. Бычкова // Проблемы патологии, иммунологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов: тез. докл. всеросс. науч.-практ. конф. - М.: Россельхозакадемия, 2003. - С. 143-143; Юхименко Л. Н. Проблема экологической безопасности лечебных и профилактических мероприятий в рыбоводстве / Л. Н. Юхименко, Л. И. Бычкова, К. В. Гаврилин, Е. С. Трифонова // Аквакультура и интегрированные технологии: проблемы и возможности: матер, междунар. науч.-практ. конфер. (11-13 апреля 2005 г.). - М.: ГНУ ВНИИР, 2005. - Т. 2. - С. 344-347]. Тому в рибогосподарській практиці постійно проводяться роботи з пошуку ефективних засобів підвищення захисних функцій організму риб, у тому числі в умовах гербіцидного забруднення. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб компенсації наслідків токсичного впливу гербіцидів на коропа (Cyprinus carpio L.), який можливо було б використовувати у технологіях вирощування ставкових риб і який би забезпечував підвищення їх виживання у разі дії токсикантів. Поставлена задача вирішується шляхом додавання у воду пробіотичного препарату бацилярного субтилісу (БПС-44). Препарат БПС-44 створено на основі аеробних спороутворюючих бактерій Bacillus subtilis 44-p. Штам бактерій Bacillus subtilis 44-р депоновано у Депозитарії Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (вул. Донецька, 30, м. Київ) за реєстраційним номером 141. Доза пробіотичного препарату БПС3 44 для риб становить 125 млн. мікробних клітин на 1 дм води. Препарат БПС-44 необхідно вносити: для ікри та личинок коропа - одноразово, для дорослих особин - один раз на 5-10 днів упродовж часу, поки зберігається загроза отруєння риб гербіцидами. В умовах гербіцидного забруднення застосування пробіотичного препарату БПС-44 сприяє підвищенню життєздатності ікри та виживанню личинок коропа; заселенню організму личинок сапрофітною аеробною споровою мікрофлорою; нормалізації функцій крові коропових риб і позитивно впливає на біохімічну рівновагу в організмі риб. Пробіотичний препарат БПС-44 значною мірою нівелює токсичний вплив гербіцидів і може застосовуватись для корегування порушень у риб при їх дії. Можливість здійснення способу відображено у наведених нижче прикладах. Приклад № 1 Вплив гербіциду Раундап на життєздатність ікри коропа та можливість профілактики його токсичної дії пробіотичним препаратом БПС-44. Дослід з вивчення впливу Раундапу (діюча речовина - ізопропіламінна сіль гліфосату, 480 3 г/дм ) [Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні / [В. Л. Петрунек, Г. О. Лагуточкіна, Д. В. Іванов та ін.]. - К.: Юнівест Маркетинг, 2001.-274 с.], в 3 3 концентраціях 0,05 ГДК (гранично допустима концентрація) (0,001 мг/дм ), 0,5 ГДК (0,01 мг/дм ), 3 3 3 3 1 ГДК (0,02 мг/дм ), 2 ГДК (0,04 мг/дм ), 4 ГДК (0,08 мг/дм ), 40 ГДК (0,8 мг/дм ), 400 ГДК (8,0 3 3 мг/дм ), 4000 ГДК (80 мг/дм ), а також сумісної дії пробіотичного препарату БПС-44 й Раундапу (у визначених концентраціях) на життєздатність заплідненої ікри коропа, проводили у 1-літрових акваріумах, з відстояною водопровідною водою (температура води становила 18,0-20,2 °C, 3 концентрація кисню - 7,8-8,2 мг/дм , рН - 7,7-8,1). Як спосіб введення БПС-44 в організм риб на ранніх стадіях ембріонального розвитку була проведена обробка заплідненої ікри, шляхом додавання у воду (за добу до внесення Раундапу) пробіотичного препарату, з концентрацією 3 мікроорганізмів Bacillus subtilis 125 млн. мікробних клітин на 1 дм води. У кожному з варіантів використовували по 100 ікринок. Ефективність БПС-44, щодо дії різних концентрацій Раундапу вивчали за кількістю життєздатної ікри методом прямого обліку. Встановлено, що пробіотичний препарат БПС-44 компенсує токсичну дію гербіциду Раундап, про що свідчить збільшення кількості життєздатної ікри на всіх стадіях її розвитку. При дії БПС3 44 та гербіциду, в концентраціях 8,0-80 мг/дм на ікру коропа в період розвитку, а саме від 1 UA 69721 U 5 10 15 20 25 запліднення до кінця гаструляції, виживання ембріонів у порівнянні до тих, що перебували лише під впливом Раундапу достовірно збільшилось, в середньому на 3,6 %, що, на нашу думку, пояснюється підвищенням токсикорезистентності оболонок зародка, завдяки діяльності бактеріального штаму Bacillus subtilis 44-p. Компенсаторний вплив БПС-44 щодо дії Раундапу чітко проявлявся на стадії утворення очних бокалів та рухливості ембріонів в оболонці, де смертність ікри також значно зменшилась. Під час вилуплення личинок загибель ікри у групах з 3 пробіотичним препаратом та концентраціями гліфосату 0,001-80 мг/дм зменшилась в середньому на 9,4 % порівняно з варіантами досліду, де використовували лише Раундап. Приклад № 2 Підвищення життєздатності личинок коропа в умовах дії гербіциду Раундап за використання пробіотичного препарату БПС-44. Дослід з вивчення впливу Раундапу, а також сумісної дії БПС-44 й Раундапу на виживання личинок коропа здійснювали у 1-літрових акваріумах, з відстояною водопровідною водою 3 (температура води була на рівні 20,8-22,1 °C, вміст кисню - 7,0-7,8 мг/дм , рН - 7,5-8,4) у різних варіантах. Варіанти досліду: 1) контроль; 2) вплив різних концентрацій Раундапу, а саме 0,05 3 3 3 3 ГДК (0,001 мг/дм ), 0,5 ГДК (0,01 мг/дм ), 1 ГДК (0,02 мг/дм ), 2 ГДК (0,04 мг/дм ), 4 ГДК (0,08 3 3 3 3 мг/дм ), 40 ГДК (0,8 мг/дм ), 400 ГДК (8,0 мг/дм ), 4000 ГДК (80 мг/дм ) здійснювався тільки на личинок після їхнього вилуплення без попереднього впливу на ікру; 3) з попереднім впливом Раундапу (у всіх визначених концентраціях) на ікру, потім - на личинок; 4) вплив пробіотичного препарату БПС-44 за різних концентрацій Раундапу на личинок коропа без попереднього впливу гербіциду на ікру, дія дослідних препаратів на личинок здійснювалася тільки після їхнього вилуплення; 5) з попереднім впливом досліджуваного гербіциду (у всіх визначених концентраціях) на ікру, потім сумісна дія препарату БПС-44 і Раундапу на личинок. Відхід личинок в усіх варіантах досліду визначали методом прямого обліку. Встановлено, що пробіотичний препарат БПС-44 проявляє суттєвий позитивний вплив на виживання личинок коропа, як тих, що потрапляли у токсичні умови вже у постнатальному розвитку, так і тих, які на стадії ікри піддавалися дії досліджуваного токсиканту. Його ефект найкраще проявляється за умов гербіцидного навантаження, що перевищує ГДК у 2-4 рази (табл.1, 2). 30 Таблиця 1 Вплив Раундапу на виживання личинок коропа, які не піддавалися його попередній дії (упродовж ембріонального розвитку), % (М±m, n=6) Концентрація 3 Раундапу, мг/дм Контроль 0,001 (0,05 ГДК) 0,01 (0,5 ГДК) 0,02 (1 ГДК) 0,04 (2 ГДК) 0,08 (4 ГДК) 0,8 (40 ГДК) 8,0 (400 ГДК) 80 (4000 ГДК) 12 91,8±2,01 90,9±2,80 90,1±1,76 89,6±3,08 87,3±2,21 84,5±2,22* 80,2±2,99* 69,3±2,55* 0,0 Тривалість експозиції, год. 24 48 72 91,1±1,35 90,3±2,11 88,8±1,63 89,2±1,68 86,3±1,70 83,7±1,64* 87,3±1,82 86,7±1,93 83,2±1,69* 86,0±1,66* 83,5±1,99* 81,9±1,34* 83,5±2,24* 81,1±1,72* 76,4±1,98* 80,4±1,62* 78,3±1,44* 70,3±1,50* 72,6±1,67* 55,6±1,32* 48,6±0,92* 58,7±2,37* 22,4±0,29* 4,6±0,09* 0,0 0,0 0,0 96 85,2±2,37 79,0±1,64* 78,4±2,26 74,3±1,60* 62,0±1,53* 43,1±1,55* 12,9±0,18* 0,0 0,0 Таблиця 2 Вплив пробіотичного препарату БПС-44 та Раундапу на виживання личинок коропа, які не піддавалися попередній дії гербіциду (упродовж ембріонального розвитку), % (М±m, n=6) Концентрація 3 Раундапу (мг/дм ) + БПС-44 Контроль 0,001+БПС-44 0,01+БПС-44 0,02+БПС-44 0,04+БПС-44 Тривалість експозиції, год. 12 24 48 72 96 91,8±2,01 92,7±2,25 91,1±1,70 90,4±1,40 89,3±1,90 91,1±1,35 91,5±2,81 90,2±2,76 88,4±1,65 88,1±2,33 90,3±2,11 88,9±2,23 87,6±1,85 87,2±1,21 86,8±2,43 88,8±1,63 85,6±2,76 84,3±1,76 83,8±1,85 81,5±3,11 85,2±2,37 82,1±1,13 81,4±1,44 79,5±2,50 74,6±4,07 2 UA 69721 U Продовження таблиці 2 0,08+БПС-44 0,8+БПС-44 8,0+БПС-44 80+БПС-44 5 10 15 20 88,9±2,53 87,1±1,99 83,0±1,54* 46,1±1,23* 85,3±2,60 84,6±1,79* 67,5±1,31* 37,8±1,64* 83,0±3,00 82,5±3,16 60,1±0,97* 32,8±0,72* 80,2±3,42* 73,1±1,68* 44,5±0,75* 21,0±0,42* 67,7±0,71* 52,0±0,97* 25,3±0,20* 10,6±0,12* Приклад № 3 Використання пробіотичного препарату БПС-44 для формування мікробоценозу личинок коропа та підвищення їх резистентності при дії гербіциду Раундап. У досліді використовували личинок коропа зразки матеріалу відбирали у віці 2, 8 та 14 діб життя личинок, які піддавалися впливу Раундапу й сумісній дії БПС-44 з Раундапом. При проведенні мікробіологічних досліджень, з метою уникнення потрапляння сторонніх мікроорганізмів із води або поверхні, личинок коропа оброблювали етиловим спиртом, а потім, шестикратно промивали у стерильному фізіологічному розчині і гомогенізували у пробірках з цим же розчином у співвідношенні 1:9 (маса: об'єм) до отримання гомогенної суспензії. Перед посівом проби прогрівали на водяній бані при 80 °C упродовж 10 хв. з метою знищення неспорової мікрофлори. В отриманій суспензії визначали титр клітин Bacillus subtilis використовуючи живильне середовище - м'ясопептонний агар. Типовість виділених бактеріальних культур перевіряли під мікроскопом у пофарбованих за Грамом мазках, спостерігаючи типові для аеробних бацил клітини - грампозитивні палички з центрально розташованими спорами. Встановлено, що застосування пробіотичного препарату БПС-44 в умовах гербіцидного забруднення сприяє кількісному збільшенню бацилярної складової мікрофлори та скорішому заселенню організму личинок риб сапрофітною аеробною споровою мікрофлорою. При сумісній дії БПС-44 й різних концентрацій гербіциду Раундап титр мікробних клітин Bacillus subtilis залишається високим протягом 14 діб (табл. 3, 4), що має важливе значення для використання у рибництві даного пробіотичного препарату. Таблиця 3 Кількість життєздатних клітин аеробних бацил в організмі личинок коропа різного віку за дії Раундапу (М±m, n=6) 3 Кількість бактерій, КУО/см , в організмі личинок коропа віком: Концентрація Раундапу у 3 воді акваріуму, мг/дм 2 доби 8 діб 14 діб 3 3 3 0,000 (контроль) (4,0±0,2)·10 (6,3±1,1)·10 (7,2±0,8)·10 3 3 3 0,001 (5,6±1,0)·10 (6,4±1,9)·10 (1,7±0,4)·10 * 3 3 2 0,010 (3,9±1,2)·10 (1,2±0,1)·10 * (8,6±1,4)·10 * 3 2 2 0,020 (3,7±0,6)·10 (9,2±0,9)·10 * (6,8±0,6)·10 * 3 2 2 0,040 (3,2±0,8)·10 (6,6±1,3)·10 * (1,2±0,1)·10 ** 3 2 1 0,080 (2,7±1,1)·10 (5,4±0,9)·10 * (7,6±0,6)·10 *** 3 2 0,800 (1,9±0,5)·10 (1,9±0,4)·10 ** 0,9±0,2*** 3 8,000 (1,4±0,3)·10 X X 80,000 X X X Примітка. Вірогідна різниця порівняно з контрольною групою личинок відповідного віку: *-р