Спосіб доставки реплікативних та інтегративних плазмідних днк у клітини штаму streptomyces echinatus

Реферат: Спосіб уведення реплікативних та інтегративних плазмідних ДНК у штам Streptomyces echinatus, який базується на кон'югативному перенесенні ДНК у штам, причому як донор використовують штам кишкової палички Escherichia coli ET12567 (pUB307) із реплікативною плазмідою рКС1139 чи рКС1218Е або інтегративною плазмідою pSET152 чи pRT801, а транскон'югантів відбирають на агаризованому вівсяному середовищі. UA 70091 U (12) UA 70091 U UA 70091 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до генетики та біотехнології мікроорганізмів і може бути використана для клонування генів у клітинах штаму Streptomyces echinatus, що продукує антрацикліновий антибіотик аранціаміцин. Відомий спосіб доставки плазмідних ДНК у клітини актиноміцетів за допомогою електропорації [Wang Y, Zhang S. High frequency transformation of the industrial erythromycinproducing bacterium Saccharopolyspora erythraea II Biotechnol Lett. - 2008. - Vol. 30, N2. - P. 357361]. Спосіб базується на збільшенні проникності клітинної мембрани бактерій під дією зовнішнього електричного поля за напруженості 10 кВ/см. Однак цей спосіб передбачає використання складної апаратури і його ефективність для представників роду Streptomyces є малоефективним через низьку частоту перенесення плазмід. Відомий спосіб, що включає отримання протопластів штамів стрептоміцетів та їхню подальшу трансформацію плазмідними ДНК за наявності поліетиленгліколю [Kieser Т., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F., Hopwood D.A. Practical Streptomyces genetics // John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom. - 2000. - 613 p.]. Однак ефективність цього способу у різних видів стрептоміцетів сильно відрізняється. До того ж для кожного виду цих бактерій необхідно підбирати свої технічні умови виконання, що ускладнює його застосування. Найближчим за технічною суттю - прототипом є спосіб уведення ДНК у клітини Actinoplanes teichomyceticus за допомогою кон'югативних схрещувань із донорним штамом кишкової палички Escherichia coli ET12567 (pUB307), що містить у плазміді pUB307 tra-оперон, який і забезпечує перенесення корезидентних плазмід [ПУ № 54717. Осташ Б.О., Забуранний Н.В., Громико О.М., Федоренко В.О. Спосіб уведення реплікативних та інтегративних плазмід у штам Actinoplanes teichomyceticus]. Для проведення схрещувань A. teichomyceticus вирощували на вівсяному середовищі: вівсяне борошно - 30 г/л, агар - 18 г/л, вода водопровідна - до 1 л, рН до стерилізації - 7,0 протягом 8 діб за температури 30 °C, а донорну культуру - на середовищі LA: триптон - 10 г/л, дріжджовий екстракт - 5 г/л, NaCl - 5 г/л, агар - 16 г/л протягом 18 год. за температури 37 °C. Пророщену культуру А. teichomyceticus змішували із клітинами донора Е. coli ET12567 (pUB307) та висівали на агаризоване вівсяне середовище. Чашки інкубували протягом 18-20 год. за 30 °C, а потім заливали 1,5 мл дистильованої води, що містила налідиксову кислоту та апраміцин. Частоту появи транскон'югантів визначали через сім діб вирощування за температури 30 °C. Проте, у цьому способі не продемонстровано можливість уведення та стабільної підтримки у клітинах S. echinatus широкого кола реплікативних тa інтегративних плазмід. Також не розкрито впливу плазмід на рівень синтезу аранціаміцину та морфологічні характеристики бактерій. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб доставки реплікативних та інтегративних плазмідних ДНК у клітини штаму Streptomyces echinatus шляхом використання широкого кола реплікативних та інтегративних плазмідних ДНК, що дасть змогу стабільно підтримувати їх у клітинах продуцента аранціаміцину. Поставлена задача вирішується так, що у способі доставки реплікативних та інтегративних плазмідних ДНК у клітини штаму Streptomyces echinatus, який базується на кон'югативному перенесенні ДНК у штам, де як донори використовують штам кишкової палички Escherichia coli ЕТ12567 (pUB307) Із реплікативною плазмідою рКС1139 чи рКС1218Е або інтегративною плазмідою pSET152 чи pRT801, а транскон'югантів відбирають на агаризованому вівсяному середовищі. З літературних джерел відомо, що Streptomyces echinatus DSM40730 є продуцентом антрациклінового антибіотика аранціаміцину [Luzhetskyy A, Almuth Mayer, Hoffmann J., Pelzer S. Cloning and Heterologous Expression of the Aranciamycin Biosynthetic Gene Cluster Revealed a New Flexible Glycosyltransferase // Chem. Bio. Chem. - 2008. - Vol. 8. - P. 599-602.]. Похідні цього антибіотика сьогодні успішно застосовуються як самостійно, так і у комплексі з іншими препаратами для терапії злоякісних новоутворень. З огляду на клінічний успіх аранціаміцинів невпинно зростає потреба у вивченні генетичного контролю біосинтезу аранціаміцинів та одержанні промислових надпродуцентів цих сполук. Для цього необхідно володіти ефективними способами перенесення рекомбінантних молекул ДНК у клітини S. echinatus. Авторами вперше запропоновано використати реплікативні плазміди рКС1139, рКС1218Е, що відрізняються своїми репліконами та інтегративні плазміди pSET152 і pRT801, що містять різні системи інтеграції, для перенесення у клітини S. echinatus. Запропоновані плазміди дозволяють значно розширити діапазон генетичних маніпуляцій із продуцентом аранціаміцину. Використання плазміди pSET152 чи pRT801 дозволяє інтегрувати екзогенну ДНК у кілька різних ділянок геному бактерій та забезпечити їхнє стабільне успадкування за відсутності селективного тиску. Плазміда рКС1139 містить температурочутливий реплікон, що дозволяє 1 UA 70091 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 використовувати її для генних нокаутів у S. echinatus. Плазміда рКС1218Е містить конститутивний промотор гена стійкості до еритроміцину ermЕр Saccharopolyspora erythraea, що спрощує її використання для експресії генів у клітинах S. echinatus. Запропонований спосіб є ширшим та ефективнішим порівняно з відомими способами. Цінністю запропонованого способу є те, що він дає змогу отримати рекомбінантні штами S. echinatus із широким спектром реплікативних та інтегративних плазмід. Також, перевагою є можливість використання дешевого вівсяного середовища для відбору рекомбінантних штамів S. echinatus. Фіг. 1 Хімічна будова аранціаміцину. Фіг. 2, 3, 4, 5 Схеми плазмід рКС1139, рКС1218Е, pSET152 і pRT801, де 1 - маркерний ген стійкості до апраміцину аас(3)IV; RK2 2 - ділянка ініціації кон′югативного перенесення ДНК orilT ; 3 - ділянки ініціації реплікації плазмід pSG5 та pSCP2 (у випадку рКС1139 та рКС1218Е, відповідно) або ділянка attP разом з геном інтегрази фага С31 або VWB (у випадку плазмід pSET152 і pRT801, відповідно); 4 - ділянка клонування чужорідної ДНК (полілінкер). Фіг. 6 Результати ПЛР-аналізу геномів траснкон'югантів S. echinatus, що містять інтегративні плазміди pSET152 і pRT801. Спосіб можна проілюструвати прикладами: Плазмідами рКС1139 чи рКС1218Е, або pSET152 чи pRT801 трансформують донорний штам Е. coli ET12567 (pUB307), який за рахунок (trа-генів плазміди pUB307 забезпечує кон'югативне перенесення плазмідних ДНК [Flett F., Mersinias V., Smith C.P. High efficiency intergeneric conjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to methyl-DNA-restricting Streptomycetes II FEMS Microbiol. Lett. - 1997. - V.I55. - P. 223-229]. Одну колонію культури E. coli засівають у 5 мл середовища LB: триптон - 10 г/л, дріжджовий екстракт - 5 г/л, NaCl - 5 г/л з 50 мкг/мл канаміцину. Культуру вирощують до оптичної густини OD 600=0,1, переносять у мікропробірки об'ємом 1,5 мл та осаджують центрифугуванням при 13 тис. об./хв. протягом 1 хв. Зливають супернантант та ресуспендують клітини у 100 мкл середовища LB. Отриману суспензію клітин охолоджують за температури 0±0,1 °C 5 хв., додають 1 мл 0,1 М розчину СаСl2 та інкубують 1 год. за температури 0±0,1 °C. Клітини осаджують центрифугуванням при 13 тис. об./хв. протягом 1 хв., зливають надосадову рідину та ресуспендують у 100 мкл 0,1 М розчину СаСl2. Інкубують 1 год. за температури 0±0,1 °C та додають розчин плазмідної ДНК. Інкубують 1 год. за температури 0±0,1 °C, після чого клітини піддають тепловому шоку протягом 1 хв. за температури 40 °C, охолоджують та додають 1 мл середовища LB. Інкубують 2 год. за температури 37 °C для індукції експресії генів стійкості та висівають на чашки з середовищем LA з 25 мкг/мл апраміцину та 50 мкг/мл канаміцину. Чашки інкубують за температури 37 °C після чого трансформанти пересівають на середовище LA з 25 мкг/мл апраміцину та 50 мкг/мл канаміцину. Плазміди рКС1139, рКС1218Е, pSET152 і pRT801 переносять в S. echinatus шляхом міжродової кон'югації з відповідним штамом Е. соlі ET12567 (pUB307). Суспензію спор штаму S. echinatus висівають на вівсяне середовище та вирощують 7 діб за температури 28 °C для отримання спорової суспензії для кон'югаційних схрещувань. Штам Е. coli ET12567 (pUB307) з плазмідами рКС1139, рКС1218Е, pSET152 i pRT801 висівають на чашку з середовищем LA з 25 мкг/мл апраміцину та 50 мкг/мл канаміцину та вирощують 18 год. за температури 37 °C. Готують суспензію клітин у 3-4 мл середовища LB. Одночасно готують суспензію спор штаму S. echinatus у 3-4 мл стерильного фізіологічного розчину. Суспензію клітин та спор стрептомiцетів осаджують центрифугуванням протягом 4 хв. при 13 тис. об./хв., зливають надосадову рідину, розчиняють у 100 мкл середовища LB, змішують між собою та висівають на чашки з вівсяним середовищем. Чашки інкубують 12-14 год. за температури 28 °C та заливають 1 мл водного розчину, що містить 25 мкг апраміцину та 50 мкг налідиксової кислоти. Частота появи транскон'югантів за наведених умов у середньому становить -3 (2,4±0,3)10 . Отримані транскон'юганти перевіряють на наявність плазміди за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та праймерів, комплементарних до промоторної ділянки маркерного гена стійкості до апраміцину aac(3)IV. Вирощують транскон'юганти у 50 мл рідкого середовища TSB (Merck Chemicals, Німеччина) та виділяють сумарну ДНК [Kieser Т., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F.,Hopwood D.A. Practical Streptomyces genetics // John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom. - 2000. - 613 p], зразки якої використовують для ампліфікації промотора гена aac(S)IV. Факт ампліфікації фрагменту ДНК розміром 0,2 т.п.н., який відображено на Фiг. 6, свідчить про iнтеграцію плазмід pSET152 і pRT801 у геном S. echinatus. 2 UA 70091 U 5 10 15 20 Перевіряють стабільність успадкування плазмід pSET152 і pRT801. Штами S. echinatus, що містять інтегративні плазміди, вирощують у середовищі TSB 5 діб за температури 30 °C. 100 мкл отриманої культури знову інокулюють у свіже середовище TSB і так повторюють пересів 5 разів. Після останнього пересіву висівають серійні розведення культур транскон'югантів на чашки Петрі із вівсяним середовищем без додавання антибіотиків. Інкубують чашки 8 діб, після цього переносять клони транскон'югантів на вівсяному середовищі з 25 мкг/мл апраміцину. Усі клони транскон'югантів успадкували фенотип стійкості до апраміцину, що свідчить про стабільність підтримання pSET152 чи pRT801. Автономні плазміди втрачалися транскон'югантами з високою частотою. Частота їх успадкування після п'яти пересівів становить 30 %. Перенесені плазміди не впливали на морфологічні характеристики S. echinatus. Використання запропонованого способу уведення реплікативних та інтегративних плазмід у штам S. echinatus дає змогу отримати передбачуваний технічний результат, який підтверджено Фіг. 6. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб уведення реплікативних та інтегративних плазмідних ДНК у штам Streptomyces echinatus, який базується на кон'югативному перенесенні ДНК у штам, який відрізняється тим, що як донор використовують штам кишкової палички Escherichia coli ET12567 (pUB307) із реплікативною плазмідою рКС1139 чи рКС1218Е або інтегративною плазмідою pSET152 чи pRT801, а транскон'югантів відбирають на агаризованому вівсяному середовищі. 3 UA 70091 U 4 UA 70091 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5