Застосування штаму streptomyces avermitilis imb ас-5015 як продуцента комплексу фітогормонів

Застосування штаму Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 як продуцента комплексу фітогормонів. Винахід відноситься до біотехнології, зокрема, до мікробіологічного виробництва регуляторів росту рослин, та може використовуватися для одержання стимуляторів росту рослин, до складу якого входять фітогормони ауксинової, гіберелінової, цитокінінової природи та брасиностероїди. Велика роль у підвищенні продуктивності сільськогосподарських культур належить регуляторам росту рослин, оскільки вони забезпечують інтенсифікацію виробництва продукції рослинництва з одночасним скороченням енергетичних витрат. Їх застосування дає можливість спрямовано регулювати найважливіші процеси в рослинному організмі, найбільш повно реалізувати їх генетично детерміновані можливості продуктивності. Головна увага при цьому приділяється регуляторам росту природного походження, діючими компонентами яких виступають фітогормони. Фітогормони - це група природних сполук, які регулюють протікання фізіологічних процесів у мінімальних кількостях та відіграють критичну роль у контролюванні росту та розвитку рослин. На сьогодні найбільш вивченими є п'ять основних класів фітогормонів: ауксини, гібереліни, цитокініни, етилен та абсцизова кислота. Такі препарати регуляторів росту рослин, які містять фітогормони, виявляють ріст регулюючу активність і водночас сприяють підвищенню стійкості до стресових чинників та патогенів. На сьогодні відомі регулятори росту, створені на основі продуктів природного походження, забезпечують суттєвий приріст високоякісної продукції. Потреба у регуляторах росту комплексної дії в Україні надзвичайно велика, тому актуальною є розробка способів отримання регуляторів росту рослин, які включають різноманітні фітогормони, зокрема, способів, що базуються на використанні мікроорганізмів. (19) UA (11) 92094 (13) C2 (21) a200901173 (22) 13.02.2009 (24) 27.09.2010 (46) 27.09.2010, Бюл.№ 18, 2010 р. (72) ІУТИНСЬКА ГАЛИНА ОЛЕКСАНДРІВНА, БІЛЯВСЬКА ЛЮДМИЛА ОЛЕКСІЇВНА, ДРАГОВОЗ ІГОР ВОЛОДИМИРОВИЧ, КОЗИРИЦЬКА ВАЛЕНТИНА ЄВГЕНІВНА, ВАЛАГУРОВА ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА, ЯВОРСЬКА ВІКТОРІЯ КАЗИМИРІВНА, КУРЧІЙ БОГДАН ОЛЕКСІЙОВИЧ (73) ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І 3 Мікробний синтез регуляторів росту рослин є найбільш перспективним способом їх високоефективного та рентабельного отримання, що дозволяє спростити процес, знизити затрати на виробництво та підвищити якість продукту. Основою мікробіологічного синтезу фітогормонів є штампродуцент. Відомий штам мікроміцета Cercospora sp. ВКПМ F-444, що є продуцентом абсцизової кислоти (АБК) (RU2085078, опубл. 27.07.1997) і являє собою моноспоровий ізолят, виділений з ураженої рослини Rosa rugosa. Штам синтезує 60-120мг АБК в 1л культуральної рідини за 10-12 днів культивування. Проте можливості використання штаму обмежені тим фактом, що він продукує лише один фітогормон, що часто є недостатнім для досягнення високої ефективності в зв'язку з тим, що АБК є загальновідомим природним інгібітором багатьох фізіологічних процесів, гормоном стану спокою, тощо. Описаний штам мікроміцета Fusarium moniliforme ВКПМ F-446, що є продуцентом гіберелінів А4 та А7 (RU2084531, опубл. 20.07.1997), який був виділений з моноспорового ізоляту, отриманого із ураженої рослини рису, шляхом генерації протопластів та їх обробку УФ-світлом. Штам характеризується високим виходом ГА7, що складає 400-700мг/л та ГА4 - 20-80мг/л. Проте як і у попередньому випадку, наявність в отриманому продукті фітогормонів одного класу обмежує можливості його використання в рослинництві, що значно звужує спектр його фізіологічної активності. У зв'язку з цим спектр сільськогосподарських культур, на яких можна застосовувати цей штам, обмежений. Як прототип заявленого винаходу вибраний штам мікроміцета-ендофіта Мусеlіа sterilia IMB F100005 (UA22644, опубл. 17.03.1998), виділений із кореневої системи женьшеню. Вказаний штам є продуцентом гормоноподібних речовин, що використовується для обробки сільськогосподарських рослин. Культуральну рідину Мусеlіа sterilia IMB F100005 використовували для підвищення врожаю рослин, покращення формування репродуктивних органів, збільшення врожайності та цукристості культур, зокрема, буряків. Недоліками вказаного штаму-продуценту є досить низький рівень синтезу основних класів фітогормонів-стимуляторів на одиницю об'єму культурального середовища; висока чутливість штаму мікроміцета до умов культивування в системі in vitro у несинтетичному середовищі, що приводить до нестабільної фізіологічної активності препаратів, отриманих на основі цього штаму. Задачею даного винаходу є одержання продуцента з високим рівнем синтезу фітогормонів різноманітних класів. Вказана задача вирішується за рахунок застосування продуцента комплексу фітогормонів штаму Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015. Зазначений штам був задепонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером IMB Ас-5015 та описаний як штам Streptomyces avermitilis, що утворює авермектини - речовини антипаразитар 92094 4 ної дії. За хімічною структурою кожен компонент авермектинового комплексу являє собою макролід з макроциклічного лактону, зв'язаного з дисахаридом діолеандрозою. Лактонна частина утворюється з тих нижчих жирних кислот, які є попередниками у біосинтезі жирних кислот у клітинах актиноміцетів. Авермектини активні по відношенню до екзо- та ендопаразитів тварин (кліщів, нематод, бліх, вошей тощо), а також фітонематод та комах - шкідників рослин (крапчастий і павутинні кліщі, міль, попелиця та ін.). Штам Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 було отримано шляхом спрямованої селекції за допомогою N-метил-N-нітро-N-нітрозогуанідіну. Відбір активних варіантів проводили за двома показниками: а) за здатністю варіантів до утворення усього комплексу авермектинів та б) за здатністю варіантів до синтезу авермектинів В1 і В2. В ході експериментів по вивченню штаму Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 було несподівано встановлено, що він є здатним до синтезу трьох класів фітогормонів: ауксинів, гіберелінів та цитокінінів. Так, при використанні хроматографічних способів у міцелії стрептоміцету та у культуральному середовищі було виявлено фітогормони ауксинової та цитокінінової природи. Ауксини були представлені індолілоцтовою кислотою, цитокініни - ізопентиладеніном, зеатином та зеатинрибозидом. Культура штаму також була здатною до утворення гіберелінів у значних кількостях. Наявність широкого спектру фітогормонів у міцелії штаму Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 забезпечує можливість його застосування за іншим призначенням, а саме як продуцента комплексу фітогормонів, що може використовуватися для регуляції росту рослин. В іншому своєму аспекті винахід також стосується препарату для регуляції росту рослин, який включає комплекс фітогормонів, що продукуються штамом Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015. Штам стрептоміцета Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 характеризується наступними ознаками: 1. Культурально-морфологічні ознаки 1.1. На агаризованому середовищі (рН 6,8-7,4; температура 28°С) утворює спорофори у вигляді невеликих спіралей до 3-5 завитків, які при суцільному рості з віком розташовуються так тісно, що мають вигляд клубочків. Оболонка спор гладка. Протягом перших семи діб росту окремі колонії плоскі на вигляд і зазвичай мають невеликі розміри; з віком (7-14 діб) колонії збільшуються у діаметрі до 10мм. В центрі колоній з'являється підвищення, по краях якого спостерігається виразна складчастість. При суцільному рості складчастість проявляється лише по краях росту. 1.2. Добре росте на картопляно-глюкозному агарі (КГА). Субстратний міцелій з віком змінюється від буруватого кольору до темно-коричнюватого з червонуватим відтінком. Повітряний міцелій теж добре розвинений. Після росту протягом 7 днів він має білувато-сіре забарвлення з коричнюватим відтінком; у 14добовому віці білий відтінок зникає, проте до за 5 барвлення додається слабкий жовтуватий відтінок. Розчинний пігмент відсутній. 1.3. На вівсяному агарі ріст досить непоганий. Субстратний міцелій - коричнюватий (в молодому віці більш світлий, з віком темнішає). Повітряний міцелій розвинений трохи слабше в порівнянні з КГА. У 7-добовому віці він сірого кольору; з віком сіро-коричнюватий. Розчинний пігмент відсутній. 1.4. На мінеральному середовищі Гаузе-1 ріст загалом непоганий. Субстратний міцелій у молодому віці безбарвний, а з віком стає коричнюватий зі слабким червонуватим відтінком. Повітряний міцелій спочатку (4 доби) відсутній, проте з віком поступово з'являється; у 14-добовому віці він слабо розвинутий, сіруватий. Розчинний пігмент відсутній. 1.5. На органічному середовищі Гаузе-2 ріст загалом непоганий. CM - світло-буруватий з жовтуватим відтінком. ПМ у молодому віці (4 доби) майже відсутній (з рідкими острівцями білого нальоту). У 7-14-добовому віці площа під ПМ збільшується, та він набуває білувато-сіруватого забарвлення. РП відсутній. Фізіолого-біохімічні властивості Штам є аеробним мікроорганізмом, оптимальна температура росту 28°С. Відношення до джерел вуглецю: добре росте на глюкозі, рамнозі, сахарозі, інозиті, маніті, не росте на арабінозі, ксилозі, фруктозі та целюлозі. Штам утворює меланін, помірно розріджує желатин, не пептонізує та коагулює молоко, помірно гідролізує крохмаль, не руйнує клітковину. Зазначений штам є чутливим до еритроміцину, неоміцину, гентаміцину та ампіциліну, слабо чутливий до тетрацикліну. Штам зберігається на скошеному КГА з пересіванням на свіжий агар через 2-4-місяці, а також у ліофільному стані. Був ідентифікований за визначником Bergey Manual of Determinative. Streptomyces avermitilis IMB Ac-5015 росте на агаризованому поживному середовищі ISP-3 або КГА. З рівня техніки відомо, що деякі спрептоміцети є продуцентами гормонів, вітамінів, амінокислот, каротиноїдів, ферментів, токсинів. Так, було описано штам Streptomyces griseus, що синтезує сполуку 3-[2-(3,5-диметил-2-оксоциклогексил)-2гідроксіетил]-2,6-піперидінедіон, яка виявляє ріст регулюючу активність (ЕР0022910, 1981); Streptomyces hygroscopicus, який продукує речовину гідацизин з ріст регулюючою активністю (JP4222589, 1992), Streptomyces sp., задепонований під номером FERM 12317 як продуцент антибіотиків, виробляє гербіциди, герміциди та регулятори росту (JP5025189, 1993). Проте ніде не повідомлялося про те, що Streptomyces avermitilis, та зокрема, штам Streptomyces avermitilis IMB Ас5015 має здатність продукувати комплекс фітогормонів: гіберелінової, ауксинової та цитокінінової природи. Даний винахід може бути проілюстрований приведеними нижче прикладами. Приклад 1 92094 6 Вирощування штаму Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 Для отримання посівного матеріалу Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 штам вирощували протягом 14 діб при 28°С на середовищі КГА наступного складу (г/л): очищена картопля 200 (відвар); СаСО3 - 0,2; MgSO4 7Н2О - 0,2, глюкоза 20,0; агар 15,0; водогінна або дистильована вода до 1л, рН 6,8-7,2. Для аналізу комплексу фітогормонів також проводили вирощування штаму Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 у рідкому повноцінному та синтетичному середовищах методом глибинного культивування. В дослідах використовували маточну культуру, яку вирощували протягом доби на рідкому повноцінному середовищі наступного складу (г/л): соєве борошно 15,0; дріжджі сухі 5,0; глюкоза 20,0; водопровідна вода до 1 л рН 6,2. Після цього піддавали штам вирощуванню на повноцінному та синтетичному середовищах, що мають наступний склад: повноцінне (г/л) - соєве борошно 16,0; дріжджі сухі 5,0; крохмаль розчинний 23,0; глюкоза 70,0, СаСО3 4,0; К2НРО4 1,0; дріжджі сухі 4,0, водопровідна вода до 1 л, рН 6,2 синтетичне (г/л) - глюкоза 70,0; NaCl 20,0; К2НРО4 0,5; (NH4)SO4 0,8; СаСО3 5,0; FeSO4 0,05; MgSO4 0,1; MnSO4 0,05; ZnSO4 0,05; вода дистильована до 1 л, рН 6,8-7,0. Штам Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 вирощували на качалках при 240об./хв. в колбах об'ємом 500мл у 50мл повноцінного або синтетичного середовища з додаванням 2% маточної культури. Біосинтетичну здатність перевіряли після закінчення процесу ферментації на культурах, вирощених протягом 7 діб. Екстракти готували наступним чином: 50мл культуральної рідини центрифугували протягом 20хв. при 4000об./хв. До осаду додавали 10мл охолодженої дистильованої води, ретельно перемішували і центрифугували додатково 10хв. при 4000об./хв. Відмивання проводили 3-4 рази. Потім до осаду додавали 5мл етанолу і при постійному перемішування проводили екстракцію ріст регулюючих сполук при кімнатній температурі протягом 1 доби. Центрифугували 10хв. при 4000об./хв. Приклад 2 Аналіз здатності штаму Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 до синтезу фітогормонів різної природи. Для визначення вмісту фітогормонів (ауксинів, цитокінінів та абсцизової кислоти) у міцелії Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 застосовували метод кількісної спектроденситометричної тонкошарової хроматографії. Одержані екстракти центрифугували при 300об./хв, упарювали під вакуумом при 40-45°С. Сухий залишок розчиняли в 1мл етанолу, переносили в ємкості Епіндорфа, залишали на добу при -24°С для виморожування поцукридів. Надосадову рідину відбирали та знову центрифугували. Попереднє очищення і концентрування фітогормонів проводили на пластинках із силікагелем марки "Silufol UV254" (Chemapol, Чехія) у суміші розчинників, застосовуваних послідовно: хлороформ, 12%-ний аміак, етилацетат: оцтова 7 92094 8 кислота (20:1). Очищені таким чином екстракти розділяли на пластинках з оксидом кремнію (фірми "Merck") для індольних сполук та на пластинках з оксидом алюмінію для цитокінінів (фірми "Merck"). Кількісне визначення фітогормонів проводили за допомогою скануючого спектроденситометра "Camag TLC Scanner" (Швейцарія). Попереднє очищення екстрактів для кількісного визначення вмісту гіберелінів проводили за методикою Г.С. Муромцева (Муромцев Г.С. Гиббереллины: Монография. - М.: Наука, 1984, 208стр.)з використанням етилацетату та цитратнофосфатної буферної системи (рн 2,5 та 7,0). Кількісне визначення вмісту гіберелініву зразку здійснювали фотоелектроколориметричним методом на КФК-3-1. Лінійна залежність між показником екстринкції та вмістом гіберелінів спостерігалася в діапазоні від 10 до 200нг гібереліну в 1мл. Проведений аналіз показав, що штам Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 є здатним до синтезу трьох класів фітогормонів: ауксинів, гіберелінів та цитокінінів. Так, при використанні хроматографічних способів у міцелії стрептоміцету та у культуральному середовищі було виявлено індолілоцтову кислоту (ІОК), зеатин (3), зеатинрибозид (ЗР) та ізопентиладенін (ІПА). Ауксини були представлені індолілоцтовою кислотою, синтез якої становив 1105,14-2094,56нг/г сухої біомаси міцелію. Цитокініни були представлені ізопентиладеніном (2182,04-837,82нг/г сухої біомаси міцелію), зеатином (759,67-168,87нг/г сухої біомаси міцелію) та зеатинрибозидом (906,61-4228,36нг/г сухої біомаси міцелію). Культура штаму також була здатною до утворення гіберелової кислоти у значних кількостях (Таблиця 1). Приклад 3 Біологічний тест на ріст регулюючу активність комплексу фітогормонів, одержаного із штаму Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 Проводили специфічне біотестування ріст регулюючої активності етанольних екстрактів міцелію штаму Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015. Так, досліджували вплив вказаного екстракту, узятого у концентрації 0,001мкг/мл, на приріст гіпокотилів паростків огірка сорту Роднічок. При цьому при використанні екстракту Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 приріст складав 27,7%, що було на 15,7% більше за стандартний еквівалент гіберелової кислоти (ГА3) у концентрації 10-5М, що свідчило про високу здатність одержаного фітогормонального комплексу до стимуляції росту рослин. Проводили також порівняння рістрегулюючої активності етанольних екстрактів штаму Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 зі стандартним препаратом Емістим С на різних культурах (ячмінь, кукурудза, озима пшениця). Дані представлені у Таблицях 2-4. Результати експерименту свідчать про те, що штам Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 продемонстрував високу здатність до синтезу комплексу фітогормонів. Препарат вказаного комплексу виявляє високу ріст регулюючу активність стосовно різних видів рослин. Таким чином, одержані дані підтримують можливість застосування вказаного штаму для синтезу комплексу фітогормонів для використання як регулятора росту та розвитку рослин. 9 92094 10 11 92094 12 13 Комп’ютерна верстка О. Рябко 92094 Підписне 14 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601