Спосіб стандартизації листя розмарину лікарського (rosmarinus officinalis l.) в багатокомпонентних рослинних сумішах

Реферат: Спосіб стандартизації листя розмарину лікарського (Rosmarinus officinalis L.) в багатокомпонентних рослинних сумішах з використанням методу ВЕРХ. Листя розмарину лікарського в рослинних сумішах, що містять в своєму складі листя розмарину, корені любистку, траву золототисячнику, корені солодки, плоди шипшини, плоди коріандру та шишки хмелю, визначають хроматографуванням в градієнтному режимі з використанням водноацетонітрильних рухомих фаз та оберненофазної колонки, з попередньою очисткою проби, з застосуванням твердофазної екстракції за наявністю та вмістом розмаринової кислоти, вміст якої повинен бути не менше ніж 1,5 % у перерахунку на висушену сировину. UA 75562 U (12) UA 75562 U UA 75562 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі фармації, зокрема до фітохімії, і може бути використана для стандартизації лікарської рослинної сировини та рослинних сумішей. Відомо, що препарати на основі біологічно активних речовин листя розмарина лікарського широко використовуються в медичній практиці як у вигляді монопрепаратів, так і у вигляді складових частин багатокомпонентних рослинних лікарських засобів [1, 2]. Даній лікарській сировині притаманний широкий спектр біологічної дії, зокрема жовчогінні, антиоксидантні, бактерицидні, спазмолітичні та тонізуючі властивості, тощо [3, 4, 5]. За літературними даними антиоксидантна дія листя розмарина лікарського пов'язана з високим вмістом похідних гідроксикоричної кислоти [4, 5]. Виходячи з того, що мажоритарним представником гідроксикоричних кислот в листі рослини є розмаринова кислота [6, 7], вважалось за доцільне дослідити можливість використання цієї сполуки в якості маркера для визначення розмарину в рослинних сумішах. За прототип нами взято методику кількісного визначення суми гідроксикоричних кислот в фармакопейній статті Європейської фармакопеї "Листя розмарину лікарського". В якій стандартизація сировини розмарину проводиться за кількісним вмістом суми гідроксикоричних кислот, в перерахунку на розмаринову кислоту, що проводиться за допомогою методу УФспектрофотометрії. В прототипі адсорбція досліджуваних розчинів після комплексоутворення вимірюється за довжини хвилі 505 нм [8]. Недоліком існуючого способу стандартизації сировини є те, що найближчий аналог передбачає стандартизацію моносировини листя розмарину лікарського. Об'єкт, який підлягає удосконаленню - спосіб ідентифікації та визначення вмісту біологічно активних речовин, що містяться в сировині листя розмарину лікарського в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять листя розмарину лікарського, корені любистку, трава золототисячнику, корені солодки голої, плоди шипшини, плоди коріандру та шишки хмелю. Зазначена лікарська сировина широко використовується для виготовлення полікомпонентних фітозасобів до складу яких входять листя розмарину лікарського, що представлені на фармацевтичному ринку України [1]. Як зазначалося, в сировині листя розмарину лікарського міститься біологічно активна речовина розмаринова кислота [6, 7]. Виходячи з цього, з застосуванням методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), нами було розроблено методику визначення розмаринової кислоти в сировині листя розмарину лікарського. З використанням розробленої методики було проаналізовано три серії сировини листя розмарину лікарського, зібраної в різних регіонах України. Згідно отриманих даних, в усіх пробах було ідентифіковано та кількісно визначено розмаринову кислоту. її вміст в досліджуваній сировині знаходився в межах від 1,938±0,084 % до 2,600±0,124 % у перерахунку на висушену сировину. Процес ідентифікації та кількісного визначення фенілпропаноїда розмаринової кислоти, як компонента сировини розмарину лікарського в багатокомпонентних рослинних сумішах, полягає в знаходженні умов для хроматографічного розділення розмаринової кислоти - як компонента листя розмарину лікарського та біологічно активних речовин інших рослин. В основу корисної моделі поставлено задачу - удосконалити ідентифікацію сировини листя розмарина лікарського в багатокомпонентних рослинних сумішах шляхом підтвердження наявності фенілпропаноїда розмаринової кислоти та визначення її вмісту, і, таким чином, забезпечити можливість стандартизації багатокомпонентних рослинних сумішей, до складу яких входить сировина листя розмарину лікарського. Поставлена задача вирішується тим, що нами запропонована ідентифікація та кількісне визначення розмаринової кислоти як компонента листя розмарину лікарського за допомогою методу ВЕРХ в присутності біологічно активних речовин інших рослин. Це досягається застосуванням твердофазної екстракції для очищення досліджуваних розчинів від заважаючих речовин. При цьому використовується градієнтне елюювання з використанням водноацетонітрильної рухомої фази з додаванням трифтороцтової кислоти, застосування якої дозволяє добитися розділення піків розмаринової кислоти листя розмарину лікарського та біологічно активних речовин інших рослин. Приклади конкретного виконання. Приклад 1: Приготування досліджуваного розчину: 1 г рослинної суміші наступного складу: листя розмарину лікарського - 1 г, коренів любистку - 1 г, трави золототисячнику - 1 г, коренів солодки голої - 1 г, плодів шипшини - 1 г, плодів коріандру - 1 г шишок хмелю - 1 г, вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього, екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну 1 UA 75562 U 5 10 колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean Іc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 15 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. По 5 мкл досліджуваного розчину та розчину достовірного зразку розмаринової кислоти поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі, обладнаному УФ-детектором в наступних умовах: колонка Synergy 4U Fusion RP, розміром 250 мм × 4,6 мм, розмір частинок 5 мкм; температура колонки - 35 °C; довжина хвилі детектування - 330 нм; швидкість потоку рухомої фази - 1мл/хв; рухома фаза: Час хроматографування (хв) 0-5 5-30 30-40 40-45 45-60 Елюент А, % 95 95→60 60→50 50 95 Елюент Б, % 5 5→40 40→50 50 5 15 20 25 30 35 40 45 50 Елюент А: 0,05 % розчин трифтороцтової кислоти в воді; Елюент Б: 0,05 % розчин трифтороцтової кислоти в ацетонітрилі. Вміст розмаринової кислоти в досліджуваній багатокомпонентній рослинній суміші (в %) обчислюється за наступною формулою: Апр * Сст * 100 * 100 * 100 ; Х А ст * mпр * 100  W  де Апр - площина піку розмаринової кислоти на хроматограмі досліджуваного розчину; Аст - площина піку розмаринової кислоти на хроматограмі розчину порівняння розмаринової кислоти; Сст - концентрація розмаринової кислоти в розчині порівняння розмаринової кислоти, г/мл; mпр - наважка досліджуваної суміші, г; W - втрата в масі при висушуванні досліджуваної рослинної суміші. Приготування розчину порівняння розмаринової кислоти: 0,025 г (точна наважка) достовірного зразку розмаринової кислоти вміщують в мірну колбу місткістю 50 мл, розчиняють в 30 мл 50 % етилового спирту, доводять до мітки тим же розчинником та перемішують. На хроматограмі досліджуваного розчину повинен бути присутній пік, час виходу якого відповідає часу виходу піку розмаринової кислоти на хроматограмі розчину порівняння розмаринової кислоти. На підставі експериментальних даних для сировини листя розмарину лікарського нами рекомендовано граничний вміст розмаринової кислоти не менше 1,5 % в перерахунку на висушену сировину. За вказаних вище умов було проаналізовано досліджувані розчини, приготовлені наступним чином: Модельна суміш без вмісту листя розмарину лікарського: 1 г рослинної суміші наступного складу: 1 г рослинної суміші наступного складу: листя розмарину лікарського - 1 г, коренів любистку - 1 г, трави золототисячнику - 1 г, коренів солодки голої - 1 г, плодів шипшини - 1 г, плодів коріандру - 1 г шишок хмелю - 1 г, вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean Іc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 15 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. 2 UA 75562 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Екстракт листя розмарину лікарського: 0,5 г листя розмарину лікарського вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього, екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 15 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean Іc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 15 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Хроматограми розчину порівняння розмаринової кислоти, екстракту листя розмарину лікарського, досліджуваного розчину та модельної суміші без вмісту листя розмарину лікарського представлені на фіг. 1, фіг. 2, фіг. 3 та фіг. 4 відповідно. За даних умов аналізу пік розмаринової кислоти має час виходу близько 26 хвилин (фіг. 1). На хроматограмах екстракту листя розмарину лікарського та досліджуваного розчину присутній пік розмаринової кислоти (фіг. 2, фіг. 3 відповідно), на хроматограмі модельної суміші без вмісту листя розмарину лікарського (фіг. 4) - даний пік відсутній. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у рослинній суміші, до складу якої входять листя розмарину лікарського, корені любистку, трава золототисячнику, корені солодки голої, плоди шипшини, плоди коріандру та шишки хмелю, присутність та вміст листя розмарину лікарського можна визначати за наявністю та кількісним вмістом фенілпропаноїду розмаринової кислоти. Винахід обумовлює можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту сировини листя розмарину лікарського, в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять листя розмарину лікарського, корені любистку, трава золототисячнику, корені солодки голої, плоди шипшини, плоди коріандру та шишки хмелю за наявністю та вмістом фенілпропаноїду розмаринової кислоти як фізіологічно активного компонента, що присутній в листі розмарину лікарського. Порівняння способів ідентифікації у прототипі та винаході наведено в таблиці. Перелік посилань: 1) Компендиум 2009 - Лекарственные препараты / под ред. В.Н. Коваленко, А.П. Вікторова. К.: Морион, 2009.-2224 с. 2) Довідник лікарських засобів, зареєстрованих на Україні станом на 01.01.2011 // www.Pharma-center.kiev.ua. 3) Лікарські рослини: Енциклопедичний довідник / Відп. ред. Гродзінський А.М. - К.: Головна ред. УРЕ, 1989.-544 с. 4) Oluwatuyi M., Kaatz G.; Gibbons S. Antibacterial and resistance modifying activity of Rosmarinus officinalis / Phytochemistry.-2004. - Vol. 65, N. 24. - P. 3249-3254. 5) Genena A., Hense H., Smania Junior A. de Souza S. Rosemary (Rosmarinus officinalis) - a study of the composition, antioxidant and antimicrobial activities of extracts obtained with supercritical carbon dioxide / Cienc. Tecnol. Aliment.-2008. - N 28(2). - P. 463-469. 6) Yesil-Celiktas O., Nartop P., Gurel A., Bedir E., Vardar-Sukan F. Determination of phenolic content and antioxidant activity of extracts obtained from Rosmarinus officinalis' calli // J. Plant Physiol.-2007. - N. 164(11). - P. 1536-1542. 7) Mulinacci N., Innocenti M., Bellumori M., Giaccherini C, Martini V., Michelozzi M. Storage method, drying processes and extraction procedures strongly affect the phenolic fraction of rosemary leaves: an HPLC/DAD/MS study/Talanta.-2011. - N. 85(1). - P. 167-176. 8) European Pharmacopoeia.-6 th ed. - Strasbourg: European Department for the Quality of Medicines, 2008. - Vol. 2.-3308 p. 3 UA 75562 U Таблиця Характеристика способів стандартизації листя розмарину лікарського № п/п 1 2 Об'єкт Компонент Об'єкт дослідження Сума гідроксикоричних Найближчий кислот в аналог перерахунку на розмаринову кислоту Моносировина листя розмарину лікарського Корисна модель Багатокомпонентні рослинні суміші, до складу яких входять; листя розмарину, корені любистку, трава золототисячнику, корені солодки, плоди шипшини, плоди коріандру, шишки хмелю Розмаринова кислота Метод визначення Метод УФ-спектрофотометрії Можливість кількісної стандартизації моносировини листя розмарину лікарського; неспецифічне визначення Метод ВЕРХ Можливість кількісної стандартизації сировини та багатокомпонентних рослинних сумішей листя розмарину; специфічне визначення ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб стандартизації листя розмарину лікарського (Rosmarinus officinalis L.) в багатокомпонентних рослинних сумішах з використанням методу ВЕРХ (високоефективної рідинної хроматографії), який відрізняється тим, що листя розмарину лікарського в рослинних сумішах, що містять в своєму складі листя розмарину, корені любистку, траву золототисячнику, корені солодки, плоди шипшини, плоди коріандру та шишки хмелю, визначають хроматографуванням в градієнтному режимі з використанням водно-ацетонітрильних рухомих фаз та оберненофазної колонки, з попередньою очисткою проби, з застосуванням твердофазної екстракції за наявністю та вмістом розмаринової кислоти, вміст якої повинен бути не менше ніж 1,5 % у перерахунку на висушену сировину. 4 UA 75562 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5