Спосіб стандартизації меліси лікарської в багатокомпонентних рослинних сумішах

Спосіб стандартизації меліси лікарської в багатокомпонентних рослинних сумішах, який відрі 3 53863 4 Таблиця 1 Вміст розмаринової кислоти в сировині меліси лікарської Сировина трави меліси лікарської, регіон та рік заготівлі, n=5 Київська область, 2008 р. Одеська область, 2008 р. Республіка Крим, 2008 р. Згідно даних, представлених в табл.1, вміст розмаринової кислоти в досліджуваній сировині лежить в межах від 1,4634±0,107% до 1,931±0,110% в перерахунку на висушену сировину. Процес ідентифікації та кількісного визначення розмаринової кислоти як компонента сировини меліси лікарської в багатокомпонентних рослинних сумішах полягає в знаходженні умов для хроматографічного розділення розмаринової кислоти як компонента меліси лікарської та біологічно активних речовин інших рослин. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити ідентифікацію сировини меліси лікарської (листя, трава) в багатокомпонентних рослинних сумішах шляхом підтвердження наявності розмаринової кислоти та визначення її вмісту, і таким чином забезпечити можливість стандартизації багатокомпонентних рослинних сумішей, до складу яких входить сировина меліси лікарської. Поставлена задача вирішується тим, що запропонована ідентифікація та кількісне визначення розмаринової кислоти як компонента меліси лікарської за допомогою методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) в присутності біологічно активних речовин інших рослин. Це досягається застосуванням твердофазної екстракції для очищення досліджуваних розчинів від заважаючих речовин. При цьому використовується рухома фаза наступного складу: ацетонітрил вода - оцтова кислота (17:80:3), застосування якої дозволяє добитися розділення піків розмаринової кислоти меліси лікарської та біологічно активних речовин інших рослин. Приклад 1: 7г (точна наважка) подрібненої суміші лікарських рослин наступного складу: трави меліси лікарської - 1г, плодів глоду колючого - 1г, трави кропиви собачої - 1г, шишок хмелю - 1г, зерен вівса посівного - 1г, плодів коріандру - 1г, трави буркуну лікарського - 1г вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 100мл суміші метанол - вода у співвідношенні 70:30 та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 60 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100мл, доводять до мітки сумішшю метанол - вода (70:30) та перемішують. До 5мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація метанолу становила 20%, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5мл) та промитий 10мл води патрон для твердо-фазної екстракції Вміст розмаринової кислоти (%) в перерахунку x на висушену сировину, x 1,648±0,115 1,4634±0,107 1,931±0,110 "Superclean lc-18 SPE Tubes 1 ml" виробництва фірми Supeico (США). Патрон промивають 30мл 20% розчину метанолу. Отриманий розчин випаровують у вакуумі досуха та сухий залишок розчиняють в 5мл 70% метанолу, фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45мкм. По 5мкл досліджуваного розчину та розчину стандарту розмаринової кислоти поперемінне хроматографують в наступних умовах: колонка С18 Х-Тегга, розміром 250мм х 4,6мм, розмір часток 5мкм; рухома фаза: ацетонітрил - вода - оцтова кислота (17:80:3); температура колонки 30°С; довжина хвилі детектування 330нм; швидкість потоку рухомої фази 1мл/хв. Вміст розмаринової кислоти в досліджуваній багатокомпонентній рослинній суміші (в %) обчислюється за наступною формулою: А пр * С ст * 100 * 100 * 100 X ; А ст * mпр * (100 W ) де Апр - площина піку розмаринової кислоти на хроматограмі досліджуваного розчину; Aст - площина піку розмаринової кислоти на хроматограмі стандартного розчину розмаринової кислоти; Сст - концентрація розмаринової кислоти в стандартному розчині розмаринової кислоти, г/мл; mпр - наважка досліджуваної сировини, г; W - втрата в масі при висушуванні досліджуваної рослинної суміші. Приготування стандартного розчину розмаринової кислоти: 0,010г достовірного стандарту розмаринової кислоти вміщують в мірну колбу місткістю 25мл, розчиняють в 15мл суміші метанол-вода (70:30), доводять тією ж сумішшю до мітки та перемішують. 1мл отриманого розчину вміщують в мірну колбу місткістю 50мл, доводять до мітки сумішшю метанол-вода (70:30) та перемішують. На хроматограмі досліджуваного розчину повинен бути присутній пік, час виходу якого відповідає часу виходу піку розмаринової кислоти на хроматограмі стандартного розчину розмаринової кислоти. На підставі експериментальних даних для сировини трави меліси лікарської нами рекомендований наступний граничний вміст розмаринової кислоти: не менше 1,2% в перерахунку на висушену сировину. За вказаних вище умов було проаналізовано досліджувані розчини, приготовлені наступним чином: Модельна суміш без вмісту меліси лікарської. 6г (точна наважка) подрібненої суміші лікарсь 5 53863 ких рослин наступного складу: плодів глоду колючого - 1г, трави кропиви собачої - 1г, шишок хмелю - 1г, зерен вівса посівного - 1г, плодів коріандру 1г, трави буркуну лікарського - 1г вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 100мл суміші метанол - вода (70:30) та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 60 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100мл, доводять до мітки сумішшю метанол - вода (70:30) та перемішують. До 5мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація метанолу становила 20%, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5мл) та промитий 10мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 1 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 30мл 20% розчином метанолу. Отриманий розчин випаровують у вакуумі досуха та сухий залишок розчиняють в 5мл 70% метанолу, фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45мкм. Екстракт трави меліси лікарської. 1г трави меліси лікарської вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 100мл суміші метанол - вода (70:30) та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 60 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100мл, доводять до мітки сумішшю метанол - вода (70:30) та перемішують. До 5мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація метанолу становила 20%, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5мл) та промитий 10мл води патрон для 6 твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 1 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 30мл 20% розчину метанолу. Отриманий розчин випаровують у вакуумі досуха та сухий залишок розчиняють в 5мл 70% метанолу, фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45мкм. Хроматограми екстракту меліси лікарської, досліджуваного розчину та модельної суміші без вмісту меліси лікарської представлені на фіг.1, 2 та 3 відповідно. На хроматограмах екстракту меліси лікарської та досліджуваного розчину присутній пік цикорієвої кислоти (фіг.1 та фіг.2 відповідно), на хроматограмі модельної суміші без вмісту меліси лікарської (фіг.3) - даний пік відсутній. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у рослинній суміші, до складу якої входять трава меліси лікарської, плоди глоду колючого, трава кропиви собачої, шишки хмелю, зерна вівса посівного, плоди коріандру та трава буркуну лікарського, присутність та вміст меліси лікарської можна визначати за наявністю та кількісним вмістом розмаринової кислоти. Винахід обумовлює можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту сировини меліси лікарської в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входить меліса лікарська, плоди глоду колючого, трава кропиви собачої, шишки хмелю, зерна вівса посівного, плоди коріандру та трава буркуну лікарського за наявністю та вмістом розмаринової кислоти як фізіологічно активного компонента, що присутній в траві та листях меліси лікарської. Порівняння способів ідентифікації у прототипі та винаході наведено в таблиці 2. Таблиця 2 Характеристика способів стандартизації меліси лікарської № п/п 1 2 Об'єкт Найближчий аналог Корисна модель Компонент Об'єкти дослідження Сума оксикоМоносировина меліси лікарської ричних кислот Розмаринова кислота Багатокомпонентні рослинні суміші, до складу яких входять: трава меліси лікарської, плоди глоду колючого, трава кропиви собачої, шишки хмелю, зерна вівса посівного, плоди коріандру та трава буркуну лікарського Джерела інформації: 1) Зузук Б.М., Куцик Р.В. Мелисса лекарственная (Melissa Officinalis L.)// Провизор. - 2002. - № 1. - С. 36-39. 2) Лавренов В.К., Лавренова Г.В. Современная энциклопедия лекарственных растений. - М.: ОЛМА Медиа Групп, 2007. - 272 с. 3) Chlabicz J., Galasinski W. The components of Метод визначення Метод УФспектрофотометрії Можливість кількісної стандартизації моно сировини меліси лікарської; неспецифічне визначення Метод ВЕРХ Можливість кількісної стандартизації сировини та багатокомпонентних рослинних сумішей меліси лікарської; специфічне визначення Melissa officinalis L. that influence protein biosynthesis in-vitro // J. Pharm. Pharmacol. - 1986 Vol. 38, №11 - P. 791-794. 4) Авдеева Е.В., Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Болтабекова З.В. Качественный и количественный анализ сырья и настойки Melissa officinalis L.// Растительные ресурсы. - 1999. - Т. 35. - Вып. 3. С.116-121. 7 53863 5) Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 1. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К: Моріон, 2007. - 1128 с. Комп’ютерна верстка А. Крулевський 8 6) Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 2. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К: Моріон, 2007. - 1126 с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601