Спосіб стандартизації листя кропиви дводомної (urtica dioica l.) в багатокомпонентних рослинних сумішах

Спосіб стандартизації листя кропиви дводомної (Urtica dioica L.) в багатокомпонентних рослин 3 рема, були проаналізовані наступні препарати кропиви дводомної: листя кропиви в пачках по 50 г (Виробники: ЗАТ «Ліктрави» (серії: 10111, 141010), ЗАТ ФФ «Віола» (серія 101210) та КП «Фармацевтична фабрика» (серія 10610)); Кропиви листя в 65078 4 фільтр-пакетах по 1,5 г (Виробники: ЗАТ «Ліктрави» (серія 31110), ЗАТ ФФ «Віола» (серія 050810)). Вміст скополетину в листі кропиви дводомної різних вітчизняних виробників представлений в таблиці 1. Таблиця 1 Вміст скополетину в досліджуваних препаратах листя кропиви дводомної № п/п 1 2 3 4 5 6 Препарат листя кропиви Вміст скополетину у (в %) в перерахунку Виробник, № серії дводомної на висушену сировину Кропиви листя в пачці по ЗАТ «Ліктрави», серія 10111 0,2470±0,0118 50 г Кропиви листя в пачці по ЗАТ «Ліктрави», серія 141010 0,2333±0,0123 50 г Кропиви листя в пачці по ЗАТ ФФ «Віола», серія 101210 0,1757±0,0093 50 г Кропиви листя в пачці по КП «Фармацевтична фабрика», 0,2361±0,0108 50 г серія 10610 Кропиви листя в фільтрЗАТ «Ліктрави», серія 31110 0,2796±0,0139 пакетах по 1,5 г Кропиви листя в фільтрЗАТ ФФ «Віола», серія 050810 0,3464±0,01631 пакетах по 1,5 г Згідно з даними, представленими в таблиці, в усіх пробах був ідентифікований та кількісно визначений кумарин скополетин. Вміст скополетину в досліджуваній сировині лежить в межах від 0,1757±0,0093 % до 0,3464±0,01631 % в перерахунку на висушену сировину. Процес ідентифікації та кількісного визначення скополетину як компонента сировини листя кропиви дводомної в багатокомпонентних рослинних сумішах полягає в знаходженні умов для хроматографічного розділення скополетину як компонента кропиви дводомної та біологічно активних речовин інших рослин. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити ідентифікацію сировини листя кропиви дводомної в багатокомпонентних рослинних сумішах шляхом підтвердження наявності скополетину і визначення його вмісту. Таким чином, забезпечується можливість стандартизації багатокомпонентних рослинних сумішей, до складу яких входить сировина листя кропиви дводомної. Поставлена задача вирішується тим, що запропонована ідентифікація та кількісне визначення скополетину як компонента листя кропиви за допомогою методу ВЕРХ в присутності біологічно активних речовин інших рослин. Це досягається застосуванням твердофазної екстракції для очищення досліджуваних розчинів від заважаючих речовин. При цьому використовується градієнтне елюювання з використанням водноацетонітрильної рухомої фази, застосування якої дозволяє добитися розділення піків скополетину кропиви дводомної та біологічно активних речовин інших рослин. Приклад 1: Приготування досліджуваного розчину: 5 г (точна наважка) подрібненої суміші лікарських рослин наступного складу: листя кропиви дводомної - 1 г, плодів глоду колючого - 1 г, кореневищ лепехи - 1 г, трави споришу - 1 г, кори крушини - 1 г, квіток нагідок лікарських - 1 г, плодів шипшини - 1 г, коренів та кореневищ валеріани лікарської - 1 г, кори крушини - 1 г, насіння льону 1 г вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього, екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витяжок до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 10 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 25 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. По 5 мкл досліджуваного розчину та розчину стандарту скополетину поперемінно хроматографують в наступних умовах: колонка С18 Х-Тегга, розміром 250 мм × 4,6 мм, розмір частинок 5 мкм; температура колонки - 35 °С; довжина хвилі детектування - 344 нм; швидкість потоку рухомої фази 1 мл/хв; об'єм проби, що вводився, - 5 мкл; рухома фаза: 0-1 хв: ізократичне елюювання 100 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об./об.); 1-26 хв: градієнтне елюювання від 100 % до 70 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об./об.) та від 0 % до 30 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об./об.); 26-30 хв: градієнтне елюювання від 70 %до 20 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об./об.) та від 30 % до 80 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об./об.); 5 30-35 хв: ізократичне елюювання 20 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об./об.) та 80 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об./об.); 35-51 хв: ізократичне елюювання 100 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об./об.). Вміст скополетину в досліджуваній багатокомпонентній рослинній суміші (в %) обчислюється за наступною формулою: Апр * Сст * 100 * 100 * 100 X А ст * mпр * 100  W  ; де Апр - площина піку скополетину на хроматограмі досліджуваного розчину; Aст - площина піку скополетину на хроматограмі стандартного розчину скополетину; Сст - концентрація скополетину в стандартному розчині, г/мл; mпр - наважка досліджуваної суміші, г; W - втрата в масі при висушуванні досліджуваної рослинної суміші. Приготування стандартного розчину: 0,01 г (точна наважка) достовірного стандарту скополетину вміщують в мірну колбу місткістю 25 мл, розчиняють в 15 мл метанолу, доводять метанолом до мітки та перемішують. 1 мл отриманого розчину вміщують в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять до мітки метанолом та перемішують. На хроматограмі досліджуваного розчину повинний бути присутній пік, час виходу якого відповідає часу виходу піку скополетину на хроматограмі стандартного розчину. На підставі експериментальних даних для сировини листя кропиви дводомної нами рекомендовано граничний вміст для скополетину - не менше 0,15 % у перерахунку на висушену сировину. За вказаних вище умов було проаналізовано досліджувані розчини, приготовлені наступним чином: Модельна суміш без вмісту листя кропиви. 5 г (точна наважка) подрібненої суміші лікарських рослин наступного складу: плодів глоду колючого - 1 г, кореневищ лепехи - 1 г, трави споришу 1 г, кори крушини - 1 г, квіток нагідок лікарських - 1 г, плодів шипшини - 1 г, коренів та кореневищ валеріани лікарської - 1 г, кори крушини - 1 г, насіння льону - 1 г вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витяжок до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 10 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції "Superclean lc 65078 6 18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 25 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Екстракт листя кропиви. 1 г (точна наважка) подрібненої сировини листя кропиви дводомної вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 50 мл 50 % етилового спирту та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 45 хвилин. Після цього, екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл. Екстракцію проводять ще раз, та доводять об'єм витягів до 100 мл 50 % етиловим спиртом. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 10 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції "Superclean lc18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 25 % етилового спирту. Пробу із патрона вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Хроматограми стандартного розчину, екстракту листя кропиви, досліджуваного розчину та модельної суміші без вмісту листя кропиви представлені на фіг. 1, фіг. 2, фіг. 3 та фіг. 4 відповідно. За даних умов аналізу пік скополетину має час виходу біля 16,7 хвилин (фіг. 1). На хроматограмах екстракту листя кропиви та досліджуваного розчину присутній пік скополетину (фіг. 2 та фіг. 3 відповідно), на хроматограмі модельної суміші без вмісту листя кропиви (фіг. 4) даний пік відсутній. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у рослинній суміші, до складу якої входять листя кропиви дводомної, плоди глоду колючого, трава споришу, квітки нагідок лікарських, плоди шипшини, корені та кореневища валеріани лікарської, кора крушини, кореневища лепехи та насіння льону, присутність та вміст листя кропиви дводомної можна визначати за наявністю та кількісним вмістом кумарину скополетину. Корисна модель дає можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту сировини листя кропиви дводомної в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входять листя кропиви дводомної, плоди глоду колючого, трава споришу, квітки нагідок лікарських, плоди шипшини, корені та кореневища валеріани лікарської, кора крушини, кореневища лепехи та насіння льону за наявністю та вмістом скополетину як фізіологічно активного компонента, що присутній в листі кропиви дводомної. Порівняння способів ідентифікації у прототипі та корисній моделі наведено в таблиці 2. 7 65078 8 Таблиця 2 Характеристика способів стандартизації листя кропиви дводомної № п/п Об'єкт Компонент хлоровенова Найближчий кислота, кофе1 аналог їл-яблучна кислота 2 Корисна модель Скополетин Об'єкти дослідження Метод визначення Моносировина листя кропиви дводомної Метод ВЕРХ. Можливість кількісної стандартизації моно-сировини листя кропиви дводомної Багатокомпонентні рослинні суміші, до Метод ВЕРХ. складу яких входять: листя кропиви дводоМожливість кількісної стандамної, плоди глоду колючого, трава споришу, ртизації сировини та багатоквітки нагідок лікарських, плоди шипшини, компонентних рослинних сукорені та кореневища валеріани лікарської, мішей листя кропиви кора крушини, кореневища лепехи та насіндводомної ня льону Перелік посилань: 1) Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 1. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К: Моріон, 2007. - 1128 с. 2) Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 2. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К: Моріон, 2007. - 1126 с. 3) Лікарські рослини: Енциклопедичний довідник / Відп. ред. Гродзінський А.М. - К.: Головна ред. УРЕ, 1989. - 544 с. 4) Gulcin I., Küfrevioglu О., Oktay M., Büyükokuroglu M. Antioxidant, antimicrobial, antiulcer and analgesic activities of nettle (Urtica dioica L.) // J. Ethnopharmacol. - 2004. - Vol. 90(2-3). P. 205-215. 5) Terzi A, Yildiz F, Çoban S, Taşkin A, Bitiren M, Aksoy N. Protective effect of Urtica dioica on liver injury induced by hepatic ischemia reperfusion injury in rats // Düzce Med J. - 2010. Vol. 12. P. 43-47. 6) Kandis H, Karapolat S, Yildirim U, Saritas A, Gezer S, Memisogullari R. Effects of Urtica dioica on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats//Clinics (Sao Paulo). -2010. - Vol. 65 (12). - P. 1357-1361. 7) Zhang W., Lee J., Kim Y., Kim I., Park J., Myung C. Amelioration of insulin resistance by scopoletin in high-glucose-induced, insulin-resistant HepG2 cells // Horm. Metab. Res. -2010. - Vol. 42 (13). - P. 930-935. 8) Державна Фармакопея України / ДП «Науково-експертний фармакопейний центр». - 1-е вид. - Доповнення 3. -X.: ДП «Науково-експертний фармакопейний центр», 2009. - 280 с. 9) Растительные лекарственные средства / Максютина Н.П., Комиссаренко Н.Ф., Прокопенко А.П., Погодина Л.И., Липкан Г.Н. - К.: Здоров'я, 1985. - 280 с. 9 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 65078 Підписне 10 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601