Спосіб стандартизації квіток нагідок лікарських (calendula officinalis l.) в багатокомпонентних рослинних сумішах

Спосіб стандартизації квіток нагідок лікарських (Calendula officinalis L.) в багатокомпонентних 3 складу яких входить сировина квіток нагідок лікарських. Поставлена задача вирішується тим, що запропонована ідентифікація та кількісне визначення ізорамнетин-3-рутинозида як компонента квіток нагідок лікарських за допомогою методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) в присутності БАР інших рослин. Це досягається застосуванням твердофазної екстракції для очищення досліджуваних розчинів від заважаючих речовин. При цьому використовується градієнтне хроматографування з застосуванням водноацетонітрильної рухомої фази з додаванням ортофосфорної кислоти, застосування якої дозволяє добитися розділення піку ізорамнетин-3рутинозида квіток нагідок лікарських та БАР інших рослин. Попередньо була перевірена можливість стандартизації квіток нагідок лікарських за ізорамнетин-3-рутинозидом в двохкомпонентних сумішах з наступною рослинною сировиною: плодами шипшини, плодами та квітками глоду колючого, шишками хмелю, листям м'яти перцевої, листям подорожника великого та квітками ромашки аптечної. Приклад 1: Приготування екстракту квіток нагідок лікарських. 1 г подрібнених квіток нагідок лікарських (сито диаметр отворів 2 мм) вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 100 мл суміші етанол - вода (50:50) та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 60 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл, доводять до мітки сумішшю етанол - вода (50:50) та перемішують. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація етанолу становила 10 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердофазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 1 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 10 % розчину етанолу. Потім досліджувані компоненти вимивають з патрону 4 мл метилового спирту. Метанольний витяг кількісно переносять в мірну колбу об'ємом 5 мл, доводять метанолом до мітки та перемішують, фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Приготування моноекстракту досліджуваної сировини (плодів шипшини, плодів та квіток глоду колючого, шишок хмелю, листя м'яти перцевої, листя подорожника великого та квіток ромашки аптечної). 1 г подрібненої рослинної сировини (сито: діаметр отворів 2 мм) вносять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 100 мл суміші етанол - вода (50:50) та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 60 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл, доводять до мітки сумішшю етанол - вода (50:50) та перемішують. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація етанолу становила 10 %, та пропускають отриманий зразок че 56796 4 рез попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 1 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 10 % розчину етанолу. Потім досліджувані компоненти вимивають з патрону 4 мл метилового спирту. Метанольний витяг кількісно переносять в мірну колбу об'ємом 5 мл, доводять метанолом до мітки та перемішують, фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Приготування двохкомпонентних екстрактів нагідок лікарських. По 1 г подрібнених квіток нагідок та іншої досліджуваної сировини (плодів шипшини, плодів та квіток глоду колючого, шишок хмелю, листя м'яти перцевої, листя подорожника великого та квіток ромашки аптечної) лікарських вностять в конічну колбу, обладнану зворотним холодильником, додають 100 мл суміші етанол - вода (50:50) та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 60 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 100 мл, доводять до мітки сумішшю етанол - вода (50:50) та перемішують. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація етанолу становила 10 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 1 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 10 % розчину етанолу. Потім досліджувані компоненти вимивають з патрону 4 мл метилового спирту. Метанольний витяг кількісно переносять в мірну колбу об'ємом 5 мл, доводять метанолом до мітки та перемішують, фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. По 5 мкл екстракту квіток нагідок лікарських, кожного з екстрактів моносировини (плодів шипшини, плодів та квіток глоду колючого, шишок хмелю, листя м'яти перцевої, листя подорожника великого та квіток ромашки аптечної) та двохкомпонентних екстрактів квіток нагідок лікарських поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі, обладнаному УФ-деткором в наступних умовах: колонка С18 Symmetry, розміром 250 мм х 4,6 мм, розмір частинок 5 мкм; температура колонки 35 °С; довжина хвилі детектування 350 нм; об'єм проби, що вводиться - 5мкл; швидкість потоку рухомої фази 1 мл/хв; рухома фаза: 0-25 хв: градієнтне елюювання від 95 % до 92,5 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та від 5 % до 7,5 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 25-45 хв: градієнтне елюювання від 92,5 % до 85 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та від 7,5 % до 15 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 45-50 хв: градієнтне елюювання від 85 % до 0 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та від 15 % до 100 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 50-55 хв: ізократичне елюювання 100 % суміші ацетонітрил 5 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 55,01-70 хв: ізократичне елюювання від 95 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та від 5 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об). На малюнках 1-7 представлені хроматограми моноекстрактів кожної з зазначеної вище сировини (А), двохкомпонентних екстрактів квіток нагідок лікарських з кожною з зазначеною вище сировиною (Б) та екстрактів квіток нагідок (В). Як видно на малюнках 1-7 ізорамнетин-3-рутинозид (пік з часом утримування 32,18 хв) ідентифікований лише в квітках нагідок лікарських і жоден компонент плодів шипшини, плодів та квіток глоду колючого, шишок хмелю, листя м'яти перцевої, листя подорожника великого та квіток ромашки аптечної не заважає його визначенню в зазначених хроматографічних умовах. Для підтвердження валідності розробленої методики було виготовлено багатокомпонентний рослинний екстракт, до складу якого входять квітки нагідок лікарських, плоди шипшини, плоди та квітки глоду колючого, шишки хмелю, листя м'яти перцевої, листя подорожника великого та квітки ромашки аптечної, а також екстракт, аналогічний за складом попередньому, але без додавання квіток нагідок лікарських. Зазначені вище екстракти були проаналізовані за наведених раніше умов. Приклад 2: Приготування багатокомпонентного рослинного екстракту з квітками нагідок лікарських. 8 г (точна наважка) подрібненої суміші лікарських рослин наступного складу: квіток нагідок лікарських - 1 г, плодів шипшини - 1 г, плодів глоду колючого - 1г, квіток глоду колючого - 1 г, шишок хмелю - 1 г, листя м'яти перцевої - 1 г, листя подорожника великого - 1 г та квіток ромашки аптечної - 1 г вносять в конічну колбу об'ємом 500 мл, обладнану зворотним холодильником, додають 200 мл суміші етанол-вода у співвідношенні 50:50 та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 60 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 200 мл, доводять до мітки сумішшю етанол - вода (50:50) та перемішують. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація етанолу становила 10 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 1 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 10 % розчину етанолу. Потім досліджувані компоненти вимивають з патрону 4 мл метилового спирту. Метанольний витяг кількісно переносять в мірну колбу об'ємом 5 мл, доводять метанолом до мітки та перемішують, фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Приготування багатокомпонентного рослинного екстракту без вмісту квіток нагідок лікарських. 7 г (точна наважка) подрібненої суміші лікарських рослин наступного складу: плодів шипшини - 1 г, плодів глоду колючого - 1 г, квіток глоду колючо 56796 6 го - 1 г, шишок хмелю - 1 г, листя м'яти перцевої 1 г, листя подорожника великого - 1 г та квіток ромашки аптечної - 1 г вносять в конічну колбу об'ємом 500 мл, обладнану зворотним холодильником, додають 200 мл суміші етанол-вода у співвідношенні 50:50 та витримують на киплячому водяному огрівнику протягом 60 хвилин. Після цього екстракт охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через фільтр "червона стрічка" в мірну колбу об'ємом 200 мл, доводять до мітки сумішшю етанол - вода (50:50) та перемішують. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація етанолу становила 10 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean Іc-18 SPE Tubes 1 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 10 % розчину етанолу. Потім досліджувані компоненти вимивають з патрону 4 мл метилового спирту. Метанольний витяг кількісно переносять в мірну колбу об'ємом 5 мл, доводять метанолом до мітки та перемішують, фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. По 5 мкл багатокомпонентної рослинного екстракту з квітками нагідок лікарських, багатокомпонентного рослинного екстракту без вмісту квіток нагідок лікарських та екстракту квіток нагідок лікарських хроматографують на рідинному хроматографі, обладнаному УФ-детектором в наступних умовах: колонка С18 Symmetry, розміром 250 мм х 4,6 мм, розмір частинок 5 мкм; температура колонки 35 °С; довжина хвилі детектування 350 нм; об'єм проби, що вводиться - 5мкл; швидкість потоку рухомої фази 1 мл/хв; рухома фаза: 0-25 хв: градієнтне елюювання від 95 % до 92,5 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та від 5 % до 7,5 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 25-45 хв: градієнтне елюювання від 92,5 % до 85 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та від 7,5 % до 15 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 45-50 хв: градієнтне елюювання від 85 % до 0 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та від 15 % до 100 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 50-55 хв: ізократичне елюювання 100 % суміші ацетонітрил 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об); 55,01-70 хв: ізократичне елюювання від 95 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (10:90) (об/об) та від 5 % суміші ацетонітрил - 5 % розчин ортофосфорної кислоти (90:10) (об/об). На фіг. 8 представлені хроматограми багатокомпонентного рослинного екстракту без вмісту квіток нагідок лікарських (А), багатокомпонентного рослинного екстракту з квітками нагідок лікарських (Б), та екстракту квіток нагідок лікарських (В). На хроматограмах Б і В має місце пік ізорамнетин-3рутинозиду, тоді як на хроматограмі А даний пік відсутній. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у рослинній суміші, до складу якої входять 7 56796 квітки нагідок лікарських, плоди шипшини, плоди та квітки глоду колючого, шишки хмелю, листя м'яти перцевої, листя подорожника великого та квітки ромашки аптечної, присутність та вміст квіток нагідок лікарських можна визначати за наявністю та кількісним вмістом ізорамнетин-3рутинозиду. Корисна модель обумовлює можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту сировини квіток нагідок лікарських в багатокомпонентних 8 рослинних сумішах, до складу яких входять квітки нагідок лікарських, плоди шипшини, плоди та квітки глоду колючого, шишки хмелю, листя м'яти перцевої, листя подорожника великого та квітки ромашки аптечної за наявністю та вмістом ізорамнетин-3-рутинозиду як фізіологічно активного компонента, що присутній в квітках нагідок лікарських. Порівняння способів ідентифікації у прототипі та корисній моделі наведено в таблиці. Таблиця Характеристика способів стандартизації квіток нагідок лікарських № п/п 1 2 Об'єкт Компонент Об'єкти дослідження Метод визначення Метод УФспектрофотометрії Сума флавоноїНайближчий Моносировина квіток нагідок лі- Можливість кількісної стандів в перерахунаналог карських дартизації моносировини ку на гіперозид квіток нагідок лікарських; неспецифічне визначення Багатокомпонентні рослинні суМетод ВЕРХ міші, до складу яких входять: квітМожливість кількісної станки нагідок лікарських, плоди шипдартизації сировини та баКорисна мо- Ізорамнетин-3шини, плоди та квітки глоду гатокомпонентних рослиндель рутинозид колючого, шишки хмелю, листя них сумішей квіток нагідок м'яти перцевої, листя подорожнилікарських; специфічне вика великого та квітки ромашки значення аптечної Перелік посилань: 1) Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 1. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К.: Моріон, 2007. - 1128 с. 2) Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 2. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К.: Моріон, 2007. - 1126 с. 3) Зузук Б.М., Куцик Р.В., Калугина С.М., Гудивок Я.С., Куровець Л.М. Календула лекарственная (Calendula officinalis L). Аналитический обзор Ч. 1 // Провизор. - 2001. - №4. - С. 29-31. 4) Зузук Б.М., Куцик Р.В., Калугина С.М., Гудивок Я.С., Куровець Л.М. Календула лекарственная (Calendula officinalis L). Аналитический обзор Ч. 2 // Провизор. - 2001. - №5. - С. 29-31. 5) Ukiya M., Akihisa Т., Yasukava К., Tokuda H., Suzuki Т., Kimura Y., Antiinflammatory, anti-tumorpromoting and cytotoxic activies of constituents of Marigold (Calendula officinalis) flowers // J. Nat. Prod. -2006. - Vol. 69. - P. 1692-1696. 6) Vidal-Ollivier E. Flavonol glycosides from Calendula officinalis flowers // Planta Med. - 1989. Vol. 55. - P. 73. 7) Куркин В.А., Шарова О.В. Флавоноиды из цветков календулы. Химия природных соединений. - 2007. - №2. - С. 179-180. 8) European Pharmacopoeia. 6th ed. Strasbourg: Council of Europe, 2007. - P. 1169-1170. 9 56796 10 11 56796 12 13 56796 14 15 56796 16 17 56796 18 19 56796 20 21 56796 22 23 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 56796 Підписне 24 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601