Штам бактерій bradyrhizobium japonicum рс08 (в-7399) для одержання бактеріального добрива під сою

Реферат: Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum РС08 (В-7399) для одержання бактеріального добрива під сою. UA 78755 U (12) UA 78755 U UA 78755 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології і сільськогосподарської мікробіології і являє собою новий штам бульбочкових бактерій, специфічний для районованих сортів сої. Штам забезпечує ефективний симбіоз із рослиною-господарем і може бути використаний для виробництва бактеріального добрива під сою. Селекція нових сортів сої, зниження з часом активності у штамів, що тривалий час зберігаються, обумовлює постійну потребу у отриманні нових штамів бульбочкових бактерій, застосування яких сприятиме максимальному проявленню азотофіксувального потенціалу бобово-ризобіальних систем. Не зважаючи на те, що нові штами бульбочкових бактерій, виділені із природних біоценозів, за азотфіксувальною активністю істотно не перевершують ті, що вже використовуються у виробництві, або зберігаються у колекційних музейних фондах, доцільність їх використання не викликає сумніву. Оскільки вони є більш пристосованими до ґрунтово-кліматичних умов зони походження і конкурентоздатними за відношенням до місцевої мікробіоти. Протягом тривалого часу для виробництва бактеріальних азотфіксувальних препаратів під сою використовували ряд штамів бульбочкових бактерій В. japonicum аналітичної селекції 6396 [А.с. № 1287590), який забезпечував прибавку зерна 0,8-5,6 ц/га (8,3-29,1 %], 629а [А.с. № 939547, СССР], 24105 [А.с. № 1496209, прибавка зерна сої 0,6-2,3 ц/га порівняно до штаму 634б], а також 24106 [А.с. № 1524432, урожай зерна не вказаний] і 24100 (А.с. 1483942, підвищував збір зерна сої на 1,2-1,5 ц/га порівняно із штамом еталоном 634б і на 14,8-22,6 % перевищував штам 629а за урожаєм зеленої маси] в залежності від ґрунтово-кліматичних умов і сорту сої. Близьким до запропонованого є штам 24108 (71 т, ІMB НАН України), А.с. № SU 1824385 А1), виділений із бульбочок сорту Іскра у Чернівецькій області України на чорноземі опідзоленому рН ґрунту 7,1. При використанні вказаного штаму урожай зеленої маси підвищується в 2,4 разу порівняно із штамом 639б, а також збір зерна на 40 % більше у порівнянні із застосуванням штаму 24100, на 30 % - у порівнянні із застосуванням штаму 24105 і на 1,0-2,7 ц/га порівняно до штаму 634б. Штам високотехнологічний, ефективний із різними сортами рослин-господарів. Близькими до запропонованого є також штами - Т66 [пат. України № 83298] та Т21-2 [пат. України № 64086], отримані в ІФРГ НАН України внаслідок застосування транспозонового мутагенезу до штаму 634б. На даний час при виготовленні бактеріальних добрив для сої як біологічна основа найчастіше використовується штам аналітичної селекції Bradyrhizobium japonicum 634б [А. с. СССР № 922104, кл. С 05 F 11/08, 1982], який можна вважати найбільш наближеним до запропонованого. В основу корисної моделі поставлена задача отримати штам із достатньо високою азотфіксувальною активністю та ефективністю у симбіозі із сортами сої та оптимальними технологічними параметрами. Суть корисної моделі: Задача вирішується завдяки новому штаму бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum PC08, який виділений у 2007 році із бульбочок сої сорту Київська 27, яка росла на темно-сірому опідзоленому ґрунті в Уманському районі, Черкаської області України. Основою для селекції стала виділена культура із бульбочок сої, яка тривалий час культивувалася на агробіостанції Уманського державного педагогічного університету імені Павла Тичини. Чиста культура була розмножена на штучному середовищі МДА і знову використана для інокуляції сої сорту Київська-27. Наступна повторна інокуляція насіння сої культурою РС08 підвищувала вірулентність і ефективність симбіозу штаму з сортом Київська 27 та іншими сортами. При подальшій ступеневій селекції за підвищеними симбіотичними властивостями в умовах симбіозу із рослинами сої різних сортів був відібраний штам РС08, що пропонується до патентування. При дослідженні штаму, що заявляється, використовували стандартні мікробіологічні, фізіологічні та біохімічні методи, а також правила постановки і обліку результатів вегетаційних та польових дослідів. Ефективність симбіозу оцінювали в польових умовах на полях, де сою висівали вперше, і на полях тривалого вирощування культури, де в ґрунті вже виявлена постійна присутність Bradyrhizobium japonicum. Вірулентність штаму оцінювали за кількістю та масою утворених бульбочок у середньому на одній рослині, а ефективність - за приростом надземної маси рослин та урожаєм зерна. як ілюстрації властивостей виділеного і відселектованого штаму наводимо таблиці польових випробувань рідкого препарату на його основі в 2008-2010 pp. (таблиці 2, 3, 5). Про генетичну стабільність штаму свідчить незмінність показників вірулентності і ефективності симбіозу з сортами Мар'яна і Васильківська, після багаточисленних пасажів 1 UA 78755 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 культури на манітно-дріжджових і горохових агаризованих середовищах як при посіві через рідку суспензію, так і безпосередньо при пересівах бактеріологічною петлею. Ідентифікацію штаму провели як за результатами вищеописаних операцій (характерні симбіотичні властивості) так і за мікроскопічними, біохімічними і фізіологічними ознаками у відповідності з визначником Берги (1980, М: "Мир". - С. 495). Культуру ідентифіковано як штам виду Bradyrhizobium japonicum. Штам депонований і зберігається у колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Заболотного НАН України (м. Київ) під реєстраційним номером ІMB В-7399. Штам Bradyrhizobium japonicum PC08 характеризується наступними культуральноморфологічними і фізіолого-біохімічними ознаками. Культурально-морфологічні ознаки: Bradyrhizobium japonicum PC08, повільнорослі, грамнегативні палички розміром 1,60-2,8 × 0,50,8 мкм. Культура не спороносна, рухлива (монотрих). Росте на поживних середовищах наступного складу: манітно-дріжджовий агар (МДА): г/л: K2НРО4-0,5; MgSO4·7Н2О - 0,2; NaCl-0,1; маніт - 10,0; дріжджовий екстракт - 0,5; агар - 15,0-17,0; дист. вода, рН 6,8-7,0. Стерилізувати при 1 атм. 30 хв, рН 6,8-7,2; люпиновий агар (г/л): K2НРО4-0,5; KН2РО4-0,5; MgSO4-0,2; NaCl-0,2; CaSO4-0,1; (NH4)2MoO4 сліди, маніт - 15,0; люпинова мука - 10,0; рН середовища 6,8-7,0; середовище Лазаревої (г/л): дріжджовий екстракт - 100; глюкоза - 10, тирозин - 0,5; K2НРО40,5; MgSO4-0,2; NaCl-0,2, рН 7,0-7,2; середовище TY (г/л): триптон - 5,0; дріжджовий екстракт - 3,0; СаС12·2Н2О - 0,94. Фізіологічні ознаки. Аероб. Температурний діапазон росту: 20-28 °C. Оптимальна температура росту 26-28 °C. Діапазон рН 6,0-7,2. Оптимальна рН - 7,0. Колонії з'являються на 78 добу, однотипові, дрібні, круглі, помірно-випуклі, білуваті, слизисті. З часом розростаються на поверхні агаризованого середовища, але не розтікаються. Росте на багатих поживних середовищах на основі вуглеводів, екстрактів і авто лізатів дріжджів. При вирощуванні культури на середовищах із вуглеводами виділяє слиз полісахаридної природи. Біохімічні ознаки. Штам являється хемоорганотрофом, використовує вуглеводи із підлуговуванням середовища вирощування. Він активно використовує Д-маніт, глюкозу, мальтозу, а також вуглевод ескулін і не засвоює сахарозу. Відмінним джерелом вуглецю для культури РС08 є меляса, проте як джерело вуглецю і енергії не використовує клітковину і крохмаль. Має дуже слабкий ріст на картопляному агарі. Культура бактерій В. japonicum PC08 желатину не розріднює, оскільки не має протеолітичного ферменту желатинази, молоко із лакмусом не пептонізує. Росте на середовищах із амонійними солями. Сечовій кислоті, як джерелу азоту ризобії надають перевагу перед іншими сполуками азотного живлення. Не росте на м'ясо-пептонному агарі (МПА). Характерною особливістю культури є відсутність бетагалактозидазної активності та виділення сірководню (H2S), а також відсутність реакції утилізації цитрату натрію. Ознаки штаму стабільні. Штам не патогенний. Культура добре зберігається в пробірках на скошеному мінеральному середовищі МДА під шаром мінеральної олії (об'єм олії не повинен перевищувати 1 см над поверхнею кінцівки косяка середовища) при кімнатній температурі або в холодильнику при температурі 4-5 °C на цьому ж середовищі, але без олії. Рекомендовано пересівати 1-2 рази на рік. Культура В. japonicum РС08 проявляє високу азотфіксувальну активність в умовах симбіозу із рослинами сої. Азотфіксувальну активність кореневих бульбочок (АфА) методом Hardy et al [Hardy R.W.F., Holsten R.D, Jackson E.K., Burns R.C. 1968., Крикунець В.М. 1993] і виражали в мікромолях етилену, який утворився бульбочками однієї рослини за 1 год. Із цією метою корені рослин сої, на яких утворилися бульбочки, клали у герметично-закриті скляні флакони ємністю 3 75 см , через гумову мембрану до них вводили 10 % ацетилену від загального об'єму. 3 Тривалість інкубації із ацетиленом - 1 година. Об'єм проби для аналізу - 1см . За стандарт брали чистий етилен, одержаний із етилового спирту і концентрованої сірчаної кислоти (1:30) при підігріванні до 160 °C Газову суміш аналізували на газовому хроматографі Agilent Technologies 6855 Network GC System USA (визначення проводили у п'яти-семикратних повтореннях). Із метою виготовлення рідкої форми препарату бактерії штаму РС08 вирощували на МДА у пробірках при +28 °C протягом 6-7 діб. Культуру із агару змивали стерильною водою, готували густу суспензію (20 мл), якою засівали колби із середовищем МДА (об'єм - 350 мл) і культивували протягом 6 діб при температурі 28 °C на качалці з 180 об/хв., що забезпечувало постійну аерацію середовища вирощування. Для приготування бактеріального препарату на твердому носії у пакети із вермикулітом (130 г/га) вводили стерильно 20 мл бактеріальної суспензії (попередньо вирощеної на середовищі 2 UA 78755 U 5 10 15 20 МД у колбах), а також поживні добавки: 3 г меляси, 1 г кукурудзяного екстракту, 1 г глюкози, які готували з розрахунку на 130 г сухого вермикуліту (1 га /порція), добре перемішували. Інокуляцію проводили в асептичних умовах. Виготовлений у такий спосіб бактеріальний препарат розміщували при кімнатній температурі (+18-20 °C) на 10 діб для дорощування. Після термостатування бактеріальний титр препарату на твердому носії становив не менше 2-2,5 млрд. бактеріальних клітин штаму РС08/1 г препарату. Ефективність інокуляції насіння сої запропонованим штамом РС08 вивчали у вегетаційних і польових дослідах у порівнянні із виробничим штамом 634б B. japonicum. У вегетаційних умовах рослини вирощували на піщаному субстраті з 0,2 н азоту за Гельрігелем (1 норма відповідає 708 мг Ca(NO3)2×4Н2О на 1 кг піску). Польові досліди проведені в Черкаській області на темно-сірому опідзоленому ґрунті (вміст гумусу 1,6-2,0 %, азоту 12,112,7 фосфору 9,3-12,2, калію 13,1-17,6 мг/100 г ґрунту, рН 5,7-6,0). Результати представлені в таблиці 1. У контрольованих умовах азотфіксувальна активність рослин, інокульованих запропонованим штамом, істотно переважала рослини контрольного варіанту (інокуляція штамом 634б) протягом вегетаційного періоду. Особливістю симбіозу сої з новим штамом РС08 був високий рівень азотфіксуальної активності у ранній період функціонування симбіотичного апарату (фаза одного справжнього листка) і у фазу наливу бобів, що може слугувати додатковим джерелом надходження сполук азоту до рослини-хазяїна (табл. 1). В умовах Черкаської області при вирощуванні сої на полях за відсутності специфічної для цієї рослини ризобіальної мікрофлори азотфіксувальна активність кореневих бульбочок утворених за участю штаму РС08 на сої сорту Мар'яна перевищувала у 2,7 разу, а на сорті Васильківська у 1,5 разу аналогічний показник при використанні штаму 6346 (табл. 2). Таблиця 1 Азотфіксувальна активність сої сорту Мар'яна протягом онтогенезу в залежності від інокуляції штамом В. japonicum PC08 (вегетаційний дослід 2008 р.) Штам Штам-стандарт В. japonicum 634б Запропонований штам В. japonicum РС08 25 Азотфіксувальна активність, мкмоль С2Н4 / (рослину·год.) Фаза розвитку рослин Цвітіння – Один Бутонізація – Три справжні початок справжній початок Налив бобів листки утворення листок цвітіння бобів 1,86±0,19 38,98±3,27 116,60±7,90 81,02±6,18 64,18±4,28 8,94±0,43 59,66±2,52 126,60±2,52 108,96±9,93 96,44±3,33 На фоні аборигенної мікрофлори передпосівна бактеризація насіння сої штамом РС08 приводила до збільшення азотфіксувальної активності бульбочок у сої сорту Мар'яна у 1,3 разу, сорту Васильківська - у 2 разу, порівняно із застосуванням штаму 634б і відповідно у 2 разу сої сорту Мар'яна (2009 р.) і 3,3 разу сорту Васильківська (2010 р.) порівняно із спонтанно утвореними бульбочками (табл. 2). 30 Таблиця 2 Азотфіксувальна активність (мкмоль С2Н4 / (рослину·год.) у різних сортів сої за інокуляції штамом В. japonicum PC08 (польові досліди 2008-2010 рр. Штам Контроль без інокуляції Штам-стандарт В. japonicum 634б Запропонований штам В. japonicum PC08 Сорт Мар'яна 2008 р. 2009 р. 0,0 4,26±0,55 Сорт Васильківська 2008 р. 2010 р. 0,0 1,64±0,01 4,66±1,09 6,69±0,62 5,54±0,37 2,71±0,14 12,60±0,25 8,48±0,21 8,35±0,47 5,42±0,38 3 UA 78755 U 5 10 15 20 25 30 У залежності від сорту сої приріст надземної маси у рослин, інокульованих штамом РС08, коливався в межах 17,7-64,6 % у порівнянні із рослинами бактеризованими штамом 634б, та 59,3-81,0 % - у порівнянні із спонтанно інокульованими рослинами (табл. 3). Штам РС08 виявився високовірулентним. Кількість і маса утворених за його участю кореневих бульбочок на сої сортів Мар'яна і Васильківська, які належать до сортів різних груп стиглості, перевищувала аналогічні показники при використанні виробничого штаму 634б у польових умовах. Зокрема, у фазу початок цвітіння у сої сортів Мар'яна і Васильківська, інокульованої штамом РС08, маса кореневих бульбочок була більшою відповідно на 33,0 % і 50,0 % порівняно із аналогічним показником у рослин, інокульованих штамом 634б (табл. 3). Додатковою перевагою штаму РС08 є його висока конкурентоздатність, яка забезпечує йому пріоритет у процесі утворення бульбочок при вирощуванні сої за присутності аборигенної ризобіальної мікрофлори. Конкурентоздатність штаму РС08 визначали непрямим методом (за надземною масою інокульованих рослин) і розраховували за формулою Амаргер (Amarger N., 1981). На сої сорту Васильківська запропонований штам перевищував за конкурентоздатністю еталонний виробничий штам 634б В. japonicum. Показники конкурентоздатності складали відповідно 84 % і 79,5 % (табл. 4). Використання запропонованого штаму РС08 для бактеризації районованих сортів сої у ґрунтово-кліматичних умовах Черкаської області збільшує урожай зерна в середньому на 17,128,4 % (2,9-9,2 ц/га) порівняно із варіантом без інокуляції і на 5,9-16,0 % (1,1-3,9 ц/га) порівняно із виробничим штамом 6346 (табл. 5). Рекомендований штам РС08 достатньо технологічний і його можна використовуватися у виробництві бактеріального добрива під сою, оскільки добре приживається і інтенсивно розмножується на сипучих субстратах-носіях - вермикуліті та перліті, збагачених поживними домішками (кукурудзяний екстракт, меляса, глюкоза) (табл. 6). Протягом 40 діб зберігання бактеріальний титр препаратів виготовлених на основі штаму РС08 мав тенденцію до збільшення порівняно із препаративними формами на основі штаму 6346. Результати із визначення життєздатності ризобій РС08 представлені у вермикулітному препараті на 10 і 40-у добу його зберігання (табл.7). Таким чином, штам РС08 Bradyrhizobium japonicum за симбіотичними та основними господарсько-цінними властивостями - ефективністю симбіозу, конкурентоздатністю та технологічністю рекомендується для виготовлення бактеріальних добрив під сою. Таблиця 3 Симбіотичні властивості штамів B. japonicum в залежності від сорту сої у фазі - початок цвітіння (польові досліди 2009-2010 pp.) Штам Контроль без інокуляції В. japonicum 634б В. japonicum РС08 Сорт Мар'яна (середньостиглий) Сорт Васильківська (середньоранній) Кількість Маса Надземна Кількість Маса Надземна бульбочок, бульбочок, г маса, г бульбочок, шт. бульбочок, г маса шт. 13,5±1,2 0,27±0,05 6,26±0,50 11,0±0,7 0,30±0,02 13,26±0,80 22,0±2,0 0,33±0,02 8,47±0,34 19,3±0,8 0,38±0,03 14,60±1,40 27,8±1,0 0,44±0,01 9,97±0,63 24,5±1,5 0,57±0,04 24,03±1,04 Таблиця 4 Наростання вегетативної маси рослин та визначення відносної конкурентоздатності при моно- та змішаній інокуляції сої активним і неактивним штамами В. japonicum (вегетаційний дослід) Штам Без інокуляції Азотфіксувальна активність, мкмоль С2Н4/(рослину год.) Маса сухих рослин, г/посудину 8,90±0,36 4 Приріст маси сухих рослин від Відносна інокуляції, конкурентоздатність, г/посудину % + + шт. шт. + шт. UA 78755 U Продовження таблиці 4 634б 604к 634б+604к РС08 РС08+604к 4,88±0,24 0,12±0,05 3,82±0,40 5,11±0,41 3,63±0,24 13,14±0,43 9,42±0,38 12,38±0,59 13,53±0,47 12,86±0,28 4,24 79,5 3,48 4,63 84,0 3,96 Таблиця 5 Вплив інокуляції новим аналітично селеціонованим штамом B. japonicum на продуктивність різних сортів сої (ц/га) (польові досліди 2008-2010 pp., Черкаська обл.) Штам Сорт Мар'яна 2008 р. 2009 р. Середнє % до % до Середнє % до % до значення контролю 634б значення контролю 634б Контроль без 16,9±0,6 інокуляції В. japonicum 18,7±0,4 634б В. japonicum 19,8±0,3 РС08 НІР0,05 1,9 Сорт Васильківська 2010 р. Середнє % до % до значення контролю 634б 23,4±0,8 -4,1 32,4±1,9 10,6 24,4±0,5 4,3 37,1±1,0 14,5 17,1 5,9 28,3±1,2 20,9 16,0 41,6±0,7 28,4 12,1 2,6 3,2 Таблиця 6 Інтенсивність росту B. japonicum на середовищах із різними джерелами азоту і вуглеводами Тривалість інкубації, доба 3 7 Штам КУО на мл 7 9 12 10 10 10 МД 240±7,8 261±18,2 10,5±1,8 634б KM 104±8,2 134±9,7 22,3±3,1 МД 115±3,0 159±4,8 36,7±5,8 РС08 KM 62±8,5 132±7,7 31,5±3,6 Примітка: МД - манітно-дріжджове середовище; KM - кукурудзяно-мелясне середовище; КУО - кількість утворених одиниць. Поживне середовище 1 Таблиця 7 Життєздатність ризобій сої у вермикулітному препараті залежно від терміну зберігання, КУО млрд./г Штам 634б РС08 Термін зберігання, доба 10 7,8±0,09 8,9±0,03 1 0,10±0,002 0,15±0,008 40 32,5±1,5 46,7±4,2 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum РС08 (В-7399) для одержання бактеріального добрива під сою. 10 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5