Спосіб прогнозування ризику спонтанного раку молочної залози

Реферат: Спосіб прогнозування ризику спонтанного раку молочної залози включає використання генетичних досліджень поліморфізму генів. Вивчають частоту варіації поліморфізмів (SNP) у кодуючих і некодуючих ділянках ДНК у жінок методом піросеквенування з використанням набору Руrо Gold Reagents фірми Qiagen. При виявленні гомозиготних варіантів мутації по цих генах прогнозують розвиток спонтанного ризику раку молочної залози. UA 82003 U (54) СПОСІБ ПРОГНОЗУВАННЯ РИЗИКУ СПОНТАННОГО РАКУ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ UA 82003 U UA 82003 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області медицини, а саме онкології, мамології та медичної генетики, і може бути застосована для прогнозування схильності до спонтанного раку молочної залози. Рак молочної залози - найбільш розповсюджене онкологічне захворювання у жінок і в багатьох економічно розвинених країнах світу протягом останніх десятиріч займає перше місце в структурі онкологічної захворюваності (1, 2). Рак молочної залози частіше зустрічається у жінок передменопаузального і постменопаузального віку. Питома вага раку молочної залози серед жінок, що хворі на онкологічні захворювання в віковій групі від 18 до 29 років, становить 6,2 %, а від 55-75 років 19,3 %. В структурі ракових захворювань жінок молодого віку перше місце займає рак молочної залози, який становить 40 % (3, 4, 5). Морфологічні і молекулярно-біологічні показники раку мають велике прогностичне значення. Багато досліджень показало, що тривалість життя хворих на рак молочної залози залежить не тільки від стадії захворювання. Принаймні клінічний перебіг обумовлено внутрішньоклітинними (молекулярно-біологічними) факторами самої пухлини. Молекулярно-біологічні та генетичні дослідження грають велику роль у розумінні ступеня злоякісності новоутворення. Ключовим моментом непластичної трансформації є ланцюг генетичних порушень, який призводить до неконтрольованого росту клітин, порушенню апоптозу та втрати диференціації тканини. Крім молекулярно-біологічних критеріїв, в сучасній онкології широке значення має генетичне дослідження. В останнє десятиріччя вирішення питання ранньої діагностики та профілактики раку молочної залози пов'язують з відкриттями в молекулярній генетиці. Фундаментальні дослідження в цій галузі суттєво змінили уявлення про структуру генів, взаємодію ген-білок, генотип-фенотип. Що має суттєве прикладне значення для трактовки клінічного, біохімічного та морфологічного фенотипу раку молочної залози, а також для прогнозованого розвитку і профілактики спадкових варіантів раку молочної залози (5, 6). Онкологічні захворювання, як відомо, є полігенними, тобто в їх виникненні, розвитку і прогресуванні приймають участь кілька десятків генів, які відносяться до різних функціональних груп, що беруть участь в регуляції клітинного циклу, апоптозу, диференціювання, контролю стану геномної ДНК і т.і. Найбільш близьким до заявленого технічного рішення є розробка, в якій визначається схильність до раку молочної залози шляхом ідентифікації фенотипічних комбінацій специфічних варіантів генів CYP1B1, CASP8, BRCA2 і СНЕК - 2 (7). У способі виявляється підвищений ризик захворюваності на рак молочної залози, оснований на результатах аналізу зразка ДНК на наявність SNP у позиціях 142, 355 і 4326 гена CYP1B1, делеційних варіантів 110 0 delC, del5395, а також 1VS2+1G>А гена SHEK2 і заміни С5972Т у гені BRCA2. При цьому визначені комбіновані генотипи по всіх указаних позиціях трьох вказаних генів, при яких ризик розвитку рака молочної залози перевищує суму ефектів, яка визначається відповідними варіантами кожного із трьох генів окремо, які розглядаються як ознака особливої схильності пацієнтки до захворювання (непропорційно високого ризику захворювання) на рак молочної залози. Однак вказаний спосіб є недостатньо ефективним для визначення ризику розвитку рака молочної залози, недостатньо чуттєвим і вірогідним. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення способу прогнозування ризику спонтанного раку молочної залози шляхом виявлення поліморфізу в генах, які пов'язані зі схильністю до розвитку раку молочної залози, використовуючи метод піросеквенування та аналізу поліморфізму в генах, які пов'язані зі схильністю до розвитку раку молочної залози, що дозволить з високим ступенем вірогідності прогнозувати (генотипувати) ризик спонтанного раку молочної залози, призначати індивідуалізовану тактику профілактики і лікування з урахуванням відносної чутливості до спеціального лікування, що, в свою чергу, призводить до поліпшення показників виживаності хворих на рак молочної залози. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з корисною моделлю, вивчають частоту варіації поліморфізмів (SNP) у кодуючих і некодуючих ділянках ДНК у жінок методом піросеквенування з використанням набору Pyro Gold Reagents фірми Qiagen на приладі PyroMark Q96 MA і при виявленні гомозиготних варіантів мутації за цими генами прогнозують ризик розвитку спонтанного раку молочної залози. Спосіб виконується наступним чином. У виникненні, розвитку і прогресуванні онкологічних захворювань приймають участь декілька десятків генів, які відносяться до різних функціональних груп, що беруть участь у регуляції клітинного циклу, апоптозу, диференціювання, контролю стану геномної ДНК. У даній розробці вивчені зміни в ДНК, відомі як поодинокі нуклеотидні поліморфізми (SNP), які відіграють досить важливу роль у житті людини. Вивчена частота варіації зазначених вище поліморфізмів генів у 1 UA 82003 U 5 10 15 20 25 кодуючих і некодуючих ділянках ДНК у здорових жінок та у хворих на рак молочної залози з аналізом у групах генів, пов'язаних з регуляторними клітинними шляхами. У відповідності з планом, здійснювався забір крові у жінок, хворих на рак молочної залози, а також у здорових жінок. Вік жінок, відібраних для аналізу, становив 40-48 років. Загалом було проаналізовано 206 проб крові, взятих у хворих на аденокарциному молочної залози, і 104 проби від здорових жінок, у яких не було захворювань молочної залози. ДНК виділяли із крові за допомогою наборів GeneJET™ PCR Purification Kit згідно з протоколом (Fermentas). Виділену ДНК зберігали при - 20 °C. За допомогою PSQ Assay Design software здійснювався дизайн праймерів для аналізу поліморфізму. Праймери синтезували в фірмах "Синтол" (Москва) та Metabion international AG (Німеччина). З метою уніфікації ампліфікації специфічних ділянок ДНК різних генів, її проводили методом мультиплексної - uchDown HotStart DNA Polymerase з використанням набору HotStarTaq Plus Master Mix (Qiagen) та 10 пкмоль специфічних праймерів для аналізованих SNP досліджуваних генів: 95 °C - 15 хв, 10 циклів 95 °C - 30 с, 65 °C - 1 хв, з пониженням температури на 1,0 град/цикл; 30 циклів 95 °C - 30 с, 60 °C - 30 с, 72 °C - 45 с, 72 °C - 10 хв на термоциклері MJR. Аналіз SNP був проведений методом піросеквенування з використанням набору Pyro Gold Reagents фірми Qiagen та 0.3 мМ специфічних секвенуючих праймерів до досліджуваних SNP, згідно методики піросеквенування (Qiagen). Аналіз поліморфізму проводили на приладі PyroMark Q96 MA. Статистичний аналіз даних проводили за допомогою програми MedCalc software. Для аналізу поліморфізму в генах, пов'язаних зі схильністю до раку молочної залози, були взяті SNP з бази даних по повногеномному аналізу SNP на мікрочіпах (GWAS, www.gwascentral/org). Були відібрані 16 найбільш тісно пов'язаних з ризиком розвитку раку молочної залози за даними GWAS. Вибрані SNP локалізувались і інтронній, некодуючій частині генів, поруч з генами або в кодуючій ділянці генів (Таблиця 1). Аналіз вибраних методом піросеквенування SNP показав наступні результати (Таблиця 2). Таблиця 1 SNP, відібрані для аналізу схильності до раку молочної залози за даними GWAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 SNP Rs 1256049 Rs 17462877 Rs 3803662 Rs 12443621 Rs3817198 Rs 889312 Rs 4973768 Rs 2981582 Rs 2420946 Rs 34330 Rs 999737 Rs 4880 Rs 299284 Rs 2107425 Rs 3731239 Rs 3020314 Ген ESR2 CASP8 TOX3 TOX3 LSP1 MAP3K1 SLC4A7 FGFR2 FGFR2 CDKN1B RAD51L1 SOD2 HMMR H19 CDKN2A ESR1 Локалізація intergenic Synonymous, coding intron intron intergenic noncoding intron intron noncoding intron promo-r exon intergenic intron intron 2 Мутантний генотип GG TT TT GG TT CC TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT UA 82003 U Таблиця 2 Результати генотипування відібраних SNP № п/ п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 SNP Rs 1256049 Rs 17462877 Rs 12443621 Rs 3803662 Rs 3817198 Rs 889312 Rs 4973768 Rs 2981582 Rs 2420946 Rs 34330 Rs 999737 Rs 4880 Rs 299284 Rs 2107425 Rs 3731239 Rs 3020314 Rs 88931217 Rs 3803662 5 10 15 20 25 30 Мутантний генотип Співвідношення шансів Odd ratio ESR2 CASP8 ТОХ3 TOX3 LSP1 MAP3K1 SLC4A7 FGFR2 FGFR2 CDKN1В RAD51 L1 SOD2 HMMR H19 CDKN2A ESR1 GG TT GG TT TT СС TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT 0.932 1.172 1.4515 1.95 1.08 1.85 1.85 1.65 1.445 1.103 1.232 1.002 1.033 1.123 1.112 0.912 0.5207-1.5713 0.5662-2.2062 0.6277-3.3565 0.96-3.91 0.055-2.107 0.91 1.01-3.37 0.93-2.912 0.7683-2.7263 0.094-1.325 0.051-1.572 0.841-1.192 0.0953-1.142 1.031-1.230 0.967-1.421 0.084 Відносний p ризик (relative risk) 0.723 0.745 1.18 0.3837 1.41 P=0.06 1.78 0.8 1.3 0.08 1.68 0.043 1.4 0.08 1.34 0.2526 1.372 0.932 0.216 0.976 0.383 0.689 0.39 0.991 MAP3K1TOX3 CC-TT 2.01 1.0-4.2 0.039 Ген Cs (95 %) p 0.76 0.39 0.065 0.51 0.091 0.048 0.072 0.258 У представлених в таблиці даних показано, що зі схильністю до раку молочної залози у жінок найбільше пов'язані поліморфізми Rs 3803662 (ТОХ3), Rs 2981582 (FGFR2), Rs 4973768 (SLC4A7) і Rs 889312 (МАР3K1). - Ген ТОХ3 - транскрипційний коактиватор Р300/СВР транскрипційного комплексу - пригнічує апоптоз, стимулює транскрипцію естроген - респонсивних промоторів та BCL2 - гена. - Ген FGFR2 - рецептор фактора росту фібробластів відіграє важливу роль у регуляції клітинної проліферації, диференціювання, міграції та апоптозу, і в регуляції ембріонального розвитку. - Ген МАР3K1, мітоген - активована протеїнкіназа, є частиною сигнальних каскадів, включаючи ERK, JNK та NFk сигнальні шляхи. - Ген SLC4A7 відповідає за підтримку внутрішньоклітинного рН. Інші поліморфізми в генах недостовірні і слабко пов'язані зі схильністю до раку молочної залози. Вибрані для аналізу гени були проаналізовані в біоінформаційній програмі GENEMANIA для пошуку асоціацій і взаємодії між собою в регуляторних клітинних шляхах. На рисунку представлена схема взаємодій між генами, виходячи з опублікованих даних про ко-локалізацію, ко-експресію, ген - ген взаємодії, загальні протеїнові домени і т.д. Як показано, вибрані гени взаємодіють між собою у вигляді ген - ген взаємодій, ко-експресії, протеїн - протеїн взаємодій. Були визначені нові гени для вивчення їхнього внеску в забезпечення схильності до раку молочної залози. Це такі гени, як RAD1, RAD51, XRCC3, FAS, SLC4, CDKN1C, CDK4. В результаті дослідження за заявленим способом було виконано наступне: 1. Проведено дослідження частоти зустрічальності 16 SNP у різних генах, пов'язаних зі схильністю до раку молочної залози в хворих на аденокарциному молочної залози, у порівнянні з жінками, що не мають злоякісних захворювань молочної залози. 2. Виявлено 4 SNP з найбільш вираженим зв'язком зі схильністю до раку молочної залози: Rs 3803662 (ТОХ3), Rs 2981582 (FGFR2), Rs 4973768 (SLC4A7) і Rs 889312 (МАР3K1). Частота зустрічальності Rs 4973768 (SLC4A7) достовірно вища у хворих на рак молочної залози, ніж у здорових жінок. Частота зустрічальності трьох інших поліморфізмів наближається до достовірних значень. Дані можуть використовуватися для генотипування схильності до раку молочної залози, в комплексі з попередньо використаними варіаціями поліморфізмі генів CYP1B1, CASP8, BRCA2 і СНЕK. 3 UA 82003 U 5 10 15 20 25 30 35 40 3. Встановлено, що відносний ризик (RR) для SNP Rs 3803662, Rs 889312, Rs 4973768 та Rs 2981582 становить 1,78; 1,68; 1,4 та 1,34 - відповідно. Таким чином, у порівнянні з прототипом, запропоноване технічне рішення, за рахунок нового підходу до прогнозування ризику раку молочної залози шляхом визначення частоти варіації поліморфізмів (SNP) у кодуючих і некодуючих ділянках ДНК методом піросеквенування, дозволило визначити нові гомозиготні варіанти мутації, по яких з високим ступенем вірогідності прогнозують ризик спонтанного раку молочної залози, що дозволить своєчасно призначати індивідуалізовану тактику профілактики і лікування, що поліпшить показники виживаності хворих на рак молочної залози. Джерела інформації: 1. Althuis M. Global trends in breast cancer incidence and mortality 1973-1997 / M.D. Althuis, J.M. Dozier, W.F. Anderson, S.S. Dvesa, L.A. Brsnton // Int J Epidemiol.-2005. - № 34. - P. 405-412. 2. Рак в Україні, 2006-2007 (захворюваність, смертність, показники діяльності онкологічної служби): Бюлетень Національного канцер-реєстру України. - К. 2008. - № 9.-94 с. 3. Goldhirsch F / 10th St. Gallen conference. Progress and promise: highlights of the international expert consensus on the primary therapy of early breast cancer 2007 / A. Goldhirsch, W.C. Wood, R.D. Gelber, A.S. Coates, B. Thürlimann, HJ. Senn // Ann Oncol.-2007. - № 18 (7). - P. 1133-44. 4. Стандарти діагностики та лікування онкологічних хворих: Затверджено наказом Міністерства охорони здоров'я України "Про затвердження протоколів надання медичної допомоги за спеціальністю "онкологія" від 17.09.2007, № 554. - [Чинний від 17.09.2007]. - Київ: СПД Морозов, 2007.-202 с. - (Національний стандарт України). 5. Klauber-DeMore N. Tumor biology of breast cancer in young women / N. Klauber-DeMore // Breast Disease.-2005, 2006 / - Vol. 23/ - № 1. - P. 9-15. 6. Gluck I. Prognostic characteristics in young premenopausal breast cancer patients compared to older premenopausal patients / І. Gluck, I. Wolf, S. Sadetzki [et al] // Abstract book 2003 ASCO Annual Meeting / - 2003. - abstract 3604. 7. Пат. 2470998 C2 Российская Федерация, МПК C12Q 1/68 (2006.01). Определение предрасположенности к раку путем идентификации генотипических комбинаций специфичных вариантов генов CYP1B1, BRCA2 и СНЕK2 / Любински Я., Цыбульский Ц., Дебняк Т., Курзавский Г., Сухи Я., Серрано-Фернандес П., Матиясик И., Горский Б.; заявитель и патентообладатель Любински Я., Цыбульский Ц., Дебняк Т., Курзавский Г., Сухи Я., СерраноФернандес П., Матиясик И., Горский Б., Поморски Унивэрситит Мэдичны, (PL). - № 2009127735/10; заявл. 06.09.2006; опубл. 27.12.2009. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб прогнозування ризику спонтанного раку молочної залози з використанням генетичних досліджень поліморфізму генів, який відрізняється тим, що вивчають частоту варіації поліморфізмів (SNP) у кодуючих і некодуючих ділянках ДНК у жінок методом піросеквенування з використанням набору Руrо Gold Reagents фірми Qiagen і при виявленні гомозиготних варіантів мутації по цих генах прогнозують розвиток спонтанного ризику раку молочної залози. 4 UA 82003 U Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м.Київ – 42, 01601 5