Рекомбінантний hcg та його застосування для виготовлення лікарського засобу для лікування розладів, пов’язаних з безплідністю

1. Рекомбінантний hCG, який характеризується питомою біоактивністю в діапазоні від 23000 МО/мг до 28000 МО/мг, одержаний шляхом обробки вихідного матеріалу, яким є культуральне середовище клітин СНО, за способом, який включає такі стадії: (a) елюювання вихідного матеріалу через хроматографічну колонку з силікагелем; (b) елюювання вихідного матеріалу через колонку для іонообмінної хроматографії; (c) елюювання через другу колонку для іонообмінної хроматографії; 2 (19) 1 3 86938 4 8. Застосування рекомбінантного hCG за будьдля лікування розладів, пов'язаних з безплідністю. яким з пп. 1-7 для виготовлення лікарського засобу Цей винахід стосується способу очищення хоріонічного гонадотропіну, зокрема, очищення рекомбінантного хоріонічного гонадотропіну людини (hCG) із препарату неочищеного рекомбінантного hCG. Спосіб включає використання іонообмінної хроматографії та рідинної хроматографії високої ефективності (РХВЕ) з оберненою фазою. Хоріонічний гонадотропін є гормон, який продукується плацентою, і його традиційно одержують із сечі вагітних жінок. Цей гормон являє собою гетеродимер, що складається з a- і b-субодиниць, зв'язаних нековалентно. Його ефекти є переважно ефектами гонадотропіну лютеїнізуючого гормону. Хоріонічний гонадотропін призначають жінкам із метою індукування овуляції після стимулювання розвитку фолікулів гормоном стимуляції яєчників або менопаузними гонадотропінами людини при лікування ановуляторної безплідності, спричиненої відсутністю гонадотропінів або їх низькими концентраціями. При цьому вводять внутрішньом'язово одиничну дозу від 5000 одиниць до 10000 одиниць для імітації піка лютеїнізуючого гормону в середині циклу, який за нормальних умов стимулює овуляцію. Хоріонічний гонадотропін вживають також у комбінації з менотрофіном та іноді також із кломіфен-цитратом як допоміжний засіб при процедурах запліднення in vitro та інших способах штучного запліднення, які включають суперовуляцію та відбирання яйцеклітин. Його використовують також для лікування препубертатного крипторхізму у чоловіків. Режими вживання можуть варіювати в широких межах, але звичайно дози становлять від 500 одиниць до 4000 одиниць, які вводять шляхом внутрішньом'язової ін'єкції тричі на тиждень. Хоріонічний гонадотропін вживають також при чоловічій безплідності, пов'язаній з гіпогонадотропним гіпогеніталізмом. В цьому разі режими дозування також варіюють в широких межах, і дози можуть становити від 500 одиниць до 4000 одиниць два або три рази на тиждень. Для сприяння нормальному сперматогенезу часто додатково вживають також агент, що має здатність стимулювати розвиток фолікулів, такий як менотрофін. У випадках олігоспермії можна застосовувати хоріонічний гонадотропін в дозах до 3000 одиниць на тиждень в комбінації з менотрофіном або іншим препаратом для стимуляції фолікулів. Для лікування затримання статевого дозрівання у чоловіків, пов'язаного з гіпогеніталізмом, застосовують дози від 500 одиниць до 1500 одиниць двічі на тиждень; дозу слід коригувати з урахуванням рівня тестостерону в плазмі. Для виділення та очищення hCG із препаратів сечі використовують різні способи (Біркен та інші Birken et al.. Endocrinology, 133(3): 1390-7, 1993; Сакакібара та інші - Sakakibara et al., Chem. Pharm. Bull., 35(5): 1414-6, 1990; Доніні та інші - Donini et al., Acta Endocrinol., 73(1): 133-45, 1973). Останнім часом був розроблений та застосований для очищення hCG зі сечі варіант методу афінної хроматографії, названий мембранно-фільтраційною афінною хроматографією (Цзю та інші - Xu et al.. Protein expression and purification, 16: 221-3, 1999). Цей спосіб виключає використання активованої бромціаном Сефарози як нерухомої фази в колонці для афінної хроматографії та являє собою різновид звичайного способу очищення hCG методом афінної хроматографії із препаратів сечі. Їмуноактивність hCG, очищеного цим способом, становить 8554 МО/мг. Перевага рекомбінантного hCG полягає у відсутності інших гормонів групи гонадотропінів та домішок, що походять із людського організму, більш конкретно, від забруднювачів, присутніх у людській сечі. Неочищений препарат рекомбінантного hCG містить, однак, усі інші протеїни та домішки, що походять із клітин, використаних при одержанні рекомбінантного матеріалу, і, отже, дуже бажаним є створення способу досягнення абсолютної чистоти рекомбінантного хоріонічного гонадотропіну. Автори цього винаходу з'ясували, що неочищений препарат hCG, одержаний з концентрованого препарату культурального середовища після рекомбінаційного процесу або з неочищеного концентрату сечі вагітних жінок, можна очистити так, що одержаний hCG буде практично вільний від протеїнів або інших домішок, які містилися в неочищеному препараті hCG. Спосіб очищення базується на використанні іонообмінної хроматографії та рідинної хроматографії високої ефективності з оберненою фазою. Можливе подальше використання ексклюзійної колонки дозволяє видалити з чистого препарату hCG будь-які залишкові кількості домішок. Оптимальні результати досягаються при використанні щонайменше двох стадій іонообмінного хроматографування. Спосіб за цим винаходом можна використати для очищення рекомбінантного hCG із неочищеного препарату культурального середовища, одержаного після рекомбінаційного процесу. Одержаний hCG має високий ступінь чистоти та високу питому біоактивність (в діапазоні 23000-28000 МО/мг) і практично вільний від протеїнів сироватки зародка великої рогатої худоби (FBS), в разі їх присутності в культуральному середовищі, нуклеїнових кислот або інших домішок, присутніх у клітинах носія, які використовуються в рекомбінаційному процесі. Спосіб за цим винаходом можна використати також для очищення сечового hCG, при цьому вихідним матеріалом є неочищений концентрат сечі вагітних жінок, та для очищення CG, одержаного з організмів інших ссавців, в тому числі, наприклад, великої рогатої худоби, коней, свиней, овець та мавп. 5 86938 6 Метою цього винаходу є запропонувати спосіб культуральному середовищі, нуклеїнових кислот очищення hCG із вихідного матеріалу з викорисабо інших домішок, присутніх у клітинах носія, які танням іонообмінної хроматографії в комбінації з використовуються в рекомбінаційному процесі. рідинною хроматографією високої ефективності Винахід призначений для застосування до біо(РХВЕ) з оберненою фазою. Спосіб включає стадії логічних матеріалів, зокрема, до неочищених супіддавання вихідного матеріалу іонообмінному мішей, які містять hCG та інші протеїнові забрудхроматографуванню та піддавання елюату рідиннювачі. Такі суміші в цьому описі позначено ному хроматографуванню високої ефективності з терміном "вихідні матеріали". У прикладах, детаоберненою фазою. Може бути використана додатльно описаних нижче, використовуються вихідні кова подальша стадія пропускання елюату через матеріали, що містять r-hCG, одержані з супернаексклюзійну колонку. тантного середовища культури клітин в біореактоПеревага віддається двократному використанрі. Альтернативним різновидом вихідного матеріаню іонообміної хроматографії в різних умовах із лу є неочищений концентрат сечі вагітних жінок. метою досягнення оптимальних результатів проЯк вихідний матеріал використовують свіжозіцесу очищення. Варіант способу згідно з винахобране супернатантне середовище культури клітин, дом, якому віддається перевага, включає стадії: що проходило через біореактор протягом двох діб. (a) елюювання вихідного матеріалу через хроПеревага віддається просвітленню супернатанта матографічну колонку з силікагелем; фільтруванням. Потім неочищений розчин можна (b) елюювання через колонку для іонообмінної в разі необхідності концентрувати та піддати хрохроматографії зі стаціонарною фазою ДЕАЕматографуванню на силікагелі С4 для видалення Сефароза (DEAE-Sepharose); домішок, що походять із культури клітин. (c) елюювання через колонку для іонообмінної Напівочищений вихідний матеріал після ультхроматографії зі стаціонарною фазою СМрафільтрування піддають іонообмінному хроматоСефароза (CM-Sepharose); графуванню, причому перевага віддається дво(d) елюювання через колонку для РХВЕ з обекратному виконанню іонообмінного рненою фазою на силікагелі С18 (Silica C18); і хроматографування, у варіанті, якому віддається (e) елюювання через колонку для ексклюзійної перевага, в різних умовах, та РХВЕ з оберненою хроматографії зі стаціонарною фазою "Сефакрил" фазою. На першій стадії іонообмінного хроматог(Sephacryl). рафування можна застосувати як сорбент ДЕАЕУ варіанті здійснення винаходу, якому віддаСефарозу, при цьому hCG практично повністю ється перевага, елюювання через колонку для проходить через колонку, і досягається видалення іонообмінної хроматографії з ДЕАЕ-Сефарозою значної частки протеїнів, інших ніж hCG, та ДНК. здійснюють у натрій-фосфатному буферному розДруга стадія, при якій перевага віддається засточині при рН приблизно 7,5. суванню СМ-Сефарози, діє як стадія зв'язування При елююванні через колонку для іонообмінhCG і забезпечує видалення залишкових кількосної хроматографії з СМ-Сефарозою перевага відтей ДНК та клітин носія або протеїнів із середовидається використанню натрій-фосфатного буферща. У варіанті, якому віддається перевага, цю станого розчину при рН приблизно 6. дію виконують при температурі приблизно 5°С з При виконанні елюювання через колонку для елююванням натрій-фосфатним буферним розчиРХВЕ з оберненою фазою на стадії (d) перевага ном при рН приблизно 6. віддається використанню 2-пропанолу з буферним Хроматографування з оберненою фазою на розчином Трис-фосфату як рухомої фази. силікагелі С18 забезпечує ефективне видалення CG за цим винаходом у варіанті, якому віддазалишкових кількостей нуклеїнових кислот та доється перевага, є CG людини, а найбільша перемішок, що походять із культури клітин. Перевага вага віддається рекомбінантному hCG, одержановіддається елююванню колонки сумішшю 2му з культурального середовища клітин СНО, які пропанолу з буферним розчином Трис-фосфату як використовуються в рекомбінаційному процесі. рухомою фазою. Розчин затриманої фракції потім Іншою метою цього винаходу є запропонувати у варіанті, якому віддається перевага, піддають фармацевтичну композицію, яка містить терапевультрафільтруванню при верхній межі пропускантичне ефективну кількість очищеного рекомбінання молекулярної маси 10кДа, концентрують, і протного hCG, одержаного з рекомбінаційного процедукт можна виділити з нього бікарбонатом амонію, су, як описано вище, разом із придатними для рН8. Концентрований продукт можна потім піддати цього наповнювачами. Прикладом придатного наексклюзійній хроматографії на сорбенті "Сефакповнювача є сахароза, яка сприяє стабілізації ліорил" (Sephacryl S-200 HR). На цій стадії досягаєтьфілізованого продукту. Фармацевтична композиція ся розділення за розміром молекул з елююванням рекомбінантного hCG особливо придатна для підбікарбонатом амонію (рН8) для видалення залишшкірного введення. ків домішок, що походять із культури клітин, присуДетальний опис винаходу тність яких ще можлива, потенціальних агрегатів Цей винахід пропонує спосіб очищення hCG, та вільних субодиниць hCG. Потім елюат можна зокрема, спосіб очищення рекомбінантного hCG із піддати діалізу шляхом ультрафільтрування через неочищеного препарату культурального середомембрани з верхньою межею пропускання 10кДа, вища рекомбінаційного процесу. Одержаний hCG переважно в натрій-фосфатному буферному розмає високий ступінь чистоти та високу питому біочині, рН 7. Після фільтрування очищений нерозактивність (в діапазоні 23000-28000 МО/мг) і пракфасований розчин hCG доцільно зберігати в стетично вільний від протеїнів сироватки зародка верильних пляшках при низькій температурі. ликої рогатої худоби (FBS), які присутні в Приклад 1 7 86938 8 Реагенти Трифтороцтова кислота (ТФК) для РХВЕ Аміак для аналізу Трис-(гідроксиметил)амінометан для аналізу Бікарбонат амонію для аналізу (за БритансьСхема послідовності технологічних операцій кою Фармакопеєю) (далі БФ) процесу очищення у короткому викладі. Вторинний кислий фосфат натрію для аналізу Первинний матеріал із процесу культивування Етанол абсолютний денатурований клітин очищають та концентрують шляхом посліФосфорна кислота для аналізу (за Європейсьдовного виконання п'яти стадій хроматографуванкою Фармакопеєю) (далі ЄФ) ня. 2-Пропанол для аналізу (за Швейцарською Таблиця 1 являє собою схему послідовності фармакопеєю) технологічних операцій, що коротко представляє Хлорид натрію для аналізу (ЄФ) варіант здійснення процесу очищення г-hCG, якоПервинний кислий фосфат натрію для аналізу му віддається перевага, і характеризує сорбенти в Гідроксид натрію гранульований для аналізу хроматографічних колонках та принципи виконан(ЄФ) ня кожної із проміжних стадій. Таблиця 1 Схема послідовності технологічних операцій процесу очищення г-hCG у короткому викладі СТАДІЯ І СТАДІЯ II СТАДІЯ III СТАДІЯ IV СТАДІЯ V КУЛЬТУРАЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ 3 БіОРЕАКТОРА ¯ Хроматографування на силікагелі С4 (елюат містить r-hCG) ¯ Ультрафільтрування (10 кДа) (Затримана фракція містить r-hCG) ¯ КОНЦЕНТРОВАНИЙ НЕОЧИЩЕНИЙ ПРЕПАРАТ r-hCG4¯ ДЕАЕ-СЕФАРОЗА FF (Незв'язана фракція містить г-hCG) ¯ СМ-СЕФАРОЗА FF (елюат містить r-hCG) ¯ РХВЕ 3 ОБЕРНЕНОЮ ФАЗОЮ НА СИЛІКАГЕЛІ С 18 (елюат містить r-hCG) ¯ Ультрафільтрування (10 кДа) ¯ SEPHACRYL S-200 HR (елюат містить r-hCG) ¯ НЕФАСОВАНИЙ РОЗЧИН r-hCG Нижче подано детальну схему послідовності технологічних операцій процесу та його опис. Для попереднього виділення (стадії І) вказані умови, які звичайно використовуються, якщо неочищений матеріал походить із рекомбінаційного процесу. Стадія І (попереднє виділення) На цій стадії (Стадії І) досягається попереднє концентрування та виконується заміна буферного розчину з метою регулювання його складу. Цю стадію починають при кімнатній температурі (хроматографування на силікагелі С4), а потім продовжують при приблизно +5°С. Перевага віддається робочій температурі в діапазоні 5±3°С. Цю стадію повторюють окремо для кожної партії первинного матеріалу, зібраної на протязі виробничого циклу біореактора. (і) Просвітлення первинного матеріалу Свіжовідібране культуральне середовище з біореактора спочатку звичайно просвітлюють шляхом фільтрування. (іi) Хроматографування на силікагелі С4 Після просвітлення первинний матеріал завантажують у хроматографічну колонку з силікагелем С4, попередньо зрівноважену в 25мМ розчині фосфату натрію, рН 7. Перевага віддається діапа зону рН від 6,6 до 7,7. Колонку промивають 25мМ розчином фосфату натрію до повернення сигналу УФ-детектора на рівень базової лінії. Потім виконують елюювання продукту сумішшю 25мМ розчину фосфату натрію з 2-пропанолом (34,2% (мас.)). (іiі) Оброблення аміаком Потім до розчину додають розчин аміаку до досягнення кінцевої концентрації 1М. Цю суміш інкубують протягом 6 год. Після цього розбавляють розчин вдвічі водою і встановлюють рН 7,5, використовуючи 85%-ну фосфорну кислоту. Діапазон рН, якому віддається перевага, становить 7,5±0,2. (iv) Концентрування та діаліз Мембрани з верхньою межею пропускання молекулярної маси 10кДа, які в проміжках між операціями зберігають в 0,05М розчині гідроксиду натрію, промивають очищеною водою до зниження рН приблизно до 8. Продукт концентрують і діалізують (шляхом ультрафільтрування через мембрани з верхньою межею пропускання 10кДа) для видалення речовин із молекулярними масами менше ніж 10кДа та залишків 2-пропанолу та для заміни розчину аміаку 40мМ розчином фосфату натрію, рН 7,5. Діапа 9 86938 10 зон рН, якому віддається перевага, становить використовуючи 85%-ну фосфорну кислоту. Діапа7,5±0,2. зон рН, якому віддається перевага, становить Кінцеву затриману фракцію виділяють із мем6±0,1. бран 40мМ розчином фосфату натрію з розрахун(іі) Іонообмінне хроматографування на СМком на досягнення концентрації цільового протеїну Сефарозі FF. 3-15мг/мл. Колонку, заповнену слабко зарядженою аніоПотім розчин фільтрують, і одержаний конценнообмінною смолою – карбоксиметил-(СМ)трат зберігають в замороженому стані при темпеСефарозою для високої швидкості потоку (CMратурі приблизно - 15°С. Sepharose Fast Flow), зрівноважують 20мМ натрійСтадія II (фільтрування та іонообмінне хромафосфатним буферним розчином, рН 6. Діапазон тографування на ДЕАЕ-Сефарозі FF). рН, якому віддається перевага, становить 6±0,1. На цій стадії хроматографування г-hCG проРозчин r-hCG завантажують у верхню частину ходить через колонку, де з розчину видаляється колонки. значна частка протеїнів, інших ніж r-hCG, та нуклеКолонку промивають 20мМ натрій-фосфатним їнових кислот. Якщо фільтрування виконують при буферним розчином, рН 6. Хроматографічний кімнатній температурі, то хроматографічні стадії, процес контролюють способом УФ спектрофотоде продукт проходить через колонку, виконують в метрії на довжині хвилі 280нм. холодному приміщенні. Для елюювання продукту використовують (і) Розтоплення та нагромадження неочище130мМ натрій-фосфатний буферний розчин, рН 6. них концентратів г-hCG. Головну фракцію елюату до початку елюювання Заморожені концентрати розтоплюють і об'єдпіка відкидають. нують у загальному збірнику. Партію очищеного Збирають весь пік, який містить r-hCG. Пронефасованого r-hCG одержують з об'єднаних пардукт на цій стадії можна факультативно профільттій неочищеного концентрату r-hCG, одержаних із рувати для видалення вірусних забруднювачів. використанням культури однієї й тієї ж лінії клітин, Стадія IV (РХВЕ з оберненою фазою на силіпри цьому кількість об'єднуваних партій конценткагелі С18). рату може змінюватися. Критерієм кількості об'єдНа цій стадії рідинної хроматографії високої нуваних партій концентрату є показник максимаефективності з оберненою фазою забезпечується льної здатності зв'язування протеїну на наступній ефективне видалення залишкових кількостей дохроматографічній стадії процесу очищення (4мг мішок, що походять із культури клітин, залишків суми протеїнів на 1мг смоли). нуклеїнових кислот та ендотоксинів. Після неї ви(іі) Просвітлення фільтруванням. конують ультрафільтрування з верхньою межею Розчин r-hCG у варіанті, якому віддається пепропускання молекулярної маси 10кДА та факульревага, пропускають через фільтрувальний притативне фільтрування. стрій і промивають фільтри 40мМ розчином фос(і) Підготовка аліквотних кількостей фатунатрію, рН 7,5. Аліквотні кількості доводять до рН 5 і додають (ііі) Іонообмінне хроматографування на ДЕАЕ2-пропанол до кінцевої концентрації 15% (об'єми.) Сефарозі FF. (іі) РХВЕ з оберненою фазою на силікагелі Колонку, заповнену слабко зарядженою аніоС18 нообмінною смолою – діетиламіноетан-(ДЕАЕ)Колонку, заповнену сорбентом силікагелем Сефарозою для високої швидкості потоку (DEAEС18, спочатку зрівноважують в суміші 15% (об'Sepharose FF), зрівноважують 40мМ розчином єми.) 2-пропанолу з 0,5М буферним розчином фосфату натрію, рН 7,5. Трис-фосфату. Розчин r-hCG завантажують у верхню частину Завантажують у верхню частину колонки перколонки. шу аліквотну кількість розчину r-hCG і контролюВ колонку подають 40мМ розчин фосфату нають хроматографічний процес методом УФ спекттрію, рН 7,5. Розчин r-hCG у завантажують у верхрофотометрії. ню частину колонки. Промивають колонку тим же самим зрівноваВ колонку подають 40мМ розчин фосфату нажувальним буферним розчином. трію, pH 7,5. Хроматографічний процес контролюПотім виконують елюювання r-hCG із лінійним ють способом УФ спектрофотометрії на довжині градієнтом концентрації 2-пропанолу в рухомій хвилі 280нм. фазі (суміші 2-пропанолу з 0,5М буферним розчиГоловну фракцію елюату до початку елююном Трис-фосфату) від 15% (об'єми.) до 25% (об'вання піка відкидають. Після цього збирають неєми.). зв'язану фракцію, яка містить r-hCG. Фракції r-hCG починають відбирати, коли спекСтадія III (іонообмінне хроматографування на трофотометричний пристрій починає детектувати СМ-Сефарозі FF). відповідний пік (А280). Фракції, поглинання яких На цій хроматографічній стадії видаляється перевищує 65% максимальної висоти піка у визначна частка домішок, що походять із клітин носхідній його частині і 20% максимальної висоти сія. Стадію виконують при температурі приблизно піка у низхідній частині, збирають в один збірник. 5°С. Перевага віддається температурі в діапазоні Потім чотири збірних партії елюату, які містять 5±3°С. r-hCG, об'єднують і розбавляють еквівалентним (і) Розбавлення елюату з колонки з ДЕАЕоб'ємом води для ін'єкцій (ВДI). Сефарозою FF Продукт концентрують та діалізують (шляхом До елюату з колонки з ДЕАЕ-Сефарозою FF ультрафільтрування через мембрану з верхньою додають воду для ін'єкцій і встановлюють рН 6, межею пропускання 10кДа) проти ВДI для вида 11 86938 12 лення речовин із молекулярною масою менше Стадія III: СМ-Сефароза для великої швидко10кДа та 2-пропанолу. сті потоку (CM-Sepharose FF) (фірма Pharmacia). Після цього продукт діалізують проти 0,1М Стадія IV: Силікагель С 18 (Silica С 18), розмір буферного розчину бікарбонату амонію, рН 8. пор 300 А, розмір частинок 15-20 мкм (фірма Одержаний проміжний продукт зберігають Vydac). приблизно при +5°С або в разі необхідності замоСтадія V: Сефакрил S-200 HR (Sephacryl Sрожують. Перевага віддається температурі збері200 HR) (фірма Pharmacia). гання відповідно 5±3°С або -15°С чи нижче. Нинішні постачальники: Стадія V (ексклюзійне хроматографування на Amersham Pharmacia Biotech, Bjorkgatan 30, Sсорбенті Сефакрил S-200 HR). 751 84, Uppsala, Sweden; На цій хроматографічній стадії з розділенням Millipore Corporation, 17 Cherry Hill Drive, за розміром молекул забезпечується видалення Danvers, MA 01923, USA; залишкових кількостей домішок, що походять із Vydac, The Separation Group, 17434 Mojave St., культури клітин, потенціальних агрегатів та/або Hesperia, CA 92345, USA. вільних субодиниць. Після неї виконують ультраРезультати фільтрування з верхньою межею пропускання моМолекулярна маса та розміри молекул лекулярної маси 10кДа. Операції хроматографуSDS-PAGE вання на сорбенті Сефакрил S-200 HR та Відносну молекулярну масу r-hCG, одержаноультрафільтрування з верхньою межею пропусго за способом очищення згідно з цим винаходом, кання молекулярної маси 10кДа виконують при визначали методом електрофорезу в поліакрилатемпературі приблизно +5°С. Температурний діамідному гелі (SDS-PAGE) в порівнянні зі стандартпазон, якому віддається перевага, становить ними протеїнами з відомими молекулярними ма+5±3°С. сами. (і) Хроматографування на сорбенті Сефакрил Забарвлення індикатором брильянтовим зеS-200 HR леним (продукт фірми Coomassie) після невідновКолонку, заповнену сорбентом Сефакрил Sлювального SDS-PAGE виявило одну широку сму200 HR, зрівноважують 0,5М розчином бікарбонату гу гетеродимеру r-hCG із молекулярною масою амонію, рН 8. Перевага віддається діапазону рН приблизно 70кДа (діапазон 65-75кДа). Ідентичність 8±0,2. смуги підтверджено вестерн-блотингом. У верхню частину колонки завантажують розБіологічна активність чин r-hCG і починають елюювання 0,5М розчином Біологічна активність різних партій r-hCG після бікарбонату амонію, рН 8. Перевага віддається очищення за способом цього винаходу відображедіапазону рН 8±0,2. на в Таблиці 2. Концентрацію протеїну визначали Збирання фракції r-hCG починають із початку спектрофотометричним методом на довжині хвилі піка і продовжують до досягнення 50% максима276,5нм, а = 0,616. льної висоти піка на низхідній його частині. Середня питома активність препаратів r-hCG (іі) Ультрафільтрування з межею пропускання має особливо високе значення і досягає приблиз10кДа но 25000МО/мг. Ультрафільтрувальні мембрани з верхньою Таблиця 2 межею пропускання молекулярної маси 10кДа, які у проміжках між операціями очищення зберігають в 0,05М розчині гідроксиду натрію, промивають Номер партії r-hCG Питома активність (МО/мг) водою для ін'єкцій, доки рН не досягне приблизно ВСЕА 9901 24427 8. ВСЕА 9902 26868 Продукт концентрують і діалізують (шляхом ВСЕА 9903 25636 ультрафільтрування) проти ВДI. ВСЕА 9904 27152 Потім продукт діалізують (шляхом ультрафільВСЕА 9905 23729 трування) проти 0,01 М натрій-фосфатного буферного розчину, рН 7, і регулюють кінцеву концентКомпозиції рацію протеїнів для досягнення кінцевої Розроблено як рідкі, так і ліофілізовані компоконцентрації цільового протеїну 3,5мг/мл. зиції на основі рекомбінантного hCG високої чисОчищений нефасований розчин г-hCG доцільтоти, очищеного способом за цим винаходом. но зберігати замороженим при температурі приРідкі композиції близно -15°С. Дві рідкі композиції з активністю 10000МО/мл, Хроматографічні сорбенти приготовані у флаконах за стандартом DIN 2R із В процесі очищення можна використовувати використанням маніту або сахарози як наповнюхроматографічні сорбенти, перелічені нижче. Мовачів, випробовували на стабільність при темпежна використовувати також їх еквіваленти. ратурах 50°С, 40°С, 25°С і 4°С. Стадія І: Силікагель С4 (Silica C4), розмір пор Характеристики композицій наведено в Таб250 Å, розмір частинок 50 мкм (продукт Matrex®, лицях З і 4. фірма МШіроге) Стадія II: ДЕАЕ-Сефароза для великої швидкості потоку (DEAE-Sepharose FF) (фірма Pharmacia). 13 Інгредієнти r-hCG Сахароза орто-Фосфорна кислота Гідроксид натрію Одиниці виміру МО/мл мг/мл мг/мл 86938 14 точки зору мінімізації окиснення протеїну та утвоТаблиця 3 рення вільних субодиниць перевага віддається зберіганню в охолодженому стані. Ліофілізована композиція Кількість Ліофілізовану композицію з ефективністю 5000 МО, приготовану у флаконах за стандартом DIN 10000 2R із використанням сахарози як наповнювача, 102,6 випробовували на стабільність при температурах 0,98 50°С, 40°С, 25°С і 4°С. Характеристики композиції подано в Таблиці за потребою 5. до рН 7 Таблиця 5 Розфасовка: 0,5мл Таблиця 4 Інгредієнти r-hCG Маніт орто-Фосфорна кислота Гідроксид натрію Одиниці виміру МО/мл мг/мл мг/мл Кількість 10000 54,6 0,98 за потребою до рН 7 Розфасовка: 0,5мл Результати випробувань стабільності, одержані методами біопроб, ексклюзійної хроматографії в комбінації з рідинною хроматографією високої ефективності та рідинною хроматографією високої ефективності з оберненою фазою, показали, що композиція з манітом більш стабільна в порівнянні з композицією, що містить сахарозу. З Комп’ютерна верстка Шеверун Д. Інгредієнти r-hCG Сахароза орто-Фосфорна кислота Гідроксид натрію Одиниці виміру МО мг мг Кількість 5000 30 0,98 за потребою до рН 7 Результати випробувань стабільності, одержані методами біопроб, ексклюзійної хроматографії в комбінації з рідинною хроматографією високої ефективності та рідинною хроматографією високої ефективності з оберненою фазою, показали, що ця ліофілізована композиція зберігала стабільність при 40°С і 50°С протягом щонайменше 19 тижнів. Випробування стабільності при 25°С і 4°С на протязі б місяців не виявили ознак розкладу активної речовини. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601