Спосіб одержання протипухлинної аутовакцини

1. Спосіб одержання протипухлинної аутовакцини шляхом промивання пухлинної тканини фізіологічним розчином, її подрібнення, обробки клітин продуктами метаболізму штаму мікроорганізму Bacillus subtilis IMB В-7025 та інкубації суміші, який відрізняється тим, що як пухлинні клітини використовують клітини модельної пухлини карциноми легені Льюїсаа, резистентної до цисплатину. 2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що як продукти метаболізму використовують фільтрат культуральної рідини штаму Bacillus subtilis IMB В7025 в кількості 1мл або виділений з нього лектин в дозі 0,08-1,0мг/мл на 0,9´107 - 1,1´107 пухлинних клітин. Винахід відноситься до медицини, а саме, до онкології і стосується технології одержання протиігухлинних засобів. Підвищення ефективності лікування хворих на злоякісні новоутворення - центральна проблема і мета експериментальної і клінічної онкології. Найбільш інтенсивно розробляються методи імунотерапії пухлин, які ґрунтуються на специфічній індукції протипухлинної резистентності організму шляхом імунізації протипухлинними вакцинами, що містять пухлиноасоційовані антигени. Такі вакцини являють собою вбиті і модифіковані вірусами чи мікробами пухлинні клітини або їх фрагменти. Переваги вакцин на основі аутологічних пухлинних клітин полягають в тому, що вони містять всі наявні антигени пухлини. При їх застосуванні відпадає потреба в попередній ідентифікації антигенів, які потрібно включити у вакцину. Відомий спосіб одержання протипухлинної аутовакцини шляхом промивання пухлинної тканини фізіологічним розчином, її подрібнення та обробки пухлинних клітин фільтратом культуральної рідини штаму мікроорганізму В. mesentericus АБ-56 [1]. Також відомий спосіб одержання протипухлинної аутовакцини шляхом обробки пухлинних клітин поліпептидом кислої природи, виділеним з культуральної рідини штаму мікроорганізму В. mesentericus АБ-56 [2]. Однак, при одержанні фільтрату чи поліпептиду культуральної рідини за такими способами використовується дороге поживне середовище. Крім того, ці протипухлинні аутовакцини не мають необхідної на сьогодні профілактичної та терапевтичної ефективності. (19) UA (11) 88842 (13) C2 (21) a200807969 (22) 12.06.2008 (24) 25.11.2009 (46) 25.11.2009, Бюл.№ 22, 2009 р. (72) ЧЕХУН ВАСИЛЬ ФЕДОРОВИЧ, ЧЕРЕМШЕНКО НАДІЯ ЛЕОНІДІВНА, КУЛІК ГАЛИНА ІВАНІВНА, ЛІСОВЕНКО ГАЛИНА СТЕПАНІВНА, БАЗАСЬ ВОЛОДИМИР МИКОЛАЄВИЧ, ТОДОР ІГОР МИКОЛАЄВИЧ, ПОТЕБНЯ ГРИГОРІЙ ПЛАТОНОВИЧ (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО НАН УКРАЇНИ (56) UA 2001064158 A 16.12.2002 UA 2002010695 A 15.11.2002 UA 2001075155 A 17.02.2003 UA 2001053528 A 16.12.2002 3 Найбільш близьким способом одержання протипухлинної аутовакцини до способу, що заявляється, є спосіб приготування протипухлинної аутовакцини шляхом обробки пухлинних клітин продуктами метаболізму штаму B.subtilis 1MB В7025. В якості продуктів метаболізму використовують фільтрат культуральної рідини штаму B.subtilis 1MB В-7025, а також одержану з нього біологічно активну речовину - цитотоксичний лектин [3, 4]. Даний фільтрат і лектин не тільки девіталізували пухлинні клітини різного гістогенезу (саркома37, рак Ерліха, лімфома NK/Ly, лімфосаркома ОН2, плазмоцитома ОН-3, карцинома Льюїса) in vitro, але попередньо аглютинували і частково їх лізували, підсилюючи при цьому імуногенність клітин. Крім того, вони є більш дешевими [5,6]. Однак, в зв'язку з природною або набутою лікарською резистентністю пухлинних клітин до цитостатиків, зокрема до цисплатину ці протипухлинні аутовакцини не забезпечують необхідну на сьогодні профілактичну і терапевтичну ефективність. Цисплатин (ЦП) відноситься до числа найбільш ефективних протипухлинних засобів, але його застосування при терапії злоякісних новоутворень обмежується досить швидкою природною або набутою резистентністю пухлинних клітин до дії цього препарату [7-12]. В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу одержання протипухлинної аутовакцини для лікування хіміорезистентних пухлин, зокрема до ЦП. Поставлена задача вирішується тим, що в способі одержання протипухлинної аутовакцини використовують резистентний до ЦП штаммодельну карциному легені Льюїса (ХР КЛЛ), який одержують шляхом послідовних перещеплень пухлинних клітин, отриманих від мишей, котрим було проведено курс хіміотерапії. Курс хіміотерапії проводився таким чином: мишам лінії С57В1 перещеплювали суспензію клітин чутливого штаму КЛЛ внутрішньом'язево в кількості 1,5´106 клітин. Тварин розділяли на дві групи - контрольну і дослідну. Мишам дослідної групи на 7-9 доби після прищеплення КЛЛ починали вводити ЦП (ЕВЕWE, Austria) в дозі 1,2мг/кг внутрішньочеревинно через день (всього 5 ін'єкцій). Пухлини, які рецидивували після закінчення хіміотерапії (23-25 доба після перещеплення), використовували для приготування суспензії клітин, що йшла на перещеплення мишам другої серії експериментів, які також одержували ЦП за описаною вище схемою. Всі наступні серії дослідів були аналогічні попередній. Всього проведено 27 курсів хіміотерапії ЦП [11]. Спосіб одержання протипухлинної аутовакцини здійснюють таким чином. Хіміорезистентну пухлинну тканину (ХР КЛЛ) тричі промивають стерильним фізіологічним розчином, подрібнюють, клітини обробляють фільтратом або цитотоксичним лектином штаму B.subtilis 1MB В-7025, одержану суміш інкубують в термостаті при 37°С протягом 0,5-1,0 години, періодично струшуючи. Для приготування 1мл вакцини до 0,9´107-1,1´107 пухлинних клітин додають 1мл фільтрату, або 0,081,0мг/мл лектину. Після закінчення інкубації вак 88842 4 цину перевіряють на стерильність та життєздатність пухлинних клітин. Виготовлена за таким способом протипухлинна аутовакцина (ПАВ) вірогідно гальмує ріст відповідної пухлини, збільшує середню тривалість життя (СТЖ) мишей, зменшує частоту виникнення метастазів легені та їх об'єм, що обумовлено підвищенням активності клітин-ефекторів протипухлинного імунітету. Ефективність та механізми дії ПАВ досліджували на експериментальних тваринах - мишах лінії С57ВІ/6, масою 20-22г розведення експериментальної бази ІЕПОР ім.Р.Є.Кавецького НАН України. При цьому застосовували профілактичну та терапевтичну моделі використання ПАВ, тобто вакцинацію тварин проводили до/або після прищеплення пухлин. Було проведено порівняльне вивчення впливу ПАВ, виготовлених за допомогою фільтрату або цитотоксичного лектину B.subtilis В-7025 з клітин чутливого до ЦП штамів модельної КЛЛ (ХЧ КЛЛ) вакцина-прототип та резистентного до ЦП штамів модельної КЛЛ (ХР КЛЛ) - вакцина-заявлена, на перебіг пухлинного процесу та основні реакції протипухлинного захисту. Зокрема, досліджували ефективність цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ), макрофагів (Мф) та природних кілерів (ПКК). Для характеристики перебігу пухлинного процесу визначали частоту прищеплюваності та гальмування росту пухлин, СТЖ мишей, розміри (об'єми) первинної пухлини та кількість і розміри метастазів. Розраховували індекси гальмування росту пухлин та індекси інгібіції метастазування в порівнянні з відповідним контролем. Суть способу пояснюють приклади конкретного виконання. Приклад 1. Ефективність вакцин на основі цитотоксичних лектинів (ЦЛ) B.subtilis B-7025 в профілактичному експерименті. Дослідним мишам підшкірно (п/ш) 3-разово по (0,3;0,5;0,5мл) вводили ПАВ, тваринам групи "контроль прищеплення" відповідно вводили 0,9% розчин хлориду натрію (ФР). На 29-у добу після завершення вакцинації було прищеплено в стегновий м'яз по 4,5´105 клітин відповідних штамів КЛЛ, мишей залишали під наглядом до загибелі та аналізували показники СТЖ. При дослідженні імунних показників після вакцинації, але до прищеплення пухлини встановлено, що цитотоксична активність ефекторів клітинного протипухлинного імунітету у мишей, які одержали ПАВ на основі хіміочутливої (ХЧ) і хіміорезистентної (ХР) КЛЛ, зростає (Фіг.1). Це в першу чергу стосується ЦТЛ та перитонеальних Мф. Між вакцинованими мишами спостерігалась суттєва різниця - у тих, що одержували ПАВ з ХР КЛЛ, в порівнянні з групою імунізованих ПАВ з ХЧ КЛЛ зареєстровано високу активність Мф. Результати оцінки впливу попередньої імунізації ПАВ з ХЧ та ХР КЛЛ на ріст відповідних варіантів КЛЛ наведені в табл.1. 5 88842 Таблиця 1 Перебіг росту ХЧ і ХР КЛЛ у вакцинованих та контрольних мишей С57ВІ на 38 добу пухлинного росту Імунізація Вакцина прототип ФР(контр) Вакцина прототип Вакцина заявлена ФР(контр) Індекс гаПрищепЧастота льмування лення прищеплення пухлинного пухлини пухлин, % росту, % 42,9±12,0 67,0 ХЧ КЛЛ 85,7±8,5 61,5±12,2 57,0 ХР КЛЛ 54,5±13,3 78,0 84,6±9,0 У вакцинованих мишей зареєстровано виразне гальмування пухлинного росту: об'єм первинних пухлин протягом 11-38 доби був суттєво нижчим, ніж у відповідному контролі. Найкращий ефект спостерігали у мишей, імунізованих ПАВ з ХР КЛЛ, яким було прищеплено ХР КЛЛ - індекс гальмування пухлинного росту на 21-38 добу перевищував 75-78%. У мишей, імунізованих вакциною з ХЧ КЛЛ, після прищеплення такої ж ХР КЛЛ відповідний показник сягав 54-57% (Фіг.2). Гальмування пухлинного росту у вакцинованих мишей супроводжувалось статистично достовірним подовженням середньої тривалості життя (СТЖ) (табл.2). Слід підкреслити досить високі показники СТЖ у вакцинованих тварин після прищеплення їм гомологічного варіанту КЛЛ, які при використанні ПАВ з ХЧ і ХР КЛЛ на 74,7 і 85,44% перевищували показники відповідного контролю. Таблиця 2 СТЖ мишей, імунізованих ПАВ з клітин ХЧ (прототип) або ХР КЛЛ (заявлена), після прищеплення пухлини Імунізація Вакцина-прототип ФР Вакцина-прототип Вакцина-заявлена ФР Індекс модуляції, % 80,20±9,04 +74,7 ХЧ КЛЛ 45,91±3,46 65,52±10,71 +68,47 ХР КЛЛ 72,10±8,72 +85,44 38,88±0,82 Пухлина Х±m Імунологічні обстеження після прищеплення КЛЛ дозволили зареєструвати відмінності, як між вакцинованими та контрольними тваринами, так і між групами вакцинованих мишей. Так, у тварин з ХЧ пухлиною, імунізованих вакциною з ХЧ КЛЛ, активність ЦТЛ на 12 добу була на рівні відповідного контролю, але в подальшому (25 та 39 доба) цей показник суттєво перевищував контрольні. У вакцинованих мишей з ХР КЛЛ активність ЦТЛ в 1,5-1,8 рази перевищувала контрольні показники. Активність Мф у контрольних мишей на 25 і 38 добу знижувалась до 4,7-10%. У тварин, які одержали ПАВ з ХЧ та ХР КЛЛ, активність Мф на відміну від контролю залишалась підвищеною (на 26,5 та 33,9%, відповідно). Всі вакциновані миші, у яких пухлина не розвинулась, і в ці строки також мали підвищений показник активності Мф. Подібні закономірності відзначені і при аналізі активності ПКК. 6 Так, у мишей, імунізованих вакциною з ХЧ КЛЛ, яким прищеплено ХР КЛЛ, на 38 добу пухлинного росту, активність ПКК, як і Мф зменшувалась до контрольного рівня. Цитотоксична активність ПКК у мишей, імунізованих вакциною ХР КЛЛ, з прищепленою ХР КЛЛ, в ці строки спостереження була найвищою - 44,8±6,6%, що співпадало з високими показниками СТЖ. Таким чином, імуногенність ПАВ, виготовлених з клітин чутливого та резистентного до ЦП штамів КЛЛ, відрізняється - вакцина, виготовлена з клітин ХР КЛЛ (заявлена), в більшій мірі впливає на активність Мф і ПКК в порівнянні з вакциною ХЧ КЛЛ і більш виражено гальмує ріст прищепленої ХР КЛЛ, ніж вакцина з вихідного штаму КЛЛ (прототип). Приклад 2. Протипухлинна активність вакцин на основі цитотоксичного лектину B.subtilis B-7025. виготовлених з відповідних варіантів карциноми легені Льюїса (ХЧ КЛЛ і ХР КЛЛ), в терапевтичному експерименті. Протипухлинну активність ПАВ, виготовлених за допомогою лектину B.subtilis B-7025 з клітин ХЧ і ХР штамів пухлини КЛЛ досліджували за терапевтичною схемою експерименту. Прищеплення клітин вихідного ХЧ штаму КЛЛ, та резистентного ХР штаму КЛЛ здійснювали загальноприйнятим методом - суспензію клітин КЛЛ, вводили мишам в стегновий м'яз в кількості 4,5´105 клітин. Після прищеплення відповідного варіанту КЛЛ, ПВ вводили п/ш, 5-разово, мишей залишали під наглядом та аналізували показники перебігу пухлинного процесу. Результати оцінки частоти виходу та гальмування росту пухлин (29 доба після прищеплення) свідчать про більшу ефективність ПАВ з гомологічних штамів КЛЛ. Аналіз показників СТЖ цілком підтвердив відмічені закономірності (табл.3). Таблиця 3 Ефективність ПАВ після прищеплення відповідних варіантів карциноми легені Льюїса (ХЧ і ХР КЛЛ) Частота Гальмування прищеплення росту пухлини, пухлини, % % Вакцина-прототип 84,6 24,14 ХЧ КЛЛ Вакцина-заявлена 69,3 16,3 Вакцина-прототип 78,6 34,6 ХР КЛЛ Вакцина-заявлена 57,1 51,6 Пухлина Лікування Результати оцінки частоти виходу пухлин дозволяють зробити висновок про більшу ефективність ПВ з ХР КЛЛ. При використанні ПВ з ХЧ КЛЛ гальмування росту ХЧ КЛЛ та ХР КЛЛ складало 24,14% і 34,62% відповідно. Аналогічні показники для ПВ з ХР КЛЛ сягали 16,32% і 51,64%, тобто вакцина з ХР КЛЛ суттєво гальмувала ріст гомологічної пухлини і майже не впливала на ріст вихідного штаму ХЧ КЛЛ. Аналіз показників СТЖ цілком підтвердив відмічені закономірності (табл.4). 7 88842 8 Таблиця 4 СТЖ мишей з ХЧ і ХР КЛЛ, які одержували вакцини з відповідних варіантів КЛЛ на основі лектинів B.subtilis B-7025 Пухлина ХЧ КЛЛ ХР КЛЛ Лікування Вакцина-прототип Вакцина-заявлена Контр(ФР) Вакцина-прототип Вакцина-заявлена Контр(ФР) СТЖ, діб Х±m 53,85±4,03 45,15±4,40 37,50±1,07 47,15+4,21 55,86±5,09 38,62±1,39 Таблиця 5 Динаміка росту хіміорезистентної КЛЛ при лікуванні мишей вакцинами, виготовленими з ХЧ і ХР КЛЛ на основі лектину B.subtilis B-7025 3 ІМ, % +43,6 +20,4 +22,1 +44,6 Отже згідно з показниками СТЖ, лікування тварин з ХР КЛЛ суттєво збільшувало їх тривалість життя при використанні вакцини з ХР КЛЛ, показники СТЖ мишей на 44,6% перевищували контрольні і сягали 55,86±15,09 при 38,62±1,39 діб в "контролі прищеплення" (р