Спосіб одержання протипухлинної автовакцини

Спосіб одержання протипухлинної автовакцини шляхом промивання пухлинної тканини фізіологічним розчином, и подрібнення з наступною обробкою клітин протеолітичним ферментом, який відрізняється тим, що протеолітичний гідролізат фракціонують і концентрують глікопептиди з молекулярною масою 12-100кДа Винахід відноситься до галузі біотехнологм і стосується одержання протипухлинних засобів та може використовуватися у медицині, а саме в онкологи, для одержання специфічного протипухлинного імунітету ВІДОМІ способи одержання вакцин -на основі генної інженери з використанням рекомбінантних білків [1, 2] або нуклеїнових кислот [3] В більшості випадків вакцини, одержані такими способами, несуть лише одну або декілька антигенних детермінант, і тому пухлинні клітини, що позбавились такого антигену внаслідок мутацій, що супроводжують пухлинну прогресію, виходять з-під імунного нагляду Це значною мірою знижує ефективність подібних вакцин Відомий також спосіб одержання протипухлинної вакцини шляхом обробки пухлинних клітин фільтратом культурального середовища мікроорганізму Bacillus mesentencus АБ-56 та інкубації суміші протягом 1 - 2 годин [4], Для одержання вакцини таким способом необхідно від 4 до 10 годин, при цьому як профілактична так і лікувальна ефективність м невисока Найближчим за сукупністю ознак аналогом є спосіб одержання протипухлинної вакцини, шляхом обробки попередньо подрібненої пухлинної тканини поліпептидом кислої природи з молекулярною масою 26500 дальтон, виділеним із фільтрату культуральної рідини мікроорганізму штаму Bacillus mesentencus АБ-56 з наступною інкубацією протягом 1 - 2 годин [5] Цей спосіб ми обрали прототипом Причини, що перешкоджають досягненню результату, який одержують при використанні заявленого винаходу є відсутність етапу фракціонування протеолітичного гідролізату пухлинних клітин, в результаті чого залишається велика КІЛЬКІСТЬ баластних речовин білків, нуклеїнових кислот, нуклеотидів, амінокислот і т п , а також продуктів мікробного походження та культурального середовища, які вводяться під час імунізації з використанням вакцини за способом - прототипом, що може викликати алергічні реакції, явища інтоксикації та ІНШІ побічні ефекти Відомо, ЩО фільтрати культурального середовища мають непостійний склад, і неоднакову ферментативну активність Крім того, наявність великої КІЛЬКОСТІ складників не дозволяє відрізнити явища специфічного протипухлинного імунітету від неспецифічних реакцій, що супроводжуються зростанням протипухлинної резистентності В основу винаходу поставлено задачу розробити такий спосіб одержання протипухлинної вакцини шляхом часткового протеолізу пухлинних клітин з наступним фракціонуванням протеолітичного гідролізату, який забезпечить одержання з пухлинних клітин антигенних структур, придатних для використання в якості активних імуногенів Оскільки культуральне середовище мікроорганізму Вас, mesentencus АБ-56 виявляє високу протеолітичну активність і містить декілька протеолітичних ферментів, що руйнують пухлинні клітини, було розроблено методику одержання імуногену на о 00 О (О ю 57608 колонці з ДЕАЕ - целюлозою Відбирають фракції, основі пептидів, що утворюються внаслідок протещо містять полісахаридний компонент їх концентолітичного гідролізу пухлинних клітин рують, тричі промивають 95% етанолом і зберігаЦе досягається шляхом обробки суспензії пухють в скляних ампулах при t 4 - 6°С Перед вжилинних клітин протеолітичним ферментом за строванням етанол ВІДДІЛЯЮТЬ центрифугуванням, го контрольованих умов з наступним фракціонуосад глікопептиду розчиняють у стерильному ванням продуктів протеолізу та концентруванням 0,85% розчині хлориду натрію і використовують пептидів, що несуть на собі вуглеводневий комподля імунізації нент Суть запропонованого винаходу "Спосіб одерПриклад 2 жання протипухлинної автовакцини" полягає в Мишам лінії СбтВІаск трикратно 1 раз на тижнаступному пухлинну тканину промивають сольодень під шкіру вводять одержаний глікопептид у 5 вим розчином, подрібнюють і обробляють пухлинні дозі, еквівалентній 10 пухлинних клітин Через З клітини протеолітичним ферментом за строго контижні тваринам прищеплюють пухлину молочної трольованих умов, далі одержаний протеолітичний залози Са 755 Динаміка росту пухлини проілюстгідролізат фракціонують і концентрують глікопепрована на фіг 1 тиди з молекулярною масою 12 - ЮОкДа Як видно з наведених даних, у тварин, імунізованих глікопептидним комплексом, спостерігається Глибину гідролізу контролюють методом елекгальмування росту пухлин (крива 3), виражене трофорезу в поліакриламідному гелі в присутності значно більше, ніж при імунізації гідролізатом клідодецилсульфату натрію При цьому основна матин (крива 2) са утворених продуктів має знаходитись у межах 12 - ЮОкДа 3 утвореної в'язкої суміші видаляють Приклад З ДНК та низькомолекулярні продукти відомими меМишам-самкам, вагою 20 - 25г, проводять імутодами Одержаний розчин олігопептидів піддають нізацію глікопептидним комплексом, одержаним з фракціонуванню за допомогою сульфату амонію, а клітин меланоми В 16 у зростаючих дозах, еквівапотім, після видалення сольового компоненту, мелентних 1 х 1 0 5 - 4 х 1 0 5 клітин з інтервалом між тодами рідинної хроматографії з нього виділяють введеннями в один тиждень фракції, що містять вуглеводневий компонент 16 v mm Фракцію глікопептидів тричі промивають етанолом, розфасовують у стерильні ампули і зберіга12ють при температурі 4 - 6° Перед застосуванням 10 суспензію глікопептидів ВІДДІЛЯЮТЬ від етанолу шляхом центрифугування, осад розчиняють у стерильному 0,85% розчині хлориду натрію і використовують для протипухлинної імунізації Винахід ілюструють приклади Приклад 1 1г пухлинної тканини подрібнюють ножицями, тричі відмивають фізіологічним розчином, забуференим до рН 7,5 фосфатним буфером Одержаний промитий осад заливають 10мл 0.15М фосфатного буферу рН 9,5, що містить 0,1мг/мл кристалічного трипсину Суспензію клітин вміщують у термостат при t° 37°C і витримують на протязі 1 години При цьому суспензія перетворюється на густу в'язку рідину Після видалення ДНК шляхом центрифугування проводять фракціонування одержаного гідролізату сульфатом амонію Збирають фракцію, що осаджується в межах 40 - 80% насичення Осад розчиняють у невеликій КІЛЬКОСТІ 0,05 фосфатного буферу і піддають фракціонуванню на 13 16 19 21 23 26 28 30 тривалість експерименту ідібі Рис 1 Вплив імунізацн глікопептидним комплексом та гідролізатом пухлинних клітин на ріст експериментального раку молочної залози Са 755 і - контроль 2 - гідролізат пухлинних КЛІТИН, 3 - пмопептидний комплекс Через три тижні після останньої імунізації мишам прищеплюють меланому В 16 в КІЛЬКОСТІ 3 х 105 пухлинних клітин на одну мишу Тварин забивають через 21 день після перещеплення Об'єм пухлин та їх вага наведені у таблиці 1 Як видно з даних таблиці, у тварин, яких імунізували глікопептидним комплексом, спостерігається гальмування пухлинного росту Крім того, у групі вакцинованих мишей у 30% тварин пухлини не розвинулися Таблиця 1 Вплив імунізації глікопептидним комплексом на ріст експериментальної меланоми В 16 мишей Середній об'єм пухлин Середня масапухлин Відсоток тварин з пухлинами Контроль 826,8мм" 4,6г Вакцина 261,6мм", 2,4г Різниця % 100 70 ЗО Одержані дані свідчать про ДОЦІЛЬНІСТЬ використання глікопептидного комплексу, одержаного з пухлинних клітин, як імуногену для вакцинотерапії пухлинного росту 69 47,8 СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1 Govmdaswami R, Rao K, Dongxu Q A novel and effecient method for synthetic carbohydrate conjugate vaccine preparation synthesis of sialyl Tn-KLH 5 57608 6 conjugate using a 4-(4-N-maleimidomethyl) кислот в соматических клетках человека и животcyciohexane -1-carboxyl hydrazide (MMCCH) linker ных Мол биология 1997, 31 209-15 arm Glycoconjugate J 1998, 15 217-21 4 Затула Д Г Канцерогенез и микроорганизмы В 2 Hanharan К, Braslawsky G, Barnett RS Tumor кн «Канцерогенез и антиканцерогенез » Киев Наregression in mice following vaccination with human ук, думка, 1979, с 326-396 papillomavirus E7 recombinant protein in PROVAX 5 Патент України №1667 на винахід "Спосіб одеIntJ Oncol 1998, 12 1229-35 ржання протипухлинної вакцини", Бюл №3, 3 Дебабов В Г ДНК-вакцинация и генотерапия на 25 10 94 основе транзиентной экспрессии нуклеиновых Комп'ютерна верстка О Воробей Підписано до друку 05 07 2003 Тираж 39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна