Спосіб швидкого виявлення вірусів грипу

1. Спосіб швидкого виявлення вірусів і/або вірусних частинок грипу, що містять гемаглютинін та нейрамінідазний компонент, який включає наступні стадії: a) зв'язування вірусів і/або вірусних частинок з основою, що містить щонайменше один тип вуглеводного рецептора, вибраного з групи, що складається з природних або синтетичних олігосахаридів, які сполучені або знаходяться у композиції з глікопротеїнами, такими як глікофорин, а1-кислий глікопротеїн, а2-макроглобулін, овомукоїд, та їх поєднаннями, вуглеводний рецептор основи зв'язується з гемаглютиніновим компонентом вірусів і/або вірусних частинок; b) взаємодії нейрамінідазного компонента зв'язаних вірусів і/або вірусних частинок з міченим ферментним субстратом, що генерують детектований сигнал; і 2 (19) 1 3 92393 4 a) основу, що містить щонайменше один тип вугречовин для напівкількісної оцінки вмісту вірусу у леводного рецептора, вибраного з групи, що склапробі. дається з природних або синтетичних олігосаха17. Система виявлення за п. 14 і/або 16, у якій ридів, які сполучені або знаходяться у композиції з зазначена основа містить щонайменше два спеглікопротеїнами, такими як глікофорин, а1-кислий цифічних рецептори різних підтипів специфічності глікопротеїн, а2-макроглобулін, овомукоїд, та їх для одночасного виявлення вірусів, що належать поєднаннями, до різних підтипів. вуглеводний рецептор основи зв'язується з гемаг18. Система виявлення за будь-яким з пп. 16-17, у лютиніновим компонентом вірусів і/або вірусних якій системою після виявлення присутності вірусів частинок; і/або вірусних частинок служить контейнер для b) мічений ферментний субстрат, який взаємодіє з проб та переносна установка для підтверджуючих нейрамінідазним компонентом, генеруючи таким тестів, таких як полімеразна ланцюгова реакція зі чином детектований сигнал. зворотною транскрипцією. 15. Система виявлення за п. 14, у якій зазначена 19. Застосування системи виявлення за будь-яким основа поміщена у пластиковий контейнер з вікз пп. 14-18 для виявлення вірусів і/або вірусних ном для зчитування результатів тесту з контролем частинок грипу у пробах у тварин і/або людини, проби та позитивним контролем. таких як мазки, фекалії та кров, у пробах навколи16. Система виявлення за п. 14 і/або 15, у якій шнього середовища, і/або як систему раннього зазначена основа містить щонайменше дві різних попередження появи високопатогенних підтипів кількості зазначених специфічних зв'язувальних вірусів. Даний винахід стосується способів швидкого визначення вірусів і/або вірусних частинок грипу, що містять гемаглютинін або нейрамінідазний компонент, при цьому вказаний спосіб включає зв'язування вірусів і/або вірусних частинок з основою за допомогою специфічної зв'язувальної молекули, яка зв'язується з гемаглютиніновим компонентом вірусів і/або вірусних частинок, і визначення зв'язаних вірусів і/або вірусних частинок за допомогою реакції нейрамінідазного компонента з ферментним субстратом, що приводить до детектованого сигналу. Даний винахід також стосується системи швидкого визначення вірусів грипу і/або вірусних частинок, у якій використовується спосіб за винаходом, та застосування системи детекції за винаходом. Всі віруси пташиного грипу (АІ) належать до вірусів типу А у сімействі вірусів Orthomyxoviridae, і всі відомі штами вірусу грипу А інфікують птахів. Вірус грипу типу А підрозділяють на підтипи залежно від білків гемаглютиніну (Н) та нейрамінідази (N), виступаючих з центрального кору вірусу. Існує 16 типів Η та до 9 підтипів Ν, що дає можливість для 144 різних комбінацій Η і N. Пташиний грип (також відомий як вірус грипу А, грип типу А або грип виду А) є грипом, що викликається типом вірусу грипу, який переноситься птахами, але також може заражати декілька видів ссавців. Пандемія грипу - це великомасштабна епідемія вірусу грипу, наприклад, як епідемія іспанки у 1918р. Всесвітня Організація охорони здоров'я (WHO) попереджає, що існує значний ризик пандемії грипу протягом наступних декількох років. Одним з найбільш небезпечних вірусів є підтип A (H5N1) пташиного грипу. H5N1 є типом вірусу пташиного грипу, який за рахунок дрейфу генів мутував у велику кількість високопатогенних форм, але всі вони у даний час належать до генотипу Ζ вірусу пташиного грипу Η5Ν1. Генотип Ζ з'явився у 2002 р. шляхом рекомбінації більш ранніх високопатогенних генотипів Η5Ν1, які вперше були виявлені у птахів в Китаї у і 996 році та у людини в Гонконзі у 1997р. Віруси Η5Ν1 інфекцій людини та близько споріднені віруси пташиного грипу, виділені у 2002 та 2004pp., належать до одного генотипу, який часто називається генотипом Z. Підтипами пташиного грипу, підтвердженими у людей, які, як відомо, привели до великого числа людських смертей, є: H1N1, що викликав іспанку, H2N2, що викликав пташиний грип, H3N2, що викликав гонконгівський грип, H5N1, H7N7, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7. Щоб швидко відреагувати на появу нового штаму грипу, що мутував і є вірулентним, здатного передаватися від людини до людини, потрібний швидкий та надійний метод аналізу виявлення, чи заражена людина або тварина вірусом. Лабораторні методи виявлення вірусів, що існують у даний час, у пробах з навколишнього середовища, у тварин і людини є трудомісткими та тривалими за часом. В US-B-6 503 745 описані сполуки циклопентану і циклопентену, а також їх застосування у способі виявлення вірусів грипу. Вірус захоплюється за допомогою покритої фетуїном поверхні, і детекцію проводять міченою композицією, яка зв'язується з нейрамінідазою. Доктор Нойола та ін. описують у Journal of Clinical Microbiology, 2000, стор.1161-1165, гранули, покриті фетуїном. Фетуїн також виступає в ролі субстрату для нейрамінідази, і детекцію проводять за допомогою аглютинації. В US-A-2003/0129618 описані способи і композиції для детекції аналогічним способом за допомогою флуоресценції, що відбувається у полімерному матеріалі у відповідь на вибіркове зв'язування аналізованої речовини з полімерними матеріалами. Зокрема, цей винахід дозволяє визначити за допомогою флуоресценції реакцій, що модифікують мембрану, та аналізованих речовин, відповідальних за такі реакції, і для спостереження діючих інгібіторів. 5 92393 6 Всі відомі та доступні підходи у цій галузі заУ винаході зокрема використовують вуглеводсновані або на використанні антитіл до вірусних ний рецептор, що містить мотив 2-3Gal. Згідно з епітопів, або на звичайних тестах на нейрамінідазу одним із варіантів здійснення винаходу (дот-блот (NA). підхід), зв'язування вірусів і/або вірусних частинок Головним недоліком методів, що використодосягається шляхом поміщення вірусів і/або вірусвують антитіла, заснованих на техніці розтікання них частинок, що містять пробу, на основу у викраплі рідини, або інших типів аналізу є нестабільгляді плями. Згідно з винаходом зв'язування віруність реагентів з антитіл. сів і/або вірусних частинок досягається Крім того, більшість імунологічних методів зануренням вірусів і/або вірусних частинок, що аналізу, доступних у даний час, показують специмістять зразок, у згадану основу за методом так фічно грипу А, а не H5N1. До того ж використання званої техніки розтікання краплі рідини. В іншому антитіл неминуче веде до підвищення вартості варіанті здійснення винаходу мічений ферментний аналізу. субстрат нейрамінідазного компонента осаджуєтьГоловним недоліком тестів NA, специфічних ся на місці зв'язування вірусу і/або вірусних частидо вірусів грипу, є необхідність використання донок. рогого, використовуваного при сучасному рівні Ще в одному варіанті здійснення даного винатехніки, субстрату реагенту, який повинен бути ходу ферментний субстрат помічений хромогенчастково метилованим. ною групою, і реакція з нейрамінідазою викликає Даний винахід вирішує ці проблеми шляхом зміну кольору згаданого ферментного субстрату. забезпечення способів швидкого визначення віруЯк ферментний субстрат можуть бути використані, сів і/або вірусних частинок грипу, системи виявокрім інших, наступні хромогенні похідні Nлення, у якій використовується вказаний спосіб, а ацетилнейрамінової кислоти, зокрема, 5-бромо-4також застосування вказаного способу визначенхлор-3-індоліл- -ацетилнейрамінова кислота. Як ня, як зазначено у формулі винаходу. альтернатива, реакція з нейрамінідазою викликає В описі винаходу будуть використані наступні специфічний флуоресцентний сигнал, якщо як абревіатури: 3'SLN = Neu5Ac 2-3Ga1p1-4GlcNAc; мітка використовуються підхожі флуоресцентні НА = гемаглютинін; HAR = реакція гемаглютинації; молекули. LOD = межа виявлення; ΝΑ = нейрамінідаза; TCID Спосіб за винаходом може здійснюватися за = доза інфекції у культурі тканин; TN буфер = 0,02 допомогою системи швидкого виявлення вірусів Μ Трис-НСІ (рН 7,2) з 0,1 Μ NaCl. і/або вірусних частинок грипу за винаходом. СисВинахід стосується способу швидкого виявтема включає систему швидкого виявлення вірусів лення вірусів і/або вірусних частинок грипу, який і/або вірусних частинок грипу способом за винаховключає наступні етапи: дом, причому вказана система містить: a) зв'язування вірусів або вірусних частинок з a) основу, що містить щонайменше один тип основою, що містить щонайменше один тип вуглевуглеводного рецептора, обраного з групи, що водних рецепторів, обраних з групи, що складаскладається з природних або синтетичних олігосається з природних або синтетичних олігосахаридів, харидів, які сполучені або знаходяться у композиякі кон'юговані або розташовані у композиції з гліції з глікопротеїнами, такими як глікофорин, а1копротеїнами, такими як глікофорин, а1-кислий кислий глікопротеїн, а2-макроглобулін, овомукоїд глікопротеїн, а2-макроглобулін, овомукоїд та їх та їх сполученнями, вуглеводний рецептор основи сполученнями, приєднує до гемаглютинінового компонента вірусів вуглеводний рецептор основи зв'язується з і/або вірусних частинок; гемаглютиніновим компонентом вірусу і/або вірусb) мічений ферментний субстрат, який реагує ної частинки; з нейрамінідазним компонентом, генеруючи таким b) реакцію нейрамінідазного компонента зв'ячином детектований сигнал. заних вірусів і/або вірусних частинок з їх міченим Зокрема, основа поміщається у пластиковий ферментним субстратом, яка викликає генеруванконтейнер з вікном для зчитування результатів ня детектованого сигналу; і тесту з контролем проби та позитивним контроc) детектування сигналу, генерованого на еталем. Основа містить, зокрема, щонайменше дві пі b). різних кількості згаданих специфічних зв'язувальЗокрема, можуть бути виявлені віруси і/або віних речовин для напівкількісної оцінки вмісту вірурусні частинки грипу, що містять всі відомі підтипи су у пробі. В іншому варіанті здійснення основа Avian Influenza (ΑΘ). містить щонайменше два специфічні рецептори В іншому варіанті здійснення винаходу віруси різних підтипів специфічності для одночасного і/або вірусні частинки грипу містять конкретний виявлення вірусів, що належать до різних підтипів. підтип або групу підтипів. Спосіб може використоСистемою детекції за винаходом служить контейвуватися для виявлення вірусів і/або вірусних часнер для проб та переносна установка для підтвертинок грипу, що містять високопатогенний варіант. джуючих тестів, таких як полімеразна ланцюгова Винахід може зокрема здійснюватися з оснореакція зі зворотною транскрипцією, після вияввою, яка являє собою хроматографічний папір або лення присутності вірусів і/або вірусних частинок. мембрану. Такі матеріали добре відомі фахівцям у Також, відповідно до винаходу, система детеданій галузі. Згідно з винаходом можна здійснювакцій, що заявляється, може використовуватися для ти ковалентне зв'язування або фізичне адсорбувиявлення вірусів і/або вірусних частинок грипу у вання вуглеводного рецептора, як вказано вище, з пробах у тварин і/або людини, таких як мазки, феосновою. калії та кров, у пробах навколишнього середови 7 92393 8 ща, і/або як система раннього попередження поядані і розчин утримувався 18 год. при кімнатній ви високопатогенних підтипів вірусів. температурі, після чого застосовувалася гельпроГемаглютинін (НА) і нейрамінідаза (NA) присуникна хроматографія на сефарозі LH, вихід реакції тні на поверхні вірусів грипу. НА викликає зв'язу~ 90%. вання вірусів з сіалілвмісними клітинними рецепПриклад 2: торами, a NA стимулює доступ вірусу до клітинВиявлення вірусів грипу у рідині алантоїса мішеней і сприяє вивільненню вірусу із заражених способом та тест-системою за винаходом клітин та природних інгібіторів [Matrosovich, M.N., Набір: Matrosovich, Τ.Υ., Gray, Т., Roberts, N.A., Klenk, 1. Тест-смужка H.D., 2004: J. Virol. 78(22) 12665-7], тобто НА зв'я2. Буфер для проби буфер № 1 зує рецептори, a NA руйнує рецептори. Важливою 3. Контрастний буфер буфер № 2 умовою для ефективної реплікації вірусів є спільна 4. Буфер промивки А буфер № З дія НА та NA, і у різних видів відношення цих двох 5. Буфер промивки В буфер № 4 активних речовин розрізняється. Віруси грипу, ви6. Забарвлювальний буфер буфер № 5 ділені у птахів, мають деякі характерні особливос7. Подвійна смужка (2 ряди з 8 лунками) або ті. Всі віруси пташиного грипу мають НА, який вочашка на 96 лунок 8. Ножиці або скальпель лодіє найбільшою спорідненістю до Nеu5Ас 29. Щипці ЗGаl -термінованих вуглеводних ланцюгів. Крім 10. Чашка для промивання смужки того, активність їх NA вище порівняно з вірусами 11. Ємність для проходження реакції іншого виду. 12. Термостат (або його замінник) У способі виявлення та системі детекції за да13. Камера для процедури хроматографуванним винаходом використовуються ці властивості ня (або кришка, якою закривають чашку на 96 луобох, НА та NA, компонентів віріона пташиного нок із смужками). грипу. Вірус грипу,·який зв'язується із специфічною Матеріали: зв'язувальною молекулою, переважно, із субстанСмужки: нітроцелюлоза, абсорбент, підкладка цією, яка містить сіаліловані вуглеводи та сполудля проби, виготовлена з ватману, USA. чена з мембраною, після чого відбувається реак1. Специфічний реагент (фетуїн, Sigma) був ція, переважно, розщеплення нейрамінідазного виділений з сирих курячих яєць. субстрату, яка викликає смерть зони, що містить 2. Буфер № 1: 0,2 Μ трис-НСІ (рН 7,2) з 3 Μ вірус, на мембрані. Спосіб виявлення вірусів грипу NaCl та 0,5% Твін-20. та система за даним винаходом демонструють ряд 3. Буфер № 2: 0,02 Μ трис-НСІ (рН 7,2) з 0,3 Μ переваг у порівнянні з тестовими системами, відоNaCl та 0,05% Твін-20. мими у даній галузі до цього часу: використання 4. Буфер № 3: 0,02 Μ трис-НСІ (рН 7,2) з 0,1 Μ двох компонентів, НА та NA, підвищує специфічNaCl та 0,05% Твін-20. ність аналізу і дозволяє конструювати системи 5. Буфер № 4: 0,02 Μ трис-НСІ (рН 7,2) з 0,1 Μ виявлення з обраними специфічностями. У той же NaCl (TN-буфер). час, і на противагу системам детекції, заснованим 6. Буфер №5: 4 мМ розчину Neu-X у TNна імунологічних методах, немає потреби у додатбуфері з 0,01 Μ СаСl2. кових маркерних ферментах для позитивної детеTN-буфер може бути замінений іншим підхокції, оскільки для цих цілей служить сама нейраміжим буфером, наприклад, забуференим фосфанідаза вірусу. том сольовим розчином або сольовим розчином. Різні варіанти ретельно відібраних типів молеСмужка (Фіг. 1) розділена на три зони: зони кул вуглеводних рецепторів збиратимуть віруси змочування, виявлення та абсорбції. Лінія молекугрипу незалежно від типу та підтипу і одночасно ли вуглеводного рецептора (тестова лінія), так здатні до специфічного виявлення високопатогенсамо як і контрольна лінія, розташовується у зоні них форм, таких як H5N1. виявлення. Смужки зроблені з мембрани, адсорРезультат способу виявлення за винаходом бенту та подушечки для проби. Молекула вуглеможе бути одержаний без використання якогось водного рецептора (1 мікролітр на 1 мг/мЛ розчискладного обладнання. ну) поміщається у зону виявлення, після чого Спосіб за винаходом дозволяє виявляти вірусмужка висушується та промивається. Смужка си протягом 0,1-2 годин. зберігається у герметично закритій посудині при Винахід далі детально описується за допомо18-25°С. гою прикладів, що не обмежують обсяг винаходу. Виявлення: Приклади 1. Приготування проби. 1/10 частина (об./об.) Приклад 1: буфера № 1 додається до проби безпосередньо Синтез поліакриламідового кон'югата 3'SLNперед аналізом і ретельно струшується. Це проба тpиcaxapидy для одержання специфічної молеку№ 1 (Р № 1). ли вуглеводного рецептора 2. Процедура виявлення включає декілька Розчин 1,7 мг (10 цмоль) поліакрилової кислоетапів. (Таблиця 1). ти, повністю активованої N-гідроксисукцинімідом, На першому етапі подушечка для проби на MW 1000кДа, у 200мкл диметилсульфохлориду та смужці поміщається у 80-100 мкл Ρ №1. Під дією 4 мкл діізопропілетиламін були додані до розчину капілярних сил рідина з проби піднімається угору і 1, 46 мг (2 моль) 3'SLN-O(CH2)3NH2 у 200 мкл досягає зони абсорбції через зону виявлення, де диметилсульфохлориду, суміш утримувалася при вірусні частинки зв'язуються з молекулою вугле37°С протягом 48 годин, 40 мкл 25%-го водного водного рецептора. Тривалість цього процесу зарозчину аміаку або 40 мкл етаноламіну були до 9 92393 10 лежить від в'язкості проби, але не повинна переКонтрольна лінія нейрамінідази у зоні вияввищувати 15 хв. Буфер № 2 додається у ту ж саму лення використовується для оцінки функціональлунку чашки (як альтернатива, можна перемістити ності аналізу. Повинне з'являтися темно-синє засмужку в іншу лунку, наповнену буфером № 2). барвлення контрольної зони. Через 10 хв. смужку виймають з лунки. Результати інтерпретуються наступним чином: На другому етапі змочувана частина смужки 1) Якщо спостерігається рівномірно забарвлевідрізається (ножицями). Після обережного вилуна лінія, то результат вважається позитивним, чення (наприклад, за допомогою пінцета) абсортобто проба містить вірус; інтенсивність кольору буючої зони частини смужки тестова зона промиповинна бути порівнянна з інтенсивністю кольору вається буфером № 3 і потім буфером № 4. Потім контрольної лінії. зона абсорбції теж відрізається. 2) Якщо спостерігається слабо забарвлена ліТретій етап. Частина тестової зони, що залинія, то проба містить вірус у концентрації, недосташилася, поміщається у колбу з буфером № 5. Котній для точного виявлення, витримування смужки лба щільно закривається і залишається у темноті у буфері № 5 повинне бути продовжене на всю ніч, при 37-40°С. Присутність вірусів грипу у пробі виабо тест може бути повторений ще раз. являється за темно-синім забарвленням зони мо3) Відсутність забарвленої лінії означає, що у лекули вуглеводного рецептора. Тривалість цього пробі немає вірусу, або його концентрація менша, кроку залежить від концентрації вірусу у пробі і ніж мінімальна межа виявлення. може зайняти від 20 хв. до 60 хв., перш ніж вірус 4) Відсутність забарвленої лінії у зоні позитивзможе бути виявлений за допомогою реакції геманого контролю означає або те, що експеримент глютинації (HAR титр близько 2). Як правило, ці проведений неправильно, або те, що NA у контропроби мають значення TCID/мл близько 105. Для льній лінії була зруйнована; у цьому випадку репроб з 10 та 100-кратно меншим вмістом вірусу комендується повторно протестувати пробу, вико(104-103 TCID/мл) забарвлення може з'явитися ристовуючи новий тест-набір. через декілька годин. Після процедури смужку Дані щодо чутливості тесту наведені у Таблиці виймають з розчину, після чого здійснюється візу2. альна оцінка результату реакції. 11 Приклад 3: Виявлення вірусів грипу у курячих фекаліях за допомогою системи виявлення за винаходом У даному прикладі використовуються ті ж самі матеріали та способи, що й у прикладі 2. 1. Було виконано багатократне розчинення проб, що містять вірус, у суспензії фекалій здорових курок (2 г сухої субстанції на 10 мл буфера). Це показало, що тест не чутливий і не специфічний до виявлення вірусу у фекаліях. 2. До свіжих курячих фекалій була додана 1/10 частина (об./об.) вірусу А/качка/Альберта/76 (HARтитр 1:10), і суміш була гомогенізована. Після додання буфера № 2 до гомогенату (1:1 об./об.) аліквот суспензії, що утворилася, був взятий та використаний в аналізі. Темно-синє забарвлення у 92393 12 тестовій зоні з'явилося після 2 год. Коли курячі фекалії були додані до проб з таблиці 1 перед початком процедури, це не зробило ніякого помітного впливу на результати тесту. Приклад 4: Виявлення вірусів грипу у тканині легень мертвих курок за допомогою системи виявлення згідно з винаходом У цьому прикладі використовуються ті ж самі матеріали та способи, що й у прикладі 2. Тканини легенів курки, померлої від інфекції вірусу грипу H5N1, були виділені дослідженим силіновим буфером (зібрані: Крим/січень 2006 p.). Може бути показано, що віруси грипу можуть бути достовірно виявлені в легенях дослідженого тіла курки. 13 Комп’ютерна верстка В. Мацело 92393 Підписне 14 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601