Спосіб біодеструктивного впливу на патогенні і умовно-патогенні мікроорганізми

Реферат: Спосіб біодеструктивного впливу на патогенні і умовно-патогенні мікроорганізми здійснюють шляхом обробки області, що містить мікроорганізми фотосенсибілізатором, з наступним оптичним випромінюванням. Як фотосенсибілізатор використовують катіони - антисептики, концентрацією 0,01 %, що містять у своєму складі хлор: декаметоксин, мірамістин, бензалконію хлорид, цетилпіридинію хлорид. Як комплексоутворювач використовують 0,02 % динатрію едетат (ЕДТА), концентрацією 0,02 % та здійснюють одночасне оптичне випромінення за допомогою фотонної матриці Коробова, складеної з 24 штук суперлюмінісцентних світлодіодів фіолетового спектру довжиною хвилі випромінювання у діапазоні 380-430 нм, потужністю 2 випромінювання світлодіодів 25 мВт/см , діаметр світлової плями - 10 мм, відстань UA 97422 U (12) UA 97422 U опромінювання 10 см, протягом 10 хвилин з наступним термостатуванням у вологій камері протягом доби. UA 97422 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біології та медицини, а саме до протимікробної терапії й фізіотерапії. Питання оцінки впливу факторів зовнішнього середовища на живі організми, а також питання про механізми дії світлодіодного випромінювання на біологічні об'єкти з різними рівнями організації в даний час є досить актуальним До теперішнього часу доведено, що метаболічні та функціональні властивості ряду біологічних систем можуть бути істотно змінені при впливі на них світлодіодного випромінювання [Гинюк В.А. Применение фототерапии в комплексном лечении экспериментальных гнойных ран / В.А. Гинюк, Г.П. Рычагов, Т.А. Летковская [и др.] // Новости хирургии. - 2011. - Том 19, № 1. - С. 8-15). В останні роки вдалося значно просунутися в розумінні первинних механізмів, що лежать в основі дії світлодіодного випромінювання на біологічні об'єкти. Низькоінтенсивне електромагнітне випромінювання в даний час знаходить широке застосування практично у всіх областях біології та медицини. Біологічні дослідження та клінічні спостереження показали ефективність червоного, помаранчевого, зеленого, фіолетового і синього спектрів для місцевого застосування на вогнище запалення і для впливу на весь організм [Ищук А.В. Использование фото динамической терапии лазерным аппаратом «Родник-1» с фотосенсибилизатором «Хлорофиллипт» в лечении гнойных ран и трофических язв нижних конечностей / А.В. Ищук, С.И. Леонович // Новости хирургии. - 2008. - № 1. - С. 44-54]. В даний час доведено, що низькоінтенсивне випромінювання має виражену терапевтичну дію [Клебанов Г.И. Фотосенсибилизированный производными гематопорфирина или фталоцианином гемолиз эритроцитов при лазерном облучении / Клебанов Г.И. // Биол. мембраны. - 1997. - № 14 (5). - С. 486-494]. Залежно від характеру взаємодії оптичного випромінювання з біологічними тканинами відомі наступні види фотобіологічних ефектів: фотодеструктивний вплив, при якому гідродинамічний і фотохімічний ефекти світла викликають деструкцію тканин; фотофізичний і фотохімічний вплив, при якому світло, що було поглинене біотканинами, збуджує в них атоми і молекули, викликає фотохімічні та фотофізичні реакції ґрунтується на застосуванні світлодіодного випромінювання як терапевтичного [Коробов A.M. Фототерапевтические аппараты Коробова серии «Барва» / А.М. Коробов, В.А. Коробов, Т.А. Лесная. - Харьков.: ИПП «Контраст», 2008. - 176 с.]. Фотобіологічні ефекти залежать від параметрів оптичного випромінювання: довжини хвилі, інтенсивності потоку світлової енергії, часу впливу на біологічні тканини. Фотобіологічні процеси досить різноманітні та специфічні. В основі їх лежать фотохімічні реакції, що виникають в організмі при впливі світла, і які обумовлені збудженням електронів в атомах речовини, що поглинає світло. На молекулярному рівні це виражається у вигляді фотоіонізації речовини, її відновлення або фотоокислення, фотодисоціації молекул, в їх перебудові - фотоізомеризації [Кару Т.Й. Первичные и вторичные клеточные механизмы лазерной терапии. // Низкоинтенсивная лазерная терапия. / Под ред. С.В. Москвина и В.А. Буйлина. - М.: ТОО «Фирма «Техника», 2000. - С. 71-94; Бриль Г.Е. Молекулярные аспекты биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения. // Актуальные проблемы патологии. Саратов, из-во Саратовского ун-та, 2001. - С. 124-136]. Світлодіодне випромінювання взаємодіє з фотоакцепторами, запускаючи весь комплекс фотофізичних і фотохімічних реакцій. Крім фотоакцепторів на прямий вплив електромагнітних хвиль реагує також і різні молекулярні структури речовини, в яких відбувається порушення слабких атомно-молекулярних зв'язків, що в свою чергу доповнює і підсилює ефект безпосереднього впливу світлодіодного випромінювання. Оскільки світлодіодне випромінювання, яке діє на біооб'єкт є енергетичним фактором, то в результаті безпосереднього та опосередкованого впливу відбувається зміна енергетичних параметрів внутрішнього середовища організму та утворення електронних збуджених станів біомолекул з проявом внутрішнього фотоелектричного ефекту, зміною енергетичної активності клітинних мембран та інші процеси, які пов'язані з міграцією енергії електронного збудження. Живі організми і біосфера в цілому не ізольовані, а відкриті системи, що обмінюються з навколишнім середовищем й речовиною і енергією. Всі ці системи є нерівноважними, самоструктурованими та самоорганізованими. За оптимальних дозах впливу на організм світлодіодного випромінювання здійснюється відповідний енергетичний ефект. У відповідь на це в системах і органах відбуваються процеси активізації саморегуляції, мобілізуються власні резерви. Кінцевий фотобіологічний ефект світлодіодного випромінювання проявляється у відповідь реакцією організму в цілому, комплексним реагуванням органів і систем. Це знаходить відображення в клінічних ефектах фототерапії: в результаті зниження рецепторної чутливості, зменшення інтерстиціального набряку і напруження тканин проявляються знеболюючі дії. Зменшення тривалості фаз запалення і набряку тканин дає протизапальний і протинабряковий 1 UA 97422 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ефект [Kаru Т.І. Photobiological fundamentals of low-level laser therapy / IEEE J. Quant. Elect. 1987. - V. QE-23. - P. 1703-1717]. Відомий спосіб фотодинамічної дії червоного (625 нм) й інфрачервоного (805 нм) випромінювання на бактерії P.Acnes, які оброблені фотосенсибілізаторами [Тучина Е.С. Оценка фотодинамического воздействия in vitro на бактерии из микробиоценозов ротовой полости и кожи человека: автореф. дис. на соискание уч. спеп. к.б.н.: спец. 03.00.16 «Экология»; 03.00.07 «Микробиология» / Е.С. Тучина. - Саратов, 2008 - 20 с.], що включає вивчення впливу оптичного випромінювання на адаптацію бактерій за життєздатністю, чисельністю популяції бактерій, морфологію колоній і особливості росту на живильних середовищах. Для аналізу морфології бактеріальних клітин через 24-72 години після опромінення готували мікропрепарати і забарвлювали за методом Грама; переглядали препарати шляхом світлової мікроскопії з об'єктивом × 90 під масляною імерсією, а також за допомогою цифрової мікрофотокамери ScopeTek. Але цей спосіб не передбачав вивчення впливу фотодинамічної дії червоного (625 нм) й інфрачервоного (805 нм) випромінювання на здатність до формування біоплівок бактеріями. До недоліків відомих способів можна віднести: необхідність підтримки постійної концентрації розчинів фотосенсибілізаторів; неможливість попередити дифузію й розтікання фотосенсибілізаторів; тривалість забарвлення, що пов'язано з необхідністю використання низьких концентрацій барвників; недостатня антибактеріальна активність; не досліджено вплив оптичного випромінювання на здатність мікроорганізмів, збудників гнійно-запальних процесів, до формування біоплівок, як захисної форми їх існування. Вивчення цього аспекту in vitro є актуальною задачею для визначення дозування терапевтичного впливу оптичного випромінювання, насамперед, при гнійно-запальних процесах. Найбільш близьким до запропонованого способу за сукупністю ознак є спосіб знищення патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів [Пат. 2430756 Российская Федерация, МПК' C12Q 1/04, C12N 13/00. Способ уничтожения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов / Тучин В.В., Тучина Е.С; заявитель и патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского" (RU)], що полягає у одночасній обробці області, що містить мікроорганізми, композицією фотосенсибілізатора і фотокаталізатора. їх витримують протягом періоду часу, необхідного для зв'язування композиції з клітинами мікроорганізмів. Потім на цю область впливають оптичним випромінюванням. Використовують випромінювання довжиною хвиль, що відповідає максимуму поглинання фотосенсибілізатора і фотокаталізатора і щільністю потужності, необхідної для активації композиції. При цьому в якості фотосенсибілізатора використовують метиленовий синій або діамантовий зелений, а в якості фотокаталізатора - наночастинки діоксиду титану. Недоліками способу є вплив фізико-біологічних факторів тільки на суспензійну культуру патогенів, сформована біоплівка й планктонні клітини не підлягали випромінюванню. Ступінь оцінки впливу фізико-біологічних факторів за біолюмінесценцією є обмеженим й потребує спеціального обладнання, а також неможливість попередити дифузію й розтікання фотосенсибілізаторів. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу впливу на патогенні бактерії, у якому за рахунок зміни характеру впливу, досягнуто можливість пригнічення здатності до формування біоплівок мікроорганізмами та запобігання розтікання розчинів антисептиків з осередку запалення. Поставлена задача вирішується в способі біодеструктивного впливу на патогенні і умовнопатогенні мікроорганізми, який здійснюють шляхом обробки області, що містить мікроорганізми, фотосенсибілізатором з наступним оптичним випромінюванням, згідно з корисною моделлю, як фотосенсибілізатор використовують катіони - антисептики, концентрацією 0,01 %, що містять у своєму складі хлор: декаметоксин, мирамістин, бензалконію хлорид, цетилпіридинію хлорид, як комплексоутворювач використовують 0,02 % динатрію едетат (ЕДТА), концентрацією 0,02 % та здійснюють одночасне оптичне випромінення за допомогою фотонної матриці Коробова, складеної з 24 штук суперлюмінісцентних світлодіодів фіолетового спектру довжиною хвилі 2 випромінювання у діапазоні 380-430 нм, потужністю випромінювання світлодіодів 25 мВт/см , діаметр світлової плями - 10 мм, відстань опромінювання 10 см, протягом 10 хвилин з наступним термостатуванням у вологій камері протягом доби. Спосіб підвищує ефективність інактивації планктонних клітин ізолятів S. aureus та Е. coli з пригніченням здатності до утворення біоплівок за рахунок підвищення чутливості мікроорганізмів до оптичного випромінювання фіолетового спектру. Використання 2 UA 97422 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 комплексоутворювача динатрію едетату, який є стабілізатором розчинних препаратів, запобігає розтіканню антисептику із фокусу ушкодження. Спосіб здійснюють таким чином. Відразу після інокуляції ізолятів до комірок планшету (у 4-х повторах) додають антисептичні препарати: 1-0,01 % розчин декаметоксину; 2-0,01 % розчин декаметоксину, що містить 0,02 % ЕДТА; 3-0,01 % розчин мирамістину; 4-0,01 % розчин мирамістину з 0,02 % ЕДТА; 5-0,01 % розчин бензалконію хлориду, 6-0,01 % розчин бензалконію хлориду з 0,02 % ЕДТА; 7-0,01 % розчин цетилпіридинію хлориду; 8-0,01 % розчин цетилпіридинію хлориду з 0,02 % ЕДТА; 9-0,02 % ЕДТА, з опромінюванням протягом 10 хвилин за допомогою фотонної матриці Коробова, складеної з 24 штук суперлюмінісцентних світлодіодів фіолетового спектру з довжиною хвилі випромінювання в діапазоні 380-430 нм. Потім після 18 годинного термостатування проводять повторне вимірювання оптичної щільності. Визначення здатності штамів бактерій до адгезії на поверхні 96 коміркової полістиролових планшетів для імуноферментного аналізу. Вимірюють оптичну щільність вихідної бактеріальної суспензії на "Densi-La-Meter" й доводять її концентрацію відповідно до ступенів за McFarland за допомогою суспензійного середовища. Для більш точного вимірювання оптичної щільності та її корекції бактеріальну суспензію, що відповідає певному ступеня за McFarland, інокулюють у комірки панелі дозатором по 200 мкл у 4 повтореннях. Як негативний контроль вносять 200 мкл поживного бульйону. Кількість інокульованих планктонних клітин підраховують на фотометрі «Multiskan ЕХ 355» при довжині хвилі 540 нм й виражають в умовних одиницях оптичної щільності. Після одержання бактеріальної суспензії з необхідною концентрацією мікроорганізмів у комірки планшета інокулюють по 200 мкл даної суспензії з відповідним поживним середовищем у 4 повтореннях з подальшою інкубацією згідно з умовами для кожної родини бактерій у вологому контейнері під закритою кришкою планшета. Після інкубації проводять підрахунок кількості клітин на рідері. З комірок панелі вилучають планктонні клітини й забарвлюють плівки. Для цього у комірку вносять 200 мкл фосфатного буферу й 15 мкл 1 % спиртового розчину кристалвіолету та інкубують 45 хвилин при кімнатній температурі. Після триразового промивання фосфатним буфером у комірки для екстракції фарби з плівки додають 250 мкл 96 % етилового спирту та інкубують ще 45 хвилин при кімнатній температурі й вимірюють оптичну щільність цього розчину при довжині хвилі 540 нм. Інтенсивність забарвлення вмісту комірок (спирту у комірках) відповідає ступеню плівкоутворення. Кількісним вираженням ступеню утворення біоплівки є значення оптичної щільності, що виміряно на спектрофотометрі при 540 нм. Результат визначать в умовних одиницях оптичної щільності (од.ощ.) біоплівкоутворення мікроорганізмами. Суть запропонованої корисної моделі пояснюється прикладами. Приклад 1. Оцінка комплексної дії світлодіодного випромінювання фіолетового спектру й катіонних антисептиків з ЕДТА на добові біолоплівки Е. coli. Щільність добової біоплівки Е. coli після дії світлодіодного випромінювання фіолетового спектру знижується у 1,9 разу порівняно з контролем (0,785±0,09 од.ощ. й 1,473±0,48 од.ощ відповідно). При комплексному застосуванні антисептичних препаратів з ЕДТА й низькоінтенсивного оптичного випромінювання фіолетового, зеленого й помаранчевого спектрів звертає на себе увагу той факт, що світлодіодне випромінювання спектрів, що були досліджені, сприяють посиленню чутливості ізолятів Е. coli до катіонних антисептиків: під впливом світлодіодного випромінювання фіолетового спектру та антисептиків щільність добової біоплівки знижується у 2,5-2,7 разу. Оцінюючи здатність до проліферації нових планктонних клітин добовою біоплівкою Е. coli після дії світлодіодного випромінювання встановлено, що світлодіодне випромінювання фіолетового спектру пригнічує продукцію планктонних клітин добовою біоплівкою Е. coli у 2,7 разу (0,259±0,02 од.ощ.). Результати дослідження здатності формування планктонними клітинами Е. coli вторинних біоплівок після дії світлодіодного випромінювання на добову біоплівку показали, що світлодіодне випромінювання фіолетового спектру пригнічує здатність планктонними клітинами Е. coli формувати щільні вторинні біоплівки у 4,9 рази порівняно з контролем (0,683±0,04 од.ощ. й 3,378±0,09 од.ощ. відповідно). Після застосування антисептиків та світлодіодного випромінення встановлено, що самими ефективними комбінаціями є комплексне застосування декаметоксину з ЕДТА (0,036±0,006 од.ощ.), мирамістину з ЕДТА (0,036±0,008 од.ощ.) та цетилпіридинію хлориду (0,042±0,004 од.ощ.) та світлодіодного випромінювання фіолетового спектру дії порівняно з контролем (щільність вторинної біоплівки Е. coli без впливу СДВ й антисептичних препаратів - 3,378±0,61 од.ощ.) з пригніченням формування вторинної біоплівки планктонними клітинами Е. coli. При застосуванні бензалконію хлориду з ЕДТА й світлодіодного випромінювання фіолетового спектру дії відбувається 3 UA 97422 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 пригнічення формування вторинної біоплівки Е. coli у 25,2 рази порівняно з контролем (0,134±0,008 од.ощ. й 3,378±0,61 од.ощ. відповідно). Приклад 2. Визначення комплексної дії світлодіодного випромінювання фіолетового спектру й антисептиків з ЕДТА на добові біоплівки S. aureus. При визначенні дії світлодіодного випромінювання й антисептиків з ЕДТА на добові біоплівки S. aureus встановлено, що після дії світлодіодного випромінювання фіолетового спектру (0,452±0,08 од.ощ.) щільність добової біоплівки знижується у 5 рази порівняно з контролем. Найефективнішою комбінацією виявилось застосування світлодіодного випромінювання фіолетового спектру та розчину бензалконію хлориду - щільність добової біоплівки знижується у 20,9 рази порівняно з контролем (0,108±0,06 од.ощ. й 2,26±0,16 од.ощ) та у 4,2 рази порівняно з впливом світлодіодного випромінювання без антисептичного препарату (0,452±0,08 од.ощ.). Оцінюючи здатність до проліферації нових планктонних клітин добовою біоплівкою S. aureus після дії світлодіодного випромінювання фіолетового спектру зафіксовано зниження проліферації планктонних клітин добовою біоплівкою S. aureus у 5 раз (0,165±0,06 од.ощ.). Результати дослідження здатності формування планктонними клітинами S. aureus вторинних біоплівок після дії світлодіодного випромінювання на добову біоплівку показали, що світлодіодне випромінювання фіолетового спектру пригнічує здатність планктонними клітинами S. aureus формувати щільні вторинні біоплівки у 4,9 рази порівняно з контролем (0,701±0,06 од.ощ. й 3,507±0,05 од.ощ. відповідно). Після застосування антисептиків та світлодіодного випромінення встановлено, що самими ефективними комбінаціями є комплексне застосування мирамістину з ЕДТА (0,076±0,004 од.ощ.) - щільність вторинної біоплівки S. aureus знижується у 46,1 рази порівняно з контрольними значеннями; декаметоксину з ЕДТА (0,106±0,008 од.ощ.) щільність вторинної біоплівки S. aureus знижується у 33,8 рази та світлодіодного випромінювання фіолетового спектру дії порівняно з контролем (щільність вторинної біоплівки S. aureus без впливу СДВ й антисептичних препаратів складає 3,507±0,05 од.ощ.). При застосуванні бензалконію хлориду з ЕДТА й світлодіодного випромінювання фіолетового спектру дії відбувається пригнічення формування вторинної біоплівки S. aureus у 22,1 рази (0,159±0,007 од.ощ.), а при застосуванні цетилпіридинію хлориду з ЕДТА - у 24 рази (0,127±0,0,03 од.ощ.) порівняно з контролем. Таким чином, для попередження утворення як первинних, так й вторинних біоплівок ізолятів, а також для інгібіції сформованих біоплівок ізолятів доречно застосовувати антисептики з 0,02 % ЕДТА, які пригнічують продукцію планктонних клітин й руйнують добову біоплівку ізолятів, що пов'язано з одного боку механізмом дії самих антисептиків, а саме: в основі їх дії лежить пряма гідрофобна взаємодія молекули з ліпідами мембран мікроорганізмів, що призводить до їх фрагментації й руйнування. При цьому частина молекули препаратів, занурюючись у гідрофобну ділянку мембрани, руйнує надмембранний шар й підвищує проникну здатність мембрани для високомолекулярних речовин, змінює ферментну активність мікробної клітини, інгібує ферментні системи, що призводить до пригнічення життєдіяльності мікроорганізмів і їх цитолізу, а з другого боку - при хімічній взаємодії хлорвмісних антисептиків (катіонів), що досліджувалися з ЕДТА (аніоном) утворюється еквівалентна кількість іонів водню. Концентрація іонів водню в довкіллі діє на організм або безпосередньо, або опосередковано, через вплив на іонний стан і доступність багатьох іонів і метаболітів й на стабільність макромолекул. Якщо концентрація водневих іонів з розчину виходить за нормальні межі для даного виду мікроба, його життєдіяльність припиняється. Отже, застосування антисептиків з ЕДТА запобігає утворенню щільних біоплівок штамів мікроорганізмів й сприяє руйнуванню сформованих біоплівок. Запропонований спосіб може бути використаний для визначення оптимальних схем комплексної терапії гнійно-запальних процесів із застосуванням фотонної матриці Коробова й протимікробних засобів в умовах моделювання в доклінічних експериментах. 50 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 60 Спосіб біодеструктивного впливу на патогенні і умовно-патогенні мікроорганізми, який здійснюють шляхом обробки області, що містить мікроорганізми фотосенсибілізатором, з наступним оптичним випромінюванням, який відрізняється тим, що як фотосенсибілізатор використовують катіони - антисептики, концентрацією 0,01 %, що містять у своєму складі хлор: декаметоксин, мірамістин, бензалконію хлорид, цетилпіридинію хлорид, як комплексоутворювач використовують 0,02 % динатрію едетат (ЕДТА), концентрацією 0,02 % та здійснюють одночасне оптичне випромінення за допомогою фотонної матриці Коробова, складеної з 24 штук суперлюмінісцентних світлодіодів фіолетового спектру довжиною хвилі випромінювання у 4 UA 97422 U 2 діапазоні 380-430 нм, потужністю випромінювання світлодіодів 25 мВт/см , діаметр світлової плями - 10 мм, відстань опромінювання 10 см, протягом 10 хвилин з наступним термостатуванням у вологій камері протягом доби. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5