Пристрій для впливу оптичного випромінювання in vitro на патогенні бактерії

Реферат: Пристрій для впливу оптичного випромінювання in vitro на патогенні бактерії містить штатив з вузлами кріплення джерела оптичного випромінювання та підставки для розміщення оброблюваного матеріалу. Штатив містить стійку та опору, до якої у вигляді горизонтально розташованої робочої платформи жорстко закріплена підставка для розміщення 96-коміркового полістиролового плоскодонного планшета або чашки Петрі з інокульованими мікроорганізмами, а на стійці, над робочою платформою, паралельно їй, з можливістю пересування вздовж стійки закріплено джерело оптичного випромінювання у вигляді фотонної матриці Коробова, що містить 24 світловипромінюючі елементи, крім того, на верхній частині стійки, в боці, діаметрально протилежному розташуванню джерела оптичного випромінювання, жорстко закріплена з'єднана з комп'ютером відеокамера, оптична вісь якої розміщена паралельно осі стійки на відстані, що дорівнює відстані між віссю стійки та геометричною віссю джерела оптичного випромінювання, причому стійка встановлена з можливістю повертання навколо своєї осі на 180°. UA 80355 U (54) ПРИСТРІЙ ДЛЯ ВПЛИВУ ОПТИЧНОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ IN VITRO НА ПАТОГЕННІ БАКТЕРІЇ UA 80355 U UA 80355 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до експериментальної медицини та біотехнології, а саме експериментального обладнання, і може бути використана для визначення оптимальних схем комплексної терапії гнійно-запальних процесів фармацевтичними протимікробними засобами та низькоінтенсивним світлом видимого діапазону, наприклад від фотонної матриці Коробова, в умовах доклінічного експерименту. На сьогоднішній день фахівці у своїй практиці використовують пристрої для фототерапії при різних захворюваннях, в тому числі й при гнійно-запальних процесах. Відомий фізіотерапевтичний апарат [1] в одному корпусі поєднує блок живлення, без трансформаторного виконання, зі світлодіодною матрицею. Світлодіодна матриця апарата являє собою послідовно з'єднані 21 червоний і 16 інфрачервоних світлодіодів з технічними характеристиками: світлодіоди генерують випромінювання: червоне довжиною хвилі - 650 нм 2 (щільність випромінювання - 0,8 мВт/см ) та інфрачервоне - 920 нм (щільність випромінювання 2 1,5 мВт/см ). Зазначений пристрій має технічні властивості, що передбачають його використання для широкого спектра фізіотерапевтичного впливу в клінічних та домашніх умовах, але не забезпечують умов для проведення досліджень впливу оптичного випромінювання на мікроорганізми - збудники гнійно-запальних процесів in vitro. Відомий пристрій для лікування ушкоджень гомілковостопних суглобів [2] містить шину для фіксації в місті ушкодження гомілковостопного суглоба, в якій у спеціально сформованих отворах вмонтовані світлодіоди потужністю не менше 1 мВт в інфрачервоному діапазоні і яскравістю не менше 500 мКд в видимому діапазоні спектра. Світлодіоди видимого та інфрачервоного діапазонів спектра розташовані в отворах шини почергово еквідистантно з кроком не більше 3 см. Засоби для світлотерапії також можуть бути виконані в вигляді світлодіодних лінійок, які сформовані з світлодіодів видимого і інфрачервоного діапазонів спектра. Світлодіодні лінійки розташовані в отворах шини почергово і еквідистантно з кроком не більш 3 см, а отвори для світлодіодних лінійок в шинах розташовані один від одного на відстані не більше 3 см. Засоби для світлотерапії виконані у вигляді світлодіодів, які випромінюють в видимому діапазоні спектра 620-660 нм та в інфрачервоному діапазоні спектра 840-940 нм. Зазначений пристрій також не забезпечує можливості використання його в експериментах in vitro для визначення впливу світла на мікроорганізми. Відомий спосіб визначення динаміки мінливості мікроорганізмів in vitro [3], заснований на впливі низькоенергетичного лазерного випромінювання при енергетичних експозиціях від 0,05 2 до 0,5 Дж/см , магнітною індукцією поля 60 мТл впродовж 60 с на мікробну клітину в біологічному середовищі з наступною фіксацією бактеріальних клітин тушшю або азур-еозином. Дводобову культуру коринебактерій вносять до біологічного середовища на предметне скло и дивляться під мікроскопом. Обладнання, що використовують у зазначеному способі, не дозволяє вирішувати поставлених технічних завдань корисної моделі, що заявляється. Найближчим аналогом до запропонованої корисної моделі вибрано пристрій для екстракорпорального ультрафіолетового опромінення трансфузійних рідин [4], що містить штатив з вузлами кріплення джерела оптичного випромінювання та підставки для розміщення оброблюваного матеріалу. Зазначений пристрій передбачає розміщення на штативі принаймні одного встановленого вертикально джерела ультрафіолетового випромінювання, у верхньому краю якого встановлені принаймні два гакоподібні тримачі для кювет із стерильним трансфузійним розчином. Відомий пристрій не забезпечує експериментального вивчення дії світлодіодного випромінювання на мікроорганізми - збудники гнійно-запальних процесів. В основу корисної моделі поставлена задача створення пристрою для визначення впливу оптичного випромінювання фотонної матриці Коробова in vitro на мікроорганізми, збудники гнійно-запальних процесів. Технічним завданням при виготовленні пристрою також є низька собівартість, надійний спосіб фіксації кронштейна на стійці, мінімум деталей та вузлів, з котрих складається штатив, та зручність при використанні. Поставлена задача вирішується тим, що у пристрої [4], прийнятому за найближчий аналог, що містить штатив з вузлами кріплення джерела оптичного випромінювання та підставки для розміщення оброблюваного матеріалу, згідно з корисною моделлю, штатив містить стійку та опору, до якої у вигляді горизонтально розташованої робочої платформи жорстко закріплена підставка для розміщення 96-коміркового полістиролового плоскодонного планшета або чашки Петрі з інокульованими мікроорганізмами, а на стійці, над робочою платформою, паралельно їй, з можливістю пересування вздовж стійки закріплено джерело оптичного випромінювання у вигляді фотонної матриці Коробова, що містить 24 світловипромінюючі елементи, крім того, на верхній частині стійки, в боці, діаметрально протилежному розташуванню джерела оптичного випромінювання, жорстко закріплена з'єднана з комп'ютером відеокамера, оптична вісь якої 1 UA 80355 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розміщена паралельно осі стійки на відстані, що дорівнює відстані між віссю стійки та геометричною віссю джерела оптичного випромінювання, причому стійка встановлена з можливістю повертання навколо своєї осі на 180°. Крім того, як світловипромінюючі елементи використані світлодіоди з довжиною хвилі випромінювання в діапазоні 470 нм. Крім того, як світловипромінюючі елементи використані світлодіоди з довжиною хвилі випромінювання в діапазоні 627 нм. Крім того, вузол кріплення джерела оптичного випромінювання виконаний з можливістю пересування вздовж стійки та фіксування джерела оптичного випромінювання в п'яти положеннях відносно робочої платформи. Пристрій дозволить відпрацьовувати оптимальну технологію лікування бактеріальних інфекцій. Виготовлення пристрою не потребує великих капітальних затрат, а ефективність його використання очевидна. Наведено креслення пристрою як приклада виконання корисної моделі. Пристрій складається з робочої платформи 1, на якій розміщений 96 комірковий полістироловий плоскодонний планшет або чашка Петрі з інокульованими мікроорганізмами 2, вертикального штатива 3, фотонної матриці Коробова 4, вузлів кріплення 5, відеокамери 6 та комп'ютера 7. Пристрій працює наступним чином. На робочу платформу 1 встановлюють 96 комірковий полістироловий плоскодонний планшет або чашку Петрі з досліджуваними інокульованими мікроорганізмами 2 та опромінюють з потрібною експозицією за допомогою фотонної матриці Коробова 4, складеної з 24 штук суперлюмінесцентних світлодіодів з довжиною хвилі випромінювання в діапазоні 470 нм або з довжиною хвилі випромінювання в діапазоні 627 нм. З метою дослідження дії випромінювання різної щільності на мікроорганізми джерело випромінювання 4 переміщується та фіксується на п'яти різних рівнях від робочої платформи 1. Після опромінення проводять добову інкубацію й визначають здатність опромінених планктонних клітин формувати біоплівки та здатність сформованих біоплівок продукувати планктонні клітини за оптичною щільністю, яку реєструють на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм. Крім того, за допомогою відеокамери 6, з'єднаного з персональним комп'ютером 7, фіксують, запам'ятовують та обробляють одержані зображення. Суть роботи пристрою пояснюється прикладом досліджування комплексного впливу хіміотерапевтичних препаратів та оптичного випромінювання на формування біоплівок наступних штамів P. mirabilis, К. рnеumоnіае, E. coli, P. aeruginosa та S. aureus. Відразу після інокуляції ізолятів до комірок планшета (у 4-х повторах) їх опромінювали протягом 15 хвилин за допомогою фотонної матриці Коробова, складеної з 24 штук суперлюмінісцентних світлодіодів з довжиною хвилі випромінювання в діапазоні 470 нм, а потім з довжиною хвилі випромінювання в діапазоні 627 нм, і вимірювали оптичну щільність. Потім після 18 годинного термостатування проводили повторне вимірювання оптичної щільності. Контрольний, 1 планшет, не опромінювали, 2 планшет опромінювали червоним світлом, 3 планшет - синім. Визначення здатності штамів бактерій до адгезії на поверхні 96 коміркової полістиролових планшетів для імуноферментного аналізу. Вимірювали оптичну щільність вихідної бактеріальної суспензії на "Densi-La-Meter" й доводили її концентрацію відповідно до ступенів за McFarland за допомогою суспензійного середовища. Для більш точного вимірювання оптичної щільності та її корекції бактеріальну суспензію, що відповідала певному ступеню за McFarland, інокулювали у комірки панелі дозатором по 200 мкл у 4 повтореннях. Як негативний контроль вносили 200 мкл поживного бульйону. Кількість інокульованих планктонних клітин підраховували на фотометрі "Multiskan EX 355" при довжині хвилі 540 нм й виражали в умовних одиницях оптичної щільності. Після одержання бактеріальної суспензії з необхідною концентрацією мікроорганізмів у комірки планшета інокулюється по 200 мкл даної суспензії з відповідним поживним середовищем у 4 повтореннях з подальшою інкубацією згідно з умовами для кожної родини бактерій у вологому контейнері під закритою кришкою планшета. Після інкубації проводили підрахунок кількості клітин на ридері. З комірок панелі вилучали планктонні клітини й забарвлювали плівки. Для цього у комірку вносили 200 мкл фосфатного буферу й 15 мкл 1 % спиртового розчину кристалвіолету та інкубували 45 хвилин при кімнатній температурі. Після триразового промивання фосфатним буфером у комірки для екстракції фарби з плівки додавали 250 мкл 96 % етилового спирту та інкубували ще 45 хвилин при кімнатній температурі й вимірювали оптичну щільність цього розчину при довжині хвилі 540 нм. Інтенсивність забарвлення вмісту комірок (спирту у комірках) відповідала ступеню плівкоутворення. Кількісним вираженням ступеня утворення біоплівки є значення оптичної 2 UA 80355 U 5 10 15 20 25 30 35 щільності, що виміряно на спектрофотометрі при 540 нм. Результат визначається в умовних одиницях оптичної щільності (од. ощ.) біоплівкоутворення мікроорганізмами. За умов комплексного впливу фотонного випромінювання й хіміотерапевтичних препаратів на суспензійну культуру P. mirabilis було встановлено, що тільки у 6,2 % випадків ізоляти були чутливі до хіміотерапевтичних препаратів цефалоспоривного ряду під впливом синього світла порівняно з комплексною дією червоного світла та контролем. Аналіз результатів впливу світлодіодного випромінювання й хіміотерапевтичних препаратів на ізоляти К. рnеumоnіае показав, що при комбінованому застосуванні синього світла й цефатоксиму та цефтриаксону у концентрації 64 мкг/мл; цефтазидиму та цефепіму у концентрації 32 мкг/мл; ципрофлоксацину у концентрації 4 мкг/мл відбувається пригнічення росту й розмноження ізолятів. Що стосується впливу хіміотерапевтичних препаратів й фотонного випромінювання та ізоляти Е. соlі, то слід відмітити той факт, що усі ізоляти були активно чутливі до препаратів цефалоспоринного ряду (8 мкг/мл) й ципрофлоксацину (1 мкг/мл), а до амікацину при дії концентрацій 32 мкг/мл. Оцінка випливу фотонного випромінювання й протимікробних препаратів на P. aeruginosa, показала, що ізоляти були полірезистентні, але у 87,5 % випадків до цефепіму (32 мкг/мл), і у 23.4 % випадків до гентаміцину (8 мкг/мл), 12,3 % випадків до амікацину (32 мкг/мл) й у 47,2 % до цифрофлоксацину (4мкг/мл) під впливом синього світла ізоляти виявляли чутливість. При застосуванні даного методу для визначення антибіотикочутливості ізолятів S. aureus під впливом червоного світла та хіміотерапевтичних препаратів було виявлено, що більшість штамів були резистентні до доксицикліну, а саме від 69 до 88 %, - у комірках мікропланшетів як з більшою, так й з меншою концентрацією антибактеріальних препаратів був наявний ріст культури. Під впливом як синього, так й червоного світла та хіміотерапевтичних препаратів до цифрофлоксацину й ванкоміцину штами S. aureus були чутливі. До інших хіміотерапевтичних препаратів ізоляти проявили варіабельну активність. Отримані дані свідчать про наявність вираженого впливу різних видів оптичного випромінювання на швидкість росту S. aureus. Вплив червоного світла викликає уповільнення зростання оптичної щільності, при впливі синього випромінювання відмічено зниження швидкості зростання оптичної щільності, а саме вплив синього випромінювання викликав затримку зростання оптичної щільності на 10,7 %. Джерела інформації: 1. Патент RU № 2090224, A61N5/06, опубл. 20.09.1997. 2. Патент UA № 71826, А61В17/00, опубл 15.12.2004. 3. Патент RU № 2141532, C12Q1/01, C12Q1/24, C12N13/00, опубл. 20.11.99, Бюл. № 32. 4. Патент UA № 5464, А61М5/00, опубл. 15.03.2005, Бюл. № 3. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 50 55 1. Пристрій для впливу оптичного випромінювання in vitro на патогенні бактерії, що містить штатив з вузлами кріплення джерела оптичного випромінювання та підставки для розміщення оброблюваного матеріалу, який відрізняється тим, що штатив містить стійку та опору, до якої у вигляді горизонтально розташованої робочої платформи жорстко закріплена підставка для розміщення 96-коміркового полістиролового плоскодонного планшета або чашки Петрі з інокульованими мікроорганізмами, а на стійці, над робочою платформою, паралельно їй, з можливістю пересування вздовж стійки, закріплено джерело оптичного випромінювання у вигляді фотонної матриці Коробова, що містить 24 світловипромінюючі елементи, крім того, на верхній частині стійки, в боці, діаметрально протилежному розташуванню джерела оптичного випромінювання, жорстко закріплена з'єднана з комп'ютером відеокамера, оптична вісь якої розміщена паралельно осі стійки на відстані, що дорівнює відстані між віссю стійки та геометричною віссю джерела оптичного випромінювання, причому стійка встановлена з можливістю повертання навколо своєї осі на 180°. 2. Пристрій за п. 1, який відрізняється тим, що як світловипромінюючі елементи використані світлодіоди з довжиною хвилі випромінювання в діапазоні 470 нм. 3. Пристрій за п. 1, який відрізняється тим, що як світловипромінюючі елементи використані світлодіоди з довжиною хвилі випромінювання в діапазоні 627 нм. 4. Пристрій за п. 2 або п. 3, який відрізняється тим, що вузол кріплення джерела оптичного випромінювання виконаний з можливістю пересування вздовж стійки і фіксування джерела оптичного випромінювання в п'яти положеннях відносно робочої платформи. 3 UA 80355 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4