Спосіб визначення впливу порушення метаболізму вітаміну в1 на функціонування нервово-м’язового синапсу

Реферат: Спосіб визначення впливу аліментарного дефіциту вітаміну В1 на функціонування нервовом'язового синапсу шляхом створення тіамін-дефіцитного стану. Складають гістограми розподілу амплітуд, викликаних електричною стимуляцією нерва потенціалів кінцевої пластинки, проводять їх порівняння і за відхиленнями від норми визначають вплив аліментарного дефіциту вітаміну В1 на функціонування нервово-м'язового синапсу. UA 99307 U (12) UA 99307 U UA 99307 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до області фундаментальної медицини, а саме до експериментальної фізіології, і може бути використана для дослідження квантової секреції медіатора ацетилхоліну з нервових закінчень діафрагми миші за умов експериментально створеного порушення метаболізму вітаміну В1 (тіаміну). Однією зі сполук, що відіграють виключно важливу роль у забезпеченні функціональної активності збудливих тканин, є вітамін В1 (тіамін). В сучасних умовах глибокий дефіцит цього вітаміну, іноді навіть з летальними наслідками, зустрічається у людини внаслідок зловживання алкоголем, ускладнень після операцій на шлунково-кишковому тракті, повного парентерального харчування, перітонеального діалізу та гемодіалізу, невгамовної блювоти вагітних, при синдромі набутого імунодефіциту, злоякісних новоутвореннях, незбалансованому харчуванні, зловживанні дієтами. Надзвичайно розповсюдженими у людини (дітей та дорослих) є субклінічні форми дефіциту тіаміну. Тому актуальність досліджень, спрямованих на встановлення механізмів нейротропної дії вітаміну В1 в організмі, не викликає сумнівів. Однією з характерних ознак глибокого дефіциту вітаміну В1 у людини є м'язова слабкість, а в ряді випадків - часткова або повна втрата моторної функції кінцівок. У хворих при цьому виявляється зменшення складних потенціалів дії уражених скелетних м'язів [1]. Описані випадки паралічу дихальної мускулатури при отруєнні людини продуктами життєдіяльності ціанобактерій, які містять тіаміназу, фермент, що розщеплює тіамін [2]. Припускається, що ряд випадків раптової смерті немовлят може бути пов'язаним з припиненням передачі моторного сигналу з діафрагмального нерва на діафрагму внаслідок порушення в ньому метаболізму вітаміну В1 [3]. З іншого боку, показано, що дефіцит вітаміну В і викликає послаблення синтезу ацетилхоліну [4], а розлади, що спостерігаються при неглибокому його дефіциті, можуть коригуватися шляхом уведення піддослідним тваринам фізистигміну [5]. Це дає підстави для пояснення ряду порушень, що мають місце при дефіциті вітаміну В1, станом синаптичної передачі в холінергічних і, зокрема, в нервово-м'язових синапсах. Для моделювання метаболічних порушень, викликаних дефіцитом вітаміну В 1 в організмі, в експериментальній вітамінології широко використовуються антагоністи вітаміну В1, зокрема окситіамін. Окситіамін відрізняється від тіаміну наявністю в його структурі в 4'-положенні піридинового кільця гідроксилу замість NH2-групи. Властивості окситіаміну як антагоніста вітаміну В1 обумовлені перетворенням окситіаміну у клітині на окситіаміндифосфат, який є конкурентним інгібітором тіаміндифосфатзалежних ферментів [6]. Найбільш близьким за технічною суттю до способу, що заявляється, є спосіб визначення впливу порушення метаболізму вітаміну В1 на функціонування нервово-м'язового синапсу шляхом уведення піддослідним тваринам антагоніста вітаміну В1 окситіаміну з подальшою реєстрацією показників спонтанної та викликаної подразненням нерва секреції медіатора з нервових закінчень ізольованої діафрагми [7]. Однак, даний спосіб має недоліки, оскільки передбачає отримання усереднених показників, які не дають інформації про характер розподілу амплітуд викликаних електричною стимуляцією нерва потенціалів кінцевої пластинки в нормі та під впливом викликаних окситіаміном метаболічних зрушень. Задача, яка вирішується способом, що заявляється - дослідження характеру розподілу амплітуд викликаних електричною стимуляцією нерва потенціалів кінцевої пластинки у синапсах діафрагмального м'яза піддослідних тварин (мишей) за умов порушення метаболізму вітаміну В1 його антагоністом окситіаміном. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, який передбачає введення піддослідним тваринам антагоніста вітаміну В1 окситіаміну та обчислення середніх значень амплітуд викликаних електричною стимуляцією нерва потенціалів кінцевої пластинки, згідно з корисною моделлю, складають гістограми розподілу амплітуд потенціалів кінцевої пластинки, проводять їх порівняння і за відхиленнями від норми визначають вплив порушення метаболізму вітаміну В1 на функціонування нервово-м'язового синапсу. Спосіб здійснюється наступним чином. Використовують молодих мишей-самців з вагою 2628 г. Кожну тварину розміщують в індивідуальній клітці при температура 23±1 °C. За випадковим принципом тварин ділять на дві групи. Тваринам експериментальної групи підшкірно одноразово вводять окситіамін в дозі 100 мг/кг ваги в 0,2 мл 0,9 % розчину NaCl. Ураховуючи різко кислу реакцію розчину окситіаміну, після приготування його рН доводять до значення 7,37,4 шляхом додавання NaOH. Тваринам контрольної групи підшкірно одноразово вводять 0,2 мл 0,9 % розчину NaCl. Стерильність усіх використовуваних розчинів при їх уведенні тваринам забезпечують використанням фільтрів Millex-G5 ("Millipore Corporation", США) з діаметром пори 0,22 мкм. Досліди по вивченню квантової секреції медіатора з нервових закінчень діафрагми проводять з використанням стандартної мікроелектродної техніки. Як об'єкт досліджень використовують ізольовані френіко-гемідіафрагмальні препарати. Препарат, отриманий в 1 UA 99307 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 результаті гострого експерименту, монтують в плексигласовій ванночці, через яку з постійною швидкістю пропускають насичений карбогеном (95 % О2 та 5 % СО2) розчин Кребса такого складу (ммоль/л): NaCl-137,0; КС1-5,0; NaHCO3-11,0; NaH2PO4-1,0; глюкоза - 11,0. Досліди проводять при кімнатній температурі (20-21 °C). М'язові скорочення блокують шляхом 2+ 2+ використання низького вмісту Са та високого вмісту Mg в згаданому розчині Кребса. Для + стандартизації досліджень співвідношення Са /Mg повинно бути постійним у всіх дослідах, його підбирають таким чином, щоб отримати максимальну амплітуду потенціалів кінцевої пластинки (ПКП) при гарантованому блокуванні скорочень в препаратах, отриманих від тварин контрольних груп. Діафрагмальний нерв стимулюють надпороговими прямокутними стимулами електричного струму тривалістю 0,1 мс, частота та інші параметри яких визначають задачами експерименту. За допомогою стандартних скляних мікроелектродів, заповнених З М КС1, внутрішньоклітинно реєструють мембранний потенціал (МП) м'язових волокон, мініатюрні потенціали кінцевої пластинки (мПКП) та ПКП. Відведення потенціалів від зони кожної кінцевої пластинки здійснюють протягом 1 хв. В кожному нервово-м'язовому препараті досліджують по декілька кінцевих пластинок. Якщо МП м'язового волокна є нижчим -60 мВ або змінюється під час реєстрації показників більше ніж на 5 мВ, дані виключають з подальших розрахунків. Реєстрацію потенціалів починають не раніше ніж за годину після початку суперфузії препарата розчином Кребса. Для амплітуд ПКП, зареєстрованих в усіх досліджених синапсах кожної контрольної або експериментальної групи, складають варіаційні ряди [8] з інтервалами, рівними 0,1 мВ [9], в діапазоні 0-5 мВ. З метою коректного співставлення варіаційних рядів частоти варіант виражають у відсотках [8]. На підставі отриманих варіаційних рядів будують гістограми розподілу амплітуд ПКП, які порівнюють між собою візуально. Прикладом конкретного використання способу, що пропонується, є дослідження нервовом'язової передачі в синапсах френіко-гемідіафрагмальних препаратів, отриманих від мишей через 3, 24 та 72 години після введення окситіаміну (експериментальна група) та 0,9 % розчину NaCl (контрольна група). Суттєвих розбіжностей гістограм розподілів амплітуд ПКП в синапсах препаратів, отриманих від тварин різних контрольних груп, виявлено не було. Гістограма розподілу амплітуд ПКП в синапсах френіко-гемідіафрагмальних препаратів, отриманих від тварин через 3 години після ін'єкції окситіаміну, у порівнянні з контрольною, характеризується збільшеною асиметрією за рахунок підвищення кількості низькоамплітудних ПКП. Кількість "нульових" реакцій, тобто таких, де у відповідь на пред'явлений стимул не виникали ПКП, помітно збільшена у порівнянні з контролем (фіг. 1). Гістограма розподілу амплітуд ПКП в синапсах препаратів, отриманих через 24 години після введення тваринам окситіаміну, зберігає ознаки збільшення кількості низькоамплітудних ПКП і практично не змінюється порівняно з такою через 3 години після ін'єкції. Кількість "нульових" реакцій порівняно з контролем залишається збільшеною (фіг. 2). Гістограма розподілу амплітуд ПКП та кількість "нульових" реакцій в синапсах нервовом'язових препаратів, отриманих від тварин через 72 години після ін'єкції окситіаміну, подібні до таких у тварин контрольної групи (фіг. 3). При цьому середні значення амплітуди ПКП в синапсах френіко-гемідіафрагмальних препаратів, отриманих від тварин експериментальних та контрольних груп, становили відповідно 1,40±0,10 мВ та 2,11+0,10 мВ через З години, 1,64+0,11 мВ та 2,19±0,10 мВ через 24 години, 2,15±0,13 мВ та 2,28±0,11 мВ - через 72 години після ін'єкції. Таким чином, запропонований спосіб дає можливість досліджувати в умовах експерименту стан синаптичної передачі в скелетних м'язах при дефіциті вітаміну В 1, що дозволяє використовувати його для широкого впровадження при проведенні досліджень, спрямованих на поглиблення уявлень про функціонування нервово-м'язової передачі та шляхи реалізації біологічної активності вітаміну В і в організмі. Джерела інформації: 1. Koike Н., Misu К., Hattori N., Ito S., Ichimura M., Ito H., Hirayama M., Nagamatsu M., Sasaki I., Sobue G. Postgastrectomy polyneuropathy with thiamine deficiency. // J Neurol. Neurosurg. Psychiatry.-2001.-71, N 3. -P. 357-362. 2. Маляревская А.Я. Обмен веществ у рыб в условиях антропогенного евтрофирования водоемов. - К.: Наук, думка, 1979.-256 с. 3. Barker J. N., Jordan F., Hillman D. E., Barlow O. Phrenic thiamin and neuropathy in sudden infant death // Annals New York Acad. Sci.-1982.-378.-P. 449-452. 4. Szutowicz A., Tomaszewicz M., Bielarczyk H. Disturbances of acetyl-CoA, energy and acetylcholine metabolism in some encephalopathies // Acta Neurobiol. Exp. (Wars.).-1996.-56, N 1. P. 323-339. 2 UA 99307 U 5 10 5. Gibson G. E., Ksiezak-Reding H., Sheu K. F. R., Mykytyn V., Blass J. P. Correlation of enzymatic, metabolic and behaviuoral deficits in thiamine deficits and its reversal // Neurochem. Res.1984.-9. - P. 803-814. 6. Островский Ю.М. Активные центры и группировки в молекуле тиамина. - Мн.: Наука и техника, 1975.-424 с. 7. Патент 39004 UA, МПК G 01 N 1/28, G 01 N 33/48. Спосіб визначення впливу порушення метаболізму вітаміну В і на функціонування нервово-м'язового синапсу / Шепелев С. С, Романенко О. В.; заявник та патентоутримувач Національний медичний університет ім. О. О. Богомольця /- № U200813594; заявл. 25.11.2008; опубл. 26.01.2009. 8. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Изд-во "Высшая школа", 1980.-293 с. 9. Скок В. И. Нервно-мышечная физиология / В. И. Скок, М. Ф. Шуба. -К.: Вища шк., 1986.224 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб визначення впливу аліментарного дефіциту вітаміну В 1 на функціонування нервовом'язового синапсу шляхом створення тіамін-дефіцитного стану, який відрізняється тим, що складають гістограми розподілу амплітуд, викликаних електричною стимуляцією нерва потенціалів кінцевої пластинки, проводять їх порівняння і за відхиленнями від норми визначають вплив аліментарного дефіциту вітаміну В 1 на функціонування нервово-м'язового синапсу. 3 UA 99307 U 4 UA 99307 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5