Рослина трансгенної сої, яка включає подію 416 сої aad-12

Реферат: Винахід належить до події pDAB4468-0416 трансформації гена aad-12 з метою набуття рослинами сої стійкості до гербіцидів. Винахід належить до гетерологічного полінуклеотиду, введеного в певний сайт геному клітини сої. UA 113610 C2 (12) UA 113610 C2 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рівень техніки Ген aad-12 (спочатку виділений з Delftia acidovorans) кодує білок арилоксіалканоатдіоксигенази (AAD-12). Ця ознака надає стійкість до 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти, наприклад до гербіцидів на основі піридилоксіацетату. Ген aad-12 як ген, що надає рослинам стійкість до гербіцидів, був уперше описаний в публікації заявки WO 2007/053482. Експресія гетерологічних або чужорідних генів в рослинах залежить від місця введення чужорідного гена в хромосому. Це може бути пов'язано, наприклад, зі структурою хроматину (наприклад, гетерохроматину) або з близькістю розташування елементів, регулюючих транскрипцію (наприклад, енхансерів), від сайта інтеграції (Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988). Один і той же ген в трансгенній рослині (або іншому організмі) однакового типу може характеризуватися великою мінливістю рівня експресії в порівнянні з іншими генами. Крім того, можуть мати місце відмінності в просторових або часових патернах експресії. Наприклад, відмінності у відносній експресії трансгена в різних тканинах рослини можуть не відповідати патернам, очікуваним від регулюючих транскрипцію елементів в конструкції введеного гена. Таким чином, часто доводиться створювати і досліджувати велике число подій, щоб ідентифікувати подію, експресуючу введений для певної мети ген на задовільному рівні. Для досягнення комерційних цілей звичайно продукують сотні і тисячі різних подій, щоб виявити єдину подію, що характеризується необхідними рівнями і патернами експресії трансгена. Подія, що характеризується необхідними рівнями і/або патернами експресії трансгена, має важливе значення для інтрогресії трансгена в інші генетичні середовища шляхом статевого ауткросингу стандартними методами селекції. Потомство таких гібридів зберігає характеристики експресії трансгена первинного трансформанту. Такий метод використовують для досягнення надійної експресії гена в ряді сортів, добре адаптованих до місцевих умов вирощування. Заявка на патент США № 20090130071 стосується події сої MON87701 і способів детекції. Заявки на патент США №№ 20090036308 і 20080051288 стосуються події сої 3560.4.3.5 і способів детекції. Заявка на патент США № 20080312082 стосується події сої DP-305423-1 і способів детекції. Заявка на патент США № 20060282915 стосується події сої MON89788 і способів детекції. Соя AAD-12, що має специфічну подію за даним винаходом, раніше не була описана в науковій літературі. Суть винаходу Даний винахід стосується сої AAD-12 (Glycine max) з подією, що визначається як DAS68416-4, насіння якої депоноване в Американську колекцію типових культур (АТСС) під номером доступу РТА-10442, і потомства вказаної сої. Іншими об'єктами даного винаходу є рослининащадки, соя, насіння і/або регенеровані частини рослин, насіння і нащадків сої з подією DAS68416-4, а також харчових або кормових продуктів, одержаних з вказаної сої. Даний винахід також стосується частин рослин сої з подією DAS-68416-4, які включають, не обмежуючись ними, пилок, насінний зачаток, квітки, пагони, коріння і листя, а також ядра вегетативних клітин, клітини пилка і яйцеклітини. Даний винахід далі стосується рослин сої, що мають стійкість до феноксіауксинових і/або арилоксіалканоатних гербіцидів (при нанесенні вказаних гербіцидів поверх рослин сої, в оточуючий ґрунт або на бур'яни, що виростають поруч), нових генетичних композицій сої з подією DAS-68416-4 і аспектів агрономічної продуктивності рослин сої, що містять подію DAS-68416-4. Даний винахід частково стосується селекції рослин і рослин, стійких до гербіцидів. Даний винахід стосується нової події трансформації aad-12 в рослинах сої, що включають полінуклеотидну послідовність за даним винаходом, введену в певний сайт геному клітини сої. У деяких варіантах здійснення винаходу вказана подія/полінуклеотидна послідовність може бути об'єднана з іншими ознаками, що включають, наприклад, інші гени стійкості до гербіцидів і/або інсектицидні білки. Однак даний винахід стосується рослин, що містять одну подію, розглянуту в даному описі винаходу. У конкретному варіанті здійснення винаходу одна або декілька ознак стійкості до гербіцидів об'єднані з подією сої DAS-68416-4 з метою боротьби з різними бур'янами, стійкими до гербіцидів (наприклад, з бур'янами, стійкими до гліфосату). Крім того, даний винахід стосується тестів, призначених для детекції в зразку (наприклад, сої) події за даним винаходом. Вказані тести можуть бути виконані на основі послідовності ДНК рекомбінантної конструкції, введеної в геном сої, і на основі геномних послідовностей, фланкуючих інсерційний сайт. У обсяг даного винаходу також входять набори і умови для виконання вказаних тестів. Таким чином, даний винахід частково стосується клонування і аналізу послідовностей ДНК всієї вставки AAD-12 і її крайових областей (в лініях трансгенної сої). Вказані послідовності є 1 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 унікальними. На основі вказаної вставки і крайових послідовностей були створені подієспецифічні затравки. Аналіз методом ПЛР показав, що вказані події можуть бути ідентифіковані в результаті аналізу ампліконів ПЛР, створених з використанням наборів подієспецифічних затравок. Таким чином, вказані і інші методи можуть бути використані для ідентифікації ліній сої, що включають подію за даним винаходом. Короткий опис креслень На фіг. 1 показана плазмідна карта pDAB4468. На фіг. 2 показана схема геномної ДНК події сої, в якій DAS-68416-4 розщеплений ферментами EcoRV або PvuII і використаний для створення відповідних бібліотек GENOMEWALKER™, які були використані як матриці для ампліфікації послідовностей ДНКмішені. На фіг. 3 показані положення затравок для підтвердження всієї послідовності події DAS68416-4 сої від 5'- до 3'-кінцевих крайових областей. На фіг. 4 показані положення затравок для підтвердження всієї послідовності події DAS68416-4 сої від 5'- до 3'-кінцевих крайових областей. На фіг. 5 показані положення затравок для підтвердження послідовності інсерційного сайта події DAS-68416-4 сої AAD-12. На фіг. 6 показані рівні експресії протягом життєвого циклу рослини. Короткий опис таблиць У таблиці 1 представлена нумерація залишків в SEQ ID NO:1 вставки і фланкуючих послідовностей для події DAS-68416-4. У таблиці 2 показані положення і довжина зондів, використаних при виконанні аналізу методом саузерн-блотингу. У таблиці 3 представлені прогнозовані і одержані гібридизуючі фрагменти при виконанні аналізу методом саузерн-блотингу. У таблиці 4 показані умови скринінгу в геномі події DAS-68416-4 сої для ампліфікації фланкуючих крайових областей. У таблиці 5 показані умови ампліфікації стандартним методом ПЛР крайових областей і подієспецифічних послідовностей в події DAS-68416-4 сої. У таблиці 6 наведений опис затравок для ампліконів 1-4 вставки Т-ланцюга. У таблиці 7 показана суміш ПЛР для ампліфікації стандартним методом ПЛР крайових областей і подієспецифічних послідовностей в події DAS-68416-4 сої. У таблиці 8 представлений короткий огляд рівнів білка AAD-12 в тканинах, одержаних з сої з подією DAS-68416-4, вирощеної в США і Канаді в 2008 р. У таблиці 9 показані положення і довжина зондів, використаних при виконанні аналізу методом саузерн-блотингу. У таблиці 10 показані прогнозовані і одержані гібридизуючі фрагменти при виконанні аналізу методом саузерн-блотингу. У таблиці 11 показані агрономічні параметри, оцінка яких була проведена в експерименті 1. У таблиці 12 показані результати аналізу агрономічних характеристик, виконаного в експерименті 1. У таблиці 13 представлені дані, зібрані в результаті досліджень агрономічних ознак і врожайності, виконаних в 2009 р. У таблиці 14 представлений короткий огляд результатів дослідження агрономічних характеристик на різних ділянках, виконаного в 2009 р. У таблиці 15 показаний аналіз захворюваності і пошкодження комахами в експерименті 1. У таблиці 16 представлені стресори, що викликають захворювання і пошкодження комахами, які мали місце у випробуваннях сої з подією DAS-68416-4 і стандартної сої. У таблиці 17 показане проростання насіння сої з подією DAS-68416-4 в теплих і холодних умовах. У таблиці 18 представлений короткий огляд аналізу загальних показників, клітковини і мінералів в стеблах сої. У таблиці 19 представлений короткий огляд аналізу загальних показників і клітковини в зерні сої. У таблиці 20 представлений короткий огляд аналізу мінералів в зерні сої. У таблиці 21 представлений короткий огляд аналізу амінокислот в зерні сої. У таблиці 22 представлений короткий огляд аналізу жирних кислот в зерні сої. У таблиці 23 представлений короткий огляд аналізу вітамінів в зерні сої. У таблиці 24 представлений короткий огляд аналізу ізофлавонів в зерні сої. У таблиці 25 представлений короткий огляд аналізу шкідливих речовин в зерні сої. 2 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У таблиці 26 наведена інформація про ділянку і обробку при виконанні досходових випробувань стійкості до гербіциду 2,4-D. У таблиці 27 показана стійкість сої DAS-68416-4 до досходового внесення гербіциду 2,4-D. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO:1 являє собою вставку і фланкуючі послідовності для сої з подією DAS-68416-4 за даним винаходом. SEQ ID NO:2-28 являють собою затравки, розглянуті в даному описі винаходу. SEQ ID NO:29 і 30 являють собою маркери SNP BARC-019093-03299 і BARC-044607-08736 фланкуючих послідовностей, розглянуті в даному описі винаходу. Докладний опис винаходу Даний винахід частково стосується селекції рослин і рослин, стійких до гербіцидів. Цей винахід стосується нових подій трансформації рослин сої, які включають полінуклеотидні послідовності aad-12 за даним винаходом, введені в певний сайт геному клітини сої. У деяких варіантах здійснення винаходу вказана полінуклеотидна послідовність може бути об'єднана з іншими ознаками (такими як інші гени стійкості до гербіцидів і/або гени, що кодують інсектицидні білки). Однак даний винахід стосується рослин, що включають одну подію, розглянуту в даному описі. Крім того, даний винахід стосується тестів, призначених для детекції в зразку події за даним винаходом. Об'єктами даного винаходу є способи створення і/або продукування будь-яких молекул діагностичних нуклеїнових кислот, розглянутих або запропонованих в даному описі, зокрема молекул нуклеїнових кислот, повністю або частково створених на основі фланкуючих послідовностей за даним винаходом. Зокрема, даний винахід частково стосується трансгенної сої, що містить подію DAS-68416-4, ліній рослин, що включають вказані події, клонування і аналізу послідовностей ДНК вказаної вставки і/або її крайових областей. Лінії рослин за даним винаходом можуть бути виявлені за допомогою послідовностей, розглянутих і запропонованих в даному описі винаходу. Деякі варіанти здійснення винаходу стосуються ліній сої, стійкої до гербіцидів, і їх ідентифікації. Даний винахід частково стосується детекції події за даним винаходом з метою визначення наявності події, що представляє інтерес, в потомстві, одержаному в результаті схрещування. Крім того, в обсяг даного винаходу входить спосіб детекції події, відповідний правилам, що вимагають передпродажної сертифікації і маркування продуктів, одержаних з рекомбінантних сільськогосподарських культур. Подію за даним винаходом можна детектувати будь-яким добре відомим методом детекції нуклеїнової кислоти, таким як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) або гібридизація ДНК з використанням зондів нуклеїнової кислоти. Подіє специфічний аналіз методом ПЛР описаний, наприклад, в публікації Windels et al., Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462 (1999). Вказаний метод включає ідентифікацію події 40-3-2 сої, стійкої до гліфосату, з використанням набору затравок, що заповнюють місце з'єднання між вставкою і фланкуючою ДНК. Зокрема, одна затравка включала послідовність з вставки і друга затравка включала послідовність з фланкуючої ДНК. Соя була модифікована шляхом введення гена aad-12, виділеного з Delftia acifovorans, який кодує білок арилоксіалканоатдіоксигенази (AAD-12). Вказана ознака надає стійкість до гербіцидів на основі 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти і піридилоксіацетату і може бути використана як селектований маркер в процесі трансформації і селекції рослин. Зокрема, в даному винаході описана подія pDAB4468-0416 сої AAD-12, її відбір і дослідження відносно стійкості і експресії у всій рослині і на молекулярних рівнях в різних поколіннях. Синтетичний ген (aad-12) за даним винаходом, виділений з Delftia acidovorans, кодує фермент, здатний деактивувати декілька гербіцидів, що містять арилоксіалканоатну частину, включаючи феноксіауксин (наприклад, 2,4-D, МСРА), а також піридилоксіауксини (наприклад, флуроксипір, триклопір). Ген aad-12 був введений за допомогою промоторів atUbi10 в лінію сої Maverick за допомогою методів з використанням Agrobacterium tumefaciens. Трансгенні рослини Т0 самозапилювалися протягом 4-6 поколінь. Ген aad-12 був паралельно введений в елітні сорти сої. Всі трансгенні події досліджували протягом 4-5 поколінь в польовому розпліднику з контрольованими умовами вирощування і в лабораторії. Обидва кінці вставки події pDAB4468-0416 секвенували і досліджували. Були розроблені подієспецифічні аналізи. Було проведене картування даної події в геномі сої (хромосома 4 сої); маркери SNP фланкуючих послідовностей представлені в даному описі винаходу як SEQ ID NO:29 і 30. Ця подія була введена в інші елітні сорти. Вказана подія надає стійкість до 2,4-D і глюфозинату. 3 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За допомогою промотору atUbi10 методами на основі Agtobacterium tumefаciens було створено більше 100 подій сої AAD-12 Т1 Maverick. Подія pDAB4468-0416 була відібрана в результаті селекції однієї лінії диференціювання протягом п'яти самозапилюваних поколінь і декількох поколінь, що зворотно схрещуються. Ця подія була морфологічно нормальною і витримувала вплив гербіциду 2,4-D, використовуваного в кількості до 2240 г еквівалента кислоти/га для обприскування сої на стадії V3 в кожному самозапилюваному поколінні. Вказана подія була успадкована у вигляді одного домінантного гена і характеризувалася нормальним менделевським розщепленням в самозапилюваних поколіннях, а також в поколіннях із зворотним схрещуванням. Було встановлено, що подія pDAB4468-0416 характеризується наявністю однієї вставки в повну транскрипційну одиницю рослини (PTU). У кістяку вектора не була виявлена послідовність гена стійкості до антибіотиків, і протягом декількох поколінь в гомозиготному і гемізиготному стані гена aad-12 не було виявлено сайленсингу гена. Ген aad-12 був експресований на очікуваних рівнях, відповідних рівням стійкості до 2,4-D. Вказана подія стійко експресувала ген aad-12 протягом декількох поколінь і в лініях сиблінгів в даному поколінні. Як указано в наведеному вище розділі "Рівень техніки", введення і інтеграція трансгена в геном рослини передбачає деякі випадкові події (звідси назва "подія" для даної експресованої інсерції). Тобто, в результаті застосування багатьох методів трансформації, таких як трансформація, за допомогою бактерій Agrobacterium, "генна рушниця" і точкова трансформація, неможливо передбачити, в яке положення в геномі буде введений трансген. Таким чином, ідентифікація фланкуючої геномної ДНК рослини з обох сторін вставки може мати важливе значення для ідентифікації рослини, що має дану інсерційну подію. Наприклад, можна створити затравки для ПЛР, що утворюють амплікон ПЛР в області з'єднання вставки з геномом хазяїна. Вказаний амплікон ПЛР може бути використаний для ідентифікації унікального або відмінного типу інсерційної події. Оскільки "події" початково є випадковими подіями, то як частина даного винаходу щонайменше 2500 насінин лінії сої, що включають подію, були депоновані, ставши надбанням громадськості без яких-небудь обмежень (за винятком патентних прав), в Американську колекцію типових культур (АТСС), 10802 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Вказаний депозит був зареєстрований як депозит АТСС № РТА-10442. 25 флаконів з насінням Glycine max (подія pDAB4468-0416 сої AAD-12) були депоновані від імені компанії Dow AgroSciеncе LLС 22 жовтня 2009 р. Депозит був перевірений 2 листопада 2009 р, і на вказану дату насіння було життєздатним. Цей депозит був зроблений і буде зберігатися відповідно до умов Будапештського договору про міжнародне визнання депонування насіння для цілей патентної процедури. Цей депозит буде зберігатися без яких-небудь обмежень в депозитарії АТСС, який є загальнодоступним депозитарієм, протягом 30 років або протягом п'яти років після останнього запиту або протягом ефективного часу дії патенту залежно від того, який з вказаних періодів часу є найбільш тривалим, і буде замінений, якщо стане нежиттєздатним протягом вказаного періоду. Депоноване насіння є частиною даного винаходу. З вказаного насіння можуть бути вирощені рослини сої, і такі рослини також є частиною даного винаходу. Даний винахід також стосується послідовностей ДНК, що містяться у вказаних рослинах сої, які придатні для детекції вказаних рослин і їх потомства. Методи детекції і набори за даним винаходом можуть бути використані для ідентифікації будь-якої однієї, двох або навіть всіх трьох вказаних подій залежно від кінцевої мети дослідження. Визначення термінів і приклади, наведені в даному описі, допоможуть описати і здійснити даний винахід фахівцям в даній галузі. За винятком особливо обумовлених випадків терміни мають загальноприйняті значення, відомі фахівцям у відповідній галузі. Використана номенклатура основ ДНК наведена в 37 статті Зводу федеральних правил, § 1.822. У використаному тут значенні термін "потомство" означає потомство будь-якого покоління батьківської рослини, що містить подію DAS-68416-4 сої AAD-12. Трансгенну "подію" одержують шляхом трансформації рослинних клітин гетерологічною ДНК, тобто конструкцією нуклеїнової кислоти, яка включає трансген, що представляє інтерес, регенерації популяції рослин, одержаної в результаті інсерції вказаного трансгена в геном рослини, і відбору конкретної рослини, що характеризується наявністю інсерції в певному положенні в геномі. Термін "подія" стосується первинного трансформанту і потомства вказаного трансформанту, що включає гетерологічну ДНК. Термін "подія" також стосується потомства, одержаного в результаті ауткросингу трансформанту з іншим сортом, що включає геномну/трансгенну ДНК. Навіть після повторного зворотного схрещування з батьківською формою, з якою гібрид схрещується знову, введена трансгенна ДНК і фланкуюча геномна ДНК 4 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 (геномна/трансгенна ДНК) з трансформованої батьківської форми присутня в потомстві гібриду в тому ж положенні в хромосомі. Термін "подія" також стосується ДНК первинного трансформанту і його потомства, що включає введену ДНК і фланкуючу геномну послідовність поруч з введеною ДНК, які повинні бути передані потомству, включаючи трансген, що представляє інтерес, в результаті схрещування однієї батьківської форми, що включає введену ДНК (наприклад, первинний трансформант і потомство, одержане в результаті самозапилення), з батьківською формою, що не містить введену ДНК. "З'єднувальна послідовність" заповнює ділянку, на якій ДНК, введена в геном, зв'язується з ДНК нативного геному сої, що фланкує ділянку інсерції, при цьому для діагностики події достатньо ідентифікувати або детектувати одну або декілька з'єднувальних послідовностей в генетичному матеріалі рослини. До таких послідовностей належать послідовності ДНК, що заповнюють місця вставки подій сої за даним винаходом, і фланкуючі ДНК однакової довжини. У даному описі наведені конкретні приклади таких діагностичних послідовностей; однак, інші послідовності, які перекривають місця з'єднання інсерцій або місця з'єднання інсерцій і геномної послідовності, також є діагностичними і можуть бути використані відповідно до даного винаходу. Даний винахід стосується ідентифікації таких фланкуючих, з'єднувальних і вставних послідовностей. У обсяг даного винаходу входять відповідні затравки і амплікони ПЛР. Відповідно до даного винаходу для детекції або ідентифікації промислових сортів трансгенної сої або ліній, виділених з ліній трансгенної сої, що є приватною власністю, можуть бути використані методи ПЛР із застосуванням ампліконів, розташованих поруч з введеною ДНК і її крайовими послідовностями. У процесі введення вставки в геном рослинних клітин можуть відбутися деякі делеції або інші зміни вставки і/або геномних фланкуючих послідовностей. Таким чином, відповідний сегмент послідовності плазміди може включати деякі незначні зміни. Те ж саме вірне для фланкуючих послідовностей за даним винаходом. Так, в обсяг даного винаходу входить рослина, що включає полінуклеотид, який характеризується деякою мірою ідентичності з фланкуючими і/або вставними послідовностями. Послідовність за даним винаходом може бути полінуклеотидною послідовністю, яка щонайменше на 65%, більш переважно щонайменше на 70%, більш переважно щонайменше на 75%, більш переважно щонайменше на 80% і більш переважно щонайменше на 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% ідентична послідовності, наведеній або розглянутій в даному описі. Гібридизація і умови гібридизації за даним винаходом також можуть бути використані для визначення таких рослин і полінуклеотидних послідовностей за даним винаходом. Фланкуючі послідовності і вставна послідовність можуть бути підтверджені з посиланням на депоноване насіння. Повні послідовності всіх вказаних вставок нарівні з частинами відповідних фланкуючих послідовностей представлені в даному описі винаходу у вигляді SEQ ID NO:1. Координати вставної і фланкуючих послідовностей даної події, що належить до SEQ ID NO:1 (всього 10212 пар основ), наведені нижче в таблиці 1. Це питання більш детально розглянуте в прикладі 3. Таблиця 1 Нумерація залишків вставної і фланкуючих послідовностей події DAS-68416-4 в SEQ ID NO:1 5'-кінцева фланкуюча послідовність Номери залишків (SEQ ID NO:1) Довжина (п.о.) Вставка 3'-кінцева фланкуюча послідовність 1-2730 2731-9121 9122-10212 2730 6391 1091 40 45 50 Вказані послідовності (зокрема фланкуючі послідовності) є унікальними. На основі вказаної вставної і крайових послідовностей були створені подієспецифічні затравки. Аналіз методом ПЛР показав, що вказані лінії сої можуть бути ідентифіковані в різних генотипах сої шляхом аналізу ампліконів ПЛР, створених за допомогою наборів подієспецифічних затравок. Таким чином, для ідентифікації вказаних ліній сої можуть бути використані вищезгадані і інші споріднені методи. Послідовності, ідентифіковані вказаними методами, є унікальними. Методи детекції за даним винаходом особливо корисні в поєднанні з селекцією рослин для визначення потомства рослин, що включає цю подію, яке було одержане після схрещування батьківської рослини, яка включає подію, що представляє інтерес, з іншою лінією рослин з метою надання вказаному потомству однієї або декількох додаткових ознак. Вказані методи ПЛР дозволяють ефективно розробляти програми селекції сої і контролювати якість, зокрема, 5 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 промислового насіння трансгенної сої. На даний час також можуть бути створені і використані набори для детекції методом ПЛР вказаних ліній трансгенної сої. Вказані методи також дозволяють реєструвати і зберігати продукти. Крім того, фланкуючі/геномні послідовності сої можуть бути використані для специфічної ідентифікації положення кожної вставки в геномі. Така інформація може бути використана для створення систем молекулярних маркерів, специфічних до кожної події. Вказані послідовності можуть бути використані для прискореної селекції і одержання даних про зчеплення генів. Інформація про фланкуючі послідовності може бути далі використана для вивчення і дослідження процесів інтеграції трансгенів, визначення сайтів для інтеграції трансгенів в геномі, сортування подій, визначення стійкості трансгенів і їх фланкуючих послідовностей і експресії генів (особливо відносно сайленсингу генів, патернів метилування трансгенів, впливу положення і можливих елементів, що визначають експресію, таких як MAR [області приєднання матриці] і тому подібних). У світлі даного опису повинно бути зрозуміло, що в обсяг даного винаходу входить насіння, депоноване в АТСС під номером РТА-10442. Даний винахід також стосується рослини сої, стійкої до гербіцидів, вирощеної з насіння, депонованого в АТСС під номером доступу РТА10442. Даний винахід далі стосується частин вказаної рослини, таких як листя, зразки тканин, насіння, вироблене вказаною рослиною, пилок і тому подібні. Даний винахід далі стосується потомства рослин, вирощених з депонованого насіння, переважно рослини сої, стійкої до гербіцидів, геном якої включає виявлювану послідовність, що з'єднує геномну ДНК дикого типу і встану ДНК за даним винаходом. У використаному тут значенні термін "соя" означає Glycine max, і у визначення даного терміну входять всі сорти, які можуть бути одержані в результаті селекції рослини сої. Даний винахід далі стосується способів одержання гібридів при використанні рослини за даним винаходом як щонайменше однієї батьківської форми. Наприклад, даний винахід стосується гібридної рослини F1, що має як одну або обидві батьківські форми будь-які рослини за даним винаходом. Крім того, в обсяг даного винаходу входить насіння, вироблене такими гібридами F1 за даним винаходом. Даний винахід стосується способу одержання насіння гібриду F1 шляхом схрещування вказаної рослини з іншою (наприклад, інбредною батьківською лінією) рослиною і одержання гібридного насіння. Даний винахід стосується вказаної рослини, яка є материнською або батьківською формою. Характеристики одержаних рослин можуть бути поліпшені в результаті ретельного відбору батьківських рослин. Рослина сої, стійкої до гербіцидів, може бути одержана в результаті первинного схрещування першої батьківської рослини сої, вирощеної з насіння будь-якої лінії за даним винаходом, і другої батьківської рослини сої, що дозволяє одержати множину рослин першого потомства; відбору рослини першого потомства, яка стійка до гербіцидів (або містить щонайменше одну з подій за даним винаходом); самозапилення рослини першого потомства, що дозволяє одержати множину рослин другого потомства; і відбору з рослин другого потомства однієї рослини, яка стійка до гербіциду (або містить щонайменше одну з подій за даним винаходом). Вказані стадії можуть далі включати зворотне схрещування рослини першого потомства або рослини другого потомства з другою батьківською рослиною сої або третьою батьківською рослиною сої. Потім може бути посіяне насіння сої за даним винаходом або його потомство. Потрібно також зазначити, що можуть бути схрещені дві різних трансгенних рослини з метою одержання потомства, що містить два незалежно доданих екзогенних гени. В результаті самозапилення відповідного потомства можуть бути одержані рослини, які є гомозиготними для обох доданих екзогенних генів. У обсяг даного винаходу також входить зворотне схрещування батьківської рослини і ауткросинг з нетрансгенною рослиною як вегетативне розмноження. У даній галузі відомі інші методи селекції, звичайно використовувані для надання рослинам різних ознак і одержання сільськогосподарських культур. Селекцію методом зворотного схрещування використовують для перенесення генів з метою створення спадкової і добре успадковуваної ознаки в необхідному гомозиготному культиварі або інбредній лінії, що є батьківською формою, з якою гібрид схрещується знову. Джерело ознаки, що передається, іменується батькомдонором. Передбачається, що одержана рослина повинна мати ознаки батьківської форми, з якою гібрид схрещується знову (тобто культивару), і необхідну ознаку, перенесену від батькадонора. Після первинного схрещування відбирають рослини, що мають фенотип батька-донора, і повторно схрещують (зворотне схрещування) з батьківською формою, з якою гібрид схрещується знову. Передбачається, що одержана батьківська форма повинна мати ознаки батьківської форми, з якою гібрид схрещується знову (наприклад, культивару), і необхідну ознаку, перенесену від батька-донора. 6 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Молекули ДНК за даним винаходом можуть бути використані як молекулярні маркери при здійсненні методу селекції з використанням маркерів (МАВ). Молекули ДНК за даним винаходом (такі як маркери AFLP, маркери RFLP, маркери RAPD, SNP і SSR) можуть бути використані в методах, які дозволяють ідентифікувати генетично пов'язані агрономічно корисні ознаки, відомі в даній галузі. Ознака стійкості до гербіцидів може бути відстежена в потомстві гібриду рослини сої за даним винаходом (або в її потомстві і в будь-якому іншому культиварі або сорті сої) за допомогою методів МАВ. Молекули ДНК є маркерами даної ознаки, і методи МАВ, добре відомі в даній галузі, можуть бути використані для відстеження ознаки стійкості до гербіцидів в рослинах сої, якщо щонайменше одна лінія сої за даним винаходом або її потомство було батьком або предком. Способи за даним винаходом можуть бути використані для ідентифікації будь-якого сорту сої, що має подію за даним винаходом. Способи за даним винаходом включають одержання рослини сої, стійкої до гербіцидів, шляхом селекції рослини за даним винаходом. Зокрема, вказані способи можуть включати схрещування двох рослин за даним винаходом або однієї рослини за даним винаходом і будьякої іншої рослини. Переважні способи далі включають відбір потомства вказаного гібриду шляхом дослідження потомства відносно наявності події, виявлюваної методами за даним винаходом. Наприклад, даний винахід може бути використаний для відстеження події за даним винаходом протягом декількох циклів селекції рослин, що включають інші необхідні ознаки, зокрема агрономічні ознаки, аналізовані в різних прикладах, наведених в даному описі винаходу. Рослини, що включають подію за даним винаходом і необхідну ознаку, наприклад, можуть бути виявлені, ідентифіковані, відібрані і швидко використані в подальших циклах селекції. Подія за даним винаходом/ознака може бути також об'єднана в процесі селекції і відстежена відповідно до даного винаходу нарівні з ознакою стійкості до впливу комах і/або іншими ознаками стійкості до гербіцидів. Один переважний варіант здійснення винаходу стосується рослини, що включає подію за даним винаходом, об'єднану з геном, що кодує стійкість до гербіциду дикамба. Таким чином, даний винахід може бути, наприклад, об'єднаний з ознаками, що кодують стійкість до гліфосату (наприклад, стійкі рослинні і бактеріальні гени EPSPS, GOX, GAT), стійкість до глюфозинату (наприклад, Pat, bar), стійкість до гербіциду, інгібуючого ацетолактатсинтазу (ALS) (наприклад, імідазолінони [такі як імазетапір], сульфонілсечовини, триазолопіримідинсульфонанілід, піримідинілтіобензоат і інші хімічні речовини [Csrl, SurA і т. д.]), стійкість до бромоксинілу (наприклад, Bxn), стійкість до інгібіторів ферменту HPPD (4гідроксифенілпіруватдіоксигеназа), стійкість до інгібіторів фітоєндесатурази (РDS), стійкість до гербіцидів, інгібуючих фотосистему II (наприклад, psbA), стійкість до гербіцидів, інгібуючих фотосистему I, стійкість до гербіцидів, інгібуючих протопорфіриногеноксидазу IX (РРО) (наприклад, РРО-1), стійкість до гербіцидів на основі фенілсечовини (наприклад, CYP76B1), ферменти, що розщеплюють гербіцид дикамба (див., наприклад, заявку на патент США № 20030135879), і іншими, які можуть бути використані окремо або в різних комбінаціях, забезпечуючи ефективне знищення або запобігання поширенню бур'янів і/або стійкість до будьякого гербіциду вищезгаданих класів. Що стосується додаткових гербіцидів, то як деякі додаткові переважні інгібітори ALS (відомі також як AHAS) можна указати триазолопіримідинсульфонаніліди (такі як клоранзулам-метил, диклозулам, флоразулам, флуметзулам, метозулам і пеноксзулам), піримідинілтіобензоати (такі як біспірибак і піритіобак) і флукарбазон. Деякі переважні інгібітори HPPD включають мезотріон, ізоксафлутол і сулкотріон. Деякі переважні інгібітори РРО включають флуміклорак, флуміоксазин, флуфенпір, пірафлуфен, флутіацет, бутафенацил, карфентразон, сулфентразон і прості дифенілові ефіри (такі як ацифлуорфен, фомесафен, лактофен і окстифлуорфен). Крім того, AАD-12 окремо або в поєднанні з однією або декількома додатковими ознаками НТС може бути об'єднаний з однією або декількома додатковими первинними ознаками (такими як, наприклад, стійкість до впливу комах, стійкість до грибів, стійкість до стресу і т. д.) або вторинними ознаками (такими як, наприклад, більш висока врожайність, кращий профіль виходу олії, краща якість клітковини і т. д.). Таким чином, даний винахід може бути використаний для створення повного агрономічного набору поліпшених якостей культури з можливістю гнучкої і економічно ефективної боротьби з цілим рядом сільськогосподарських шкідників. Фермент AAD-12 за даним винаходом робить можливою експресію трансгена, що визначає стійкість до комбінацій гербіцидів, які знищують майже всі широколисті і трав'янисті бур'яни. AAD-12 може бути прекрасною ознакою стійкості культури до гербіциду (HTC), що об'єднується з іншими ознаками HTC (такими як, наприклад, стійкість до гліфосату, стійкість до глюфозинату, стійкість до імідазолінону, стійкість до бромоксинілу і т.д.) і ознаками стійкості до впливу комах (Cry1F, Cry1Ab, Cry34/45 і т. д.). Крім того, AAD-12 може бути селектованим маркером, що 7 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомагає відібрати первинні трансформанти рослин, генетично створені з використанням другого гена або групи генів. Ген AAD-12 за даним винаходом також надає стійкість до сполук, перетворюваних на гербіциди на основі феноксіацетатауксину (наприклад, 2,4-DB, MCPB і т. д.). Група масляної кислоти, присутня в гербіциді 2,4-DB, перетворюється в результаті β-окислення на фітотоксичну 2,4-дихлорфеноксіоцтову кислоту. Аналогічним чином МСРВ перетворюється в результаті βокислення на фітотоксичний гербіцид МСРА. Гербіциди на основі бутанової кислоти самі по собі не є гербіцидами. Вони перетворюються у відповідну кислоту в результаті β-окислення в сприйнятливих рослинах, і саме оцтова кислота утворює фітотоксичний гербіцид. Гербіциди на основі бутанової кислоти не заподіюють шкоди рослинам, що не мають здатності швидкого βокислення. Однак рослини, що здатні до швидкого β-окислення і здатні перетворювати гербіцид на основі бутанової кислоти в форму оцтової кислоти, захищаються геном AAD-12. У даній галузі відомі методи внесення гербіцидів. Такі методи можуть включати змішування в баці декількох гербіцидів. Деякі переважні гербіциди, придатні для використання в даному винаході, включають гербіцид на основі феноксіауксину, такий як 2,4-D, 2,4-DB, MCPA, MCPB. Вказані гербіциди можуть бути об'єднані з одним або декількома додатковими генами стійкості до гербіцидів і відповідним гербіцидом (таким як, наприклад, гліфосат і/або глюфозинат). У корисних комбінаціях, які, як повинно бути очевидно фахівцю в даній галузі, мають сприятливі властивості за даним винаходом, може бути використано один, два, три або більше число гербіцидів. Один або декілька гербіцидів можуть бути внесені в поле/ділянку до посіву насіння за даним винаходом. Такі гербіциди можуть бути внесені, наприклад, протягом 14 днів до посіву насіння. Один або декілька гербіцидів можуть бути також внесені під час посіву і/або після посіву насіння, але до появи сходів. Один або декілька гербіцидів можуть бути внесені в ґрунт (для знищення бур'янів) або нанесені на бур'яни і/або трансгенні рослини за даним винаходом. Гербіциди можна чергувати або використовувати в комбінації для знищення або запобігання появі бур'янів, які можуть бути стійкими до одного з гербіцидів. Гербіциди трьох типів можуть бути внесені в різний час різними способами, відомими в даній галузі. Даний винахід також стосується способів знищення рослин-самосівів, що містять ген AAD-12. Див. одночасно подану заявку РСТ, озаглавлену "Знищення дводольних рослин-самосівів з геном AAD в однодольних сільськогосподарських культурах". Ознаки НТС за даним винаходом можуть бути використані в нових комбінаціях з іншими ознаками НТС (які включають, не обмежуючись цим, стійкість до гліфосату). Вказані комбінації ознак дозволяють створити нові методи знищення бур'янів (і подібних видів), завдяки знову набутій або спадковій стійкості до гербіцидів (наприклад, до гліфосату). Таким чином, в обсяг даного винаходу входять, крім ознак НТС, нові способи знищення бур'янів за допомогою гербіцидів, в яких стійкість до гербіцидів була досягнута в результаті введення вказаного ферменту в трансгенні культури. Крім того, у всьому світі переважно вирощують сільськогосподарські культури, стійкі до гліфосату. При багаторазовому чергуванні з іншими сільськогосподарськими культурами, стійкими до гліфосату, можуть виникнути труднощі із знищенням рослин-самосівів, стійких до гліфосату, в сівозмінних культурах. Таким чином, використання трансгенних ознак за даним винаходом, спільно або окремо введених в сільськогосподарські культури, робить можливим знищення інших рослин-самосівів з ознаками НТС. Переважна рослина або насінина за даним винаходом містить в своєму геномі вставні послідовності за даним винаходом поряд з 20-500 або більшим числом суміжних фланкуючих нуклеотидів з обох сторін вставки. За винятком особливо обумовлених випадків фланкуючі послідовності є послідовностями, ідентифікованими в SEQ ID NO:1 (див. наведену вище таблицю 1). SEQ ID NO:1 включає гетерогенну ДНК, введену в первинний трансформант і ілюстративні фланкуючі геномні послідовності, розташовані поруч з введеною ДНК. Можна очікувати, що всі або частина вказаних фланкуючих послідовностей буде передана потомству, яке одержить вставлену ДНК в результаті схрещування родової лінії, що включає цю подію. Даний винахід стосується культур тканин регенерованих клітин рослини за даним винаходом. У обсяг даного винаходу також входить рослина, регенерована з такої культури тканини, особливо, якщо вказана рослина може експресувати всі морфологічні і фізіологічні властивості ілюстративного сорту. Переважні рослини за даним винаходом мають всі фізіологічні і морфологічні властивості рослини, вирощеної з депонованого насіння. Даний винахід далі стосується потомства такого насіння і насіння, що має якісні ознаки, що представляють інтерес. Маніпуляції (такі як мутація, подальша трансфекція і селекція) з рослинами, насінням або їх частинами можуть привести до створення так званих "по суті похідних" сортів. Міжнародний 8 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 союз по захисту нових сортів рослин (UPOV) виробив наступне керівництво для визначення сорту, який є по суті похідним захищеного сорту: [А] сорт потрібно вважати по суті похідним іншого сорту ("первинного сорту"), якщо (i) він в основному виведений з первинного сорту або з сорту, який сам був виведений з первинного сорту, при збереженні експресії основних характеристик, властивих генотипу або комбінації генотипів первинного сорту; (ii) він має явні відмінності від первинного сорту; і (iii) за винятком відмінностей, що виникли в результаті деривації, він відповідає первинному сорту відносно експресії основних характеристик, властивих генотипу або комбінації генотипів первинного сорту. UPOV, шостий з'їзд Міжнародних організацій, Женева, 30 жовтня 1992 р.; документ підготовлений президією Союзу. У використаному тут значенні термін "лінія" означає групу рослин, що характеризуються незначною або відсутністю спадкової мінливості серед особнів відносно щонайменше однієї ознаки. Такі лінії можуть бути створені декількома поколіннями самозапилення і селекції або вегетативного розмноження з однієї родової форми за допомогою методів з використанням культур тканин або клітин. У використаному тут значенні терміни "культивар" і "сорт" є синонімами і означають лінію, використовувану для промислового виробництва. Термін "стійкість" або "стійкий" застосовно до певного компонента означає збереження даного компонента з покоління в покоління, переважно протягом щонайменше трьох поколінь, по суті на одному і тому ж рівні, наприклад, переважно ±15%, більш переважно ±10%, найбільш переважно ±5%. На стійкість може впливати температура, місцеположення, стрес і час посіву. При порівнянні подальших поколінь в польових умовах вказаний компонент повинен бути виявлений аналогічним чином. Термін "комерційна корисність" означає хорошу потужність рослини і високу фертильність, завдяки яким фермери можуть вирощувати дану сільськогосподарську культуру з використанням звичайних сільськогосподарських машин і можуть екстрагувати з насіння олію з описаними компонентами за допомогою звичайного подрібнювального і екстрагуючого обладнання. Врожайність комерційно корисної культури, виміряна з урахуванням маси насіння, вмісту олії і загальної кількості олії, одержаної на акр площі, повинна становити 15% від середньої врожайності іншого порівнюваного комерційного сорту, що не має першосортні ознаки, який був вирощений в тому ж регіоні. Термін "агрономічно елітна" означає лінію, яка має необхідні агрономічні характеристики, такі як врожайність, дозрівання, стійкість до хвороб і тому подібні, крім стійкості до впливу комах, завдяки наявності однієї або декількох подій за даним винаходом. У обсяг даного винаходу входять агрономічні ознаки, що розглядаються окремо або в будь-якій комбінації в наведених нижче прикладах, які має рослина, що включає подію за даним винаходом. Будь-які і всі вказані агрономічні характеристики і дані можуть бути використані для ідентифікації таких рослин на основі однієї ознаки, частини діапазону або всього діапазону характеристик, використовуваних для визначення таких рослин. Як повинно бути зрозуміло фахівцю в даній галузі в світлі даного опису винаходу, переважні варіанти наборів для детекції ознак за даним винаходом можуть включати, наприклад, зонди і/або затравки, які призначені для створення і/або включають "з'єднувальні послідовності" або "перехідні послідовності" (де геномна фланкуюча послідовність сої стикується з вставною послідовністю). Наприклад, даний набір включає полінуклеотидні зонди, затравки і/або амплікони, створені для ідентифікації однієї або обох з'єднувальних послідовностей (де вставка стикується з фланкуючою послідовністю), представлені в таблиці 1. Однією загальною особливістю такого набору є наявність однієї затравки, що гібридизується у фланкуючій області, і однієї затравки, що гібридизується у вставці. Такі затравки часто мають довжину, що дорівнює щонайменше приблизно ~15 залишкам. Вказані затравки можуть бути використані для створення/ампліфікації виявлюваного амплікона, що вказує на наявність події за даним винаходом. Затравки можуть бути використані для створення амплікона, що заповнює (і включає) вищезгадану з'єднувальну послідовність. Затравка, "що забезпечує з'єднання" у фланкуючій послідовності, звичайно не гібридизується на відстані більше приблизно 200 основ або за межами з'єднання. Таким чином, типові фланкуючі затравки включають щонайменше 15 залишків ланцюга в межах 200 основ фланкуючих послідовностей від початку вставки. Тобто, в обсяг даного винаходу входять затравки, які включають послідовність відповідної довжини, що складається із залишків (або гібридизується із залишками) ~2530-2730 і/або ~9122-9322 SEQ ID NO:1. Затравки для вставки 9 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть бути створені аналогічним чином в будь-якому місці вставки, але для створення таких затравок можуть бути також використані залишки ~2731-2931 і ~8921-9121. Фахівцю в даній галузі повинно бути також відомо, що затравки і зонди можуть бути створені з можливістю гібридизації в стандартних умовах гібридизації і/або ПЛР з сегментом SEQ ID NO:29 (або комплементом) і її комплементами, коли затравка або зонд не є повністю комплементарними наведеній послідовності. Тобто допустима деяка міра помилкового спарювання. Наприклад, в затравці, що складається приблизно з 20 нуклеотидів, звичайно один, два або близько того нуклеотидів можуть не зв'язуватися з протилежним ланцюгом, якщо помилково спарена основа знаходиться всередині або біля кінця затравки, протилежної амплікону. Нижче наведені різні прийнятні умови гібридизації. У зондах також можуть бути використані синтетичні аналоги нуклеотидів, такі як інозин. Також можуть бути використані пептидні зонди нуклеїнової кислоти (PNA), а також ДНК- і РНК-зонди. Важливо, щоб такі зонди і затравки дозволяли діагностувати (однозначно ідентифікувати і виявляти) наявність події за даним винаходом. Потрібно зазначити, що при ампліфікації методом ПЛР можуть виникати помилки, які викликають, наприклад, незначні помилки секвенування. Тобто, за винятком особливо обумовлених випадків, послідовності, наведені в даному описі винаходу, були визначені в результаті створення довгих ампліконів з геномних ДНК сої, після чого амплікони клонували і секвенували. У послідовностях, створених і визначених таким чином, цілком ймовірно, можуть бути виявлені невеликі відмінності і незначні розходження, пов'язані з численними циклами ампліфікації, необхідними для створення амплікона достатньої довжини для секвенування з геномних ДНК. Фахівцю в даній галузі повинно бути зрозуміло, що в обсяг даного винаходу входять будь-які коректування, необхідні в зв'язку з виникненням звичайних помилок секвенування або розходжень вказаних типів. Потрібно також зазначити, що можливе видалення деякої геномної послідовності, наприклад, при введенніпослідовності в процесі створення події. Таким чином, фланкуючі послідовності за даним винаходом можуть дещо відрізнятися від геномних послідовностей, представлених, наприклад, в базі даних GENBANK. Компоненти "вставки" показані на фігурах і більш детально розглянуті нижче в розділі "Приклади". Полінуклеотидні послідовності ДНК вказаних компонентів або їх фрагменти можуть бути використані як ДНК-затравки або зонди при здійсненні способів за даним винаходом. Деякі варіанти здійснення винаходу стосуються способів детекції трансгена/інсерційної області геному в рослинах, насінні і подібних частинах рослини сої і композицій для здійснення вказаних способів. Створені послідовності ДНК, що включають з'єднувальну послідовність трансгена/інсерційної області геному за даним винаходом (між залишками 2730-2731 і 91219122 SEQ ID NO:1), їх сегменти, комплементи наведених послідовностей і будь-які їх сегменти. З'єднувальна послідовність інсерційної області заповнює місце з'єднання між гетерологічною ДНК, введеною в геном, і ДНК з клітини сої, що фланкує інсерційний сайт. Такі послідовності дозволяють діагностувати дану подію. На основі вказаної вставки і крайових послідовностей можуть бути створені подієспецифічні затравки. Аналіз методом ПЛР показав, що лінії сої за даним винаходом можуть бути ідентифіковані в різних генотипах сої шляхом аналізу ампліконів ПЛР, створених за допомогою наборів подієспецифічних затравок. Для ідентифікації ліній сої за даним винаходом можуть бути використані вищезгадані і інші споріднені методи. Таким чином, амплікони ПЛР, одержані з таких пар затравок, є унікальними і можуть бути використані для ідентифікації вказаних ліній сої. Деякі варіанти здійснення винаходу стосуються послідовностей ДНК, що включають суміжний фрагмент нового трансгена/інсерційної області геному. У обсяг даного винаходу входять послідовності ДНК, що включають полінуклеотиди вставної послідовності трансгена достатньої довжини і полінуклеотиди геномної послідовності сої достатньої довжини, з однієї або більше ніж з трьох вищезгаданих рослин сої, і/або послідовності, придатні для використання як послідовності затравок з метою одержання амплікона, що дозволяє діагностувати одну або декілька вказаних рослин сої. Споріднені варіанти здійснення винаходу стосуються послідовностей ДНК, що включають щонайменше 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше суміжних нуклеотидів частини трансгена послідовності ДНК, ідентифікованої в даному описі винаходу (такої як SEQ ID NO:1 і її сегменти), або її комплементів, і фланкуючої послідовності ДНК сої аналогічної довжини з вказаних послідовностей або їх комплементів. Такі послідовності можуть бути використані як ДНК-затравки при здійсненні методів ампліфікації ДНК. Амплікони, одержані за допомогою вказаних затравок, дозволяють діагностувати будь-які 10 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 події сої за даним винаходом. Тому даний винахід також стосується ампліконів, одержаних за допомогою таких ДНК-затравок і гомологічних затравок. Даний винахід також стосується способів детекції в зразку ДНК, що відповідає події сої за даним винаходом. Такі способи можуть включати: (а) контактування зразка, що включає ДНК, з набором затравок, які при використанні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з ДНК щонайменше однієї з вказаних подій сої утворюють амплікон, що дозволяє діагностувати вказану подію; (b) виконання реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з утворенням амплікона; і (с) детекцію одержаного амплікона. Інші способи детекції за даним винаходом включають спосіб детекції в зразку ДНК, що відповідає щонайменше одній з вказаних подій, який включає: (а) контактування зразка, що включає ДНК, із зондом, яким гібридизується в суворих умовах гібридизації з ДНК щонайменше однієї з вказаних подій сої і не гібридизується в суворих умовах гібридизації з ДНК контрольної рослини сої (ДНК події, що не представляє інтерес); (b) гібридизацію зразка і зонда в суворих умовах гібридизації; і (с) детекцію гібридизації зонда з вказаною ДНК. Інші варіанти здійснення винаходу стосуються способів створення рослини сої, що включає подію aad-12 за даним винаходом, які включають стадії: (а) статевого схрещування першої батьківської лінії сої (що включає експресуючі кластери за даним винаходом, які надають рослинам вказаної лінії ознаку стійкості до гербіцидів) і другої батьківської лінії сої (в якій відсутня вказана ознака стійкості до гербіцидів) з утворенням численного потомства рослин; і (b) відбору рослини-нащадка за допомогою молекулярних маркерів. Такі способи можуть необов'язково включати стадію зворотного схрещування рослини-нащадка з другою батьківською лінією сої з метою одержання рослини сої з розведенням гомозигот, що включає вказану ознаку стійкості до впливу комах. Іншим об'єктом даного винаходу є способи визначення зиготності потомства гібриду, що включає будь-яку одну (або декілька) з трьох вказаних подій. Вказані способи можуть включати контактування зразка, що містить ДНК сої, з набором затравок за даним винаходом. Вказані затравки, використовувані при здійсненні реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК щонайменше однієї з вказаних подій сої, утворюють перший амплікон, що дозволяє діагностувати щонайменше одну з вказаних подій сої. Такі способи далі включають виконання реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з утворенням першого амплікона; детекцію першого амплікона і контактування зразка, що містить ДНК сої, з вказаним набором затравок (вказаний набір затравок, використовуваний при здійсненні реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК з рослин сої, продукує другий амплікон, що включає нативну геномну ДНК сої, гомологічну геномній області сої); і виконання реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з утворенням другого амплікона. Вказані способи далі включають детекцію другого амплікона і порівняння першого і другого ампліконів в зразку, при цьому присутність обох ампліконів свідчить про те, що зразок є гетерозиготним для інсерції трансгена. Набори для детекції ДНК можуть бути створені з використанням композицій за даним винаходом і методів, добре відомих в галузі детекції ДНК. Вказані набори можуть бути використані для ідентифікації ДНК події сої за даним винаходом в зразку в процесі селекції рослин сої, що містять вказану ДНК. Набори включають послідовності ДНК, гомологічні або комплементарні ампліконам, розглянутим в даному описі винаходу, або послідовності ДНК, гомологічні або комплементарні ДНК, що міститься в генетичних елементах трансгена подій за даним винаходом. Вказані послідовності ДНК можуть бути використані при здійсненні реакцій ампліфікації ДНК або як зонди в способі гібридизації ДНК. Набори можуть також містити реагенти і речовини, необхідні для виконання способу детекції. Термін "зонд" означає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, до якої приєднана стандартна детектована мітка або репортерна молекула (така як радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентна речовина або фермент). Такий зонд є комплементарним ланцюгу нуклеїнової кислоти-мішені у випадку даного винаходу, ланцюгу геномної ДНК однієї з вказаних подій сої, рослини сої або зразка, що включає ДНК цієї події. Зонди за даним винаходом включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також поліаміди і інші речовини зонда, які специфічно зв'язуються з послідовністю ДНК-мішені і можуть бути використані для детекції вказаної послідовності ДНК-мішені. Термін "затравки" означає виділені/синтезовані нуклеїнові кислоти, які гібридизовані з ланцюгом комплементарної ДНК-мішені методом гібридизації нуклеїнових кислот з утворенням гібриду між затравкою і ланцюгом ДНК-мішені і потім подовжені по ланцюгу ДНК-мішені полімеразою, наприклад ДНК-полімеразою. Пари затравок за даним винаходом використовують для ампліфікації послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, наприклад, за допомогою 11 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або інших стандартних методів ампліфікації нуклеїнових кислот. Зонди і затравки звичайно складаються з 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, або 500 або більшого числа полінуклеотидів. Такі зонди і затравки специфічно гібридизують з послідовністю-мішенню в суворих умовах гібридизації. Зонди і затравки за даним винаходом переважно мають повну схожість послідовності з послідовністю-мішенню, хоч стандартними методами можуть бути створені зонди, які відмінні від послідовності-мішені, але зберігають здатність гібридизувати з послідовностями-мішенями. Методи одержання і використання зондів і затравок описані, наприклад, в публікації nd Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2 ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. Пари затравок для ПЛР можуть бути виділені з відомої послідовності, наприклад, за допомогою комп'ютерних програм, призначених для вказаної мети. Затравки і зонди на основі фланкуючих послідовностей ДНК і вставних послідовностей за даним винаходом можуть бути використані для підтвердження (і за необхідності для корекції) розглянутих послідовностей стандартними методами, наприклад методами повторного клонування і секвенування таких послідовностей. Зонди і затравки нуклеїнових кислот за даним винаходом гібридизують в суворих умовах з послідовністю ДНК-мішені. Для ідентифікації ДНК з трансгенної події в зразку можуть бути використані будь-які стандартні методи гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот. Молекули нуклеїнових кислот або їх фрагменти можуть специфічно гібридизуватися з іншими молекулами нуклеїнових кислот у визначених умовах. Як указано в даному описі, дві молекули нуклеїнових кислот можуть специфічно гібридизуватися одна з одною, якщо такі молекули здатні утворювати непаралельну дволанцюжкову структуру нуклеїнової кислоти. Вважається, що молекула нуклеїнової кислоти є "комплементом" іншої молекули нуклеїнової кислоти, якщо вказані молекули є повністю комплементарними. Як указано в даному описі, молекули є "повністю комплементарними", якщо кожний нуклеотид однієї молекули комплементарний нуклеотиду іншої молекули. Дві молекули вважаються "мінімально комплементарними", якщо вказані молекули здатні гібридизуватися одна з одною з достатньою мірою стійкості для збереження гібриду щонайменше в умовах зниженої суворості. Аналогічним чином молекули вважаються "комплементарними", якщо вказані молекули здатні гібридизуватися одна з одною з достатньою мірою стійкості для збереження гібриду в стандартних суворих умовах. Стандартні суворі умови гібридизації описані в публікації Sambrook et al., 1989. Відхилення від повної комплементарності допустимі, якщо такі відхилення повністю не анулюють здатність молекул утворювати дволанцюжкову структуру. Молекула нуклеїнової кислоти, яка може бути використана як затравка або зонд, повинна мати достатньо комплементарну послідовність, 12 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здатну утворювати стійку дволанцюжкову структуру при визначених концентраціях розчинника і солі. У використаному тут значенні по суті гомологічна послідовність є послідовністю нуклеїнової кислоти, яка специфічно гібридизується з комплементом послідовності нуклеїнової кислоти, порівнюваної в суворих умовах гібридизації. Термін "суворі умови" застосовно до гібридизації зонда нуклеїнової кислоти з нуклеїновою кислотою-мішенню (тобто з конкретною послідовністю нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес) методом специфічної гібридизації описаний в публікації Sambrook et al., 1989, стор. 9.52-9.55. Див. також публікацію Sambrook et al., 1989, стор. 9.47-9.52 і 9.56-9.58. Таким чином, нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть бути використані завдяки їх здатності вибірково утворювати дуплексні молекули з комплементарними ділянками фрагментів ДНК. Залежно від передбачуваного застосування можна використовувати різні умови гібридизації для досягнення різних мір вибірковості зонда відносно послідовності-мішені. Для застосувань, що вимагають високої вибірковості, звичайно використовують відносно суворі умови утворення гібридів, наприклад, можуть бути вибрані умови, що характеризуються низькою концентрацією солі і/або високою температурою, наприклад, що досягаються при використанні від близько 0,02М до близько 0,15М NaCl при температурі від близько 50 °C до близько 70 °C. Суворі умови, наприклад, можуть включати щонайменше двократне промивання фільтра для гібридизації суворим промивальним буфером (0,2-кратний об'єм SSC, 0,1% SDS, 65 °C). Фахівцям в даній галузі відомі відповідні суворі умови, стимулюючі гібридизацію ДНК, наприклад 6,0-кратний об'єм хлориду натрію/цитрату натрію (SSC) при температурі близько 45 °C з подальшим промиванням 2,0-кратним об'ємом SSC при 50 °C. Наприклад, концентрація солі на стадії промивання може бути вибрана в діапазоні від умов зниженої суворості, що включають використання приблизно 2,0-кратного об'єму SSC при 50 °C, до суворих умов, що включають використання приблизно 0,2-кратного об'єму SSC при 50 °C. Крім того, температура на стадії промивання може бути підвищена від кімнатної температури, приблизно 22 °C, що створюється в умовах зниженої суворості, до температури близько 65 °C, що застосовується в суворих умовах. Можуть бути змінені як температура, так і концентрація солі, або один з параметрів, температура або концентрація солі, може залишатися постійним при зміні іншого параметра. Такі вибіркові умови допускають незначні, якщо взагалі допускають, помилкові спарювання між зондом і матрицею або ланцюгом-мішенню. Фахівцям в даній галузі добре відомі методи детекції послідовностей ДНК шляхом гібридизації, і як приклад таких аналізів методом гібридизації можна навести патенти США №№ 4965188 і 5176995. У особливо переважному варіанті здійснення винаходу нуклеїнова кислота за даним винаходом специфічно гібридизується в суворих умовах з однією або декількома затравками (ампліконами або іншими послідовностями), наведеними або запропонованими в даному описі, включаючи їх комплементи і фрагменти. У одному варіанті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом включає послідовність нуклеїнової кислоти, представлену в одній з наведених послідовностей, її комплементи і/або фрагменти. У іншому варіанті даного винаходу, маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом включає послідовність, яка ідентична таким послідовностям нуклеїнових кислот на 80-100% або 90-100%. У ще одному варіанті даного винаходу маркерна молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом ідентична такій послідовності на 95-100%. Такі послідовності можуть бути використані як маркери в процесі селекції рослин для ідентифікації потомства генетичних гібридів. Гібридизацію зонда з молекулою ДНК-мішені можна детектувати різними методами, відомими фахівцям в даній галузі, які включають, не обмежуючись ними, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки на основі антитіл і хемілюмінесцентні мітки. У випадку ампліфікації послідовності-мішені нуклеїнової кислоти (наприклад, методом ПЛР) з використанням конкретної пари затравок для ампліфікації, "суворі умови" являють собою умови, в яких вказана пара затравок гібридизується тільки з послідовністю-мішенню нуклеїнової кислоти, з якою затравка, що має відповідну послідовність дикого типу (або її комплемент), повинна зв'язуватися і переважно продукувати унікальний продукт ампліфікації, амплікон. Термін "специфічний до (послідовності-мішені)" означає, що зонд або затравка гібридизується в суворих умовах гібридизації тільки з послідовністю-мішенню в зразку, що включає таку послідовність-мішень. У використаному тут значенні термін "ампліфікована ДНК" або "амплікон" означає продукт ампліфікації нуклеїнової кислоти послідовності-мішені нуклеїнової кислоти, що є частиною матриці нуклеїнової кислоти. Наприклад, для визначення наявності в рослині сої, одержаній в результаті статевого схрещування, геномної ДНК трансгенної події з рослини сої за даним винаходом, ДНК, екстрагована із зразка тканини рослини сої, може бути піддана ампліфікації 13 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нуклеїнової кислоти з використанням пари затравок, з яких одна затравка виділена з фланкуючої послідовності, локалізованої в геномі рослини поруч з інсерційним сайтом вставленої гетерологічної ДНК, і друга затравка виділена з вставленої гетерологічної ДНК, для продукування амплікона, що дозволяє діагностувати наявність ДНК події. Подію також можна діагностувати на основі довжини і послідовності амплікона. Довжина амплікона може дорівнювати загальній довжині пар затравок і однієї пари нуклеотидних основ і/або загальній довжині пар затравок і приблизно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, або 500, 750, 1000, 1250, 1750, 2000 або більшому числу пар нуклеотидних основ (плюс або мінус будьяке число вищезгаданих приростів). Альтернативно, пара затравок може бути виділена з фланкуючої послідовності з обох сторін вставленої ДНК з утворенням амплікона, що включає всю нуклеотидну послідовність вставки. Один член пари затравок, виділеної з геномної послідовності рослини, може бути розташований на відстані від вставленої послідовності ДНК. Вказана відстань може складати від однієї пари нуклеотидних основ приблизно до двадцяти тисяч пар нуклеотидних основ. У визначення терміна "амплікон" входять димери затравок, які можуть бути утворені при виконанні термічної реакції ампліфікації ДНК. Нуклеїнова кислота може бути ампліфікована різними методами ампліфікації нуклеїнових кислот, відомими в даній галузі, включаючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). У даній галузі відомі різні методи ампліфікації, які описані, нарівні з іншими публікаціями, в патенті США № 4683195 і патенті США № 4683202. Методом ПЛР можна ампліфікувати до 22 т.п.о. геномної ДНК. При здійсненні даного винаходу можуть бути використані вказані методи, а також інші методи ампліфікації ДНК, відомі в даній галузі. Послідовність ДНК-вставки або фланкуючої геномної послідовності гетерологічного трансгена з події сої за даним винаходом може бути перевірена (і за необхідності скоректована) шляхом ампліфікації таких послідовностей події за допомогою затравок, виділених з послідовностей за даним винаходом, стандартними методами секвенування ДНК амплікона ПЛР або клонованої ДНК. Амплікон, одержаний вказаними методами, може бути виявлений різними методами. Електрофорез в агарозному гелі і забарвлення бромідом етидію є загальноприйнятим, добре відомим методом детекції ампліконів ДНК. Іншим таким методом є генетичний двійковий аналіз з використанням олігонуклеотиду ДНК, що перекриває суміжну фланкуючу геномну послідовність ДНК і вставлену послідовність ДНК. Вказаний олігонуклеотид іммобілізують в ямках мікропланшета. Після ПЛР області, що представляє інтерес (з використанням однієї затравки у вставленій послідовності і однієї затравки в суміжній фланкуючій геномній послідовності), одноланцюжковий продукт ПЛР може бути гібридизований з іммобілізованим олігонуклеотидом і використаний як матриця для виконання реакції подовження на одну основу з використанням ДНК-полімерази і мічених ddNTР, специфічних до передбачуваної наступної основи. Зчитування може бути виконане за допомогою флуоресцентного аналізу або ELISA. 14 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Сигнал вказує на наявність вставки/фланкуючої послідовності в результаті успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу. Іншим методом є метод піросеквенування, описаний в публікації Winge, Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000. При виконанні вказаного методу створюють олігонуклеотид, який перекриває місце з'єднання суміжної геномної ДНК і вставленої ДНК. Олігонуклеотид гібридизують з одноланцюжковим продуктом ПЛР з області, що представляє інтерес (одна затравка у вставленій послідовності і одна затравка у фланкуючій геномній послідовності), і інкубують в присутності ДНК-полімерази, АТР, сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5'фосфосульфату і люциферину. Окремо додають DNTP, в результаті чого виникає світловий сигнал, який вимірюють. Світловий сигнал свідчить про наявність вставки/фланкуючої послідовності трансгена в результаті успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну або декілька основ. Поляризація флуоресценції є ще одним методом, який може бути використаний для детекції амплікона за даним винаходом. Відповідно до даного методу створюють олігонуклеотид, який перекриває місце з'єднання геномної фланкуючої послідовності і вставленої ДНК. Олігонуклеотид гібридизують з одноланцюжковим продуктом ПЛР з області, що представляє інтерес (одна затравка у вставленій ДНК і одна затравка у фланкуючій геномній послідовності ДНК), і інкубують в присутності ДНК-полімерази і міченого флуоресцентним барвником ddNTP. Подовження на одну основу викликає включення ddNTP. Таке включення можна виміряти у вигляді зміни поляризації за допомогою флуорометра. Зміна поляризації свідчить про наявність вставки/фланкуючої послідовності трансгена в результаті успішної ампліфікації, гібридизації і подовження на одну основу. TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) є методом детекції і кількісного визначення наявності послідовності ДНК. У короткому викладі даний метод включає створення олігонуклеотидного зонда FRET, який перекриває місце з'єднання геномної фланкуючої і вставної ДНК. Зонд FRET і затравки для ПЛР (одна затравка в послідовності вставної ДНК і одна затравка у фланкуючій геномній послідовності) піддають циклічній обробці в присутності термостійкої полімерази і dNTP. У процесі специфічної ампліфікації taq полімераза ДНК відщеплюється і вивільняє флуоресцентну частину з гасильної частини зонда FRET. Флуоресцентний сигнал свідчить про наявність фланкуючої/вставної послідовності трансгена в результаті успішної ампліфікації і гібридизації. Для детекції послідовності був запропонований метод молекулярних маяків. У короткому викладі даний метод включає створення олігонуклеотидного зонда FRET, який перекриває місце з'єднання фланкуючої геномної і вставної ДНК. Унікальна структура зонда FRET дозволяє одержати вторинну структуру, що містить флуоресцентну і гасильну частини в безпосередній близькості одна від одної. Зонд FRET і затравки для ПЛР (одна затравка в послідовності вставної ДНК і одна затравка у фланкуючій геномній послідовності) піддають циклічній обробці в присутності термостійкої полімерази і dNTP. Після успішної ампліфікації методом ПЛР гібридизація зонда FRET з послідовністю-мішенню викликає видалення вторинної структури зонда і просторове відділення флуоресцентної і гасильної частин. Виникає флуоресцентний сигнал. Флуоресцентний сигнал свідчить про наявність фланкуючої геномної/вставної послідовності трансгена в результаті успішної ампліфікації і гібридизації. Крім розглянутого положення в геномі сої, яке є найбільш придатним для інсерції, даний винахід також стосується насіння сої і/або рослини сої, що включає щонайменше одну вставку, відмінну від гена aad-12, в безпосередній близькості від даного положення в геномі. Один варіант здійснення винаходу стосується заміни вставки aad-12, розглянутої в даному описі, іншою вставкою. Для вказаної мети може бути використана, наприклад, направлена гомологічна рекомбінація. Даний метод описаний, наприклад, в WO 03/080809 A2 і відповідній опублікованій заявці на патент США (US 2003/0232410). Таким чином, даний винахід стосується рослин і рослинних клітин, що включають гетерологічну вставку (замість гена aad-12 або з декількома копіями гена aad-12), фланковану повними фланкуючими послідовностями або упізнаваними частинами фланкуючих послідовностей за даним винаходом (наприклад, залишками 1-2730 і 9122-10212 SEQ ID NO:1). Подібним чином може бути використана для вставки додаткова копія (або додаткові копії) гена aad-12. У даній галузі описані методи введення полінуклеотидної послідовності в конкретну ділянку хромосоми рослинної клітини шляхом гомологічної рекомбінації. Наприклад, метод сайтспецифічної інтеграції, описаний в публікації заявки на патент США № 2009/0111188 А1, передбачає використання рекомбіназ або інтеграз, що опосередковують введення полінуклеотидної послідовності донора в хромосому-мішень. Крім того, в міжнародній заявці на патент № WO 2008/021207 описаний метод гомологічної рекомбінації, опосередковуваної 15 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цинковмісною пальцеподібною областю, для введення однієї або декількох полінуклеотидних послідовностей донора в певні положення геному. Для введення полінуклеотидної послідовності в певну ділянку хромосоми можуть бути використані рекомбінази, такі як FLP/FRT, описані в патенті США № 6720475, або CRE/LOX, описані в патенті США № 5658772. І, нарешті, мегануклеази, використовувані для направленого введення донорських полінуклеотидів в певну ділянку хромосоми, були описані в публікації Puchta et al., PNAS USA 93 (1996), pp. 5055-5060. Добре відомі і широко застосовуються різні інші методи сайт-специфічної інтеграції в рослинні клітини (Kumor et al., Trands in Plant Sсi. 6(4) (2001), pp. 155-159). Крім того, для модифікації рослин можуть бути використані системи сайт-специфічної рекомбінації, ідентифіковані в декількох прокаріотичних і нижчих еукаріотичних організмах. Приклади таких систем включають, не обмежуючись ними, систему рекомбіназ R/RS з плазміди pSR1 дріжджів Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985), J. Mol. Biol. 182:191-203) і систему Gin/gix фага Mu (Maeser and Kahlmann (1991), Mol. Gen. Genet. 230:170-176). У деяких варіантах здійснення даного винаходу може бути бажано інтегрувати або приєднати новий трансген поруч з існуючою трансгенною подією. Трансгенною подією може бути переважний геномний локус, вибраний на основі унікальних характеристик, таких як єдиний інсерційний сайт, нормальне менделевське розщеплення, стійка експресія і краща комбінація ефективності, що включає стійкість до гербіцидів і агрономічну продуктивність в різних оточеннях. Знову інтегровані трансгени повинні зберігати характеристики експресії трансгенів існуючих трансформантів. Крім того, розроблені аналізи, призначені для детекції і підтвердження наявності знову інтегрованої події, які дозволяють ідентифікувати геномні фланкуючі послідовності і положення в хромосомі знову інтегрованої події. І, нарешті, введення нового трансгена в певну ділянку хромосоми, зв'язану з існуючим трансгеном, дозволить прискорити інтрогресію трансгенів в інші генетичні середовища в результаті ауткросингу за допомогою стандартних методів селекції. У деяких варіантах здійснення даного винаходу може бути бажано видалити полінуклеотидні послідовності з трансгенної події. Наприклад, ексцизія трансгена, описана в попередній заявці на патент США № 61/297628, передбачає використання нуклеаз цинковмісної пальцеподібної області для видалення полінуклеотидної послідовності, що складається з полігенного експресуючого кластера, з введеної в хромосому трансгенної події. Полінуклеотидна послідовність, що видаляється, може бути селектованим маркером. Після ексцизії і видалення полінуклеотидної послідовності модифікована трансгенна подія може бути перенацілена шляхом інсерції полінуклеотидної послідовності. Ексцизія полінуклеотидної послідовності і подальше перенацілювання модифікованої трансгенної події створюють такі переваги як можливість повторного використання селектованого маркера або усунення випадкових змін транскриптоми рослини, виникаючих в результаті експресії специфічних генів. Даний винахід стосується певного сайта в хромосомі 4 геному сої, який прекрасно придатний для інсерції гетерологічних нуклеїнових кислот. Крім того, в обсяг даного винаходу входять 5'-кінцевий молекулярний маркер, 3'-кінцевий молекулярний маркер, 5'-кінцева фланкуюча послідовність і 3'-кінцева фланкуюча послідовність, використовувані для ідентифікації положення сайта-мішені в хромосомі 4. Таким чином, даний винахід стосується способів введення гетерологічних нуклеїнових кислот, що представляють інтерес, в попередньо визначений сайт-мішень або поруч з вказаним сайтом-мішенню. Даний винахід також стосується насіння і/або рослини сої, що включає будь-яку гетерологічну нуклеотидну послідовність, введену у вказаний сайт-мішень або в безпосередній близькості від такого сайта. Одним способом здійснення такої цілеспрямованої інтеграції є ексцизія і/або заміна експресуючого кластера гена pat іншою вставкою за даним винаходом. Таким чином, цілеспрямована гомологічна рекомбінація може бути використана відповідно до даного винаходу без яких-небудь обмежень. У використаному тут значенні термін "стекінг" генів, подій або ознак означає об'єднання бажаних ознак в одній трансгенній лінії. Селекціонери рослин об'єднують трансгенні ознаки шляхом схрещування батьківських форм, кожна з яких має необхідну ознаку, і подальшої ідентифікації потомства, що має обидві необхідні ознаки. Іншим способом стекінгу генів є одночасне перенесення двох або більше генів в ядро клітини рослини в процесі трансформації. Іншим способом стекінгу генів є повторна трансформація трансгенної рослини іншим геном, що представляє інтерес. Наприклад, стекінг генів може бути використаний для об'єднання двох або більше різних ознак, що включають, наприклад, дві або більше різних ознак стійкості до впливу комах і ознак стійкості до хвороб, дві або більше ознак стійкості до гербіцидів і/або ознак стійкості до впливу комах і ознак стійкості до гербіцидів. Використання селектованого маркера крім гена, що представляє інтерес, також може вважатися стекінгом генів. 16 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Термін "гомологічна рекомбінація" означає взаємодію будь-якої пари нуклеотидних послідовностей, які мають відповідні сайти, що містять подібну нуклеотидну послідовність, за допомогою якої дві вказані нуклеотидні послідовності можуть взаємодіяти (рекомбінувати) з утворенням нової послідовності рекомбінантної ДНК. Сайти подібної нуклеотидної послідовності визначаються в даному описі як "гомологічна послідовність". Частота гомологічної рекомбінації звичайно зростає із збільшенням довжини гомологічної послідовності. Таким чином, хоч гомологічна рекомбінація може відбуватися між двома нуклеотидними послідовностями, які є недостатньо ідентичними, частота (або ефективність) рекомбінації зменшується при збільшенні розходження між двома послідовностями. Рекомбінація може бути здійснена при використанні однієї гомологічної послідовності в донорській молекулі і молекулі-мішені, в результаті чого утворюється продукт рекомбінації "одного кросинговеру". Альтернативно в нуклеотидну послідовність-мішень і донорську нуклеотидну послідовність можуть бути введені дві гомологічні послідовності. В результаті рекомбінації двох гомологічних послідовностей донорської молекули з двома гомологічними послідовностями мішені утворюється продукт рекомбінації "двох кросинговерів". Якщо гомологічні послідовності в донорській молекулі фланкують послідовність, призначену для маніпуляції (наприклад, послідовність, що представляє інтерес), рекомбінація молекули-мішені двома кросинговерами дозволяє одержати продукт рекомбінації, в якому послідовність, що представляє інтерес, замінює послідовність ДНК, яка спочатку знаходилася між гомологічними послідовностями в молекулі-мішені. Обмін послідовностями ДНК між мішенню і донором в результаті рекомбінації "двома кросинговерами" іменується "заміною послідовності". Всі патенти, заявки на патент, попередні заявки і публікації, наведені в даному описі, повністю включені в цей опис як посилання в тій мірі, в якій вони відповідають положенням даного винаходу. Наведені нижче приклади ілюструють способи здійснення винаходу і демонструють певні переважні варіанти здійснення винаходу. Вказані приклади не обмежують обсяг винаходу. Фахівцям в даній галузі повинно бути зрозуміло, що методи, описані в нижченаведених прикладах, представляють певні підходи, використовувані для ілюстрації переважних варіантів здійснення винаходу. Однак фахівцям в даній галузі повинно бути зрозуміло в світлі даного опису винаходу, що в конкретні варіанти здійснення винаходу можуть бути внесені багато які зміни, які дозволяють одержати аналогічні або подібні результати, не виходячи за межі суті і обсягу винаходу. За винятком особливо обумовлених випадків всі проценти є масовими процентами, і співвідношення сумішей розчинників є об'ємними співвідношеннями. За винятком особливо обумовлених випадків в даному описі використані наступні абревіатури: AAD-12 арилоксіалканоатдіоксигеназа-1 п.о. пара основ °С градуси по шкалі Цельсія ДНК дезоксирибонуклеїнова кислота DIG дигоксигенін EDTA етилендіамінтетраоцтова кислота т.п.о. тисяча пар основ мкг мікрограм мкл мікролітр мл мілілітр М молярна маса OLP перекриваючий зонд ПЛР полімеразна ланцюгова реакція PTU транскрипційна одиниця рослини SDS додецилсульфат натрію SOP стандартна методика експерименту SSC буферний розчин, що містить суміш хлориду натрію і цитрату натрію, рН 7,0 буферний розчин, що містить суміш тріс-буфера з основою, борної кислоти і ТВЕ EDTA, рН 8,3 V вольти Приклади Приклад 1. Трансформація і відбір події DAS-68416-4 сої AAD-12 Подія DAS-68416-4 трансгенної сої (Glycine max) була одержана в результаті опосередкованої Agrobacterium трансформації експлантатів сім’ядольного вузла сої. Для ініціації трансформації був використаний штам Agrobacterium EHA101 без плеча хромосоми 17 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Hood et al., 2006), що містить подвійний вектор pDAB4468 (фіг. 1) з селектованим маркером (pat) і геном, що представляє інтерес (aad-12), в області Т-ланцюга ДНК. Опосередковану Agrobacterium трансформацію виконували за допомогою модифікованого методу, описаного в публікації Zeng et al. (2004). Насіння сої (сорти Maverick) пророщували на базальному середовищі, сім’ядольні вузли видаляли і інфікували Agrobacterium. У середовище для утворення паростків, подовження паростків і вкорінення додавали цефотаксим, тиментин і ванкоміцин для видалення Agrobacterium. Для інгібування росту нетрансформованих паростків використовували глюфозинат. Відібрані паростки переносили в середовище для вкорінення, що забезпечує розвиток кореневої системи, і потім переносили в ґрунтову суміш для акліматизації паростків. Верхівкові листя відібраних паростків забарвлювали глюфозинатом для скринінгу передбачуваних трансформантів. Досліджені паростки переносили в теплицю, залишали для акліматизації і забарвлювали листя глюфозинатом для підтвердження стійкості і виявлення передбачуваних трансформантів. Брали зразки досліджених рослин і виконували молекулярні аналізи для підтвердження наявності гена селектованого маркера і/або гена, що представляє інтерес. Рослини Т0 залишали в теплиці для самозапилення, в результаті чого була одержана насінина Т1. Рослини Т1 піддавали зворотному схрещуванню і використовували для інтрогресії в елітну зародкову плазму (Maverick). Подія DAS-68416-4 сої була одержана з незалежного трансформованого ізоляту. Ця подія була відібрана на основі унікальних характеристик, таких як один інсерційний сайт, нормальне менделевське розщеплення, стійка експресія і прекрасна комбінація ефективності, що включає стійкість до гербіцидів і агрономічну продуктивність в широких генотипічних середовищах і різних навколишніх умовах. У нижченаведених прикладах представлені дані, які були використані для дослідження події DAS-68416-4 сої. Приклад 2. Дослідження події DAS-68416-4 сої методом саузерн-блотингу Аналіз методом саузерн-блотингу був виконаний для визначення патерна інтеграції події DAS-68418-4 сої. В результаті виконаних експериментів були одержані дані, що свідчать про інтеграцію і цілісність трансгена aad-12 в геномі сої. Подія DAS-68418-4 сої являла собою повну, просту інтеграційну подію, що містить одну копію РTU aad-12 з плазміди pDAB4468. Дані, одержані в результаті виконання саузерн-блотингу, показали, що в геном події DAS68418-4 сої був введений фрагмент Т-ланцюга pDAB4468. Детальний аналіз методом саузернблотингу був виконаний з використанням зонда, специфічного до гена aad-12, що знаходився в області інтеграції pDAB4468 Т-ланцюга, і дескриптивних рестрикційних ферментів, які мають сайти розщеплення в плазміді і продукують гібридизуючі фрагменти всередині плазміди або фрагменти, що заповнюють місце з'єднання плазміди з геномною ДНК сої (крайові фрагменти). Молекулярна маса, встановлена в результаті гібридизації методом саузерн-блотингу для комбінації рестрикційного ферменту і зонда, була характерна для цієї події і визначала його ідентифікуючі патерни. Вказані аналізи також показали, що фрагмент плазміди був введений в геномну ДНК сої без реаранжування PТU aad-12. Приклад 2.1. Одержання зразка листя сої і виділення геномної ДНК (гДНК) Геномну ДНК екстрагували з тканини листя окремих рослин сої, що містять подію DAS68416-4. Крім того, гДНК була виділена зі стандартної рослини сої сорту Maverick, генетичний фон якої типовий для даної лінії з відсутністю гена aad-12. Геномну ДНК екстрагували з ліофілізованої тканини листя стандартним методом СТАВ. Екстраговану ДНК піддавали кількісному спектрофлуорометричному аналізу, використовуючи реагент Pico Green (Invitrogen, Carlsbad, CA). Потім ДНК візуалізували на агарозному гелі для підтвердження результатів аналізу з використанням реагенту Pico Green і визначення якості ДНК. Приклад 2.2. Розщеплення і виділення ДНК Для молекулярного дослідження події DAS-68416-4 сої методом саузерн-блотингу розщеплювали десять мікрограмів (10 мкг) геномної ДНК. Геномну ДНК з події DAS-68416-4 сої і лінії нетрансгенної сої Mavrick розщеплювали, додаючи до кожного зразка ДНК приблизно п'ять одиниць вибраного рестрикційного ферменту на один мкг ДНК і відповідний реакційний буфер. Кожний зразок інкубували протягом ночі, приблизно при 37 °C. Для розщеплення використовували рестрикційні ферменти SpeI, KpnI і PacI (New England Biolabs, Ipswich, MA). Крім того, був одержаний позитивний контрольний гібридизований зразок шляхом об'єднання плазмідної ДНК, pDAB4468, з геномною ДНК нетрансгенної сої сорту Maverick. Суміш плазмідної ДНК/геномної ДНК розщеплювали такими ж методами з використанням такого ж рестрикційного ферменту, що і експериментальні зразки. Розщеплену ДНК інкубували протягом ночі, додавали NaCl до кінцевої концентрації 0,1М, після чого зразки розщепленої ДНК осаджували 18 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 ізопропанолом. Осаджену ДНК ресуспендували в 20 мкл 1-кратного наповнюючого буфера (0,1% бромфенолового синього, 100 мМ EDTA, 50% гліцерину, 10 мМ тріс-буфера, рН 7,5). Зразки ДНК і маркери молекулярної маси піддавали електрофорезу в 0,85% агарозному гелі, використовуючи 0,4-кратний буфер ТАЕ (Fisher Scientific, Pittsburg, PA), під напругою 35 вольт протягом приблизно 18-22 годин для відділення фрагмента. Гелі забарвлювали бромідом етидію (Invitrogen, Carlsbad, CA) і ДНК візуалізували в ультрафіолетовому (УФ) світлі. Приклад 2.3. Перенесення методом саузерн-блотингу і обробка мембрани Аналіз методом саузерн-блотингу виконували відповідно до опису, наведеного в публікації Severson et al. (1997). Після відділення методом електрофорезу і візуалізації фрагментів ДНК в УФ-світлі гелі занурювали в денатуруючий розчин (150 мМ NaOH, 3 мМ EDTA) приблизно на 20 хвилин і потім переносили в нейтралізуючий розчин (150 мМ NaPO 4, рН 7,8) щонайменше на 20 хвилин. Перенесення методом саузерн-блотингу на нейлонові мембрани (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) виконували протягом ночі, використовуючи систему тампонів з буфером для перенесення (25 мМ пірофосфату натрію, рН 10). Перенесену ДНК зв'язували з мембраною шляхом нагрівання мембрани при 65 °C протягом приблизно 2 годин. Таким чином, методом саузерн-блотингу були одержані мембрани, готові для гібридизації. Приклад 2.4. Мічення ДНК-зонда і гібридизації Фрагменти ДНК, зв'язані з нейлоновою мембраною, виявляли за допомогою міченого зонда. Зонд, використаний в даному експерименті, був одержаний в результаті ампліфікації методом ПЛР з використанням затравок для конкретної нуклеотидної області плазміди pDAB4468. Фрагмент, ампліфікований методом ПЛР, виділяли, очищали від агарозного гелю і використовували як матрицю для гібридизуючого зонда. Гібридизуючий зонд, створений 32 методом саузерн-блотингу, мітили α Р-специфічним нуклеотидом шляхом довільного примування з використанням гранул для мічення ДНК READY-TO-GO™ GE Healthcare (GE Healthcare, Piscataway, NJ), відповідно до інструкцій виробника, і очищали на мікроколонках PROBEQUATN™ G-50 (Amersham/Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA). Зонд, використаний в даному експерименті, представлений в таблиці 2. Попередню гібридизацію виконували при 65 °C протягом 4 годин з використанням буфера для гібридизації (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Розчин для попередньої гібридизації декантували і замінювали розчином для гібридизації, що містить необхідну кількість специфічного зонда, попередньо денатурованого шляхом кип’ятіння у воді протягом 5 хвилин. Суміш розчину для гібридизації і зонда інкубували з нейлоновою мембраною протягом ночі при 65 °C. Після гібридизації мембрану тричі промивали при 65 °C протягом 20 хвилин в промивальному буфері (10 мМ фосфату натрію, 2,5 мМ пірофосфату натрію, 0,5 мМ EDTA, 0,1% SDS, який доводили до рН 7,8 додаванням фосфорної кислоти). Промиті фільтри експонували на екрані пристрою Phosphorimager для виконання авторадіографії і сканували зображення. Для даного зонда були зареєстровані число і розміри виявлених смуг. Крім того, був використаний маркер молекулярної маси для визначення розміру гібридизуючого фрагмента на саузерн-блотах. 40 Таблиця 2 Локалізація і довжина зондів, використаних при виконанні аналізу методом саузерн-блотингу Назва зонда aad-12 45 50 Генетичний елемент aad-12 Положення в pDAВ4468 (п.о.) 10118-10768 Довжина (п.о.) 671 Приклад 2.5. Результати аналізу методом саузерн-блотингу У таблиці 3 наведені розміри передбачуваних фрагментів і фрагментів, одержаних для певного гідролізату і зонда на основі відомих сайтів рестрикційних ферментів PTU aad-12. Розміри передбачуваних фрагментів визначені на основі плазмідної карти pDAB4468 (фіг. 1), розміри одержаних фрагментів визначені за результатами вказаних аналізів і на основі 32 встановлених розмірів фрагментів маркера молекулярної маси II α Р-міченої ДНК. В результаті вказаних розщеплень і гібридизацій були ідентифіковані фрагменти двох типів: внутрішні фрагменти, де відомі сайти ферментів фланкують область зонда і повністю знаходяться в інсерційній області PTU aad-12, і крайові фрагменти, де відомий сайт ферменту локалізований біля одного кінця області зонда і другий сайт знаходиться в геномі сої. Розміри крайових фрагментів змінюються залежно від події, оскільки в більшості випадків сайти інтеграції фрагментів ДНК є унікальними для кожної події. Крайові фрагменти являють собою засіб локалізації сайта рестрикційного ферменту відносно інтегрованої ДНК і визначення числа 19 UA 113610 C2 інсерцій ДНК. Аналізи методів саузерн-блотингу, виконані в трьох поколіннях сої, що містить подію DAS-68416-4, дозволили одержати дані, з яких випливає, що в геном події DAS-68416-4 сої була введена інтактна PTU aad-12 з плазміди pDAB4468. Таблиця 3 Гібридизуючі фрагменти, прогнозовані і встановлені при виконанні аналізу методом саузерн-блотингу ДНК-зонд SpeI Ген aad-1 Розміри передбачуваних 1 фрагментів (п.о.) 12154 Немає >5436 (крайовий) 12154 Немає >5383 (крайовий) 2904 Немає 2904 Рестрикційні ферменти KpnI PacI pDAB4468 Maverick DAS-68416-4 pDAB4468 Maverick DAS-68416-4 pDAB4468 Maverick DAS-68416-4 Розміри встановлених 2 фрагментів (п.о.) 12154 Немає ~12000 12154 Немає ~16000 2904 Немає 2904 5 10 15 20 25 30 35 40 Рестрикційні ферменти SpeI і KpnI містять унікальні сайти рестрикції в плазміді pDAB4468. Тому вказані ферменти були вибрані для дослідження вставки гена aad-12 в події DAS-68416-4 сої. Було передбачено, що крайові фрагменти >5436 п.о. або >5383 п.о. повинні гібридизуватися із зондом до гена aad-12 відповідно після розщеплення ферментами SpeI і KpnI (таблиця 3). Окремі смуги гібридизації aad-12 ~12000 п.о. і ~16000 п.о. були виявлені при використанні, відповідно, SpeI і KpnI. Гібридизація зонда зі смугами вказаного розміру дозволяє передбачити наявність одного сайта інсерції для гена aad-12 в геномі події DAS-68416-4 сої. Рестрикційний фермент PacI був вибраний для вивільнення фрагмента довжиною 2904 п.о., що містить транскрипційну одиницю рослини aad-12 (PTU, промотор/ген/термінатор) (таблиця 3). Прогнозований фрагмент довжиною 2904 п.о. був виявлений за допомогою зонда до гена aad12 після розщеплення ферментом PacI. Результати, одержані при розщепленні зразка DAS68416-4 всіма трьома ферментами з подальшою гібридизацією із зондом до гена aad-12, показали, що в геном події DAS-68416-4 сої була введена одна копія інтактної PTU aad-12 з плазміди pDAB4468. Приклад 2.6. Відсутність острівних послідовностей Для перевірки наявності або відсутності гена стійкості до спектиноміцину в події DAS-684164 сої, виконували мультиплексний аналіз методом ПЛР. Метою даного експерименту була детекція п'яти різних областей кодуючої послідовності гена стійкості до спектиноміцину і області довжиною 407 п.о. в послідовності ендогенного гена сої, лектині (ідентифікуючий номер GenBank: K00821 М30884), як внутрішнього контрольного зразка. Крім того, були використані наступні контрольні зразки: (i) позитивний контрольний зразок з плазмідною ДНК, що містить ген стійкості до спектиноміцину, введений в геномну ДНК нетрансформованої сої; (ii) негативний контрольний зразок, одержаний при використанні геномної ДНК з нетрансформованої сої Maverick; і (iii) контрольний зразок без геномної ДНК. Геномну ДНК виділяли з сої методом СТАВ і проводили кількісне визначення з використанням реагенту Pico Green. Концентрацію ДНК в кожному зразку нормалізували до 100 нг/мкл. ПЛР виконували, використовуючи послідовності затравок, специфічні до кодуючої послідовності гена стійкості до спектиноміцину, і послідовності гена лектину. Продукти реакції аналізували, поміщуючи 20 мкл продукту ПЛР кожного зразка на 2% Е-гель. Наявність множини ампліконів (смуги, відповідні 100 п.о., 150 п.о. і 407 п.о.) на Е-гелі показує, що подія DAS-68416-4 сої містить кодуючу послідовність гена стійкості до спектиноміцину (до кодуючих послідовностей гена стійкості до спектиноміцину передбачувано належать ампліфіковані смуги, відповідні 100 п.о. і 150 п.о.). Наявність тільки одного амплікона довжиною 407 п.о., відповідного внутрішній регуляторній послідовності гена лектину, вказує на те, що подія DAS-68416-4 сої не містить кодуючу послідовність гена стійкості до спектиноміцину. Зразки ДНК з події DAS-68416-4 сої не ампліфікували фрагменти довжиною 100 п.о. або 150 п.о. Був ампліфікований тільки фрагмент довжиною 407 п.о. Однак ампліфіковані фрагменти довжиною 100 п.о., 150 п.о. і 407 п.о. були присутні в позитивному контрольному зразку, в якому 20 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 плазмідну ДНК, що містить ген стійкості до спектиноміцину, вводили в геномну ДНК сої. Негативний контрольний зразок, що містить ДНК з нетрансформованої сої, ампліфікував один фрагмент довжиною 407 п.о. І, нарешті, продукти реакції, що не містили геномну ДНК, не продукували ніяких ампліфікованих фрагментів. Тому кодуюча послідовність гена стійкості до спектиноміцину не була виявлена в події DAS-68416-4 сої. Приклад 3. Клонування і дослідження послідовності ДНК у вставці і фланкуючих крайових областях події DAS-68416-4 сої Для дослідження і опису інсерційного сайта геномної ДНК була визначена ДНК-вставка Тланцюга і фланкуючі крайові області геномної ДНК події DAS-68416-4. Було підтверджено в загальній складності 10212 п.о. геномної послідовності події DAS-68416-4 сої, з яких 2730 п.о. належали до 5'-кінцевої фланкуючої крайової послідовності, 1091 п.о. належали до 3'-кінцевої фланкуючої крайової послідовності і 6391 п.о. належали до вставки Т-ланцюга (SEQ ID NO:1). Аналіз послідовності показав, що подія DAS-68416-4 сої містить єдину копію інтактного трансгена, що включає елемент MAR, експресуючий кластер aad-12 і експресуючий кластер pat, без зміни послідовності передбачуваної вставки Т-ланцюга. Ампліфікація методом ПЛР на основі вставки і крайових послідовностей події DAS-68416-4 сої показала, що крайові області належать сої, і з'єднувальні області можуть бути використані для подієспецифічної ідентифікації події DAS-68416-4 сої. Аналіз послідовності, що заповнює з'єднувальні області, включаючи фланкуючі крайові послідовності, не дозволив виявити нові відкриті рамки зчитування (ORF>=150 кодонів), що утворилися в результаті інсерції в Т-ланцюг. Крім того, був досліджений інсерційний сайт Т-ланцюга шляхом клонування геномного фрагмента, відповідного області ідентифікованих фланкуючих крайових послідовностей з геному нетрансгенної сої. В результаті порівняння події DAS-68416-4 сої з геномною послідовністю дикого типу була виявлена делеція довжиною 55 п.о. у вихідному локусі і інсерція довжиною 9 п.о. в положенні 3'-кінцевого інтеграційного з'єднання цієї події. Дослідження вставки і крайової послідовності події DAS-68416-4 сої указало на наявність в геномі сої однієї інтактної копії Т-ланцюга. Приклад 3.1. Екстракція і кількісний аналіз геномної ДНК Геномну ДНК екстрагували з ліофілізованих або щойно подрібнених тканин листя за допомогою модифікованого методу СТАВ. Після екстракції геномної ДНК зразки ДНК розчиняли в 1-кратному буфері ТЕ (10 мМ тріс-буфера, рН 8,0, 1 мМ EDTA) (Fluka, Sigma, St. Louis, MO) і виконували кількісний аналіз з використанням реагенту Pico Green, відповідно до інструкцій виробника (Molecular Probes, Eugene, OR). Для виконання аналізу методом ПЛР зразки ДНК розводили водою з мірою чистоти для молекулярної біології (5 PRIME, Gaithersburg, MD) до концентрації 10-100 нг/мкл. Приклад 3.2. Затравка для ПЛР У таблиці 4 представлені послідовності затравок, які були використані для клонування і підтвердження ДНК-вставки і фланкуючих крайових областей події DAS-68416-4 сої, з указанням положень і описами, наведеними на фіг. 2. Всі затравки були синтезовані в компанії Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). Затравки розчиняли у воді (5 PRIME, Gaithersburg, MD) до концентрації 100 мкМ для одержання вихідного розчину і розбавляли водою до концентрації 10 мкМ для одержання робочого розчину. Таблиця 4 Умови скринінгу геному події DAS-68416-4 сої для ампліфікації фланкуючих крайових областей ПослідовСуміш ністьНабір затравок для мішень ПЛР ES_Lend03 (SEQ ID NO:2)/AP1(SEQ ID NO:3) F ES_Lend04 5'-кінцева (SEQ ID крайова NO:4)/AP2(SEQ (вкладена) ID NO:5) F 5'-кінцева крайова Попередня Кінцеве ДенаПодовДенатуПодовденатуВідпал Відпал подовтурація ження рація ження рація ження (С/сек.) (С/сек.) (С/сек.) (С/хв.:сек.) (С/сек.) (С/хв.:сек.) (С/хв.) (С/хв.) 680,5/ 95/30 68/10:00 95/30 64/30 68/10:00 72/10 циклу 95/3 64/30 8 циклів 22 цикли 680,5/ 95/30 68/10:00 95/30 64/30 68/10:00 72/10 циклу 95/3 64/30 8 циклів 24 цикли 21 UA 113610 C2 Таблиця 4 Умови скринінгу геному події DAS-68416-4 сої для ампліфікації фланкуючих крайових областей ПослідовСуміш ністьНабір затравок для мішень ПЛР ES_PATEnd03 (SEQ ID NO:6)/AP1(SEQ ID NO:1) F ES_PATEnd04 3'-кінцева (SEQ ID крайова NO:7)/AP2(SEQ (вкладена) ID NO:5) F 3'-кінцева крайова Попередня Кінцеве ДенаПодовДенатуПодовденатуВідпал Відпал подовтурація ження рація ження рація ження (С/сек.) (С/сек.) (С/сек.) (С/хв.:сек.) (С/сек.) (С/хв.:сек.) (С/хв.) (С/хв.) 680,5/ 95/30 68/10:00 95/30 64/30 68/10:00 72/10 циклу 95/3 64/30 8 циклів 22 цикли 680,5/ 95/30 68/10:00 95/30 64/30 68/10:00 72/10 циклу 95/3 64/30 8 циклів 24 цикли Таблиця 5 Умови ампліфікації за допомогою стандартної ПЛР крайових областей і подієспецифічних послідовностей в події DAS-68416-4 сої Кінцеве Суміш Попередня Денатурація Відпал Подовження подовження для денатурація (С/сек.) (С/сек.) (С/хв.:сек.) ПЛР (С/хв.) (С/хв.) 16LEndG01 (SEQ 95/30 60/30 68/5:00 72/10 ID NO:8)/AII В 95/3 LEnd05 (SEQ ID 35 циклів NO:9) 16LEndG02 (SEQ 95/30 60/30 68/5:00 72/10 ID NO:10)/AII В 95/3 LEnd06 (SEQ ID 35 циклів NO:11) 94/30 60/30 72/1:00 72/10 ПослідовністьНабір затравок мішень 5'-кінцева крайова 5-кінцева крайова Cпецифічна послідовність Soy416-F (SEQ ID в місці 5'NO:12)/ Soy416-R концевого (SEQ ID NO:13) з’єднання вставки 16PATG01 (SEQ 3'-кінцева ID крайова NO:14)/PATEnd06 (SEQ ID NO:15) 16PATG02 (SEQ 3'-кінцева ID NO:16)/ крайова PATEnd06 (SEQ ID NO:15) 16LEndG03 (SEQ ID NO:17)/ Локус вставки 16PATG03 (SEQ ID NO:18) 16LEndG04 (SEQ ID NO:19)/ Локус вставки 16PATG04 (SEQ ID NO:20) С 95/15 35 циклів 95/30 В 95/3 95/3 95/3 60/30 68/5:00 72/10 60/30 68/5:00 72/10 68/5:00 72/10 35 циклів 95/30 А 72/10 35 циклів 95/30 А 68/5:00 35 циклів 95/30 В 60/30 95/3 60/30 35 циклів 22 UA 113610 C2 Таблиця 6 Опис затравок для ампліконів 1-4 вставки Т-ланцюга Послідовністьмішень 5'-кінцева геномна ДНК/ДНКвставка (978 п.о.) ДНК-вставка (2414 п.о.) ДНК-вставка (1834 п.о.) ДНКвставка/3'кінцева геномна ДНК (1705 п.о.) Інсерційний сайт ДНК (~470 п.о.) Кінцеве Суміш Попередня Денатурація Відпал Подовження подовження для денатурація (С/сек.) (С/сек) (С/хв.:сек.) ПЛР (С/хв.) (С/хв.) 416-5-1 (SEQ 94/60 55/60 72/2:00 72/15 ID NO:21)/4468D 95/2 35 циклів 1R (SEQ ID NO:22) 4468-1 (SEQ 94/60 55/60 72/2:00 72/15 ID NO:23)/4468E 95/2 35 циклів 2R (SEQ ID NO:24) 4468-2 (SEQ 94/60 55/60 72/2:00 72/15 ID NO:25)/4468E 95/2 35 циклів 3R (SEQ ID NO:26) 4468-3 (SEQ 94/60 55/60 72/2:00 72/15 ID NO:27)/416-3E 95/2 35 циклів 1R (SEQ ID NO:28) 416-5-1 (SEQ 94/60 55/60 72/1:30 72/15 ID NO:21)/416-3Е 95/2 35 циклів 1R (SEQ ID NO:28) Набір затравок Таблиця 7 Суміш для ампліфікації стандартним методом ПЛР крайових областей і подієспецифічних послідовностей в події DAS-68416-4 сої Суміш для ПЛР А 1-кратна Реагент реакційна суміш (мкл) Н2О 29 10-кратний буфер для ПЛР 5 II (Mg-плюс) MgCl2 1,5 [25 мМ] dNTP 8 [2,5 мМ] затравка 1 (10 1 мкМ) затравка 2 (10 1 мкМ) ДНК 4 [10 нг/мкл] LA Taq 0,5 (5 од./мкл) rxn vol 50 Суміш для ПЛР В 1-кратна Реагент реакційна суміш (мкл) Н2O 30,5 10-кратний буфер для ПЛР 5 II (Mg-плюс) MgCl2 0 [25 мМ] dNTP 8 [2,5 мМ] затравка 1 (10 1 мкМ) затравка 2 (10 1 мкМ) ДНК 4 [10 нг/мкл] LA Taq 0,5 (5 од./мкл) rxn vol: 50 23 Суміш для ПЛР С 1-кратна Суміш для ПЛР реакційна суміш (мкл) H2O 31 10-кратний буфер QIA 5 MgCl2 1,5 dNTP [2,5 мМ] затравка 1 (10 мкМ) затравка 2 (10 мкМ) ДНК [10 нг/мкл] QIA Hstaq (5 од./мкл) rxn vol: 8 1 1 4 0,5 50 UA 113610 C2 Таблиця 7 Суміш для ампліфікації стандартним методом ПЛР крайових областей і подієспецифічних послідовностей в події DAS-68416-4 сої Суміш для ПЛР D 1-кратна Реагент реакційна суміш (мкл) Н2O 40,25 10-кратний буфер для ПЛР 5 II (Mg-плюс) MgCl2 dNTP [10 мМ] затравка 1 (100 мкМ) затравка 2 (100 мкМ) ДНК [100 нг/мкл] Нарощувальна високоточна Taq (5 од./мкл) rxn vol: 5 10 15 20 25 30 0 1 1 1 1 0,75 Суміш для ПЛР E 1-кратна Суміш для ПЛР реакційна суміш (мкл) Н2O 22 2-кратна маточна суміш 25 Easy-A MgCl2 0 dNTP [2,5 мМ] затравка 1 (100 мкМ) затравка 2 (100 мкМ) ДНК [10 нг/мкл] 0 1 1 Суміш для ПЛР F 1-кратна Реагент реакційна суміш (мкл) H2O 32 10-кратний буфер для ПЛР 5 II (Mg-плюс) MgCl2 1,5 [25 мМ] dNTP 8 [2,5 мМ] затравка 1 (10 1 мкМ) затравка 2 (10 1 мкМ) 1 LA Taq (5 од./мкл) 0,5 rxn vol: 50 Матрична ДНК 50 rxn vol: 1 50 Приклад 3.3. Скринінг геному Для клонування 5'- і 3'-кінцевих фланкуючих крайових областей вставки pDAB4468 Тланцюга для події DAS-68416-4 був використаний універсальний набір GENOMEWALKER™ (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA), відповідно до інструкцій виробника. Приблизно 2 мкг геномної ДНК з події DAS-68416-4 сої розщеплювали протягом ночі ферментами EcoRV і PvuII (фіг. 2). Гідролізати ДНК очищали, використовуючи набір DNA CLEAN & CONCENTRATOR™-25 (ZYMO Research, Orange, CA), і лігували з адапторами GENOMEWALKER™ зі створенням бібліотек GENOMEWALKER™. Кожну бібліотеку GENOMEWALKER™ використовували як матричну ДНК для ампліфікації за допомогою первинної ПЛР з використанням адапторної затравки АР1 (входить в набір) і специфічної для конструкції затравки ES_LEnd03 або ES_PATEnd03 (таблиця 4). Один мікролітр (1 мкл) реакційної суміші для первинної ПЛР, розведеної у співвідношенні 1:25, використовували як матрицю для ампліфікації за допомогою вторинної ПЛР з використанням вкладеної адапторної затравки АР2, передбаченої в наборі, і вкладеної специфічної для конструкції затравки ES_LEnd04 або ES_PATEnd04 (таблиці 4, 7 і фіг. 2). Приклад 3.4. Стандартна ПЛР Стандартну ПЛР використовували для клонування і підтвердження наявності вставки і крайової послідовності події DAS-68416-4 сої. Для ампліфікації за допомогою стандартної ПЛР використовували набір TaKaRa LA TAQ™ (Takara Bio Inc., Shiga, Japan), ДНК-полімеразу HOTSTARTAQ™ (Qiagen, Valencia, CA), набір для ПЛР HIGH FIDELITY™ (Roche Diagnostics, Inc.) або набір високоточних полімераз EASY-A™ (Stratagene, LaJolla, CA), відповідно до рекомендацій виробника. Специфічні умови виконання ПЛР і описи ампліконів наведені в таблицях 5, 6 і 7. Приклад 3.5. Детекція, очищення, субклонування і секвенування продуктів ПЛР Продукти ПЛР досліджували за допомогою електрофорезу, використовуючи 1,2% або 2% Егель® (Invitrogen, Carlsbad, CA), відповідно до інструкцій виробника. Розмір фрагмента визначали шляхом порівняння з маркерами ДНК. За необхідності фрагменти, одержані за допомогою ПЛР, очищали, для чого вказані фрагменти переносили з 1% агарозного гелю в 1кратний буфер ТВЕ (89 мМ тріс-буфера з боратом, 2 мМ EDTA, рН 8,3) і забарвлювали бромідом етидію, використовуючи набір для екстракції гелю QIAquick (Qiаgen, Valencia, CA). Фрагменти, одержані за допомогою ПЛР, субклонували у вектор РCR®4-TOPO®, використовуючи набір для секвенування TOPO TA CLONING® (Invitrogen, Carlsbad, CA), 24 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідно до інструкцій виробника. Зокрема, два-п'ять мікролітрів клонованого продукту реакції ТОРО® переносили в хімічно компетентні клітини ТОР10 One Shot, відповідно до інструкцій виробника. Клоновані фрагменти, правильність яких перевіряли за допомогою міні-препарату плазмідної ДНК (набір QIAprep Spin Miniprep, Qiagen, CA), розщеплювали рестрикційним ферментом EcoRI або за допомогою колонієспецифічної ПЛР з використанням затравок Т3 і Т7. Плазмідну ДНК або вихідні розчини відібраних колоній в гліцерині відправляли для секвенування. Після субклонування передбачувані продукти направленої ПЛР спочатку секвенували для підтвердження клонування очікуваних фрагментів ДНК. Колонії, що містять передбачувані послідовності ДНК, відбирали для секвенування повних дволанцюжкових послідовностей шляхом скринінгу за допомогою затравок. Секвенування було виконане в компанії Cogenics (Houston, TX). Кінцеве збирання вставки і крайових послідовностей виконували за допомогою програмного забезпечення SEQUENCHER (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Опис вставки і фланкуючих крайових послідовностей події DAS-68416-4 сої був виконаний за допомогою програми Vector NTI (версія 10 і 11, Invitrogen, Carlsbad, CA). Пошук гомології був виконаний за допомогою програми BLAST на основі ненадмірної бази даних нуклеотидів GenBank. Відкриту рамку зчитування (ORF) аналізували за допомогою програми Vector NTI (версія 11, Invitrogen) для ідентифікації ORF (>=150 кодонів) в повній вставці і фланкуючих крайових послідовностях події DAS-68416-4 сої і вихідного локусу лінії сої Maverick дикого типу. Приклад 3.6. 5'-Кінцева крайова послідовність Фрагмент ДНК ампліфікували з кожної бібліотеки GENOMEWALKER™ події DAS-68416-4 сої, використовуючи набір специфічних вкладених затравок для 5'-кінця трансгена. Був виявлений фрагмент довжиною ~1,8 т.п.о. з бібліотеки EcoRV GENOMEWALKER™ і фрагмент довжиною ~3 т.п.о. з бібліотеки PvuII GENOMEWALKER™. Вказані фрагменти клонували у вектор PCR®4-TOPO®. Для секвенування кінця були довільно вибрані п'ять колоній в кожній бібліотеці з метою одержання даних для нуклеотидних послідовностей. Колонії, що містять послідовності обох затравок для ПЛР, були відібрані для одержання повних послідовностей шляхом скринінгу за допомогою затравок. Аналіз послідовностей показав, що клон, ампліфікований з бібліотеки EcoRV GENOMEWALKER™ події DAS-68416-4 сої, містив фрагмент ДНК довжиною 1744 п.о. і клон, ампліфікований з бібліотеки PvuII GENOMEWALKER™ події DAS-68416-4 сої, містив фрагмент ДНК довжиною 3047 п.о. Аналіз послідовностей показав, що фрагмент ДНК, одержаний з бібліотеки EcoRV GENOMEWALKER™, був перекритий фрагментом ДНК, одержаним з бібліотеки PvuII GENOMEWALKER™, в областях між затравкою ES_LEnd04 і сайтом EcoRV. Всі фрагменти ДНК містили 5'-кінцеве з'єднання крайової послідовності В Т-ланцюга в трансгені, з чого випливає, що вказані фрагменти були ампліфіковані з однієї і тієї ж області 5'-кінцевої вставки трансгена і фланкуючої крайової послідовності в події DAS-68416-4 сої. Було встановлено, що одержана геномна послідовність довжиною 2730 п.о. не має значної гомології з послідовностями в GenBank. Приклад 3.7. 3'-Кінцева крайова послідовність Фрагмент ДНК довжиною близько 1,3 т.п.о. був ампліфікований з бібліотеки EcoRV GENOMEWALKER™ події DAS-68416-4 сої з використанням набору специфічних вкладених затравок для 3'-кінця трансгена. Одержаний фрагмент ДНК потім клонували у вектор PCR®4ТОРО®. Для секвенування кінця були довільно відібрані п'ять колоній. Всі п'ять колоній містили послідовності затравки АР2 і затравки ES_PATEnd04. В результаті повного секвенування вказаних клонів був виявлений фрагмент консенсусної ДНК довжиною 1359 п.о. Аналіз послідовностей показав, що фрагмент довжиною 1359 п.о. включав фрагмент довжиною 268 п.о. з 3'-кінцевої області крайової послідовності А Т-ланцюга і фрагмент довжиною 1091 п.о. з геномної ДНК сої. Пошук за допомогою програми BLAST не виявив значної гомології між послідовністю ДНК сої довжиною 1091 п.о. і послідовностями в GenBank. Приклад 3.8. ДНК-вставка і з'єднувальна послідовність ДНК-вставку і фланкуючі крайові області клонували з події DAS-68416-4 сої раніше описаними методами на основі ПЛР. 5'- і 3'-кінцеві фланкуючі крайові послідовності і прогнозовану послідовність трансгена використовували для створення затравок для ПЛР, наведених в таблиці 6. Були клоновані і секвеновані в загальній складності чотири фрагменти ДНК, що перекриваються (амплікон 1 довжиною 978 п.о., амплікон 2 довжиною 2414 п.о., амплікон 3 довжиною 1834 п.о. і амплікон 4 довжиною 1705 п.о.) (фіг. 3). Повну вставку і фланкуючі крайові послідовності збирали на основі послідовності, що перекриває чотири 25 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагменти. Аналіз зібраної послідовності підтвердив наявність фрагмента довжиною 6391 п.о. з трансгена pDAB4468 і відсутність змін основ у вставленій послідовності ДНК при порівнянні з прогнозованими послідовностями з плазміди pDAB4468. Приклад 3.9. Підтвердження геномних послідовностей сої Для підтвердження наявності інсерційного сайта трансгена події DAS-68416-4 сої в геномі сої виконували ПЛР з використанням різних пар затравок (фіг. 4 і фіг. 5). Геномну ДНК з події DAS-68416-4 сої і інших ліній трансгенної або нетрансгенної сої використовували як матрицю. Таким чином, для підтвердження правильності одержаних 5'-кінцевих крайових послідовностей дві затравки, специфічні до aad-12, наприклад AIILEnd05 і AIILEnd06, і дві затравки, які були створені відповідно до 5'-кінцевої крайової послідовності і одержали назву 16LEndG01 і 16LEndG02, були використані для ампліфікації сегмента ДНК, що заповнює ділянку від гена aad12 до 5'-кінцевої крайової послідовності. Аналогічним чином для підтвердження клонованої 3'кінцевої крайової послідовності pat-специфічна затравка, наприклад РATEnd06, і дві затравки, які були створені відповідно до 3'-кінцевої крайової послідовності і одержали назву 16PATG01 і 16РATG02, були використані для ампліфікації сегментів ДНК, що заповнюють ділянку від гена pat до 3'-кінцевої крайової послідовності. Фрагменти ДНК прогнозованого розміру були ампліфіковані тільки з геномної ДНК події DAS-68416-4 сої з використанням кожної пари затравок, з яких одна затравка знаходилася у фланкуючій крайовій послідовності події DAS68416-4 сої і інша затравка була специфічною до трансгена, але не була ампліфікована із зразків ДНК інших ліній трансгенної сої або нетрансгенної контрольної сої. Одержані результати показують, що клоновані 5'- і 3'-кінцеві крайові послідовності є фланкуючими крайовими послідовностями вставки Т-ланцюга в події DAS-68416-4 сої. Для подальшого підтвердження інсерції ДНК в геном сої методом ПЛР ампліфікували дві послідовності сої. Дві затравки, створені відповідно до 5'-кінцевої крайової послідовності, 16LEndG03 і 16LEndG04, і дві затравки для 3'-кінцевої крайової послідовності, 16PATG03 і 16РATG04, були використані для ампліфікації сегментів ДНК, що містять весь трансген, 5'кінцеву крайову послідовність і 3'-кінцеву крайову послідовність. Як і передбачалося, в результаті ампліфікації методом ПЛР з використанням пари затравок 16LEndG03 і 16РATG03 був ампліфікований фрагмент ДНК довжиною 9 т.п.о. з геномної ДНК події DAS-68416-4 сої і фрагмент ДНК довжиною 2,7 т.п.о. з нетрансгенної контрольної сої і інших ліній трансгенної сої. Аналогічним чином при виконанні ПЛР з використанням пари затравок 16LEndG04 і 16PATG04 був одержаний фрагмент ДНК довжиною приблизно 9 т.п.о. із зразка події DAS-68416-4 і фрагмент ДНК довжиною 2,8 т.п.о. зі всіх інших ліній контрольної сої. Була виявлена слабка смуга розміром близько 6 т.п.о. у всіх зразках сої за винятком події DAS-68416-4 сої при використанні обох пар затравок для ПЛР, з чого випливає, що вказана слабка смуга з'явилася в результаті неспецифічної ампліфікації в геномі сої за допомогою даної пари затравок. Приклад 3.10. Підтвердження геномних послідовностей сої Фрагменти ДНК довжиною 2,7 т.п.о. і 2,8 т.п.о., ампліфіковані з використанням пари затравок 16LEndG03 і 16РATG03 або пари затравок 16LEndG04 і 16РATG04 з лінії нетрансгенної сої Maverick, клонували і секвенували. Послідовності вказаних фрагментів суміщали одну з одною і порівнювали з клонованими 5'- і 3'-кінцевими крайовими послідовностями з події DAS-68416-4 сої. Було встановлено, що клонована послідовність ДНК включала локус, в якому Т-ланцюг pDAB4468 був інтегрований в подію DAS-68416-4 сої. В результаті виконання порівняльного аналізу була виявлена делеція 55 п.о. з вихідного локусу і інсерція 9 п.о. в положенні 3'кінцевого інтеграційного з'єднання (фіг. 5). У клонованій геномній області вихідного локусу сої не були виявлені відкриті рамки зчитування (>/=450 п.о., 150 амінокислот). Приклад 4. Дослідження геному за допомогою маркерів SNP фланкуючих послідовностей події DAS-68416-4 сої Для дослідження і опису інсерційного сайта геному були визначені маркерні послідовності, розташовані в безпосередній близькості від вставки. Для ідентифікації і картування положення трансгена була використана панель поліморфних маркерів поліморфізму окремих нуклеотидів (SNP). Подія DAS-68416-4 сої локалізована на відстані 119,6 сМ в хромосомі 4. Вказані положення знаходиться між двома маркерами SNP BARC-044607-08736 і BARC-019093-03299 фланкуючих послідовностей. Зокрема, дане положення трансгена було картовано на відстані 1,3 сМ (480 т.п.о.) від маркера SNP BARC-019093-03299. Приклад 4.1. Програма BLAST з використанням послідовностей фланкуючих крайових областей Послідовності фланкуючих крайових областей події DAS-68416-4 сої (SEQ ID NO:1) використовували для дослідження за допомогою програми BLAST всієї геномної послідовності сої. Результати дослідження за допомогою програми BLAST показали, що обидві крайові 26 UA 113610 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовності події DAS-68416-4 сої були локалізовані в хромосомі 4 (Gm04), яка є зв'язувальною групою С1. Приклад 4.2. Картування SNP і результати дослідження за допомогою програми BLAST На основі результатів дослідження за допомогою програми BLASТ з використанням крайових послідовностей і картування було встановлено знаходження вказаної події в хромосомі 4. Маркери SNP були відібрані на основі карт зчеплення генів сої. Послідовності SNP були вибрані з маркерів SNP, створених доктором Креганом, Beltsville Agricultural Research Center, і Міністерством сільського господарства США. Вказані маркери SNP асоційовані зі зв'язувальною групою С1, відповідною хромосомі 4. Послідовності SNP були використані для дослідження за допомогою програми BLAST всієї геномної послідовності сої з метою визначення фізичних положень вставки Т-ланцюга для події DAS-68416-4 сої. Приклад 4.3. Результати дослідження за допомогою маркерів SNP Подія DAS-68416-4 сої картована на відстані 119.6 сМ в хромосомі 4. Двома фланкуючими маркерами SNP є BARC-044607-08736 і BARC-019093-03299. Трансген розташований на відстані 1,3 сМ (480 т.п.о.) від маркера SNP BARC-019093-03299, при відстані приблизно 119,6 сМ між маркерами SNP BARC-044607-08736 і BARC-019093-03299. Приклад 5. Дослідження білка AAD-12 в події DAS-68416-4 сої Були досліджені біохімічні властивості рекомбінантного білка AAD-12, виділеного з події DAS-68416-4 трансгенної сої. Біохімічні властивості вказаного білка досліджували за допомогою кількісного твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE, забарвленому кумасі синім і за допомогою методів детекції глікопротеїну) і вестерн-блотингу і підтверджували експресію білка AAD-12. Приклад 5.1. Експресія білка AAD-12 в тканинах рослини У події DAS-68416-4 сої визначали рівні білка AAD-12. Розчинний екстрагований білок AAD12 вимірювали за допомогою кількісного твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) в листі сої. Зразки тканин сої, виділені з піддослідних рослин, готували до виконання аналізу експресії. Білок AAD-12 екстрагували з тканин рослин сої за допомогою сольового розчину з фосфатним буфером, який містить детергент твін-20 (PBST), що включає 0,5% бичачого сироватковий альбуміну (BSA). Тканину рослини центрифугували, водний супернатант збирали, за необхідності розбавляли відповідним буфером і аналізували у вигляді сендвіча за допомогою набору для ELISA AAD-12. Вказаний набір використовували відповідно до рекомендацій виробника. Виконували аналіз для дослідження стійкості експресії і успадковуваності як по вертикалі (між поколіннями), так і по горизонталі (між лініями) в події DAS-68416-4 сої. Експресія події DAS-68416-4 сої в поколінні Т5 була стійкою (без розщеплення) і порівнянною у всій лініях (фіг. 6). Рівні експресії події DAS-68416-4 сої в польових умовах досліджували на різних стадіях росту рослин, що включають стадії до V3, після V3, до R2 і після R2. Значення експресії були аналогічні для всіх умов обприскування рослин, а також для ділянок, обприсканих і не обприсканих гербіцидом 2,4-D. Була внесена 2-кратна норма гербіциду (2240 г еквівалента кислоти/га 2,4-D) і при цьому не було виявлено пошкодження рослин на всіх етапах дослідження. Середня експресія у всіх лініях на стадії росту рослин до V3 дорівнювала 300 2 мкг/см . Після обприскування 2,4-D експресія залишалася стійкою і складала в середньому 400 2 мкг/см у всіх лініях. До часу досягнення соєю стадії росту, що передує R2, середня експресія 2 дещо знизилася і складала в середньому 200 мкг/см . Після обприскування 2,4-D експресія на 2 стадії після R2 повернулася до попереднього середнього значення, що дорівнює 400 мкг/см . Див. фіг. 6. Приклад 5.2. Експресія білка AAD-12 в тканинах рослини У 2008 р. було виконане додаткове дослідження експресії в польових умовах на шести ділянках в США і Канаді. Досліджували сою з подією DAS-68416-4, яка була піддана чотирьом обробкам (відсутність обприскування, обприскування 2,4-D, обприскування глюфозинатом або обприскування 2,4-D і глюфозинатом). Зразки тканин рослини включали листя, зерна, коріння і стебла. Тканини листя були одержані на стадії V5 і V10, коріння і стебла були одержане на стадії розвитку R3. Зерно було одержане на стадії розвитку R8 (Gaska, 2006). Розчинний екстрагований білок AAD-12 вимірювали за допомогою достовірного твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), описаного в прикладі 5.1. Рівні білка AAD-12 для всіх типів тканин обчислювали у вигляді нг/мг сухої маси. 27 UA 113610 C2 5 Короткий огляд концентрацій білка AAD-12 (в середньому на ділянках) в різних матрицях сої представлений в таблиці 8. Середні значення експресії складали від 15,5 нг/мг сухої маси в корінні на стадії R3 до 66,1 нг/мг в тканині листя на стадії V5. Значення експресії були аналогічні для всіх обприскувань, а також для рослин, обприсканих і не обприсканих гербіцидами 2,4-D і глюфозинатом. Білок AAD-12 не був виявлений в тканинах контрольних рослин на всіх шести ділянках. Таблиця 8 Короткий огляд рівнів білка AAD-12 в тканинах, одержаних з сої з подією DAS-68416-4 в США і Канаді в 2008 р. Тканина сої Лист V5 Лист V10 Корінь Стебло Зерно 10 15 20 25 30 Обробка Необприскана соя DAS-68416-4 DAS-68416-4 + глюфозинат DAS-68416-4+2,4-D DAS-68416-4+глюкозинат і 24-D Необприскана соя DAS-68416-4 DAS-68416-4 + глюфозинат DAS-68416-4 + 2,4-D DAS-68416-4 + глюкозинат і 2,4-D Необприскана соя DAS-68416-4 DAS-68416-4 + глюфозинат DAS-68416-4 + 2,4-D DAS-68416-4 + глюкозинат і 2,4-D Необприскана соя DAS-68416-4 DAS-68416-4 + глюфозинат DAS-68416-4 + 2,4-D DAS-68416-4 + глюкозинат і 2,4-D Необприскана соя DAS-68416-4 DAS-68416-4 + глюфозинат DAS-68416-4 + 2,4-D DAS-68416-4 + глюкозинат і 2,4-D AAD-12 нг/мг сухої маси тканини Середнє Стандартне Діапазон значення відхилення 51,4 25,2 26,4-97,7 50,6 23,7 28,0-94,0 51,7 25,4 27,2-101 66,1 37,8 25,1-165 54,0 20,9 29,8-90,0 56,1 22,0 25,1-92,0 55,2 20,6 30,8-91,8 57,1 23,0 32,0-95,2 17,1 5,68 8,80-27,6 15,5 4,58 6,30-23,1 16,0 6,64 3,16-27,9 16,7 6,81 1,84-26,5 41,1 25,7 5,70-91,2 39,4 24,5 5,49-88,0 40,6 25,6 5,02-88,0 39,7 22,4 4,96-69,6 16,5 3,55 9,40-21,9 16,9 3,15 11,9-22,7 16,5 3,78 9,71-22,0 16,2 3,62 9,91-23,4 Приклад 5.3. Аналіз білка AAD-12 методами SDS PAGE і вестерн-блотингу Білок AAD-12 екстрагували з ліофілізованої тканини листя сої з подією DAS-68416-4 в буфер PBST (сольовий розчин з фосфатним буфером, що містить 0,05% твіну-20, рН 7,4) з доданими стабілізаторами і розчинні білки збирали центрифугуванням. Супернатант фільтрували, і розчинні білки залишали зв'язуватися з гранулами фенілсефарози (PS) (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Після інкубації протягом однієї години гранули PS промивали PBST і зв'язані білки елюювали водою Milli-Q. Для збільшення провідності додавали хлорид натрію і білки, очищені від PS, вводили в колонку для імуноафінної хроматографії, яка була кон’югована з поліклональним антитілом, специфічним до AAD-12. Незв'язані білки видаляли з колонки і колонку протягом тривалого часу промивали попередньо охолодженим PBS (сольовий розчин з фосфатним буфером, рН 7,4). Зв'язані білки елюювали з колонки 3,5М розчином NaSCN, 50 мМ тріс-буфера, рН 8,0, і досліджували методами SDS-PAGE і вестерн-блотингу. Таким же чином виділяли білок з тканини листя контрольної лінії сої Maverick. Лінія сої Maverick не містить ген aad-12, але характеризується генетичним фоном, типовим для рослин сої з подією DAS-684164. Ліофілізовану тканину листя сої з подією DAS-68416-4 і сої Maverick змішували з буфером PBST, що містить ~2,0% суміші інгібіторів протеази (Sigma, St. Louis, MO), і екстрагували білок, подрібнюючи в кульовому млині Geno-Grinder. Зразки центрифугували, супернатанти змішували з буфером для зразка Laemmli, нагрівали і центрифугували протягом короткого часу. Зразки поміщали на гель для SDS-PAGE компанії Bio-Rad Criterion. Позитивний еталон, білок AAD-12, виділений з мікроорганізмів, також змішували з буфером для зразка і поміщали на гель. Електрофорез виконували з використанням тріс-буфера/гліцину/буфера для SDS (Bio-Rad, Hercules, CA). Після виконання електрофорезу гель розрізали навпіл, одну половину 28