Антигензв’язуючий білок, який зв’язує людський il-23

Реферат: Винахід належить до антигензв'язуючих білків, які зв'язуються з людським IL-23, нуклеїнових кислот, що кодують такий антигензв'язуючий білок, векторів і клітин, що кодують антигензв'язуючий білок, та застосування антигензв'язуючих білків, які зв'язуються з людським IL-23, в діагностичних і терапевтичних цілях. UA 113609 C2 (12) UA 113609 C2 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднені заявки У відповідності до статті 119(e) 35 Зводу законів США, дана заявка претендує на пріоритет патентної заявки США № 61/254982, поданої 26 жовтня 2009 року, і патентної заявки США № 61/381287, поданої 9 вересня 2010 року, описи яких включені сюди за посиланням. Рівень техніки Інтерлейкін 23 (IL-23), гетеродимерний цитокін, є сильним індуктором прозапальних цитокінів. IL-23 є спорідненим з гетеродимерним цитокіном Інтерлейкін 12 (IL-12), оскільки обидва містять спільну субодиницю p40. В IL-23 унікальна субодиниця p19 є ковалентно зв’язаною з субодиницею p40. В IL-12 унікальною субодиницею є p35 (Oppmann et al., Immunity, 2000, 13: 713-715). Гетеродимерний білок IL-23 є білком, що секретується. Подібно до IL-12, IL23 експресується антиген-презентуючими клітинами (такими як дендритні клітини і макрофаги) у відповідь на сигнали активації, такі як лігірування CD40, агоністи Toll-подібного рецептору і патогени. IL-23 зв’язує гетеродимерний рецептор, що містить субодиницю IL-12Rβ1 (спільну з рецептором IL-12) і унікальну рецепторну субодиницю IL-23R. Рецептор IL-12 складається з IL12Rβ1 і IL-12Rβ2. IL-23 зв’язується зі своїм гетеродимерним рецептором і сигналами через JAK2 і Tyk2, щоб активувати STAT1, 3, 4 і 5 (Parham et al., J. Immunol. 2002, 168: 5699-708). Субодиниці цього рецептору переважно експресуються одночасно на активованих Т-клітинах або Т-клітинах пам’яті і на природних кілерних клітинах, а також, на більш низьких рівнях, на дендритних клітинах, моноцитах, макрофагах, клітинах мікроглії, кератиноцитах і синовіальних фібробластах. IL-23 і IL-12 діють на різні субпопуляції Т-клітин і відіграють суттєво різні ролі in vivo. IL-23 діє на активовані Т-клітини і Т-клітини пам’яті та сприяє виживанню і розширенню субпопуляції Т-клітин Th17. Клітини Th17 продукують прозапальні цитокіни, включаючи IL-6, IL17, TNFα, IL-22 і GM-CSF. IL-23 діє також на природні кілерні клітини, дендритні клітини і макрофаги, індукуючи експресію прозапальних цитокінів. На відміну від IL-23, IL-12 індукує диференціацію наївних T-клітин CD4+ на зрілі Th1 IFNγ-продукуючі ефекторні клітини та індукує NK і цитотоксичну функцію T-клітин, стимулюючи продукцію IFNγ. Раніше вважалось, що клітини Th1, які знаходяться під впливом IL-12, є патогенною субпопуляцією Т-клітин при багатьох автоімунних захворюваннях, однак подальшими дослідженнями на тваринах на моделях запальної хвороби кишечнику, псоріазу, запального артриту і розсіяного склерозу, в яких оцінювався індивідуальний внесок IL-12 у порівнянні з внеском IL-23, було надійно встановлено, що саме IL-23, а не IL-12, є ключовою рушійною силою автоімунної/запальної хвороби (Ahern et al., Immun. Rev. 2008 226: 147-159; Cua et al., Nature 2003 421: 744-748; Yago et al., Arthritis Res & Ther. 2007 9(5): R96). Вважається, що IL-12 відіграє вирішальну роль в розвитку захисних реакцій вродженого і набутого імунітету на численні внутрішньоклітинні патогени і віруси та в імунологічному нагляді при пухлинних захворюваннях. Дивись Kastelein, et al., Annual Review of Immunology, 2007, 25: 221-42; Liu, et al., Rheumatology, 2007, 46(8): 1266-73; Bowman et al., Current Opinion in Infectious Diseases, 2006 19: 245-52; Fieschi & Casanova, Eur. J. Immunol. 2003 33: 1461-4; Meeran et al., Mol. Cancer Ther. 2006 5: 825-32; Langowski et al., Nature 2006 442: 4615. Відповідно, специфічне пригнічення IL-23 (при збереженні IL-12 або спільної субодиниці p40) потенційно повинне мати кращий профіль безпечності у порівнянні з подвійним пригніченням IL12 та IL-23. Відповідно, застосування специфічних антагоністів IL-23, які пригнічують людський IL-23 (таких як антитіла, що зв’язують щонайменше унікальну субодиницю p19 або зв’язують як субодиницю p19, так і субодиницю p40 IL-23), що зберігає IL-12, повинне забезпечити ефективність, рівну або вищу ніж ефективність антагоністів IL-12 або антагоністів p40, без потенційних ризиків, обумовлених пригніченням IL-12. Мишачі, гуманізовані антитіла і антитіла з фагової дисплейної бібліотеки, відібрані за пригніченням рекомбінантного IL-23, вже є описаними; дивись, наприклад, патент США № 7,491,391, публікації Міжнародних патентних заявок WIPO WO1999/05280, WO2007/0244846, WO2007/027714, WO2007/076524, WO2007/147019, WO2008/103473, WO2008/103432, WO2009/043933 і WO2009/082624. Однак відчувається потреба в повністю людських терапевтичних агентах, здатних пригнічувати нативний людський IL-23. Такі терапевтичні засоби мають високу специфічність до мішені, зокрема in vivo. Повне пригнічення мішені in vivo може дати препарати, які використовуються в знижених дозах, вводяться рідше та/або є більш ефективними, що, в свою чергу, забезпечить нижчу вартість і підвищену ефективність. Даний винахід пропонує такі антагоністи IL-23. Сутність винаходу Пропонуються антигензв’язуючі білки, які зв’язують IL-23, зокрема нативний людський IL-23. Ці антигензв’язуючі білки, які зв’язуються з IL-23 людини, можуть ослабляти, пригнічувати, перешкоджати та/або модулювати щонайменше одну з біологічних реакцій, пов’язаних з IL-23, і 1 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 як такі є корисними для зменшення ефектів хвороб або розладів, пов’язаних з IL-23. Антигензв’язуючі білки, які зв’язуються з IL-23 людини, можуть застосовуватись, наприклад, для того, щоб ослабити, пригнітити, перешкодити та/або модулювати передачу сигналів IL-23, активацію IL-23 клітин Th17, активацію IL-23 NK клітин або індукцію продукції прозапальних цитокінів. Також пропонуються системи експресії, включаючи клітинні лінії, для продукції антигензв’язуючих білків, які зв’язуються з IL-23 людини, та способи діагностики і лікування захворювань, пов’язаних з людським IL-23. Певні із антигензв’язуючих білків, які зв’язуються з IL-23 людини, містять щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга, що включає CDRH1, CDRH2 і CDRH3, вибрані з групи, що складається з: ділянки CDRH1, яка відрізняється не більше ніж одним амінокислотним заміщенням, вставкою або делецією від ділянки CDRH1, показаної в ТАБЛИЦІ 3; ділянки CDRH2, яка відрізняється не більше ніж трьома, двома або одним амінокислотними заміщеннями, вставками та/або делеціями від ділянки CDRH2, показаної в ТАБЛИЦІ 3; ділянки CDRH3, яка відрізняється не більше ніж трьома, двома або одним амінокислотними заміщеннями, вставками та/або делеціями від ділянки CDRH2, показаної в ТАБЛИЦІ 3; а також містять щонайменше одну варіабельну ділянку легкого ланцюга, що включає ділянки CDRL1, CDRL2 і CDRL3, вибрані з групи, що складається з: ділянки CDRL1, яка відрізняється не більше ніж трьома, двома або одним амінокислотними заміщеннями, вставками та/або делеціями від ділянки CDRL1, показаної в ТАБЛИЦІ 3; ділянки CDRL2, яка відрізняється не більше ніж одним амінокислотним заміщенням, вставкою або делецією від ділянки CDRL2, показаної в ТАБЛИЦІ 3; ділянки CDRL3, яка відрізняється не більше ніж одним амінокислотним заміщенням, вставкою або делецією від ділянки CDRL3, показаної в ТАБЛИЦІ 3. В одному варіанті здійснення пропонуються ізольовані антигензв’язуючі білки, що містять ділянку CDRH1, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 91, 94, 97, 100 і 103; ділянку CDRH2, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 92, 95, 98, 101, 104, 107 і 110; ділянку CDRH3, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 93, 96, 99, 102 і 105; ділянку CDRL1, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 62, 65, 68, 71 і 74; ділянку CDRL2, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 63, 66, 69, 72, 75 і 78; та ділянку CDRL3, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 64, 67, 70 і 73. В іншому варіанті здійснення пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що містить ділянку CDRH1, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 91, 106, 109, 112 і 115; ділянку CDRH2, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 113, 116, 118, 120, 121 і 122; ділянку CDRH3, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 108, 111, 114, 117 і 119; ділянку CDRL1, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 77, 80, 83, 85, 86, 87, 88, 89 і 90; ділянка CDRL2 є SEQ ID NO: 81; і ділянку CDRL3, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 76, 79, 82 і 84. В іншому варіанті здійснення цього винаходу пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, який містить щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга і щонайменше одну варіабельну ділянку легкого ланцюга. В ще іншому варіанті здійснення пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, як описано вище, який містить щонайменше дві варіабельні ділянки важкого ланцюга і щонайменше дві варіабельні ділянки легкого ланцюга. В ще іншому варіанті здійснення пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, де цей антигензв’язуючий білок є зчепленим з міткою. Також пропонуються ізольовані антигензв’язуючі білки, які зв’язують IL-23, вибрані з групи, що складається з а) антигензв’язуючого білка, який містить CDRH1 з послідовністю SEQ ID NO: 129, CDRH2 з послідовністю SEQ ID NO: 132, CDRH3 з послідовністю SEQ ID NO: 136, а також CDRL1 з послідовністю SEQ ID NO: 123, CDRL2 з послідовністю SEQ ID NO: 81 і CDRL3 з послідовністю SEQ ID NO: 76; б) антигензв’язуючого білка, який містить CDRH1 з послідовністю SEQ ID NO: 131, CDRH2 з послідовністю SEQ ID NO: 134, CDRH3 з послідовністю SEQ ID NO: 137, а також CDRL1 з послідовністю SEQ ID NO: 124, CDRL2 з послідовністю SEQ ID NO: 126 і CDRL3 з послідовністю SEQ ID NO: 128; в) антигензв’язуючого білка, який містить CDRH1 з послідовністю SEQ ID NO: 130, CDRH2 з послідовністю SEQ ID NO: 133, CDRH3 з послідовністю SEQ ID NO: 99, а також CDRL1 з послідовністю SEQ ID NO: 68, CDRL2 з послідовністю SEQ ID NO: 69 і CDRL3 з послідовністю SEQ ID NO: 67; та г) антигензв’язуючого білка, який містить CDRH1 з послідовністю SEQ ID NO: 91, CDRH2 з послідовністю SEQ ID NO: 135, CDRH3 з послідовністю SEQ ID NO: 138, а також CDRL1 з послідовністю SEQ ID NO: 125, CDRL2 з послідовністю SEQ ID NO: 127 і CDRL3 з послідовністю SEQ ID NO: 64. Також пропонуються ізольовані антигензв’язуючі білки, які зв’язують IL-23, що містять щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга і щонайменше одну варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрані з групи, яка складається з: варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-35, 50-65 і 99-113 з послідовності SEQ ID NO: 2 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 31; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 23-36, 52-58 і 91101 з послідовності SEQ ID NO: 1; варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-35, 50-65 і 99-110 з послідовності SEQ ID NO: 34 і варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-35, 50-66 і 99-110 з послідовності SEQ ID NO: 36; а також варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 23-36, 52-62 і 97-105 з послідовності SEQ ID NO: 4; варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-35, 50-66 і 99-114 з послідовності SEQ ID NO: 38; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 23-34, 5061 і 94-106 з послідовності SEQ ID NO: 7; варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-35, 50-66 і 99-114 з послідовності SEQ ID NO: 40; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 24-34, 50-56 і 94-106 з послідовності SEQ ID NO: 9; варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-35, 50-66 і 99-114 з послідовності SEQ ID NO: 42; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 23-34, 50-61 і 94-106 з послідовності SEQ ID NO: 11; варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-35, 50-65 і 98107 з послідовності SEQ ID NO: 44; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 24-34, 50-56 і 89-97 з послідовності SEQ ID NO: 13; варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-37, 52-67 і 100-109 з послідовності SEQ ID NO: 46 або SEQ ID NO: 153; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 24-34, 50-56 і 89-97 з послідовності SEQ ID NO: 15; варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-37, 52-67 і 100-109 з послідовності SEQ ID NO: 48; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 24-34, 5056 і 89-97 з послідовності SEQ ID NO: 17; варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-37, 52-67 і 101-109 з послідовності SEQ ID NO: 50; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 24-34, 50-56 і 89-97 з послідовності SEQ ID NO: 19; варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 3135, 50-65 і 98-107 з послідовності SEQ ID NO: 52; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 24-34, 50-56 і 98-107 з послідовності SEQ ID NO: 21; варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-37, 52-67 і 100109 з послідовності SEQ ID NO: 54; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 24-34, 50-56 і 89-97 з послідовності SEQ ID NO: 23; варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-37, 52-67 і 100-109 з послідовності SEQ ID NO: 56; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 24-34, 5056 і 89-97 з послідовності SEQ ID NO: 25; і варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 31-37, 52-57 і 100-109 з послідовності SEQ ID NO: 58; і варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає амінокислотні залишки 24-34, 50-56 і 89-97 з послідовності SEQ ID NO: 27. Тут пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23, який містить варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга, де послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга відрізняється не більше ніж 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотними заміщеннями, додатками та/або делеціями від послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга, показаної в ТАБЛИЦІ 2; а послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга відрізняється не більше ніж 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 амінокислотними заміщеннями, додатками та/або делеціями від послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга, показаної в ТАБЛИЦІ 1. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23, вибраний з групи, яка складається з а) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 140 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 30; б) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 141 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 61; в) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 142 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 4; і г) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 143 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 139. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга з амінокислотною послідовністю, яка щонайменше на 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентична послідовності SEQ ID NO: 31, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 і 58; і варіабельну ділянку легкого ланцюга з амінокислотною послідовністю, яка щонайменше на 90 % ідентична послідовності SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 і 27. В іншому варіанті здійснення пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, яка 3 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 складається з SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 і 153, і варіабельну ділянку легкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 і 27. В ще іншому варіанті здійснення пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 31, 34, 36, 38, 40 і 42, і варіабельну ділянку легкого ланцюга з послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9 і 11. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга і варіабельну ділянку легкого ланцюга, які вибрані з групи, що складається з: а) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 31 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 1; б) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 34 або 36 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 4; в) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 38 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 7; г) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 40 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 9; д) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 42 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 11; е) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 44 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 13; ж) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 46 або SEQ ID NO: 153 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 15; з) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 48 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 17; і) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 50 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 19; к) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 52 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 21; л) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 54 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 23; м) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 56 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 25; і н) варіабельної ділянки важкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 58 і варіабельної ділянки легкого ланцюга з послідовністю SEQ ID NO: 27. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23 людини, в якому перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини, містить контакти із залишками 30, 31, 32, 49, 50, 52, 53, 56, 92 і 94 послідовності SEQ ID NO: 15, де ці 2 контакти із залишками мають величину розходження, більшу або рівну 10 Å , як було визначено за площею поверхні, доступною для розчинника. В одному варіанті здійснення контакти із залишками включають залишки 31-35, 54, 58-60, 66 і 101-105 послідовності SEQ ID NO: 46. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23 людини, в якому перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини, містить контакти із залишками 31-34, 51, 52, 55, 68, 93 і 98 послідовності SEQ ID NO: 1, де ці контакти із 2 залишками мають величину розходження, більшу або рівну 10 Å , як було визначено за площею поверхні, доступною для розчинника. В одному варіанті здійснення контакти із залишками включають залишки 1, 26, 28, 31, 32, 52, 53, 59, 76, 101, 102 і 104-108 послідовності SEQ ID NO: 31. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23 людини, в якому при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 32-35, 54, 58-60, 66 і 101-105 послідовності SEQ ID NO: 46, як було визначено за допомогою рентгенівської кристалографії. В одному варіанті здійснення антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 31-35, 54, 56, 58-60, 66 і 101-105 послідовності SEQ ID NO: 46. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23 людини, в якому при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 30-32, 49, 52, 53, 91-94 і 96 послідовності SEQ ID NO: 15, як було визначено за допомогою рентгенівської кристалографії. В одному варіанті здійснення антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 30-32, 49, 50, 52, 53, 56, 91-94 і 96 послідовності SEQ ID NO: 15. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23 людини, в якому при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 26-28, 31, 53, 59, 102 і 104-108 послідовності SEQ ID NO: 31, як було визначено за допомогою рентгенівської кристалографії. В одному варіанті здійснення антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 1, 26-28, 30-32, 52, 53, 59, 100 і 102-108 послідовності SEQ ID NO: 31. 4 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23 людини, в якому при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 31-34, 51, 52, 55, 68 і 93 послідовності SEQ ID NO: 1, як було визначено за допомогою рентгенівської кристалографії. В одному варіанті здійснення антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 29, 3134, 51, 52, 55, 68, 93 і 100 послідовності SEQ ID NO: 1. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, як описано вище, де цим антигензв’язуючим білком є антитіло. В одному варіанті здійснення пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, де антитіло є моноклональним антитілом, рекомбінантним антитілом, людським антитілом, гуманізованим антитілом, химерним антитілом, мультиспецифічним антитілом або фрагментом цих антитіл. В іншому варіанті здійснення пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, де фрагментом антитіла є Fab фрагмент, Fab' фрагмент, F(ab')2 фрагмент, Fv фрагмент, діатіло або одноланцюгова молекула антитіла. В ще іншому варіанті здійснення пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, де цей антигензв’язуючий білок являє собою людське антитіло. В ще іншому варіанті здійснення пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, де цей антигензв’язуючий білок являє собою моноклональне антитіло. В іншому варіанті здійснення пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, де цей антигензв’язуючий білок являє собою імуноглобулін IgG1-, IgG2-, IgG3- або IgG4-типу. В іншому варіанті здійснення пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, де цей антигензв’язуючий білок являє собою імуноглобулін IgG1- або IgG2-типу. Пропонується також ізольована молекула нуклеїнової кислоти, кодуюча антигензв’язуючий білок, як описано вище. В одному варіанті здійснення пропонується ізольована молекула нуклеїнової кислоти, де щонайменше одна варіабельна ділянка важкого ланцюга є кодованою ізольованою молекулою нуклеїнової кислоти, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 32, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 і 152, і щонайменше одна варіабельна ділянка легкого ланцюга є кодованою ізольованою молекулою нуклеїнової кислоти, вибраною з групи, що складається з SEQ ID NO: 2, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 і 28. В іншому варіанті здійснення пропонується ізольована молекула нуклеїнової кислоти, де ця молекула нуклеїнової кислоти є функціонально зв’язаною з контрольною послідовністю. В іншому варіанті здійснення пропонується вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, як описано вище. В ще іншому варіанті здійснення пропонується клітина-хазяїн, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, як описано вище. В іншому варіанті здійснення пропонується клітина-хазяїн, що містить вищеописаний вектор. В ще іншому варіанті здійснення пропонується ізольований полінуклеотид, придатний для використання в якості гібридизаційного зонду, праймеру ПЛР або праймеру секвенування, тобто є фрагментом молекули нуклеїнової кислоти, як її описано вище, або її комплементом. Також пропонується спосіб одержання антигензв’язуючого білка, як описано вище, який включає етап виділення вказаного антигензв’язуючого білка з клітини-хазяїна, що секретує вказаний антигензв’язуючий білок. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що зв’язує людський IL-23, в якому перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини, містить контакт із залишком в межах залишків 46-58, контакт із залишком в межах залишків 112120 і контакт із залишком в межах залишків 155-163 людської IL-23p19 субодиниці, як описано в 2 SEQ ID NO: 145, де цей контакт із залишком має величину розходження, більшу або рівну 10 Å , як було визначено за площею поверхні, доступної для розчинника. В одному варіанті здійснення пропонується, щоб перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL23 людини, містив один, два, три, чотири, п’ять, шість, сім, вісім, дев’ять, десять, одинадцять, дванадцять або тринадцять контактів із залишками в межах залишків 46-58, один, два, три, чотири, п’ять, шість, сім, вісім, дев’ять або десять контактів із залишками в межах залишків 112120 і один, два, три, чотири, п’ять, шість, сім, вісім або дев’ять контактів із залишками в межах залишків 155-163 людської субодиниці IL-23p19, як описано в SEQ ID NO: 145. В іншому варіанті здійснення пропонується, щоб перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини, містив контакт із залишком в межах залишків 121-125 людської субодиниці IL-23p40, як описано в SEQ ID NO: 147. В близькому варіанті здійснення пропонується, щоб перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL23 людини, містив один, два, три, чотири або п’ять контактів із залишками в межах залишків 121-125 людської субодиниці IL-23p40, як описано в SEQ ID NO: 147. В одному варіанті здійснення пропонується, щоб перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини, містив контакти із залишками 46, 47, 49, 50, 53, 112116, 118, 120, 155, 156, 159, 160 і 163 послідовності SEQ ID NO: 145. В іншому варіанті 5 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення пропонується, щоб перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини, містив контакти із залишками 46, 47, 49, 50, 53, 112118, 120, 155, 156, 159, 160 і 163 послідовності SEQ ID NO: 145. В іншому варіанті здійснення пропонується, щоб перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL23 людини, містив контакти із залишками 46, 47, 49, 50, 53-55, 57, 58, 112-116, 118-120, 155, 156, 159, 160, 162 і 163 послідовності SEQ ID NO: 145. В близькому варіанті здійснення пропонується, щоб перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL23 людини, містив контакт із залишком 122 людської субодиниці IL-23p40, як описано в SEQ ID NO: 147. В іншому близькому варіанті здійснення пропонується, щоб перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини, містив контакти із залишками 122 і 124 людської субодиниці IL-23p40, як описано в SEQ ID NO: 147. В ще іншому близькому варіанті здійснення пропонується, щоб перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини, містив контакти із залишками 121-123 і 125 людської субодиниці IL-23p40, як описано в SEQ ID NO: 147. В подальшому близькому варіанті здійснення пропонується, щоб перекритий розрив, утворений при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини, містив контакти із залишками 121-123, 125 і 283 людської субодиниці IL-23p40, як описано в SEQ ID NO: 147. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23 людини, де при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишку в межах залишків 46-58, від залишку в межах залишків 112-123 і від залишку в межах залишків 155-163 людської субодиниці IL-23p19, як описано в SEQ ID NO: 145, що було визначено за допомогою рентгенівської кристалографії. В одному варіанті здійснення при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від одного, двох, трьох, чотирьох, п’яти, шести, семи, восьми, дев’яти, десяти, одинадцяти, дванадцяти або тринадцяти залишків в межах залишків 46-58, від одного, двох, трьох, чотирьох, п’яти, шести, семи, восьми, дев’яти або десяти залишків в межах залишків 112-123 і від одного, двох, трьох, чотирьох, п’яти, шести, семи, восьми або дев’яти залишків в межах залишків 155-163 людської субодиниці IL23p19, як описано в SEQ ID NO: 145. В іншому варіанті здійснення при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 155-163 людської субодиниці IL-23p19, як описано в SEQ ID NO: 145. В іншому варіанті здійснення при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 46-50, 113-116, 120, 156, 159, 160 і 163 послідовності SEQ ID NO: 145. В іншому варіанті здійснення при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 46-50, 112-120, 156, 159, 160 і 163 послідовності SEQ ID NO: 145. В близькому варіанті здійснення при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 46-50, 53, 112-120, 156, 159, 160 і 163 послідовності SEQ ID NO: 145. В іншому варіанті здійснення при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 46-50, 53-55, 58, 113-116, 120, 121, 156, 159, 160, 162 і 163 послідовності SEQ ID NO: 145. В близькому варіанті здійснення при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 46-51, 53-55, 57, 58, 112-116, 118-121, 123, 155, 156, 159, 160, 162 і 163 послідовності SEQ ID NO: 145. В подальшому варіанті здійснення при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 121-125 людської субодиниці IL-23p40, як описано в SEQ ID NO: 147, що було визначено за допомогою рентгенівської кристалографії. В близькому варіанті здійснення при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 122 і 124 послідовності SEQ ID NO: 147. В іншому варіанті здійснення при зв’язуванні антигензв’язуючого білка з IL-23 людини цей антигензв’язуючий білок знаходиться на відстані 5Å або менше від залишків 121-123 і 125 послідовності SEQ ID NO: 147. Також пропонується ізольований антигензв’язуючий білок, як описано вище, де цей антигензв’язуючий білок має щонайменше одну властивість, вибрану з: а) знижує активність людського IL-23; б) зменшує продукцію прозапального цитокіну; в) зв’язується з людським IL-23 -8 -6 з KD≤ 510 M; г) має константу швидкості дисоціації Koff≤510 1/сек; і д) має величину IC50≤400 пМ. Пропонується фармацевтична композиція, яка містить щонайменше один антигензв’язуючий білок, як його описано вище, і фармацевтично прийнятну допоміжну речовину. В одному 6 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіанті здійснення пропонується фармацевтична композиція, яка додатково містить мітку або ефекторну групу. В іншому варіанті здійснення пропонується фармацевтична композиція, в якій мітка вибирається. В одному варіанті здійснення пропонуються ізотопні мітки, магнітні мітки, активні у відношенні відновлення-окислення фрагментів, оптичних барвників, біотинильованих груп і попередньо визначених поліпептидних епітопів, які розпізнаються вторинним репортером. В ще іншому варіанті здійснення пропонується фармацевтична композиція, в якій ефекторна група вибирається з групи, що складається з радіоізотопу, радіонукліду, токсину, терапевтичної групи і хіміотерапевтичної групи. Також пропонується спосіб лікування або попередження стану, асоційованого з IL-23, у пацієнта, що включає введення пацієнту, який того потребує, ефективної кількості щонайменше одного антигензв’язуючого білка, як його описано вище. В одному варіанті здійснення пропонується спосіб, в якому стан вибирається з групи, що складається із запального розладу, ревматичного розладу, автоімунного розладу, онкологічного розладу і шлунково-кишкового розладу. В іншому варіанті здійснення пропонується спосіб, в якому стан вибирається з групи, що складається з розсіяного склерозу, ревматоїдного артриту, раку, псоріазу, запальної хвороби кишечнику, хвороби Крона, виразкового коліту, системного червоного вовчака, псоріатичного артриту, автоімунного міокардиту; діабету типу 1 і анкілозуючого спондиліту. В ще іншому варіанті здійснення пропонується спосіб, в якому ізольований антигензв’язуючий білок вводиться сам по собі або як комбінаційна терапія. Також пропонується спосіб зниження активності IL-23 у пацієнта, що включає введення ефективної кількості щонайменше одного антигензв’язуючого білка, як його описано вище. В одному варіанті здійснення пропонується спосіб зниження активності IL-23, де вказана активність IL-23 індукує продукцію прозапального цитокіну. Короткий опис фігур Фіг. 1А: Результати аналізу з STAT (сигнальний трансдуктор і активатор транскрипції) люциферазним репортером при використанні рекомбінантного людського IL-23. Всі антитіла повністю пригнічували рекомбінантний людський IL-23. Фіг. 1В: Результати аналізу з STAT (сигнальний трансдуктор і активатор транскрипції) люциферазним репортером при використанні нативного людського IL-23. Тільки половина тих антитіл, які повністю пригнічували рекомбінантний людський IL-23, були здатними повністю пригнічувати нативний людський IL-23. Докладний опис винаходу Даний винахід пропонує композиції, набори і способи, пов’язані з антигензв’язуючими білками, що зв’язують IL-23, включаючи молекули, які протидіють IL-23, такі як анти-IL-23 антитіла, фрагменти антитіл і похідні антитіл, наприклад антагоністичні анти-IL-23 антитіла, фрагменти антитіл або похідні антитіл. Також пропонуються полінуклеотиди, їх похідні і фрагменти, що містять послідовність нуклеїнових кислот, яка кодує весь поліпептид або частину поліпептиду, що зв’язується з IL-23, наприклад полінуклеотид, який кодує все або частину анти-IL-23 антитіла, фрагмент антитіла або похідне антитіла, плазміди і вектори, що містять такі нуклеїнові кислоти, а також клітини або клітинні лінії, що містять такі полінуклеотиди та/або вектори і плазміди. Запропоновані способи включають, наприклад, способи одержання, ідентифікації або виділення антигензв’язуючих білків, що зв’язують IL-23, таких як анти-IL-23 антитіла, способи визначення того, або дана молекула зв’язується з IL-23, способи визначення того, або дана молекула здатна протидіяти IL-23, способи приготування композицій, таких як фармацевтичні композиції, які містять антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23, і способи для введення антигензв’язуючого білка, що зв’язує IL-23, суб’єкту, наприклад способи для лікування стану, опосередкованого IL-23, і для протидії біологічній активності IL-23 in vivo або in vitro. Коли інше не вказується, наукові і технічні терміни, використовувані у зв’язку з цим винаходом, будуть мати значення, які завідомо зрозумілі спеціалістам в даній галузі. Більш того, якщо контекст не вимагає іншого, терміни в однині будуть включати множину, а терміни в множині будуть включати однину. Загалом, номенклатура і методи, використовувані в зв’язку з клітинною і тканинною культурами, молекулярною біологією, імунологією, мікробіологією, генетикою і хімією білків і нуклеїнових кислот, а також гібридизацією, є добре відомими і широко застосовуються в цій галузі. Методи і методики за цим винаходом загалом здійснюються згідно зі звичайними методами і методиками, добре відомими в цій галузі, і так, як описано в різних загальних і більш спеціальних джерелах, які цитуються і аналізуються в даному описі, якщо не вказується інше. Дивись, наприклад, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3-тє видання, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) і Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), а також Harlow & Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 7 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (1990). Ферментативні реакції і методи очистки здійснюються у відповідності до технічних вимог виробника, як загалом прийнято в цій галузі або як тут описано. Лабораторні методики і прийоми у відношенні аналітичної хімії, хімії органічного синтезу, а також медичної і фармацевтичної хімії, описані тут, і відповідна термінологія є добре відомими і широко застосовуються в цій галузі. Для хімічного синтезу, хімічних аналізів, приготування фармацевтичних препаратів, складання рецептури, доставки і лікування пацієнтів можуть використовуватись стандартні методи. Всі згадувані тут патенти та інші публікації є в явній формі включеними сюди за посиланням у всій їх повноті з метою опису і розкриття, наприклад методологій, описаних в таких публікаціях, які могли б бути використаними в зв’язку з наведеною тут інформацією. Полінуклеотидні і білкові послідовності субодиниці р19 людського IL-23 (SEQ ID NO: 144 і 145), спільної субодиниці p40 (SEQ ID NO: 146 і 147), гетеродимерних субодиниць IL-12Rβ1 рецептору людського IL-23 (SEQ ID NO: 150 і 151) і IL-23R (SEQ ID NO: 148 і 149) є відомими в цій галузі, дивись наприклад, GenBank Accession №№: AB030000; M65272, NM_005535, NM_144701, як і послідовності від інших видів ссавців. Рекомбінантний IL-23 і білки рецептору IL-23, включаючи одно ланцюгові і Fc білки, а також клітини, що експресують рецептор IL-23, вже описувались або є доступними з комерційних джерел (дивись, наприклад, Oppmann et al., Immunity, 2000, 13: 713-715; R&D Systems, Minneapolis. Minnesota; United States Biological, Swampscott, Massachusetts; WIPO Publication No. WO 2007/076524). Нативний людський IL-23 можна одержати з клітин людини, таких як дендритні клітини, з використанням методів, відомих в цій галузі, включаючи ті, що описані тут. IL-23 - це гетеродимерний цитокін, що містить унікальну субодиницю р19, яка ковалентно зв’язана зі спільною субодиницею р40. Субодиниця р19 включає чотири α-спіралі "А", "В", "С" і "D" в послідовності вверх-вверх-вниз-вниз, які з’єднуються трьома внутрішніми петлями між спіралями А і В, між спіралями В і С та між спіралями С і D; дивись Oppmann et al., Immunity, 2000, 13: 713-715 та Beyer, et al., J Mol Biol, 2008. 382(4): 942-55. Вважається, що спіралі А і D з 4 спіральних пучкових цитокінів є задіяними в зв’язуванні з рецептором. Субодиниця р40 містить три бета-складчасті тришарові домени D1, D2 і D3 (Lupardus & Garcia, J. Mol. Biol., 2008, 382:931-941). Термін "полінуклеотид" включає як однониткові, так і двониткові нуклеїнові кислоти, і включає геномні ДНК, РНК, мРНК, кДНК або синтетичного походження або певну їх комбінацію, яка не пов’язана з послідовностями, що звичайно трапляються у природі. Ізольовані полінуклеотиди, що містять конкретні послідовності, можуть включати, крім цих конкретних послідовностей, кодуючі послідовності для десяти або навіть до двадцяти інших білків або їх частин або можуть включати функціонально зв’язані регуляторні послідовності, які контролюють експресію кодуючої ділянки перелічених послідовностей нуклеїнових кислот, та/або можуть включати послідовності векторів. Нуклеотиди, що складають полінуклеотид, можуть бути рибонуклеотидами або деоксирибонуклеотидами або модифікованою формою нуклеотиду будь-якого типу. Такі модифікації включають модифікації основи, такі як похідні бромуридину і інозину, модифікації рибози, такі як 2’,3’-дідеоксирибоза, і модифікації міжнуклеотидних зв’язків, такі як фосфоротіоат, фосфородітіоат, фосфородіселеноат, фосфороанілотіоат, фосфороаніладат і фосфороамідат. Термін "олігонуклеотид" означає полінуклеотид, який включає 100 або менше нуклеотидів. В певних варіантах здійснення олігонуклеотиди мають від 10 до 60 основ у довжину. В інших варіантах здійснення олігонуклеотиди мають 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або від 20 до 40 нуклеотидів у довжину. Олігонуклеотиди можуть бути як однонитковими, так і двонитковими, наприклад для використання в створенні мутантного гену. Олігонуклеотиди можуть бути смисловими і антисмисловими олігонуклеотидами. Олігонуклеотид може включати мітку, таку як радіоактивна мітка, флуоресцентна мітка, гаптен або антигенна мітка, для аналізів на виявлення. Олігонуклеотиди можуть використовуватись, наприклад, як праймери для ПЛР, праймери для клонування або гібридизаційні зонди. Терміни "поліпептид" або "білок" означають макромолекулу, що має амінокислотну послідовність нативного білка, тобто білка, продукованого натуральною і не рекомбінантною клітиною; або він продукується генно-інженерною або рекомбінантною клітиною і являє собою молекули, що мають амінокислотну послідовність нативного білка, або молекули, що мають одну або більше делецій, вставок та/або заміщень амінокислотних залишків нативної послідовності. Цей термін включає також амінокислотні полімери, в яких одна або більше амінокислот є хімічними аналогами відповідної природної амінокислоти. Терміни "поліпептид" або "білок" охоплюють антигензв’язуючі білки (такі як антитіла), що зв’язують IL-23, і послідовності, що мають одну або більше делецій, вставок та/або заміщень амінокислотних 8 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 залишків в послідовності антигензв’язуючого білка. Термін "фрагмент поліпептиду" стосується поліпептиду, що має аміно-термінальну делецію, карбоксил-термінальну делецію та/або внутрішню делецію у порівнянні з нативним білком повної довжини. Такі фрагменти можуть містити також модифіковані амінокислоти у порівнянні з нативним білком. В певних варіантах здійснення фрагменти мають від приблизно 5 до 500 амінокислот в довжину. Наприклад, фрагменти можуть мати щонайменше 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 або 450 амінокислот в довжину. Придатні поліпептидні фрагменти включають імунологічно функціональні фрагменти антитіл, включаючи домени зв’язування. У випадку антигензв’язуючого білка, що зв’язує IL-23, такого як антитіло, придатні фрагменти включають, не обмежуючись однією або більше ділянками CDR, варіабельний домен важкого або легкого ланцюга, частину ланцюга антитіла, частину варіабельної ділянки, що включає менше ніж три CDR, і т.п. Термін «амінокислота» має своє звичайне значення в цій галузі. Двадцять природних амінокислот і їх скорочення позначаються як звичайно. Дивись Immunology-A Synthesis, 2-ге видання, (E.S. Golub & D.R. Gren, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991). Стереоізомери (наприклад, D-амінокислоти) цих двадцяти природних амінокислот, такі як [альфа]-, [альфа]-дизаміщені амінокислоти, N-алкіл амінокислоти, та інші нестандартні амінокислоти також можуть бути придатними компонентами для поліпептидів. Приклади нестандартних амінокислот включають: 4-гідроксипролін, [гамма]-карбоксиглютамат, [епсілон]N,N,N-триметиллізин, [епсілон]-N-ацетиллізин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, Nформілметіонін, 3-метилгістидин, 5-гідроксилізин, [сигма]-N-метиларгінін та інші подібні амінокислоти і імінокислоти (наприклад, 4-гідроксипролін). В позначеннях поліпептидів, які тут використовуються, напрямок вліво означає напрямок до аміно-кінця, а напрямок вправо – напрямок до карбоксил-кінця, що відповідає стандартному вживанню і прийнятим правилам. Термін "ізольований (виділений) білок" стосується білка, такого як антигензв’язуючий білок (прикладом якого може бути антитіло), що є очищеним від білків або поліпептидів або інших контамінантів, які можуть перешкоджати його терапевтичному, діагностичному, профілактичному, науково-дослідному або іншому застосуванню. Термін "суттєво чистий", як він тут використовується, означає, що описуваний вид молекули є домінуючим присутнім видом, тобто на молярній основі він є більш поширеним ніж будь-який інший індивідуальний вид в тій самій суміші. В певних варіантах здійснення суттєво чиста молекула є композицією, в якій цільовий вид займає щонайменше 50 % (на молярній основі) від всіх присутніх макромолекулярних видів. В інших варіантах здійснення суттєво чиста композиція буде містити щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % всіх присутніх в цій композиції макромолекулярних видів. В певних варіантах здійснення суттєво гомогенну речовину очищали до такого ступеня, що звичайними методами виявлення в композиції не можна було знайти жодного контамінуючого виду. Отже, така композиція складається з єдиного макромолекулярного виду, що піддається виявленню. "Варіант" поліпептиду (наприклад, антигензв’язуючого білка, такого як антитіло) являє собою амінокислотну послідовність, в якій один або більше амінокислотних залишків є вставленими, видаленими та/або заміщеними в цій амінокислотній послідовності по відношенню до послідовності іншого поліпептиду. Варіанти включають злиті білки. "Похідне" поліпептиду - це поліпептид, який було хімічно модифіковано у певний спосіб, який відрізняється від варіантів вставки, делеції або заміщення, наприклад шляхом кон’югації до іншої хімічної частки. Терміни "такий, що трапляється в природі" або "нативний", як вони використовуються в цьому описі по відношенню до біологічних матеріалів, таких як поліпептиди, нуклеїнові кислоти, клітини-хазяї і т.п., стосуються матеріалів, які зустрічаються у природі, таких як нативний людський IL-23. В певних аспектах пропонуються рекомбінантні антигензв’язуючі білки, що зв’язують нативний IL-23. В цьому контексті "рекомбінантний білок" є білком, одержаним з використанням рекомбінантних методів, тобто через експресію рекомбінантної нуклеїнової кислоти, як тут описується. Методи і прийоми одержання рекомбінантних білків є добре відомими в цій галузі. Термін "антитіло" стосується інтактного імуноглобуліну будь-якого ізотипу або його фрагменту, який може конкурувати з інтактним антитілом за специфічне зв’язування з антигеном-мішенню, і включає, наприклад, химерні, гуманізовані, повністю людські і біспецифічні антитіла. Антитіло як таке є видом антигензв’язуючого білка. Якщо інше не вказується, термін "антитіло" включає, крім антитіл, що містять два важкі ланцюги повної довжини і два легкі ланцюги повної довжини, їх похідні, варіанти, фрагменти і мутеїни, приклади яких будуть наведені далі. Інтактне антитіло загалом буде включати щонайменше два важкі ланцюги повної довжини і два легкі ланцюги повної довжини, але в певних випадках воно може 9 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містити менше ланцюгів, наприклад як у верблюдів, у яких антитіло може містити тільки важкі ланцюги. Антитіла можуть походити виключно з єдиного джерела, або вони можуть бути "химерними", тобто різні частини такого антитіла можуть походити від двох різних антитіл (далі буде описано докладніше). Антигензв’язуючі білки, антитіла або зв’язувальні фрагменти можуть одержуватись в гібридомах методами рекомбінантної ДНК або шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Термін "функціональний фрагмент" (або просто "фрагмент") антитіла або імуноглобулінового ланцюга (важкого або легкого ланцюга), як він тут використовується, означає антигензв’язуючий білок, що являє собою частину (незалежно від того, як цю частину одержано або синтезовано) антитіла, в якій відсутні щонайменше певні амінокислоти, присутні в ланцюзі повної довжини, але яка є здатною специфічно зв’язуватись з антигеном. Такі фрагменти є біологічно активними в тому відношенні, що вони специфічно зв’язуються з цільовим антигеном і можуть конкурувати з іншими антигензв’язуючими білками, включаючи інтактні антитіла, за специфічне зв’язування з даним епітопом. В одному аспекті такий фрагмент буде зберігати принаймні одну ділянку CDR, присутню в легкому або важкому ланцюзі повної довжини, а в певних варіантах здійснення буде містити єдиний важкий ланцюг та/або легкий ланцюг або його частину. Ці біологічно активні фрагменти можуть одержуватись методами рекомбінантної ДНК або шляхом ферментативного або хімічного розщеплення антигензв’язуючих білків, включаючи інтактні антитіла. Фрагменти включають, не обмежуючись ними, імунологічно функціональні фрагменти, такі як Fab, Fab', F(ab')2, Fv, доменні антитіла і одноланцюгові антитіла і можуть походити від будь-якого ссавця, включаючи, але не обмежуючись ними, людину, мишу, щура, верблюда або кроля. Припускається також, що функціональна частина описаних тут антигензв’язуючих білків, наприклад одна або дві ділянки CDR, може бути ковалентно зв’язаною з якимось другим білком або малою молекулою для створення терапевтичного агента, спрямованого на конкретну мішень в організмі, який володіє біфункціональними терапевтичними властивостями або має пролонгований період перебування в сироватці. Термін «конкурувати», коли використовується в контексті антигензв’язуючих білків (наприклад, нейтралізуючих антигензв’язуючих білків або нейтралізуючих антитіл), означає конкуренцію між антигензв’язуючими білками, яка оцінюється за допомогою проби, в якій антигензв’язуючий білок, що тестується (наприклад, антитіло або його імунологічно функціональний фрагмент), попереджає або пригнічує специфічне зв’язування еталонного антигензв’язуючого білка (наприклад, ліганду або еталонного антитіла) зі спільним антигеном (наприклад, білком IL-23 або його фрагментом). Можуть використовуватись різні типи проб на конкурентне зв’язування, наприклад: твердофазний прямий або непрямий радіоімуноаналіз (RIA), твердофазний прямий або непрямий імуноферментний аналіз (EIA), аналіз конкурентного зв’язування сандвіч-методом (дивись, наприклад, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 92:242-253); твердофазний прямий ЕІА з використанням біотину-авідину (дивись, наприклад, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619); твердофазний прямий аналіз з використанням мітки, твердофазний прямий сандвіч-аналіз з використанням мітки (дивись, наприклад, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); твердофазний прямий або непрямий радіоімуноаналіз (RIA) з використанням мітки І-125 (дивись, наприклад, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); твердофазний прямий ЕІА з використанням біотинуавідину (дивись, наприклад, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); і прямий RIA з використанням мітки (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Типово, такий аналіз передбачає використання очищеного антитіла, зв’язаного з твердою поверхнею, або клітин, що несуть або немічений антигензв’язуючий білок, що тестується, або мічений еталонний антигензв’язуючий білок. Конкурентне пригнічення оцінюється шляхом визначення кількості мітки, зв’язаної з твердою поверхнею або клітинами в присутності антигензв’язуючого білка, що тестується. Звичайно антигензв’язуючий білок, що тестується, є присутнім у надлишку. Антигензв’язуючі білки, ідентифіковані за допомогою проби на конкурентне зв’язування (конкуруючі антигензв’язуючі білки), включають антигензв’язуючі білки, які зв’язуються з тим самим епітопом, що й еталонні антигензв’язуючі білки, і антигензв’язуючі білки, які зв’язуються з суміжним епітопом, достатньо проксимальним до епітопу, зв’язаного еталонним антигензв’язуючим білком, щоб оцінити просторові перешкоди. Звичайно, коли конкуруючий антигензв’язуючий білок є присутнім у надлишку, він буде пригнічувати конкурентне зв’язування еталонного антигензв’язуючого білка до спільного антигену щонайменше на 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % або 75 %. В певних випадках зв’язування пригнічується щонайменше на 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше. 10 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "епітоп" або "антигенний детермінант" стосується місця на антигені, з яким зв’язується антигензв’язуючий білок. Епітопи можуть формуватись як зі стичних амінокислот, так і з нестичних амінокислот, які накладаються при тримірній укладці білка. Епітопи, утворені зі стичних амінокислот, типово зберігаються під дією денатуруючих розчинників, тоді як епітопи, утворені при тримірній укладці білка типово втрачаються під дією денатуруючих розчинників. Детермінанти епітопу можуть включати хімічно активні поверхневі угрупування молекул, таких як амінокислоти, бокові ланцюги цукрів, фосфорильні або сульфонільні групи, і можуть мати специфічні тримірні структурні характеристики та/або специфічні зарядні характеристики. Епітоп типово включає щонайменше 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Епітопи можуть бути визначеними за допомогою методів, відомих в цій галузі. Антигензв’язуючі білки, що зв’язують IL-23 Термін "антигензв’язуючий білок", як він тут використовується, означає білок, який специфічно зв’язує заданий цільовий антиген; цим антигеном, як тут передбачено, є IL-23, зокрема людський IL-23, включаючи нативний людський IL-23. Антигензв’язуючі білки, які пропонуються тут, взаємодіють з щонайменше частиною унікальної субодиниці р19 інтерлейкіну IL-23, помітно зв’язуючі IL-23, але не зв’язуються скільки-небудь суттєво з IL-12 (наприклад, з субодиницями р40 та/або р35 інтерлейкіну IL-12), тим самим "щадячи IL-12". Як наслідок, запропоновані тут антигензв’язуючі білки є здатними впливати на активність IL-23 без потенційних ризиків того, що може трапитись пригнічення IL-12 або спільної субодиниці р40. Антигензв’язуючі білки можуть впливати на здатність IL-23 взаємодіяти з його рецептором, наприклад впливаючи на зв’язування з рецептором, зокрема перешкоджаючи асоціації з рецептором. Конкретно, такі антигензв’язуючі білки повністю або частково зменшують, пригнічують, перешкоджають або модулюють одну або більше біологічну активність IL-23. Таке пригнічення або нейтралізація порушує біологічну реакцію в присутності антигензв’язуючого білка у порівнянні з реакцією за відсутності антигензв’язуючого білка, що можна оцінити за допомогою аналізів, відомих в цій галузі і описаних тут. Антигензв’язуючі білки, запропоновані тут, пригнічують індуковану IL-23 продукцію прозапальних цитокінів, наприклад індуковану IL-23 продукцію IL-22 в клітинах цільної крові і індуковану IL-23 експресію IFNγ в NK та клітинах цільної крові. Зниження біологічної активності може досягати приблизно 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % або більше. Антигензв’язуючий білок може містити частину, що зв’язується з антигеном, і необов’язково каркасну або підтримуючу частину, яка дозволяє частині, що зв’язується з антигеном, приймати конформацію, яка сприяє зв’язуванню антигензв’язуючого білка з антигеном. Приклади антигензв’язуючих білків включають антитіла, фрагменти антитіл (наприклад, антигензв’язуюча частина антитіла), похідні антитіла і аналоги антитіла. Антигензв’язуючий білок може містити альтернативний білковий каркас або штучний каркас з пересадженими ділянками CDR або похідними CDR. Такі каркаси включають, не обмежуючись ними, похідні від антитіла каркаси, які містять мутації, введені, наприклад, для того, щоб стабілізувати тримірну структуру антигензв’язуючого білка, а також повністю синтетичні каркаси, що являють собою, наприклад, біосумісний полімер. Дивись, наприклад, Korndorfer et al., Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, (2003) Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., Biotechnol. Prog., 2004, 20:639654. До того ж, можуть використовуватись пептидні міметики антитіла ("ПМА"), а також каркаси на основі міметиків антитіла з фібронектиновими компонентами. Певні антигензв’язуючі білки, описані тут, є антитілами або похідними від антитіл. Такі антигензв’язуючі білки включають, не обмежуючись ними, моноклональні антитіла, біспецифічні антитіла, міні-тіла, доменні антитіла, синтетичні антитіла, міметики антитіл, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, злиті антитіла, кон’юговані антитіла, одноланцюгові антитіла та їх фрагменти, відповідно. В певних випадках антигензв’язуючий білок є імунологічним фрагментом антитіла (наприклад, Fab, Fab’, F(ab’)2 або scFv). Ці різні структури будуть далі докладно описані і визначені. Певні запропоновані антигензв’язуючі білки можуть містити одну або більше ділянок CDR, як тут описано (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6 або більше ділянок CDR). В певних випадках антигензв’язуючий білок включає (а) поліпептидну структуру і (б) одну або більше ділянок CDR, що є вставленими в цю поліпептидну структуру та/або приєднаними до неї. Поліпептидна структура може приймати різноманітні форми. Наприклад, вона може бути каркасом або містити каркас природного антитіла або його фрагмент або варіант і може бути повністю синтетичною за своїм характером. Приклади різних поліпептидних структур докладно описуються далі. Про антигензв’язуючий білок за цим винаходом кажуть, що він «специфічно зв’язується» зі -8 своїм цільовим антигеном, коли константа рівноваги при дисоціації KD≤10 M. 11 UA 113609 C2 -9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Антигензв’язуючий білок специфічно зв’язує антиген з "високою афінністю", коли KD≤510 M, і -10 з "дуже високою афінністю", коли KD≤510 M. В одному варіанті здійснення антигензв’язуючий -12 білок буде зв’язуватись з людським IL-23 з KD≤510 M, а в іншому варіанті здійснення - з -13 KD≤510 M. В ще іншому варіанті здійснення цього винаходу антигензв’язуючий білок має -12 -6 -7 KD≤510 M і Koff≤510 1/сек. В іншому варіанті здійснення Koff≤510 1/сек. В іншому аспекті пропонується антигензв’язуючий білок, що має період напіввиведення щонайменше одну добу in vitro або in vivo (наприклад, коли вводиться людині). В одному варіанті здійснення антигензв’язуючий білок має період напіввиведення щонайменше три доби. В іншому варіанті здійснення антитіло або його частина мають період напіввиведення чотири доби або більше. В іншому варіанті здійснення антитіло або його частина мають період напіввиведення вісім діб або більше. В іншому варіанті здійснення антитіло або його частина є дериватизованими або модифікованими так, що мають більш тривалий період напіввиведення у порівнянні з недериватизованим або немодифікованим антитілом. В іншому варіанті здійснення антигензв’язуючий білок містить точкові мутації для збільшення періоду напіввиведення з сироватки, як описано в публікації Міжнародної патентної заявки WIPO № WO 00/09560. У варіантах здійснення, де антигензв’язуючий білок використовується для терапевтичних застосувань, антигензв’язуючий білок може зменшувати, пригнічувати, перешкоджати або модулювати одну або більше біологічну активність IL-23, таку як індукція продукції прозапальних цитокінів. IL-23 має багато різних біологічних ефектів, які можна оцінити за допомогою численних аналізів на різних типах клітин; приклади таких аналізів є відомими і наводяться тут. Деякі із запропонованих антигензв’язуючих білків мають структуру, типово асоційовану з природними антитілами. Структурні одиниці цих антитіл типово включають один або більше тетрамерів, кожний з яких складається з двох ідентичних куплетів поліпептидних ланцюгів, хоча певні види ссавців також продукують антитіла, що мають тільки один важкий ланцюг. В типовому антитілі кожна пара або куплет включає один "легкий" ланцюг повної довжини (в певних варіантах здійснення біля 25 кДа) і один "важкий" ланцюг повної довжини (в певних варіантах здійснення біля 50-70 кДа). Кожний індивідуальний імуноглобуліновий ланцюг складається з кількох "імуноглобулінових доменів", кожний з яких містить грубо від 90 до 110 амінокислот і має характерний малюнок укладки. Ці домени є тими базовими одиницями, з яких складаються поліпептиди антитіла. Аміно-термінальна частина кожного ланцюга типово включає варіабельну ділянку, що є відповідальною за розпізнавання антигену. Карбоксилтермінальна частина є більше збереженою в еволюційному плані, ніж інші кінці ланцюга, і її називають "постійною ділянкою" або "С ділянкою". Людські легкі ланцюги загалом класифікуються як капа і лямбда легкі ланцюги, і кожний з них містить одну варіабельну ділянку і один постійний домен (CL1). Важкі ланцюги типово класифікуються як мю, дельта, гамма, альфа або епсілон ланцюги, і саме вони визначають ізотип антитіла як IgM, IgD, IgG, IgA і IgE, відповідно. IgG має кілька підтипів, включаючи, але не обмежуючись ними, IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4. Підтипи IgM включають IgM і IgM2. Підтипи IgA включають IgA1 і IgA2. У людини ізотипи IgA і IgD містять чотири важкі ланцюги і чотири легкі ланцюги; ізотипи IgG і IgE містять два важкі ланцюги і два легкі ланцюги; і ізотип IgM містить п’ять важких ланцюгів і п’ять легких ланцюгів. Постійна ділянка (СН) важкого ланцюга типово містить один або більше доменів, які можуть бути відповідальними за ефекторну функцію. Кількість доменів постійної ділянки важкого ланцюга буде залежати від ізотипу. Кожний з важких ланцюгів IgG, наприклад, містить три домени СН ділянки, відомі як CH1, CH2 і CH3. Запропоновані антитіла можуть мати будь-який з цих ізотипів і підтипів, наприклад антигензв’язуючий білок, що зв’язує IL-23, може належати до підтипу IgG1, IgG2 або IgG4. Коли бажаним є IgG4, може бути бажаним також ввести точкову мутацію (CPSCP->CPPCP) в шарнірну ділянку (як описано в Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407), щоб ослабити тенденцію до утворення дисульфідних зв’язків всередині важкого ланцюга, які можуть призводити до гетерогенності серед антитіл IgG4. Запропоновані тут антитіла, що належать до одного типу, можуть бути замінені на інший тип за допомогою методів переключення підкласів. Дивись, наприклад, Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316. В легких і важких ланцюгах повної довжини варіабельні і постійні ділянки є з’єднаними ділянкою "J", що складається з приблизно дванадцяти або більше амінокислот, при цьому важкий ланцюг включає також ділянку "D", що має на десять амінокислот більше. Дивись, наприклад, Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press. Варіабельні ділянки кожної пари легкого/важкого ланцюгів типово утворює антигензв’язуючий сайт. Варіабельні ділянки 12 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Різні запропоновані тут варіабельні ділянки (чи домени) важкого ланцюга і легкого ланцюга представлені в ТАБЛИЦЯХ 1 і 2. Кожна з цих варіабельних ділянок може бути приєднаною до, наприклад, описаних вище постійних ділянок важкого і легкого ланцюгів. Більше того, кожна з утворених у такий спосіб послідовностей важкого і легкого ланцюгів може комбінуватись з утворенням повної структури антигензв’язуючого білка. Пропонуються антигензв’язуючі білки, які містять щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга (VH), вибрану з групи, яка складається з VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15 і VH16, та/або щонайменше одну варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL), вибрану з групи, яка складається з VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15 і VL16, як показано в ТАБЛИЦЯХ 1 і 2 далі. Кожна з варіабельних ділянок важкого ланцюга, наведених в ТАБЛИЦІ 2, може комбінуватись з будь-якою варіабельних ділянок легкого ланцюга, наведених в ТАБЛИЦІ 1, з утворенням антигензв’язуючого білка. В певних випадках такий антигензв’язуючий білок включає щонайменше одну варіабельну ділянку важкого ланцюга та/або одну варіабельну ділянку легкого ланцюга з тих, що наведені в ТАБЛИЦЯХ 1 і 2. В певних випадках такий антигензв’язуючий білок включає щонайменше дві різні варіабельні ділянки важкого ланцюга та/або варіабельні ділянки легкого ланцюга з тих, що наведені в ТАБЛИЦЯХ 1 і 2. Різні комбінації варіабельних ділянок важкого ланцюга можуть комбінуватись з будь-якими з різних комбінацій варіабельних ділянок легкого ланцюга. В інших випадках антигензв’язуючий білок включає дві ідентичні варіабельні ділянки легкого ланцюга та/або дві ідентичні варіабельні ділянки важкого ланцюга. В якості прикладу, антигензв’язуючий білок може бути антитілом або імунологічно функціональним фрагментом, який містить дві варіабельні ділянки легкого ланцюга і дві варіабельні ділянки важкого ланцюга в комбінаціях пар варіабельних ділянок легкого ланцюга і пар варіабельних ділянок важкого ланцюга, наведених в ТАБЛИЦЯХ 1 і 2. Приклади таких антигензв’язуючих білків, що містять дві ідентичні варіабельні ділянки важкого ланцюга і легкого ланцюга, включають: Антитіло A VH14/ VL14; Антитіло B VH9/ VL9; Антитіло C VH10/ VL10; Антитіло D VH15/ VL15; Антитіло E VH1/ VL1, Антитіло F VH11/ VL11; Антитіло G VH12/ VL12; Антитіло H VH13/ VL13; Антитіло I VH8/ VL8; Антитіло J VH3/ VL3; Антитіло K VH7/ VL7; Антитіло L VH4/ VL4; Антитіло M VH5/ VL5 і Антитіло N VH6/ VL6. Певні запропоновані тут антигензв’язуючі білки містять варіабельну ділянку важкого ланцюга та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга з послідовностями амінокислот, які відрізняються від послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга та/або варіабельної ділянки легкого ланцюга, вибраних з ТАБЛИЦЬ 1 і 2, тільки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 амінокислотними залишками, де кожна така відмінність послідовності є незалежно делецією, вставкою або заміщенням однієї амінокислоти. В певних антигензв’язуючих білках варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів мають послідовності амінокислот, які характеризуються щонайменше 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичністю з амінокислотними послідовностями, що наведені в ТАБЛИЦЯХ 1 і 2. Ще інші антигензв’язуючі білки, наприклад антитіла або імунологічно функціональні фрагменти, включають також варіантні форми ділянок важкого ланцюга та/або варіантні форми ділянок легкого ланцюга, як тут описується. Термін "ідентичність" стосується співвідношення між послідовностями двох або більше поліпептидних молекула або двох або більше полінуклеотидів, яке визначається зіставленням і порівнянням цих послідовностей. "Відсоток ідентичності" означає відсоток ідентичних залишків між амінокислотами або нуклеотидами в порівнюваних молекулах і обчислюється, виходячи з розміру найменшої з молекул, що порівнюються. 13 UA 113609 C2 ТАБЛИЦЯ 1 Типові варіантні послідовності ділянок легкого ланцюга VL1 VL2 VL3 VL4 VL5 VL6 VL7 VL8 VL9 VL10 VL11 VL12 VL13 VL14 VL15 VL16 FR1 CDRL1 FR2 CDRL2 FR3 CDRL3 FR4 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNTGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGSGNRPSG VPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTRLTVL SEQ ID NO:1 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGSNNRP SGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVL SEQ ID NO:3 QAVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGTYRIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQ GSGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSSASVFGGGTKLTVL SEQ ID NO:4 QAVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGTYRIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDK QQGSGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSSASVFGGGTKLTVL SEQ ID NO:4 QPVLTQPPSASASLGASVTLTCTLNSGYSDYKVDWYQQRPGKGPRFVMRVGTGGIVG SKGDGIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHCGADHGSGSNFVYVFGTGTKVTVL SEQ ID NO:7 QPVLTQPPSASASLGASVTLTCTLSSGYSDYKVDWYQQRPGKGPRFVMRVGTGGIVG SKGEGIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHCGADHGSGNNFVYVFGTGTKVTVL SEQ ID NO:9 QPELTQPPSASASLGASVTLTCTLSSGYSDYKVDWYQLRPGKGPRFVMRVGTGGT VGSKGEGIPDRFSVLGSGLNRSLTIKNIQEEDESDYHCGADHGSGSNFVYVFGTGTKVTVL SEQ ID NO:11 DIQLTPSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIAGWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADSFPPTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:13 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQVISSWLAWYQQKPGKAPSLLIYAASSLQSG VPSRFSGSVSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDFK SEQ ID NO:15 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGSSSWFAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK SEQ ID NO:17 DSQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWFAWYQQKPGQAPNLLIYAASSLQ SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK SEQ ID NO:19 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRAGQVISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQATSFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO:21 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGFSGWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK SEQ ID NO:23 DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQVISSWFAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPADFATYFCQQANSFPFTFGPGTKVDVK SEQ ID NO:25 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGSSSWFAWYQQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK SEQ ID NO:27 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQ SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPPTFGQGTKVEIE SEQ ID NO:29 14 UA 113609 C2 ТАБЛИЦЯ 2 Типові варіантні послідовності ділянок важкого ланцюга VH1 VH2 VH3 VH4 VH5 VH6 VH7 VH8 VH9 VH10 VH11 VH12 VH13 VH14 FR1 CDRH1 FR2 CDRH2 FR3CDRH3 FR4 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNEY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRGYTSSWYPDAF DIWGQGTMVTVSS SEQ ID NO:31 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSN KYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRGYSSSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS SEQ ID NO:33 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDG SLKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR ERTTLSGSYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:34 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWLSVISHD GSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR ERTTLSGSYFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 36 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSRSSTIYI ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRIAAAGGFHYYYAL DVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:38 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYSMNWVRQAPGKGLEW VSYISSSSSTRYHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR RIAAAGPWGYYYAMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 40 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSSFSMNWVRQAPGKGLE WVSYISSRSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCAR RIAAAGPWGYYYAMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 42 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISTYYWSWIRQPAGKGLEWIGLIYTSGSTNY NPSLKSRVTMSLDTSKNQFSLRLTSVTAADTAVYYCARDRGYYYGVDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 44 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGHIHYSGNT YYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAKNRGFYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 46 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSINSGGYYWSWIRQHPGKGLEWI GYIYYSGSSYYNPSLKSRVTISVDTSQNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR DRGHYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:48 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIG YIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR DRGHYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:50 QVQLQESGPRLVKPSETLSLTCTVSGDSISSYFWSWIRQPPGKGLEWLGY IYYSGSTNYNPSLKSRVTISIDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTR DRGSYYGSDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:52 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWTWIRQHPGKGLEWIG YIYYSGNTYYNPSLKSRITISVDTSKNQFSLSLSSVTAADTAVYYCAR NRGYYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:54 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGST YYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAK NRGFYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 56 15 UA 113609 C2 VH15 VH16 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSINSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSS YYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR DRGHYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:58 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALIWYDGSNKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR ENTVTIYYNYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 60 Для цих обчислень пропуски при зіставленнях (якщо такі мають місце) повинні оброблятись за допомогою конкретної математичної моделі або комп'ютерної програми (тобто, "алгоритму"). Методи, які можуть бути використані для обчислення ідентичності зіставлених нуклеїнових кислот або поліпептидів, включають ті, що описані в Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; і Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48: 1073. При обчисленні відсотку ідентичності порівнювані послідовності зіставляють у спосіб, який дає найбільший збіг цих послідовностей. Комп'ютерна програма, використовувана для визначення відсотку ідентичності, являє собою пакет програм GCG, що включає GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12: 387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). Комп'ютерний алгоритм GAP використовується для зіставлення двох поліпептидів або полінуклеотидів, для яких потрібно визначити відсоток ідентичності послідовностей. Послідовності зіставляються так, щоб забезпечувався оптимальний збіг їх відповідних амінокислот або нуклеотидів ("співпадаюча ділянка", як визначено за допомогою алгоритму). Застосовується штраф за виявлення пропуску (який обчислюється як 3-x середню діагональ, де "середня діагональ" являє собою середнє значення діагоналі застосованої матриці порівняння; "діагональ" означає бал або число, приписане кожному довершеному збігу амінокислот при використанні даної матриці порівняння) і штраф за розширення пропуску (який звичайно становить 1/10 від штрафу за виявлення пропуску), а також матриця порівняння, така як PAM 250 або BLOSUM 62. В певних варіантах здійснення алгоритм використовує також стандартну матрицю порівняння (дивись Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5: 345352 для матриці порівняння PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 1091510919 для матриці порівняння BLOSUM 62). Рекомендовані параметри для визначення відсотку ідентичності для поліпептидів або нуклеотидних послідовностей з використанням програми GAP є наступними: Алгоритм: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453; Матриця порівняння: BLOSUM 62 від Henikoff et al., 1992, supra; Штраф за пропуск: 12 (але без штрафу за кінцеві пропуски), Штраф за довжину пропуску: 4, Граничне значення подібності: 0. Певні схеми, використовувані для зіставлення двох амінокислотних послідовностей, можуть мати своїм результатом збіг тільки короткої ділянки цих двох послідовностей, і ця невелика співпадаюча ділянка може мати дуже високу ідентичність послідовностей навіть за відсутності значної подібності між цими двома послідовностями повної довжини. Відповідно, вибраний метод зіставлення (програму GAP) можна відрегулювати, якщо це бажано, так щоб одержувати зіставлення, яке охоплює щонайменше 50 стичних амінокислот цільового поліпептиду. Описані тут варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів включають консенсусні послідовності, утворені з груп близьких антигензв'язуючих білків. Амінокислотні послідовності варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів були проаналізовані на подібність. Було виявлено чотири групи: одна група мала варіабельні ділянки легкого ланцюга капа (VH9/ VL9, VH10/ VL10, VH11/ VL11, VH13/ VL13, VH14/ VL14 і VH15/ VL15) і три групи мали варіабельні ділянки легкого ланцюга лямбда: лямбда група 1 (VH5/ VL5, VH6/ VL6 і VH7/ VL7), лямбда група 2 (VH3/ VL3 і VH4/ VL4) і лямбда група 3 (VH1/ VL1 і VH2/ VL2). Представлені зародкові лінії легких ланцюгів включають VK1/A30 і VK1/L19. Представлені зародкові лінії легких ланцюгів лямбда включають VL1/1e, VL3/3p, VL5/5c і VL9/9a. Представлені зародкові лінії важких ланцюгів включають VH3/330, VH3/3-30.3, VH3/3-33, VH3/3-48, VH4/4-31 і VH4/4-59. Термін "консенсусна послідовність", як він тут використовується, стосується амінокислотних послідовностей, які мають збережені амінокислоти, спільні для низки послідовностей, і варіабельні амінокислоти, які варіюють в межах даних амінокислотних послідовностей. Консенсусні послідовності можуть визначатись за 16 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою стандартних філогенетичних аналізів варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів, які відповідають описаним тут антигензв'язуючим білкам, що зв'язують IL-23. Консенсусна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга для капа групи має наступний вигляд: DX1QX2TQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGX3Х4SX5WX6AWYQQKP GX7APX8LLIYAASSLQSGVPSRFSGSX9SGTX10FTLTISSLQPX11DFATYX12CQQANSFPFTFGPGTK VDX13K (SEQ ID NO: 30), де X1 вибирається з I або S; X2 вибирається з M або L; X3 вибирається з G або V і X4 вибирається з S, F або I; X5 вибирається з S або G; X6 вибирається з F або L; X7 вибирається з K або Q; X8 вибирається з K, N або S; X9 вибирається з G або V; X10 вибирається з D або E, X11 вибирається з E або A; X12 вибирається з Y або F; і X13 вибирається з I, V або F. Консенсусна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга для лямбда групи 1 має наступний вигляд: QPX1LTQPPSASASLGASVTLTCTLX2SGYSDYKVDWYQX3RPGKGPRFVMRVGTGGX4VGSKGX5GI PDRFSVLGSGLNRX6LTIKNIQEEDESDYHCGADHGSGX7NFVYVFGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 61), де X1 вибирається з V або E; X2 вибирається з N або S; X3 вибирається з Q або L і X4 вибирається з I або T; X5 вибирається з D або E; X6 вибирається з Y або S; і X7 вибирається з S або N. Консенсусна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга для лямбда групи 3 має наступний вигляд: QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNX1GAGYDVHWYQQX2PGTAP KLLIYGSX3NRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTX 4RLTVL (SEQ ID NO: 139), де X1 вибирається з T або I; X2 вибирається з V або L; X3 вибирається з G або N і X4 вибирається з R або K. Консенсусна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга для капа групи має наступний вигляд: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIX1SGGYYWX2WIRQHPGK GLEWIGX3IX4YSGX5Х6YYNPSLKSRX7TX8SVDTSX9NQFSLX10LSSVTAADTAVYYCAX11Х12RGX13YY GMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 140), де X1 вибирається з N або S; X2 вибирається з S або T; X3 вибирається з Y або H і X4 вибирається з Y або H; X5 вибирається з S або N; X6 вибирається з S або T; X7 вибирається з V або I; X8 вибирається з I або M; X9 вибирається з K або Q; X10 вибирається з K або S, X11 вибирається з R або K; X12 вибирається з D або N; і X13 вибирається з H, F або Y. Консенсусна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга для лямбда групи 1 має наступний вигляд: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCX1Х2SGFTFSX3Х4SMNWVRQAPGKGLE WVSYISSX5SSTX6YX7ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRIAAAGX8Х9X10YYY AX11DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 141), де X1 вибирається з A або V; X2 вибирається з A або V; X3 вибирається з T або S і X4 вибирається з Y або F; X5 вибирається з S або R; X6 вибирається з R або I; X7 вибирається з H, Y або I; X8 вибирається з P або G; X9 вибирається з W або F; X10 вибирається з G або H і X11 вибирається з M або L. Консенсусна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга для лямбда групи 2 має наступний вигляд: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYX1MHWVRQAPGKGL EWX2X3VISX4DGSX5KYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERTTLSGSYFDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 142), де X1 вибирається з G або A; X2 вибирається з V або L; X3 вибирається з A або S, X4 вибирається з F або H і X5 вибирається з L або I. Консенсусна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга для лямбда групи 3 має наступний вигляд: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKG LEWVAVIWYDGSNX1YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYX2SSWYPD AFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 143), де X1 вибирається з E або K і X2 вибирається з T або S. Ділянки, що визначають комплементарність Ділянки, що визначають комплементарність, або "CDR" є вставленими в каркас варіабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів, де вони утворюють ділянки, відповідальні за розпізнавання і зв'язування антигену. Варіабельні домени імуноглобулінових ланцюгів одного й того ж виду, наприклад, загалом демонструють подібну загальну будову: вони містять відносно збережені ділянки каркасу (FR), з'єднані гіперваріабельними ділянками CDR. Антигензв'язуючий білок може мати 1, 2, 3, 4, 5, 6 або більше ділянок CDR. Ті варіабельні ділянки, про які йшлося раніше, наприклад, типово містять три ділянки CDR. CDR з варіабельних ділянок важкого ланцюга і варіабельних ділянок легкого ланцюга типово зводяться каркасними ділянками з утворенням структури, яка специфічно зв'язується з антигеном-мішенню (наприклад, IL-23). Від N-кінця до С-кінця природні варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів типово додержуються наступного порядку цих елементів: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. Ділянки CDR і FR типових варіабельних доменів легкого ланцюга і варіабельних доменів важкого ланцюга показані в ТАБЛИЦЯХ 1 і 2. Відомо, що межі ділянок CDR і FR можуть відрізнятись від тих, що наведені в таблицях. Були розроблені системи нумерації для 17 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 приписування певних номерів амінокислотам, що займають позиції в кожному з цих доменів. За допомогою цих систем можна ідентифікувати ділянки, що визначають комплементарність, і каркасні ділянки даного антигензв'язуючого білка. Системи нумерації є визначеними в Kabat et th al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91-3242, 1991, або Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883. Інші системи нумерації для амінокислот в імуноглобулінових ланцюгах включають IMGT® (Міжнародна інформаційна система ImMunoGeneTics; Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 2005, 29:185-203); а також AHo (Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol. 2001, 309(3):657-670). Запропоновані тут ділянки CDR можуть використовуватись не тільки для визначення антигензв'язуючого домену в традиційній структурі антитіла. Їх можна вставляти в широке коло інших поліпептидних структур, як тут описано. Описані тут антигензв'язуючі білки є поліпептидами, в які можуть бути пересаджені, вставлені, введені та/або до яких можуть бути приєднані одна або більше ділянок CDR. Антигензв'язуючий білок може мати, наприклад, одну ділянку CDR1 важкого ланцюга ("CDRH1"), та/або одну ділянку CDR2 важкого ланцюга ("CDRH2"), та/або одну ділянку CDR3 важкого ланцюга ("CDRH3"), та/або одну ділянку CDR1 легкого ланцюга ("CDRL1"), та/або одну ділянку CDR2 легкого ланцюга ("CDRL2"), та/або одну ділянку CDR3 легкого ланцюга ("CDRL3"). Певні антигензв'язуючі білки включають і CDRH3, і CDRL3. Конкретні варіанти здійснення загалом використовують комбінації ділянок CDR, які не повторюються; наприклад, антигензв'язуючі білки загалом не створюються з двома ділянками CDRH2 в одній варіабельній ділянці важкого ланцюга і т.д. Антигензв'язуючі білки можуть містити одну або більше амінокислотних послідовностей, які є ідентичними з амінокислотними послідовностями або які відрізняються від амінокислотних послідовностей однієї або більше ділянок CDR, представлених в ТАБЛИЦІ 3 тільки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 амінокислотними залишками, де кожна така відмінність послідовності є незалежно делецією, вставкою або заміщенням однієї амінокислоти. Ділянки CDR в певних антигензв'язуючих білках містять послідовності амінокислот, що мають принаймні 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичність з послідовностями CDR, наведеними в ТАБЛИЦІ 3. В певних антигензв'язуючих білках ділянки CDR є вставленими в каркасну ділянку, яка орієнтує ділянки CDR так, що досягаються належні антигензв'язуючі властивості цих ділянок. ТАБЛИЦЯ 3 Типові послідовності CDRH і CDRL CDRL1 TGSSSNTGAGYDVH SEQ ID NO: 62 TGSSSNIGAGYDVH SEQ ID NO: 65 TLRSGINVGTYRIY SEQ ID NO: 68 TLNSGYSDYKV SEQ ID NO: 71 TLSSGYSDYKV SEQ ID NO: 74 RASQGFSGWLA SEQ ID NO: 77 RASQVISSWLA SEQ ID NO: 80 RASQVISSWFA SEQ ID NO: 83 RASQGSSSWFA SEQ ID NO: 85 RASQGISSWFA SEQ ID NO: 86 RAGQVISSWLA SEQ ID NO: 87 Типові послідовності CDRL CDRL2 GSGNRPS SEQ ID NO: 63 GSNNRPS SEQ ID NO: 66 YKSDSDKQQGS SEQ ID NO: 69 VGTGGIVGSKGD SEQ ID NO: 72 VGTGGIVGSKGE SEQ ID NO: 75 VGTGGTVGSKGE SEQ ID NO: 78 AASSLQS SEQ ID NO: 81 18 CDRL3 QSYDSSLSGWV SEQ ID NO: 64 MIWHSSASV SEQ ID NO: 67 GADHGSGSNFVYV SEQ ID NO: 70 GADHGSGNNFVYV SEQ ID NO: 73 QQANSFPFT SEQ ID NO: 76 QQATSFPLT SEQ ID NO: 79 QQADSFPPT SEQ ID NO: 82 LQHNSYPPT SEQ ID NO: 84 UA 113609 C2 RASQGIAGWLA SEQ ID NO: 88 RASQGIRNDLG SEQ ID NO: 89 CDRH1 SYGMH SEQ ID NO: 91 SYAMH SEQ ID NO: 94 TYSMN SEQ ID NO: 97 SYSMN SEQ ID NO: 100 SFSMN SEQ ID NO: 103 SGGYYWT SEQ ID NO: 106 SGGYYWS SEQ ID NO: 109 SYFWS SEQ ID NO: 112 TYYWS SEQ ID NO: 115 5 10 15 20 25 Типові послідовності CDRH CDRH2 VIWYDGSNEYYADSVKG SEQ ID NO: 92 VIWYDGSNKYYADSVKG SEQ ID NO: 95 VISFDGSLKYYADSVKG SEQ ID NO: 98 VISHDGSIKYYADSVKG SEQ ID NO: 101 YISSRSSTIYIADSVKG SEQ ID NO: 104 YISSSSSTRYHADSVKG SEQ ID NO: 107 YISSRSSTIYYADSVKG SEQ ID NO: 110 YIYYSGNTYYNPSLKS SEQ ID NO: 113 HIHYSGNTYYNPSLKS SEQ ID NO: 116 YIYYSGSTYYNPSLKS SEQ ID NO: 118 YIYYSGSSYYNPSLKS SEQ ID NO: 120 YIYYSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO: 121 LIYTSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO: 122 LIWYDGSNKYYADSVKG SEQ ID NO: 90 CDRH3 DRGYTSSWYPDAFDI SEQ ID NO: 93 DRGYSSSWYPDAFDI SEQ ID NO: 96 ERTTLSGSYFDY SEQ ID NO: 99 RIAAAGGFHYYYALDV SEQ ID NO: 102 RIAAAGPWGYYYAMDV SEQ ID NO: 105 NRGYYYGMDV SEQ ID NO: 108 NRGFYYGMDV SEQ ID NO: 111 DRGHYYGMDV SEQ ID NO: 114 DRGSYYGSDY SEQ ID NO: 117 DRGYYYGVDV SEQ ID NO: 119 ENTVTIYYNYGMDV SEQ ID NO: 6 Тут пропонуються ділянки CDR1, що містять амінокислотні залишки 23-34 послідовностей SEQ ID NO: 7 і 11; амінокислотні залишки 24-34 послідовностей SEQ ID NO: 9, 13, 15, 17, 19 21, 23, 25, 27 і 29; амінокислотні залишки 23-36 послідовностей SEQ ID NO: 1, 3 і 4; амінокислотні залишки 31-35 послідовностей SEQ ID NO: 31, 33, 34, 38, 40, 44, 52 і 60 та амінокислотні залишки 31-37 послідовностей SEQ ID NOs: 46, 48, 50, 54, 56 і 58. Пропонуються ділянки CDR2, що містять амінокислотні залишки 50-56 послідовностей SEQ ID NOs: 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 і 29; амінокислотні залишки 50-61 послідовностей SEQ ID NO: 7 і 11; амінокислотні залишки 52-62 послідовності SEQ ID NO: 4; амінокислотні залишки 5065 послідовностей SEQ ID NOs: 31, 33, 44 і 52; амінокислотні залишки 50-66 послідовностей SEQ ID NO: 36, 38, 40, 42 і 60; амінокислотні залишки 52-58 послідовностей SEQ ID NOs: 1 і 3 та амінокислотні залишки 52-67 послідовностей SEQ ID NO: 46, 48, 50, 54, 56 і 58. Пропонуються також ділянки CDR3, що містять амінокислотні залишки 89-97 послідовностей SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 і 29; амінокислотні залишки 91-101 послідовностей SEQ ID NOs: 1 і 3; амінокислотні залишки 94-106 послідовностей SEQ ID NOs: 7, 9 і 11; амінокислотні залишки 98-107 послідовностей SEQ ID NOs: 44 і 52; амінокислотні залишки 97105 послідовності SEQ ID NO: 4; амінокислотні залишки 99-110 послідовностей SEQ ID NOs: 34 і 36; амінокислотні залишки 99-112 послідовності SEQ ID NO: 112; амінокислотні залишки 99-113 послідовностей SEQ ID NOs: 31 і 33; амінокислотні залишки 99-114 послідовностей SEQ ID NOs: 38, 40 і 42; амінокислотні залишки 100-109 послідовностей SEQ ID NOs: 46, 48, 54, 56 і 58; та амінокислотні залишки 101-019 послідовності SEQ ID NO: 50. Описані тут ділянки CDR включають консенсусні послідовності, утворені з груп близьких послідовностей. Як вже зазначалось, було ідентифіковано чотири групи послідовностей варіабельної ділянки: капа група і три лямбда групи. Консенсусна послідовність CDRL1 з капа групи складається з RASQX1Х2SX3WX4A (SEQ ID NO: 123), де X1 вибирається з G або V; X2 вибирається з I, F або S; X3 вибирається з S або G і X4 вибирається з F або L. Консенсусна 19 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність CDRL1 з лямбда групи 1 складається з TLX1SGYSDYKVD (SEQ ID NO: 124), де X1 вибирається з N або S. Консенсусна послідовність CDRL1 з лямбда групи 1 складається з TGSSSNX1GAGYDVH (SEQ ID NO: 125), де X1 вибирається з I або T. Консенсусна послідовність CDRL2 з лямбда групи 1 складається з VGTGGX1VGSKGX2 (SEQ ID NO: 126), де X1 вибирається з I або T і X2 вибирається з D або E. Консенсусна послідовність CDRL2 з лямбда групи 3 складається з GSX1NRPS (SEQ ID NO: 127), де X1 вибирається з N або G. Консенсусні послідовності CDRL3 включають GADHGSGX1NFVYV (SEQ ID NO: 128), де X1 це S або N. Консенсусна послідовність CDRH1 з капа групи складається з SGGYYWX1 (SEQ ID NO: 129), де X1 вибирається з S або T. Консенсусна послідовність CDRH1 з лямбда групи 1 складається з X1Х2SMN (SEQ ID NO: 131), де X1 вибирається з S або T і X2 вибирається з Y або F. Консенсусна послідовність CDRH1 з лямбда групи 2 складається з SYX1MH (SEQ ID NO: 130), де X1 вибирається з G або A. Консенсусна послідовність CDRH2 з капа групи складається з X1IX2YSGX3Х4YYNPSLKS (SEQ ID NO: 132), де X1 вибирається з Y або H; X2 вибирається з Y або H; X3 вибирається з S або N і X4 вибирається з T або S. Консенсусна послідовність з лямбда групи 1 складається з YISSX1SSTX2YX3ADSVKG (SEQ ID NO: 134), де X1 вибирається з R або S, X2 вибирається з I або R, X3 вибирається з I, H або Y. Консенсусна послідовність з лямбда групи 2 складається з VISX1DGSX2KYYADSVKG (SEQ ID NO: 133), де X1 - це F або H, а X2 - це L або T. Консенсусна послідовність CDRH2 з лямбда групи 3 складається з VIWYDGSNX1YYADSVKG (SEQ ID NO: 135), де X1 вибирається з K або E. Консенсусна послідовність CDRH3 з капа групи складається з X1RGX2YYGMDV (SEQ ID NO: 136), де X1 вибирається з N або D, а X2 вибирається з H, Y або F. Консенсусна послідовність CDRH3 з лямбда групи 1 складається з RIAAAGX1Х2X3YYYAX4DV (SEQ ID NO: 137), де X1 вибирається з G або P; X2 вибирається з F або W; X3 вибирається з H або G і X4 вибирається з L і M. Консенсусна послідовність CDRH3 з лямбда групи 3 складається з DRGYX1SSWYPDAFDI (SEQ ID NO: 138), де X1 вибирається з S або T. Моноклональні антитіла Антигензв'язуючі білки, що пропонуються, включають моноклональні антитіла, які зв'язуються з IL-23. Моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням будь-якого методу, відомого в цій галузі, наприклад шляхом імморталізації клітин селезінки, взятих від трансгенної тварини після завершення протоколу імунізації. Клітини селезінки можуть бути імморталізовані за допомогою будь-якого методу, відомого в цій галузі, наприклад шляхом їх злиття з клітинами мієломи з утворенням гібридом. Клітини мієломи для використання в методах злиття з утворенням гібридом переважно мають бути такими, що не продукують антитіл, володіють високою ефективністю злиття і характеризуються дефіцитом ферментів, що робить їх нездатними рости в певних селективних середовищах, які підтримують ріст тільки бажаних злитих клітин (гібридом). Приклади придатних клітинних ліній для використання з метою злиття з мієломними клітинами миші включають Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 і S194/5XXO Bul; приклади клітинних ліній для використання з метою злиття з мієломними клітинами щура включають R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F і 4B210. Іншими клітинними лініями, придатними для злиття клітин, є U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 і UC729-6. В певних випадках гібридомну клітинну лінію одержують шляхом імунізації тварини (наприклад, трансгенної тварини, що має послідовності імуноглобуліну людини) імуногеном IL23; взяття клітин селезінки від цієї імунізованої тварини; злиття взятих клітин селезінки з мієломною клітинною лінією з утворенням гібридомних клітин; встановлення гібридомних клітинних ліній з гібридомних клітин і ідентифікація гібридомної клітинної лінії, яка продукує антитіло, що зв'язує поліпептид IL-23 і щадить IL-12. Такі гібридомні клітинні лінії і продуковані ними анти-IL-23 моноклональні антитіла є аспектами даної заявки. Моноклональні антитіла, секретовані гібридомною клітинною лінією, можуть бути очищені будь-яким методом, відомим в цій галузі. Гібридоми або mAbs можуть бути піддані додатковому скринінгу для ідентифікації mAbs з конкретними властивостями, такими як здатність пригнічувати індуковану IL-23 активність. Химерні і гуманізовані антитіла Химерні і гуманізовані антитіла на основі вище приведених послідовностей також пропонуються цим винаходом. Моноклональні антитіла для застосування в якості терапевтичних агентів можна модифікувати різними способами. Одним прикладом є химерне антитіло, що є антитілом, яке складається з білкових сегментів від різних антитіл, ковалентно 20 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з'єднаних з утворенням функціональних імуноглобулінових легких або важких ланцюгів або їх імунологічно функціональних частин. Загалом, частина важкого ланцюга та/або легкого ланцюга є ідентичною або гомологічною з відповідною послідовністю в антитілах, одержаних від конкретного виду, або в антитілах, що належать до конкретного класу або підкласу антитіл, тоді як решта ланцюга (ланцюгів) є ідентичною або гомологічною з відповідною послідовністю в антитілах, одержаних від іншого виду, або в антитілах, що належать до іншого класу або підкласу антитіл. У відношенні методів, пов'язаних з химерними антитілами, дивись, наприклад, патент США № 4,816,567; а також Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855. Пересаджування CDR є описаним, наприклад, в патентах США NO 6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 і 5,530,101. Одним корисним типом химерного антитіла є "гуманізоване" антитіло. Загалом, гуманізоване антитіло одержується з моноклонального антитіла, вирощеного спочатку в тварині, що не є людиною. Певні амінокислотні залишки в цьому моноклональному антитілі, типово з тих частин антитіла, які не розпізнають антиген, модифікуються, щоб бути гомологічними з відповідними залишками в людському антитілі відповідного ізотипу. Гуманізація може здійснюватись, наприклад, з використанням різних методів шляхом заміщення щонайменше частини варіабельної ділянки гризуна відповідними ділянками антитіла людини (дивись, наприклад, патенти США №№ 5,585,089 і 5,693,762; Jones et al., 1986, Nature 321:522525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536). В певних варіантах здійснення постійні ділянки від виду, іншого ніж людина, можуть бути використані разом з людською варіабельною ділянкою (ділянками) для одержання гібридних антитіл. Повністю людські антитіла Повністю людські антитіла також пропонуються цим винаходом. Існують методи для одержання повністю людських антитіл, специфічних для даного антигену, без піддавання людей дії цього антигену. Одним специфічним засобом, запропонованим для одержання повністю людських антитіл, є "гуманізація" гуморальної імунної системи миші. Введення локусів людського імуноглобуліну (Ig) мишам, у яких гени ендогенного Ig були інактивовані, є одним зі шляхів одержання повністю людських моноклональних антитіл (mAbs) у миші, тварини, яку можна імунізувати будь-яким бажаним антигеном. Застосування повністю людських антитіл може мінімізувати імуногенні і алергічні реакції, які деколи можуть викликатись введенням мишачого або дериватизованого від мишей mAbs людям в якості терапевтичного агента. Повністю людські антитіла можуть бути одержані шляхом імунізації трансгенних тварин (звичайно мишей), які здатні продукувати певний репертуар людських антитіл за відсутності продукції ендогенного імуноглобуліну. Антигени для цієї мети типово мають шість або більше стичних амінокислот і необов'язково є кон'югованими до носія, такого як гаптен. Дивись, наприклад, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; а також Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. В одному прикладі реалізації такого методу трансгенних тварин одержують шляхом виведення з ладу локусів ендогенного імуноглобуліну, кодуючих важкі і легкі імуноглобулінові ланцюги миші і введення цій миші великих фрагментів ДНК геному людини, що містять локуси, які кодують білки важких і легких ланцюгів людини. Частково модифіковані тварини, які мають менше ніж повний комплект імуноглобулінових локусів людини, потім схрещуються з одержанням тварини, що має всі бажані модифікації імунної системи. При введенні імуногену такі трансгенні тварини продукують антитіла, які є імуноспецифічними для цього імуногену, але мають швидше людські, ніж мишачі, амінокислотні послідовності, включаючи варіабельні ділянки. Більш докладний опис таких методів можна знайти, наприклад, в патентних публікаціях WIPO WO96/33735 і WO94/02602. Додаткові методи, що мають відношення до трансгенних мишей для одержання людських антитіл, є описаними в патентах США №№ 5,545,807; 6,713,610; 6,673,986; 6,162,963; 5,545,807; 6,300,129; 6,255,458; 5,877,397; 5,874,299 і 5,545,806; в патентних публікаціях WIPO WO91/10741, WO90/04036; та в EP 546073B1 і EP 546073A1. Вищеописані трансгенні миші містять мінілокус гену імуноглобуліну людини, який кодує неаранжовані послідовності важких ([мю] і [гамма]) і легкого [капа] ланцюгів імуноглобуліну людини, разом з цільовими мутаціями, які інактивують ендогенні локуси ланцюгів [мю] і [капа] (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Відповідно, такі миші демонструють зменшену експресію мишачого IgM або [капа] у відповідь на імунізацію, і введені трансгени важких і легких ланцюгів людини піддаються перемиканню на інший клас і соматичній мутації, щоб генерувати людські IgG [капа] моноклональні антитіла високої афінності (Lonberg et al., supra.; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546). Одержання таких мишей є докладно описаним у Taylor et al., 1992, Nucleic Acids 21 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Research 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-85. Дивись також патенти США № 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299 і 5,770,429; а також патент США № 5,545,807; публікації WIPO №№ WO 93/1227; WO 92/22646 і WO 92/03918. Технології, використовувані для одержання людських антитіл у таких трансгенних мишей, є описаними також в публікації WIPO № WO 98/24893 та у Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156. Наприклад, для одержання анти-IL-23 антитіл можуть бути використані лінії трансгенних мишей HCo7 і HCo12. Використовуючи гібридомну технологію, можна одержувати антигенспецифічні людські mAbs з бажаною специфічністю і відбирати з трансгенних мишей такі, як описані вище. Такі антитіла можна клонувати і експресувати за допомогою придатного вектору і клітини-хазяїна або такі антитіла можна збирати з культивованих гібридомних клітин. Повністю людські антитіла можуть бути одержані з фагових дисплейних бібліотек (так, як описано в Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; публікації WIPO № WO 99/10494). Методи фагового дисплею імітують імунний відбір шляхом виведення репертуару антитіл на поверхню філаментозного бактеріофага і наступного відбору фага за його зв'язуванням з антигеном вибору. Біспецифічні або біфункціональні антигензв'язуючі білки "Біспецифічний", "подвійно специфічний" або "біфункціональний" антигензв'язуючий білок або антитіло - це гібридний антигензв'язуючий білок або антитіло, відповідно, що має два різні антигензв'язуючих сайти, такі як одна або більше ділянок CDR або одна або більше варіабельних ділянок, як описувалось раніше. В певних випадках вони є штучним гібридним антитілом, що має дві різні пари важкого/легкого ланцюгів і два різних сайти зв'язування. Мультиспецифічний антигензв'язуючий білок або "мультиспецифічне антитіло" є націленими більше ніж на один антиген або епітоп. Біспецифічні антигензв'язуючі білки або антитіла є одним з видів мультиспецифічного антигензв'язуючого білка або антитіла і можуть одержуватись різноманітними методами, включаючи, але не обмежуючись ними, злиття гібридом або зв'язування фрагментів Fab'. Дивись, наприклад, Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Імунологічні фрагменти Антигензв'язуючі білки включають також імунологічні фрагменти антитіла (наприклад, Fab, Fab", F(ab")2 або scFv). "Fab фрагмент" складається з одного легкого ланцюга (варіабельної ділянки легкого ланцюга (VL) і відповідного їй постійного домену (CL)) і одного важкого ланцюга (варіабельної ділянки важкого ланцюга (VH) і першого постійного домену (CH1)). Важкий ланцюг молекули Fab не може утворювати дисульфідний зв'язок з іншою молекулою важкого ланцюга. "Fab" фрагмент" містить один легкий ланцюг і частину одного важкого ланцюга, яка має ділянку між доменами CH1 і CH2, так що може утворюватись внутрішній дисульфідний зв'язок між двома важкими ланцюгами двох Fab" фрагментів з формуванням молекули F(ab')2. Отже, "F(ab')2 фрагмент" складається з двох Fab" фрагментів, які утримуються разом дисульфідним зв'язком між двома важкими ланцюгами. "Fv фрагмент" складається з варіабельної ділянки легкого ланцюга і варіабельної ділянки важкого ланцюга з одного плеча антитіла. Одноланцюгові антитіла "scFv" є молекулами Fv, в яких варіабельні ділянки легкого і важкого ланцюгів були з'єднані гнучким лінкером з утворенням одного поліпептидного ланцюга, що слугує антигензв'язуючою ділянкою. Одноланцюгові антитіла докладно розглядаються в публікації WIPO № WO 88/01649, патентах США №№ 4,946,778 і No. 5,260,203; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387; Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108 and Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40. Ділянка "Fc" містить фрагменти двох важких ланцюгів, які включають домени CH1 і CH2 антитіла. Фрагменти двох важких ланцюгів утримуються разом двома або більше дисульфідними зв'язками і за рахунок гідрофобної взаємодії доменів CH3. Також включеними в об'єм цього винаходу є доменні антитіла, імунологічно функціональні фрагменти імуноглобуліну, які містять тільки варіабельну ділянку важкого ланцюга або варіабельну ділянку легкого ланцюга. В певних випадках дві або більше ділянки VH є ковалентно з'єднаними з пептидним лінкером, утворюючи двохвалентне доменне антитіло. Дві ділянки VH двохвалентного доменного антитіла можуть націлюватись на той самий або різні антигени. Діатіла - це двохвалентні антитіла, що містять два поліпептидні ланцюги, де кожний 22 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептидний ланцюг включає домени VH і VL, з'єднані лінкером, що є надто коротким, щоб дозволити структурування між двома доменами на тому самому ланцюзі, а це дає можливість кожному домену об'єднуватись з комплементарним доменом на іншому поліпептидному ланцюзі (дивись, наприклад, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993 та Poljak et al., Structure 2:1121-23, 1994). Подібно до цього, тріотіла і тетратіла є антитілами, що містять три і чотири поліпептидні ланцюги, відповідно, які можуть бути однаковими або різними. Макситіла містять двохвалентні scFv, ковалентно приєднані до Fc ділянки імуноглобуліну IgG1, (дивись, наприклад, Fredericks et al., 2004, Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106; Powers et al., 2001, Journal of Immunological Methods, 251:123-135; Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; Hayden et al., 1994, Therapeutic Immunology 1:3-15). Різні інші форми Пропонуються також варіантні форми вищеописаних антигензв'язуючих білків; певні з цих антигензв'язуючих білків мають, наприклад, одне або більше консервативних амінокислотних заміщень в одному або більше важких або легких ланцюгах, варіабельні ділянки або ділянки CDR, наведені в ТАБЛИЦЯХ 1 і 2. Природні амінокислоти можна поділити на класи на основі спільних властивостей бічних ланцюгів: гідрофобні (норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile); нейтральні гідрофільні (Cys, Ser, Thr, Asn, Gln); кислотні (Asp, Glu); основні (His, Lys, Arg); залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга (Gly, Pro); і ароматичні (Trp, Tyr, Phe). Консервативні амінокислотні заміщення можуть передбачати обмін представника одного з цих класів на іншого представника того самого класу. Консервативні амінокислотні заміщення можуть охоплювати залишки неприродних амінокислот, які типово вводяться швидше шляхом хімічного синтезу пептидів, ніж шляхом синтезу в біологічних системах. Вони включають пептидоміметики або інші обернені або перевернені форми амінокислотних частин. Такі суттєві модифікації в функціональних та/або біохімічних характеристиках описаних тут антигензв'язуючих білків можуть досягатись шляхом створення заміщень в амінокислотних послідовностях важких і легких ланцюгів, які значно відрізняються за своїм впливом на підтримання (а) структури молекулярного каркасу на ділянці заміщення, наприклад у вигляді листкової або спіральної конформації, (б) заряду або гідрофобності молекули в цільовому місці, або (в) об'ємності бічного ланцюга. Неконсервативні заміщення можуть передбачати обмін представника одного з вищенаведених класів на представника іншого класу. Такі заміщені залишки можуть вводитись в ділянки антитіла, що є гомологічними з людськими антитілами, або в не гомологічні ділянки молекули. При здійсненні таких змін, згідно з певними варіантами здійснення цього винаходу, може враховуватись індекс гідрофобності амінокислот. Профіль гідрофобності білка обчислюють, приписуючи кожній амінокислоті числове значення ("індекс гідрофобності"), а потім усереднюючи ці значення одне за одним вдовж пептидного ланцюга. Кожна амінокислота одержала індекс гідрофобності на основі своїх характеристик гідрофобності і заряду. Ці значення є наступними: ізолейцин (+4,5); валін (+4,2); лейцин (+3,8); фенілаланін (+2,8); цистеїн/цистин (+2,5); метіонін (+1,9); аланін (+1,8); гліцин (-0,4); треонін (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролін (-1,6); гістидин (-3,2); глутамат (-3,5); глютамін (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагін (-3,5); лізин (-3,9); і аргінін (-4,5). Важливість профілю гідрофобності для надання інтерактивної біологічної функції білку є зрозумілою в цій галузі (дивись, наприклад, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131). Відомо, що певні амінокислоти можуть заміщатись іншими амінокислотами, що мають подібний індекс гідрофобності, і все ще зберігати подібну біологічну активність. В певних варіантах здійснення при внесенні змін на основі індексу гідрофобності допускається заміщення амінокислот, індекси гідрофобності яких знаходяться в межах ±2. В певних аспектах допускаються заміщення амінокислот, індекси гідрофобності яких знаходяться в межах ±1, а в інших аспектах допускаються заміщення амінокислот, індекси гідрофобності яких знаходяться в межах ±0.5. Також в цій галузі встановлено, що заміну подібних амінокислот можна ефективно здійснювати на основі гідрофільності, особливо тоді, коли біологічно функціональний білок або пептид, створений у такий спосіб, призначається для застосування в імунологічних варіантах здійснення цього винаходу, як в даному випадку. В певних варіантах здійснення найбільша локальна середня гідрофільність білка, яка управляється гідрофільністю суміжних амінокислот, корелює с його імуногенністю і зв'язуванням антигену або імуногенністю, тобто з біологічними властивостями цього білка. Наступні значення гідрофільності були приписані даним амінокислотним залишкам: аргінін (+3,0); лізин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серин (+0,3); аспарагін (+0,2); глютамін 23 UA 113609 C2 5 10 (+0,2); гліцин (0); треонін (-0,4); пролін (-0,5±1); аланін (-0,5); гістидин (-0,5); цистеїн (-1,0); метіонін (-1,3); валін (-1,5); лейцин (-1,8); ізолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенілаланін (-2,5) і триптофан (-3,4). В певних варіантах здійснення при внесенні змін на основі подібних значень гідрофільності допускається заміщення амінокислот, значення гідрофільності яких знаходяться в межах ±2, інші варіанти допускають заміщення амінокислот, значення гідрофільності яких знаходяться в межах ±1, а ще інші варіанти допускають заміщення амінокислот, значення гідрофільності яких знаходяться в межах ±0.5. В певних випадках на основі гідрофільності можна також ідентифікувати епітопи з первинних амінокислотних послідовностей. Ці ділянки називають також "ділянками ядра епітопу". Типові консервативні амінокислотні заміщення наведені в ТАБЛИЦІ 4. ТАБЛИЦЯ 4 Консервативні амінокислотні заміщення Залишок Зам. Ala Ser Arg Lys Asn Gln, His Залишок Зам. Gln Asn Glu Asp Gly Pro Залишок Зам. Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Asp Cys His Ile Phe Ser Glu Ser Asn, Gln Leu, Val Met, Leu, Tyr Thr Залишок Зам. Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp, Phe Val Ile, Leu Thr Ser Залишок = оригінальний залишок; Зам. = Типове заміщення. 15 20 25 30 35 40 45 Спеціаліст в даній галузі зможе визначити підходящі варіанти поліпептидів, представлених тут, використовуючи загальновідомі методи. Спеціаліст в даній галузі може ідентифікувати відповідні ділянки молекули, які можуть бути змінені без порушення активності, націлюючись на ділянки, які не вважаються важливими для активності. Спеціаліст в даній галузі зможе також ідентифікувати залишки і частини молекул, що є збереженими в подібних поліпептидах. В подальших варіантах здійснення цього винаходу навіть ділянки, що можуть бути важливими для біологічної активності або для структури, можуть піддаватись консервативним амінокислотним заміщенням без руйнування біологічної активності або без несприятливого впливу на структуру поліпептиду. Крім цього, спеціаліст в даній галузі може проаналізувати дослідження структура-функція, в яких визначаються ті залишки в подібних поліпептидах, що є важливими для активності або структури. С урахуванням такого порівняння можна прогнозувати важливість амінокислотних залишків в білку, які відповідають амінокислотним залишкам, важливим для активності або структури в подібних білках. Спеціаліст в даній галузі зможе вибрати хімічно подібні амінокислотні заміщення для таких прогнозовано важливих амінокислотних залишків. Спеціаліст в даній галузі може також проаналізувати тримірну структуру і амінокислотну послідовність в зв'язку з цією структурою в подібних поліпептидах. З урахуванням такої інформації спеціаліст в даній галузі може прогнозувати зіставлення амінокислотних залишків антитіла по відношенню до його тримірної структури. Спеціаліст в даній галузі може вибрати не вносити радикальних змін в амінокислотні залишки на поверхні білка, оскільки ці залишки можуть брати участь у важливих взаємодіях з іншими молекулами. Більше того, спеціаліст в даній галузі може генерувати тестові варіанти, які містять одне амінокислотне заміщення при кожному бажаному амінокислотному залишку. Ці варіанти потім можна піддати скринінгу, застосовуючи аналізи на активність IL-23 (дивись приклади далі), одержуючи у такий спосіб інформацію стосовно того, які амінокислоти можна заміняти, а які заміняти неможна. Іншими словами, на основі інформації, зібраної в таких рутинних експериментах, спеціаліст в даній галузі може легко визначити позиції амінокислот, де подальших заміщень слід уникати як самих по собі, так і в комбінації з іншими мутаціями. Прогнозуванню вторинної структури була присвячена низка наукових публікацій. Дивись, Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochem. 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; та Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Більш того, в наш час розроблені комп'ютерні програми, які допомагають прогнозувати вторинну структуру. Один метод прогнозування вторинної структури базується на моделюванні гомології. 24 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, два поліпептиди або білки, які мають ідентичність послідовностей понад 30 % або подібність понад 40 %, часто мають подібну структурну топологію. Збільшення за останній час бази даних щодо білкових структур (PDB) забезпечило підвищену передбачуваність вторинної структури, включаючи потенційне згинів в білковій або поліпептидній структурі. Дивись Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27: 244-247. Було зроблене припущення (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7: 369-376), що в даному поліпептиді або білку має місце обмежене число згинів і що, коли буде вирішена проблема критичного числа згинів, прогнозування структури стане набагато точнішим. Додаткові методи прогнозування вторинної структури включають "нанизування" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "аналіз профілю" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358) та "еволюційний зв'язок" (дивись Holm, 1999, supra; і Brenner, 1997, supra). В певних варіантах здійснення передбачаються амінокислотні заміщення, які: (1) зменшують чутливість до протеолізу, (2) зменшують чутливість до окислення, (3) змінюють афінність зв'язування для формування білкових комплексів, (4) змінюють афінності зв'язування ліганду або антигену і (5) надають або модифікують інші фізико-хімічні або функціональні властивості таким поліпептидам, такі як підтримання структури молекулярного каркасу на ділянці заміщення, наприклад у вигляді листкової або спіральної конформації; підтримання або зміна заряду або гідрофобності молекули в цільовому місці; або підтримання або зміна об'ємності бічного ланцюга. Наприклад, одне або кілька амінокислотних заміщень (в певних варіантах здійснення консервативних амінокислотних заміщень) можуть бути внесені в природну послідовність. Заміни можна вносити в ту частину антитіла, яка лежить ззовні домену (доменів), що формують міжмолекулярні контакти. В таких варіантах здійснення можуть використовуватись консервативні амінокислотні заміщення, які суттєво не змінюють структурні характеристики материнської послідовності (наприклад, одне або більше амінокислотних заміщень, які не порушують вторинну структуру, що характеризує материнський або нативний антигензв'язуючий білок). Приклади відомих в цій галузі поліпептидних вторинних і третинних структур є описаними в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; та Thornton et al., 1991, Nature 354:105. Додаткові варіанти включають цистеїнові варіанти, в яких один або більше цистеїнових залишків в материнській або нативній амінокислотній послідовності видаляється або заміщується іншою амінокислотою (наприклад, серином). Цистеїнові варіанти використовуються, між іншим, коли необхідно здійснити рефолдинг антитіл (наприклад) в біологічно активну конформацію. Цистеїнові варіанти можуть мати менше цистеїнових залишків ніж нативний білок і типово становлять парне число, щоб мінімізувати взаємодії внаслідок непарної кількості цистеїнів. Описані варіабельна ділянка важкого і легкого ланцюгів і ділянки CDR можуть використовуватись для одержання антигензв'язуючих білків, які містять ділянку зв'язування антигену, що може специфічно зв'язуватись з поліпептидом IL-23. "Ділянка зв'язування антигену" означає білок або частину білка, яка специфічно зв'язує заданий антиген, така як ділянка, що містить амінокислотні залишки, які взаємодіють з антигеном і надають антигензв'язуючому білку його специфічність і афінність до цільового антигену. Ділянка зв'язування антигену може включати одну або більше ділянок CDR, а певні ділянки зв'язування антигену можуть включати також одну або більше "каркасних" ділянок. Наприклад, одну або більше ділянок CDR, наведених в ТАБЛИЦІ 3, можна ввести в молекулу (наприклад, поліпептид) ковалентно або не ковалентно для досягнення імуноадгезії. Імуноадгезія може забезпечити включення ділянки (ділянок) CDR як частини більшого поліпептидного ланцюга, ковалентне з'єднання ділянки (ділянок) CDR з іншим поліпептидним ланцюгом або не ковалентне включення ділянки (ділянок) CDR. Ділянка (ділянки) CDR дають можливість за рахунок іміноадгезії специфічно зв'язуватись з конкретним антигеном, що становить інтерес (наприклад, поліпептидом IL-23). Інші антигензв'язуючі білки включають міметики (наприклад, "пептидні міметики" або "пептидоміметики") на основі описаних тут варіабельних ділянок і ділянок CDR. Ці аналоги можуть бути пептидами, не пептидами або комбінаціями пептидних і не пептидних ділянок. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger, 1985, TINS p. 392; та Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229. Пептидні міметики, що є структурно подібними до терапевтично використовуваних пептидів, можуть застосовуватись для забезпечення подібного 25 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 терапевтичного або профілактичного ефекту. Такі сполуки часто розробляються за допомогою комп'ютеризованого молекулярного моделювання. Загалом, пептидоміметики є білками, що структурно подібні до антигензв'язуючого білка, який демонструє бажану біологічну активність, таку як здатність зв'язувати IL-23, але пептидоміметики мають один або більше пептидних зв'язків, необов'язково заміщеними зв'язком, вибраним з, наприклад: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH-CH-(cis і trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- і -CH2SO-, методами, добре відомими в цій галузі. Систематичне заміщення однієї або більше амінокислот консенсусної послідовності Dамінокислотою того ж типу (наприклад, D-лізин замість L-лізину) може використовуватись в певних варіантах здійснення для одержання більш стабільних білків. До того ж, методами, відомими в цій галузі, можуть бути одержані конформаційно напружені пептиди, які містять консенсусну послідовність або суттєво ідентичну варіацію консенсусної послідовності (Rizo and Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387), наприклад шляхом додавання внутрішніх цистеїнових залишків, здатних утворювати внутрішньомолекулярні дисульфідні містки, які циклізують такий пептид. Пропонуються також похідні описаних тут антигензв'язуючих білків. Дериватизовані антигензв'язуючі білки можуть містити будь-яку молекулу або субстанцію, яка надає бажаної властивості антигензв'язуючому білку або фрагменту, такої як збільшений період напіввиведення в конкретному застосуванні. Дериватизований антигензв'язуючий білок може містити, наприклад, частку (чи мітку), що піддається виявленню (наприклад, радіоактивну, колориметричну, антигенну або ферментну молекулу, гранулу, що піддається виявленню (таку як магнітна або електрощільна (наприклад, золота) гранула), або молекулу, яка зв'язується з іншою молекулою (наприклад, біотину або стрептавідину)), терапевтичну або діагностичну частку (наприклад, радіоактивну, цитотоксичну або фармацевтично активну частку), або молекулу, яка підвищує придатність антигензв'язуючого білка для конкретного застосування (наприклад, введення суб'єкту, такому як людина, або для іншого застосування in vivo або in vitro). Приклади молекул, які можуть використовуватись для дериватизації антигензв'язуючого білка, включають альбумін (наприклад, людський сироватковий альбумін) і поліетилен гліколь (ПЕГ). Зв'язані з альбуміном і пегильовані похідні антигензв'язуючих білків можна одержувати методами, добре відомими в цій галузі. В одному варіанті здійснення антигензв'язуючий білок кон'югують або в інший спосіб зв'язують з транстиретином (TTR) або варіантом TTR. TTR або варіант TTR можна хімічно модифікувати, наприклад сполукою, вибраною з групи, яка складається з декстрану, полі(n-вініл піролідону), поліетилен гліколю, гомополімерів пропілен гліколю, сополімерів пропілен оксиду/етилен оксиду, поліоксиетильованих поліолів і полівінілових спиртів. Інші похідні включають утворені за рахунок ковалентного зв'язку або агрегації кон'югати антигензв'язуючих білків, що зв'язують IL-23, з іншими білками або поліпептидами, такі як одержувані експресією рекомбінантні злиті білки, що містять гетерологічні поліпептиди, злиті з N-кінцем або з C-кінцем антигензв'язуючого білка, який зв'язує IL-23. Наприклад, кон'югований пептид може бути гетерологічним сигнальним (чи лідерним) поліпептидом, наприклад лідерним поліпептидом альфа-фактору дріжджів, або пептидом, таким як епітопна мітка. Злиті білки, що містять антигензв'язуючий білок, який зв'язує IL-23, можуть включати пептиди, додані з метою полегшення очистки або ідентифікації антигензв'язуючого білка, який зв'язує IL-23 (наприклад, полі-His). Антигензв'язуючий білок, який зв'язує IL-23, може зв'язуватись також з FLAG пептидом, як описано у Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6: 1204; і в патенті США No. 5011912. FLAG пептид є високоантигенним і надає епітоп, оборотно зв'язаний специфічним моноклональним антитілом (mAb), що сприяє швидкому аналізу і легкій очистці експресованого рекомбінантного білка. Реагенти, потрібні для одержання злитих білків, в яких FLAG пептид є злитим з даним поліпептидом, випускаються промисловістю (Sigma, St. Louis, MO). Олігомери, що містять один або більше антигензв'язуючих білків, які зв'язують IL-23, можуть використовуватись в якості антагоністів IL-23. Олігомери можуть бути у формі ковалентно зв'язаних і нековалентно зв'язаних димерів, тримерів або вищих олігомерів. Олігомери, що містять два або більше антигензв'язуючих білків, які зв'язують IL-23, розглядаються для використання, причому одним прикладом є гомодимер. Інші олігомери включають гетеродимери, гомодержери, гетеродержери, гомотетрамери, гетеротетрамери и т.д. Включеними є також олігомери, що містять кілька IL-23–зв'язуючих білків, зв'язаних за рахунок ковалентних або нековалентних взаємодій між пептидними частками, злитими з антигензв'язуючими білками, які зв'язують IL-23. Такі пептиди можуть бути пептидними лінкерами (спейсерами) або пептидами, що мають властивість сприяти олігомеризації. Серед придатних пептидних лінкерів є ті, що описані в патентах США №№ 4,751,180 і 4,935,233. Серед пептидів, які можуть сприяти олігомеризації приєднаних до них антигензв'язуючих білків, які 26 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язують IL-23, лейцинові застібки-блискавки і певні поліпептиди, утворені з антитіл. Приклади доменів лейцинової застібки-блискавки, придатних для одержання розчинних олігомерних білків, є описаними в опублікованій Міжнародній патентній заявці WIPO № WO 94/10308; Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344: 191; і Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267-278. Згідно з одним підходом рекомбінантні злиті білки, що містять фрагмент або похідне антигензв'язуючого білка, який зв'язує IL-23, злиті з пептидом лейцинової застібки-блискавки, експресуються у відповідних клітинах-хазяїнах, і розчинні олігомерні фрагменти або похідні антигензв'язуючого білка, який зв'язує IL-23, що утворюються, виділяють з культурального супернатанта. Такі олігомери можуть містити від двох до чотирьох антигензв'язуючих білків, які зв'язують IL-23. Частки антигензв'язуючих білків, які зв'язують IL-23, цього олігомеру можуть бути в будьякій формі, описаній вище, наприклад у вигляді варіантів або фрагментів. Переважно, олігомери містять антигензв'язуючі білки, що зв'язують IL-23, які мають IL-23-зв'язуючу активність. Олігомери можна одержувати, використовуючи поліпептиди, утворені з імуноглобулінів. Приготування злитих білків, що містять певні гетерологічні поліпептиди, злиті з різними частинами утворених з антитіла поліпептидів (включаючи Fc домен), є описаним, наприклад, у Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535; Byrn et al., 1990, Nature 344: 677; і Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11. Також включеними є димери, що містять два злитих білка, утворених при злитті антигензв'язуючого білка, який зв'язує IL-23, з Fc ділянкою антитіла. Такий димер можна одержати, наприклад, шляхом введення гену, кодуючого злитий білок, у відповідний вектор експресії, експресії злитих генів в клітинах-хазяїнах, трансформованих рекомбінантним вектором експресії, і забезпечення складання злитого білка з утворенням дуже подібних до антитіла молекул, після чого між Fc фрагментами утворюються міжланцюгові дисульфідні зв'язки, даючи димер. Такі Fc поліпептиди включають нативні мутеїнові форми поліпептидів, утворених з Fc ділянки антитіла. Також включеними є усічені форми таких поліпептидів, що містять шарнірну ділянку, яка сприяє димеризації. Перевага злитих білків, що містять Fc фрагменти (і утворені з них олігомери), полягає в тому, що вони легко піддаються очистці за допомогою афінної хроматографії на колонках з Білком А і Білком G. Одним підходящим Fc поліпептидом, описаним в опублікованій Міжнародній патентній заявці WIPO № WO 93/10151 і в патентах США №№ 5,426,048 і 5,262,522, є одноланцюговий поліпептид, який простягається від N-термінальної шарнірної ділянки до нативного C-кінця Fc ділянки людського IgG1 антитіла. Другим придатним Fc поліпептидом є Fc мутеїн, описаний в патенті США № 5,457,035 і в статті Baum et al., 1994, EMBO J. 13: 3992-4001. Амінокислотна послідовність цього мутеїну є ідентичною амінокислотній послідовності нативної Fc послідовності, представленої в опублікованій Міжнародній патентній заявці WIPO № WO 93/10151, за виключенням того, що амінокислоту 19 змінено з Leu на Ala, амінокислоту 20 змінено з Leu на Glu і амінокислоту 22 змінено з Gly на Ala. Мутеїн демонструє знижену афінність до Fc рецепторів. Глікозилювання Антигензв'язуючий білок може мати паттерн глікозилювання, відмінний або змінений у порівнянні з тим, що спостерігається в нативному виді. Як відомо в цій галузі, паттерни глікозилювання можуть залежати як від послідовності білка (наприклад, присутності або відсутності конкретних амінокислотних залишків, що піддаються глікозилюванню; дивись далі), так і від клітини-хазяїна або організму, в яких цей білок продукується. Далі розглядаються конкретні системи експресії. Глікозилювання поліпептидів типово є або N-зв'язаним, або O-зв'язаним. N-зв'язане глікозилювання стосується приєднання вуглеводневої частини до бічного ланцюга аспарагінового залишку. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де Х означає будь-яку амінокислоту, за виключенням проліну, є послідовностями розпізнавання для ферментативного приєднання вуглеводневого фрагмента до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, присутність будь-якої з цих трипептидних послідовностей в поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. О-зв'язане глікозилювання стосується приєднання одного з цукрів N-ацетилгалактозаміну, галактози або ксилози до гідроксиламінокислоти, найчастіше серину або треоніну, хоча можуть використовуватись також 5-гідроксипролін або 5гідроксилізин. Додавання сайтів глікозилювання до антигензв'язуючого білка звичайно здійснюється шляхом зміни амінокислотної послідовності у такий спосіб, щоб вона містила одну або більше вищеописаних трипептидних послідовностей (для N-зв'язаних сайтів глікозилювання). Таку зміну можна здійснити також шляхом додавання до вихідної послідовності або заміщення одного або більше залишків серину або треоніну (для O-зв'язаних сайтів глікозилювання). Для 27 UA 113609 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 простоти амінокислотну послідовність антигензв'язуючого білка можна змінювати шляхом перемін на рівні ДНК, зокрема шляхом мутації ДНК, кодуючої цільовий поліпептид, в попередньо вибраних основах, так щоб утворювались кодони, які будуть транслюватись в бажані амінокислоти. Іншим засобом збільшення числа вуглеводневих фрагментів на антигензв'язуючому білку є хімічне або ферментативне зшивання глікозидів з цим білком. Ця методика має ту перевагу, що вона не вимагає продукції білка в клітині-хазяїні, яка має здатність до N- і O-зв'язаного глікозилювання. В залежності від використовуваного способу зшивання цукор (цукри) може (можуть) приєднуватись до (a) аргініну і гістидину, (б) вільних карбоксильних груп, (в) вільних сульфгідрильних груп, таких як сульфгідрильні групи цистеїну, (г) вільних гідроксильних груп, таких як гідроксильні групи серину, треоніну або гідроксипроліну, (д) ароматичних залишків, таких як ароматичні залишки фенілаланіну, тирозину або триптофану, або (е) амідних груп глютаміну. Ці методи є описаними в публікації РСТ № WO 87/05330 і в статті Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., pp. 259-306. Видалення вуглеводневих часток, присутніх на вихідному антигензв'язуючому білку, можна здійснити хімічними або ферментативними методами. Хімічне деглікозилювання вимагає піддавання цього білка дії трифторметансульфонової кислоти або її еквівалента. Така обробка призводить до відщеплення більшості або всіх цукрів, за виключенням зв'язуючого цукру (Nацетилглюкозаміну або N-ацетилгалактозаміну), при цьому поліпептид залишається інтактним. Хімічне деглікозилювання є описаним в Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 і Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118: 131. Ферментативне відщеплення вуглеводневих фрагментів від поліпептидів можна здійснити за допомогою широкого кола ендо- і екзоглікозидаз, як описано в Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350. Глікозилювання на потенційних сайтах глікозилювання можна попередити, використовуючи сполуку тунікаміцин, як описано Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 3105. Тунікаміцин блокує утворення зв'язків білокN-глікозид. Відповідно, аспекти цього винаходу включають варіанти глікозилювання антигензв'язуючих білків, в яких число та/або тип сайту (сайтів) глікозилювання був змінений порівняно з амінокислотними послідовностями материнського поліпептиду. В певних варіантах здійснення варіанти антигензв'язуючого білка містять більшу або меншу кількість N-зв'язаних сайтів глікозилювання, ніж материнський поліпептид. Заміщення, які виключають або змінюють цю послідовність, будуть перешкоджати додаванню N-зв'язаного вуглеводневого ланцюга, наявного в материнському поліпептиді. Наприклад, ступінь глікозилювання можна зменшити шляхом делеції Asn або заміщенням Asn на іншу амінокислоту. Як правило, антитіла мають Nзв'язаний сайт глікозилювання на Fc ділянці. Мітки і ефекторні групи Антигензв'язуючі білки можуть містити одну або більше міток. Термін "мітка" або "група мічення" стосується будь-якої мітки, що піддається виявленню. Загалом, мітки відносять до різних класів в залежності від аналізу, який застосовується для їх виявлення: а) ізотопні мітки, які можуть бути радіоактивними або важкими ізотопами; б) магнітні мітки (наприклад, магнітні частки); в) частки, активні у відношенні окислення-відновлення; г) оптичні барвники; ферментативні групи (наприклад, пероксидаза хрону, β-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза; д) біотинильовані групи; і е) попередньо визначені поліпептидні епітопи, які розпізнає вторинний репортер (наприклад, послідовності лейцинової застібки-блискавки, сайти зв'язування вторинних антитіл, метал-зв'язуючі домени, епітопні мітки і т.д.). В певних варіантах здійснення мітка зв'язується з антигензв'язуючим білком через спейсерні плечі різної довжини для зменшення можливої просторової невідповідності. В цій галузі відомі різні методи мічення білків. Приклади придатних для мічення груп включають, не обмежуючись ними, наступне: 3 14 15 35 90 99 111 125 131 радіоізотопи або радіонукліди (наприклад, H, C, N, S, Y, Tc, In, I, I), флуоресцентні групи (наприклад, FITC, родамін, сполуки лантаноїдів з фосфором), ферментні групи (наприклад, пероксидаза хрону, β-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза), хемілюмінесцентні групи, біотинільні групи або попередньо визначені поліпептидні епітопи, які розпізнаються вторинним репортером (наприклад, послідовності лейцинової застібкиблискавки, сайти зв'язування вторинних антитіл, метал-зв'язуючі домени, епітопні мітки). В певних варіантах здійснення мітка зв'язується з антигензв'язуючим білком через спейсерні плечі різної довжини для зменшення можливої просторової невідповідності. В цій галузі відомі різні методи мічення білків і можуть застосовуватись, якщо їх вважають доцільними. Термін "ефекторна група" означає будь-яку групу, зшиту з антигензв'язуючим білком, яка поводить себе як цитотоксичний агент. Прикладами придатних ефекторних груп є радіоізотопи 3 14 15 35 90 99 111 125 131 або радіонукліди (наприклад, H, C, N, S, Y, Tc, In, I, I). Інші придатні групи 28