Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs

Реферат: Винахід стосується тривалетної імуногенної композиції та способу її одержання, що містить розчинну частину цільноклітинного препарату Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); антиген протеїну ORF2 цирковірусу свиней типу 2 (PCV2) та антиген вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS), де розчинна частина препарату M.hyo містить M.hyoспецифічні розчинні антигени протеїну та є відокремленою від нерозчинного клітинного матеріалу та вільною як від (i) IgG, так і (ii) імунокомплексів, що складаються з антигену, приєднаного до імуноглобуліну. UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь винаходу Даний винахід циркові русу свиней, Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae або M.hyo), та вірусу (PRRS). Більш конкретно, винахід стосується тривалентної імуногенної композиції, що містить розчинну частину цільноклітинної лікарської форми M.hyo, антиген PCV2 та антиген вірусу PRRS, та її застосування у вакцині для захисту свиней щонайменше від ензоотичної пневмонії та мультисистемного синдрому виснаження після відбирання (PMWS). Передумови створення винаходу Ензоотична пневмонія у свиней, яку також називають мікоплазмова пневмонія, викликається M.hyo. Захворювання є хронічним, несмертельним захворюванням, що уражує свиней у будьякому віці. Інфіковані свині проявляються тільки незначні симптоми кашлю та лихоманки, проте захворювання має значний економічний вплив внаслідок зниження ефективності харчування та зменшення приросту маси тіла. Ензоотична пневмонія переноситься від свині до свині через носові ходи організмами, що переносяться повітрям, які виділяються з легень уражених свиней. За первинним інфікуванням M.hyo може слідувати вторинне інфікування іншими видами мікоплазм (Mycoplasma hyorhinis та Mycoplasma flocculare), а також іншими бактеріальними патогенами. M.hyo є маленьким прокаріотичним мікроорганізмом, здатним до вільного існування, хоча його часто знаходять у асоціації з еукаріотичними клітинами, внаслідок того, що він має абсолютні вимоги для екзогенних стеринів та жирних кислот. Ці вимоги як правило викликають необхідність росту у середовищі, що містить сироватку. M.hyo зв'язується клітинною мембраною, а не клітинною стінкою. Фізична асоціація мікоплазм з поверхнею клітини хазяїна є основою розвитку та присутності ензоотичної пневмонії. M.hyo уражує дихальні шляхи свиней, колонізуючи трахею, бронхи та бронхіоли. Мікоплазма продукує статичний фактор війок, який викликає ушкодження війчастого епітелію дихальних шляхів та зупинку дихання. З часом, війки дегенерують, що робить свиней схильними до інфікування вторинними патогенами. Характерні ураження від пурпурних до сірих ділянок згущення спостерігаються у інфікованих тварин. Дослідження забитих тварин виявило ураження у 30-80 % свиней. Результати з 37 стад у 13 штатах вказали на те, що 99 % стад мали свиней з пневмонічними ураженнями, типовими для ензоотичної пневмонії. Тому, існує значна потреба у ефективних превентивних та лікувальних засобах. Антибіотики, такі як тіамулін, триметоприм, тетрацикліни та лінкоміцин мають деякі переваги, проте є дорогими та потребують пролонгованого застосування. Окрім цього, антибіотики не усувають поширення або повторне інфікування M.hyo. Запобігання шляхом підтримування стад вільних від патогенів інколи є можливим, проте часто трапляється повторна поява M.hyo. Внаслідок серйозних економічних наслідків пневмонії свиней, розробляються вакцини проти M.hyo. Вакцини, які включають композиції організмів мікоплазм, вирощені у середовищі, що містить сироватку, були представлені на ринку, проте зростають занепокоєння стосовно зворотних ефектів, викликаних компонентами сироватки (такими як імунокомплекси або не імуногенні специфічні протеїни), що присутні в матеріалі для імунізації. Інші спроби забезпечити вакцини M. hyo були успішними, проте захворювання залишається широко розповсюдженим. M.hyo та цирковірус свиней типу 2 (PCV2) є двома найбільш переважними патогенами з якими стикаються у індустрії свинарства. Свиня, інфікована PCV2, проявляє синдром, який зазвичай називають мультисистемним синдромом виснаження після відбирання (PMWS). PMWS клінічно характеризується виснаженням, блідістю шкіри, кволістю, дихальною недостатністю, діареєю та жовтухою. Окрім PMWS, PCV2 пов'язана з кількома іншими інфекціями, включаючи хибний сказ, репродуктивний та респіраторний синдром свиней (PRRS), хвороба Гласера, стрептококовий менінгіт, сальмонельоз, колібактеріоз після відбирання, дієтичний гепатоз та гнійна бронхопневмонія. M.hyo пов'язана з ензоотичною пневмонією та вважається одним з головних кофакторів у розвитку захворювання, що супроводжує цирковірус свиней (PCVAD). Репродуктивний та респіраторний синдром свиней (PRRS) викликається артерівірусом, що має надзвичайну афінність до макрофагів, особливо, які знаходяться у легенях (альвеолярні макрофаги). Ці макрофаги ковтають та видаляють бактерії та віруси, що потрапили до організму, проте не у випадку вірусу PRRS (PRRSV). У випадку вірусу PRRS, він розмножується всередині макрофагу, утворюючи ще більшу кількість вірусу та вбиває макрофаги. Коли PRRSV потрапляє у стадо, він залишається присутнім та активним нескінченно. До 40 % макрофагів знищуються, що дозволяє бактеріям та іншим вірусам проліферувати та шкодити. Типовим прикладом цього є помітне погіршення симптомів ензоотичної пневмонії у більш 1 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дорослих/старих свиней, при інфікуванні вірусом PRRS. Більше ніж половина PRRS-негативних свиней віку відбирання заражуються перед потраплянням на ринок. Тому потребою є комбінована вакцина PCV2/M.hyo проти як PCV2, так і мікоплазм у свиней. Бажано, ця полівалентна вакцина є сумісною з іншими антигенами свиней, такими як антиген вірусу PRRS. Дуже бажано одержати комбіновану вакцину PCV2/M.hyo у одному флаконі готову до використання, що включає одну дозу. Резюме винаходу Даний винахід стосується тривалетної імуногенної композиції, яка включає розчинну частину цільноклітинного препарату Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); антиген цирковірусу свиней типу 2 (PCV2); та антиген вірусу репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRS), де розчинна частина композиції M.hyo по суті є вільною від як (i) IgG, так і (ii) імунокомплексів, що складаються з антигену, приєднаного до імуноглобуліну. У одному аспекті, розчинна частина цільноклітинного препарату M.hyo обробляли протеїном-A або протеїном-G перед додаванням до імуногенної композиції. У наступному аспекті, розчинна частина препарату M.hyo та антиген PCV2 знаходяться у формі готової до використання рідкої композиції. У одному варіанті втілення, антиген вірусу PRRS є генетично модифікованим живим вірусом. У іншому варіанті втілення, генетично модифікований живий вірус PRRS знаходиться у формі ліофілізованої композиції. У одному варіанті втілення, розчинна частина препарату M.hyo включає щонайменше один антиген протеїну M.hyo. У іншому варіанті втілення, розчинна частина препарату M.hyo включає два або більше антиген протеїну M.hyo. У одному варіанті втілення, антиген PCV2 знаходиться у формі цирковірусу гібридного типу1-типу 2, гібридний вірус включаючи інактивований рекомбінантний цирковірус свиней типу 1, що експресує ORF2 протеїн цирковірусу свиней типу 2. У іншому варіанті втілення, антиген PCV2 знаходиться у формі рекомбінантного протеїну ORF2. у іншому варіанті втілення, рекомбінантний протеїн ORF2 експресується бакуловірусним вектором. У деяких варіантах втілення, тривалентна композиція даного винаходу викликає захисну імунну відповідь проти M.hyo, PCV2 та вірусу PRRS. У іншим варіантах втілення, імуногенна композиція даного винаходу також включає щонайменше один додатковий антиген. У одному варіанті втілення, щонайменше один додатковий антиген захищає від мікроорганізму, що може викликати захворювання у свиней. У одному варіанті втілення, мікроорганізм включає бактерії, віруси або найпростіших. У іншому варіанті втілення, мікроорганізм вибирають з, проте не обмежуються наступними: парвовірус свиней (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, лептоспіри, Lawsonia intracellularis, вірус свинячого грипу (SIV), антиген Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, респіраторний коронавірус свиней, вірус епізоотичної діареї свиней (PED), ротавірус, вірус гепатиту (TTV), цитомегаловірус свиней, ентеровіруси свиней, вірус енцефаломіокардиту, патоген, що викликає хворобу Ауески, класична свиняча лихоманка (CSF) та патоген, що викликає трансмісивний гастроентерит свиней, або їх комбінації. У деяких варіантах втілення, композиція даного винаходу також включає ад'ювант. У одному варіанті втілення, ад'ювант вибирають з, проте не обмежуються наступними: ад'ювант олія у воді, полімерний та водний ад'ювант, ад'ювант вода у олії, ад'ювант гідроксид алюмінію, ад'ювант вітамін Е та їх комбінації. У іншому варіанті втілення, композиція даного винаходу також включає фармацевтично прийнятний носій. У певних варіантах втілення, композиція даного винаходу викликає захисну імунну відповідь проти M.hyo, PCV2 та вірусу PRRS при введенні однократної дози. Даний винахід також стосуєтьсяспособу імунізації свині проти M.hyo, PCV2 та вірусу PRRS. Цей спосіб включає введення свині тривалентної імуногенної композиції, яка містить розчинну частину цільноклітинного препарату Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); a антиген цирковірусу свиней типу 2 (PCV2); та антигену вірусу PRRS, де розчинна частина препарату M.hyo по суті є вільною від як (i) IgG, так і (ii) імунокомплексів, що складаються з антигену, приєднаного до імуноглобуліну. У одному варіанті втілення способу даного винаходу, тривалентну композицію вводять внутрішньом'язово, інтрадермально, трансдермально або підшкірно. У іншому варіанті втілення способу даного винаходу, композицію вводять з однократним введенням. У іншому варіанті втілення способу даного винаходу, композицію вводять з двократним введенням. У наступному варіанті втілення, композицію вводять свиням, що мають материнські антитіла, проти щонайменше однoго M.hyo, PCV2, та вірусу PRRS. У наступному варіанті 2 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 втілення, композицію вводять свиням, що мають материнські антитіла, проти M.hyo, PCV2, та вірусу PRRS. У одному варіанті втілення, композицію вводять свиням віком 3 тижні або старшим. Даний винахід також стосується способу одержання імуногенної композиції даного винаходу. Цей спосіб включає i) культивування M.hyo у придатному середовищі протягом періоду в діапазоні 18-144 години; ii) потім інактивацію культури M.hyo; iii) збирання рідини інактивованої культури, де рідина інактивованої культури містить цільноклітинний препарат M.hyo, який включає як розчинну рідку фракцію, так і нерозчинний клітинний матеріал; iv) відділення розчинну рідкої фракції від нерозчинного клітинного матеріалу; v) суттєве видалення як IgG, так і імунокомплексів антиген/імуноглобулін з відділеної розчинної рідкої фракції з утворенням розчинної частини цільноклітинного препарату M.hyo; та vi) наступне об'єднання розчинної частини цільноклітинного препарату M.hyo з антигеном PCV2 та антигеном вірусу PRRS. У одному варіанті втілення, стадію vi) об'єднання готової до використання рідкої композиції, що містить як антиген PCV2, так і розчинну частину M.hyo з ліофілізованим антигеном вірусу PRRS. У одному варіанті втілення, набір даного винаходу включає перший флакон (або інший придатний сосуд), що містить композицію, яка включає як антиген PCV2, так і розчинну частину цільноклітинного препарату Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), де розчинна частина препарату M. hyo по суті є вільною від як (i) IgG, так і (ii) імунокомплексів антиген/імуноглобулін; та другий флакон, який містить антиген вірусу PRRS. У одному варіанті втілення, композиція у першій пляшці забезпечується як готова до використання рідка композиція. У наступному варіанті втілення, антигенний компонент вірусу PRRS набору знаходиться у формі ліофілізованої композиції. У іншому варіанті втілення, набір включає інструкцію з поясненнями щодо об'єднання вмісту першого та другого флаконів. У одному варіанті втілення, інструкція також включає пояснення щодо введення об'єднаного вмісту першого та другого флаконів свині. Короткий опис Фігур Фігура 1 є діаграмою, що показує ефективність моновалентних вакцин M.hyo, одержаних з антигенів M.hyo з різних випробувань (T02-T10 описані у Прикладі 3) проти плацебо (T01). Результати представлені як % LS значень уражень легень. Фігура 2 є діаграмою, що показує результати ефективності антигену PCV2 (ELISA PCV2 антигену) вакцин M.hyo у комбінації з вбитим гібридним вірусом PCV тип1-типу2. Гібридний вірус включали у композиції у початковій концентрації 1,6≤ RP. Стан кожного зразка виражали як відносну ефективність (RP). Фігура 3 є діаграмою, що показує результати віремії PCV2 (кількісна ПЛР PCV2), що спостерігали на композиціях вакцин PCV/M.hyo, що використовують різні платформи ад'ювантів. Фігура 4 є діаграмою, що показує серологічні результати ELISA антитіла PCV2 (S/P), що спостерігали на композиціях вакцин PCV/M.hyo, що використовують різні платформи ад'ювантів, у 1-й, 20-й та 42-й дні стимуляції. Фігура 5 є діаграмою, що показує фекальні виділення PCV2, одержані у групах обробки T02T04, описані у Прикладі 7, проти плацебо (T01). Результати виражені як PCV2 ДНК копії/мл. Фігура 6 є діаграмою, що показує назальні виділення PCV2, одержані у групах обробки T02T04, описані у Прикладі 7, проти плацебо (T01). Результати виражені як PCV2 ДНК копії/мл. Фігури 7 (A та B) представлені графіками, що показують результати тесту на інтерферонгама (IFN-γ), що вимірює PCV2-специфічну клітино-опосередковану (КОІ) імунну відповідь. Результати після-вакцинації/перед-викликанням представлені на Фігурі 7A, та результати після6 вакцинації/після-викликання представлені на Фігурі 7B.стимулювання 5×10 клітин вважалось значним. Фігура 8 показує ефективність M.hyo експериментальних композицій вакцин PCV2/M.hyo у SP-олія. Показники легень для композицій M.hyo з обробками T02-T08 проти плацебо (T01) зображені графічно на Фігурі 8A. Таблиця на Фігурі 8B показує контраст обробок T02-T08 у порівнянні з плацебо. Фігура 9 є блок-схемою, яка показує один варіант втілення процесу виробництва, використаного для одержання PCV2-сумісного M.hyo антигену, обробленого Протеїном-A. Фігура 10 представлена таблицею, що показує оцінку ад'юванту для віруліцидної активності проти вірусу PRRS. Фігура 11 є діаграмою, що показує результати віремії PCV2 (PCV2 кількісна ПЛР), що спостерігали для експериментальних композицій вакцини PCV2/M.hyo/PRRS. Фігура 12 є діаграмою, що показує результати PCV2 ELISA для експериментальних композицій вакцини PCV2/M.hyo/PRRS у дні дослідження -1,7,13, 20,28, 35 та 42 (зараження здійснювали на 21 добу). 3 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 13 є діаграмою, що показує фекальні виділення PCV2, одержані для груп обробки T02 та T03 (експериментальних композицій вакцини PCV2/M. hyo/PRRS), описані у Прикладі 14, проти плацебо (T01). Короткий опис послідовностей SEQ ID NO: 1 є одним варіантом втілення нуклеотидної послідовності, що кодує p46 штаму P-5722 M. hyo; SEQ ID NO: 2 є одним варіантом втілення амінокислотної послідовності, що відповідає p46 штаму P-5722 M.hyo; SEQ ID NO: 3 є одним варіантом втілення нуклеотидної послідовності, що кодує p97 штаму P-5722 M. hyo; SEQ ID NO: 4 є одним варіантом втілення амінокислотної послідовності, що відповідає p97 штаму P-5722 M.hyo; SEQ ID NO: 5 є одним варіантом втілення геномної послідовності, що кодує гібридний вірус PCV1-2; SEQ ID NO: 6 є одним варіантом втілення нуклеотидної послідовності, що відповідає ORF2 цирковірусу свиней; SEQ ID NO: 7 є одним варіантом втілення амінокислотної послідовності, що відповідає поліпептиду ORF2 цирковірусу свиней; SEQ ID NO: 8 є одним варіантом втілення геномної послідовності, що кодує гібридний вірус PCV1-2; SEQ ID NO: 9 є одним варіантом втілення нуклеотидної послідовності, що відповідає ORF2 цирковірусу свиней; SEQ ID NO: 10 є одним варіантом втілення амінокислотної послідовності, що відповідає поліпептиду ORF2 цирковірусу свиней; SEQ ID NO: 11 є одним варіантом втілення амінокислотної послідовності, що відповідає поліпептиду ORF2 цирковірусу свиней; SEQ ID NO: 12 є одним варіантом втілення нуклеотидної послідовності, що кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13 є одним варіантом втілення амінокислотної послідовності, що відповідає поліпептиду ORF2 цирковірусу свиней; SEQ ID NO: 14 є одним варіантом втілення нуклеотидної послідовності, що кодує амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15 є одним варіантом втілення амінокислотної послідовності, що відповідає поліпептиду ORF2 цирковірусу свиней; SEQ ID NO: 16 є одним варіантом втілення геномної послідовності невірулентної форми ізоляту північноамериканського вірусу PRRS, позначеного як P129; та SEQ ID NO: 17 є одним варіантом втілення нуклеотидної послідовності, що відповідає ORF2ORF5 ізоляту вірусу PRRS, позначеного як ISU-55. SEQ ID NO: 18 є одним варіантом втілення нуклеотидної послідовності, що відповідає ORF6 та ORF7 ізоляту вірусу PRRS, позначеного як ISU-55. Детальний опис винаходу Даний винахід стосується полівалентної імуногенної композиції, що містить розчинну частину цільноклітинного препарату Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo); та антиген цирковірусу свиней типу 2 (PCV2), де розчинна частина препарату M.hyo по суті є вільною від як (i) IgG, так і (ii) імунокомплексів, що складаються з антигену, приєднаного до імуноглобуліну. У одному варіанті втілення, композиція викликає захисну імунну відповідь у свині проти як PCV2, так і M.hyo. Заявники неочікувано виявили, що нерозчинна фракція цільноклітинного препарату M.hyo є неімуногенною. Навпаки, розчинний препарат M. hyo, вільний від IgG, є імуногенним та може бути ефективно комбінований з антигенами від інших патогенів, таких як PCV2, без аналітичної або імунологічної інтерференції між антигенами. Це робить розчинний препарат M.hyo ефективною платформою для полівалентних вакцин цього винаходу, включаючи готові до використання препарати у одному флаконі. Заявники також неочікувано виявили, що видалення імуноглобуліну та нерозчинних останків клітин з препарату M.hyo покращує безпечність імуногенної композиції. У описі та формулі використання одиничної форми включає також і множинну форму доки контекст чітко не вказує на інше. Наприклад, термін "антиген протеїну" включає множину антигенів протеїну, включаючи їх суміші. Як використано у даному документі, термін "містить" означає, що композиції та способи включають перелічені елементи, проте не виключає інші елементи. 4 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як визначено у даному документі, розчинна частина цільноклітинного препарату M.hyo стосується розчинної рідкої фракції цільноклітинного препарату M.hyo після відділення нерозчинного матеріалу та суттєвого видалення IgG та антиген-зв'язаних мінокомплексів. Розчинна частина M.hyo може альтернативно означати фракцію супернатанту, культуральний супернатант тощо. Вона включає розчинні протеїни, експресовані M. hyo (антиген протеїну M. hyos), відділені від або ізольовані від нерозчинних протеїнів, цілі бактерії, та інший нерозчинний клітинний матеріал M.hyo, за звичайними способами, такими як центрифугування, фільтрація або осадження. Окрім вмісту M. hyo-специфічних розчинних протеїнів, розчинна частина цільноклітинного препарату M.hyo також включає гетерологічні протеїни, такі як ті, що містяться у культуральному середовищі, використаному для ферментації M.hyo. Термін "антиген" стосується сполуки, композиції або імуногенного субстрату, що може стимулювати вироблення антитіл або T-клітинної відповіді, або обох у тварини, включаючи композиції що ін'єктують або абсорбуються твариною. Імунна відповідь може генеруватись на всю молекулу, або її частину (наприклад, епітоп або гаптен). Як визначено у даному документі, "імуногенна або імунологічна композиція", стосується композиції, що містить щонайменше один антиген, що викликає імунологічну відповідь у хазяїна клітинного та/або антитіло-опосередкованого походження на композицію або вакцину. Термін "імунна відповідь" як використано у даному документі, стосується відповіді, викликаної у тварини. Імунна відповідь може стосуватись клітинного імунітету (КОІ); гуморального імунітету або може включати обидва. Даний винахід також включає відповідь, обмежену частиною імунної системи. Зазвичай, "імунологічна відповідь" включає, проте не обмежується одним або більше наступними ефектами: вироблення або активація антитіл, B клітин, хелперів T клітин, супресорів T клітин та/або цитотоксичних T клітин та/або yd T клітин, спрямованих специфічно на антиген або антигени, включені у композицію або вакцину. Бажано, хазяїн буде проявляти терапевтичну або захисну імунологічну відповідь, так що резистентність до нової інфекції буде покращена та/або зменшена клінічна тяжкість хвороби. Такий захист буде продемонстровано зменшенням або відсутністю симптомів, що в нормі наявні у інфікованого хазяїна, швидкий час відновлення та/або понижений вірусний титр у інфікованого хазяїна. Як використано у даному документі, термін "імуногенність" означає знатність викликати імунну відповідь у тварини хазяїна проти антигену або антигенів. Ця імунна відповідь формує основу захисного імунітету, викликаного вакциною проти специфічного інфекційного організму. "Ад'ювант" як використано у даному документі, означає композицію, що складається з однієї або більше сполук, що посилюють імунну відповідь на антиген(и). Механізм дії ад'юванту повністю не відомий. Вважається, що деякі ад'юванти посилюють імунну відповідь шляхом повільного вивільнення антигену, у той час як інші ад'юванти є сильно імуногенними самі по собі та діють синергічно. Як використано у даному документі, термін "полівалентна" означає вакцину, що містить більше ніж один антиген, або одного виду (тобто, різні ізоляти Mycoplasma hyopneumoniae), різних видів (тобто, ізоляти як Pasteurella hemolytica, так і Pasteurella multocida), або вакцину, що містить антигени різного роду (наприклад, вакцина, що містить антигени Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus та Clostridium). Термін "свиня" або "порося" як використано у даному документі, означає тварину свинячого походження, у той час як "свиноматка" стосується свині жіночого роду репродуктивного віку. "Молода свиня" стосується свині жіночого роду, що ще не була вагітною. Як використано у даному документі, термін "вірулентний" означає ізолят, що зберігає здатність до інфікування тварини хазяїна. "Інактивована вакцина" означає композицію вакцини, що містить інфекційний організм або патоген, що більше не здатний до реплікації або росту. Патоген може бути бактеріального, вірусного, протозойного або грибкового походження. Інактивація може здійснюватись різноманітними способами, включаючи заморожування-відтаювання, хімічна обробка (наприклад, обробка тімерозалом або формаліном), обробка ультразвуком, опромінення, нагрівання або будь-який інший спосіб, що здатен запобігти реплікації або росту організму, при цьому підтримуючи його імуногенність. Термін "варіант" як використано у даному документі, стосується поліпептиду або послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, що має один або більше консервативних амінокислотних варіацій або інші другорядні модифікації, так що відповідний поліпептид має по суті еквівалентну функцію у порівнянні з диким типом поліпептиду. "Консервативна варіація" означає заміну амінокислотного залишку іншим біологічно подібним залишком, або заміну нуклеотиду у послідовності нуклеїнової кислоти, так що амінокислотний залишок, що кодується, не змінюється, або є іншим біологічно подібним 5 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 залишком. Приклади консервативних варіацій включають заміщення одного гідрофобного залишку, такого як ізолейцин, валін, лейцин або метіонін, на інший гідрофобний залишок, або заміщення одного полярного залишку, наприклад, заміщення аргініну на лізин, глутамінової кислоти на аспарагінову кислоту, або глутаміну на аспарагін, тощо. Термін "консервативна варіація" також включає застосування заміщеної амінокислоти замість не заміщеної вихідної амінокислоти, при умові, що антитіла, викликані проти заміщеного поліпептиду, також імунореагують з незаміщеним поліпептидом. Як використано у даному документі, терміни "фармацевтично прийнятний носій" та "фармацетивчно прийнятний наповнювач" є взаємозамінними та стосуються рідкого наповнювача, що містить антигени вакцини, що можна вводити хазяїну без побічних ефектів. Придатні відомі у галузі фармацевтично прийнятні носії включають, проте не обмежуються наступними: стерильна вода, сольовий розчин, глюкоза, декстроза або забуферені розчини. Носії можуть включати допоміжні агенти включаючи, проте не обмежуючись наступними: розбавники, стабілізатори (тобто, цукри та амінокислоти), консерванти, змочувачі, емульгатори, pH буферні агенти, добавки, що покращують в'язкість, барвники тощо. Як використано у даному документі, термін "композиція вакцини" включає щонайменше один антиген або імуноген у фармацетивчно прийнятному наповнювачі, придатному для викликання імунної відповіді у хазяїна. Композиції вакцини можуть бути введені у дозуваннях та за способами добре відомими фахівцям у галузі медицини або ветеринарії, приймаючи до уваги такі фактори, як вік, стать, маса, вид та стан тварини рецепієнта, та шлях введення. Шлях введення може бути крізьшкірний, введення у слизову (наприклад, оральне, назальне, анальне, вагінальне) або парентеральне (інтрадермальне, трансдермальне, внутрішньом'язове, підшкірне, внутрішньовенне або інтраперітонеальне). Композиції вакцини можуть бути введені окремо, або разом або послідовно з іншими обробками або терапіями. Форми введення можуть включати суспензії, сиропи або еліксири, та препарати для парентерального, підшкірного, інтрадермального, внутрішньом'язового або внутрішньовенного введення (наприклад, ін'єктивне введення), такі як стерильні суспензії або емульсії. Композиції вакцини можуть бути введені як спрей або підмішані до їжі та/або води або доставлені у суміші з придатним носієм, розчинником або ексціпієнтом, таким як стерильна вода, фізіологічний сольовий розчин, глюкоза, тощо. Композиції можуть містити допоміжні речовини, такі як змочувачі або емульгатори, pH буферні агенти, ад'юванти, гелеутворювачі або добавки, що покращують в'язкість, консерванти, ароматизатори, барвники, тощо, залежно від шляху введення та бажаного препарату. Стандартні фармацевтичні тексти, такі як "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1990 можуть прийматись до уваги при приготуванні придатних препаратів, уникаючи непотрібних експериментів. "Північноамериканський вірус PRRS" означає будь-який вірус PRRS з генетичними характеристиками, пов'язаними з ізолятом північноамериканського вірусу PRRS, таким як, проте не обмежуючись вірусом PRRS вперше ізольованим у США на початку 1990-х (дивитись, наприклад, Collins, J. E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126); ізолятом північноамериканського вірусу PRRS MN-1b (Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6:293296); штамом вірусу PRRS Quebec LAF-exp91 (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140:14051418); та ізолятом північноамериканського вірусу PRRS VR 2385 (Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801). Додаткові приклади штамів північноамериканського вірусу PRRS описані у даному документі. Генетичні характеристики стосуються геномної схожості нуклеотидної послідовності та схожості амінокислотної послідовності штамів північноамериканський вірусу PRRS. Штами китайського вірусу PRRS зазвичай мають приблизно 80-93 % схожості нуклеотидної послідовності з північноамериканськими штамами. "Європейський вірус PRRS" стосується будь-якого штаму вірусу PRRS з генетичними характеристиками, пов'язаними з вірусом PRRS вперше ізольованим у Європі приблизно у 1991 (дивитись, наприклад, Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13:121-130). "Європейський вірус PRRS" також інколи у галузі називають "вірусом Lelystad". Приклади штамів Європейського вірусу PRRS описані у даному документі. Генетично модифікований вірус є "атенуйованим", якщо він є менш вірулентним, ніж його не модифікований батьківський штам. Штам є "менш вірулентним", якщо він показує статистично значиме зменшення одного або більше параметрів, що визначають тяжкість хвороби. Такі параметри можуть включати рівень віремії, лихоманку, тяжкість респіраторного розладу, тяжкість репродуктивних симптомів або кількість або тяжкість уражень легень, тощо. "Інфекційний клон" є ізольованим або клонованим геномом агенту захворювання (наприклад, віруси), що може бути специфічно та навмисно модифікованим у лабораторії, та потім використаним для відновлення живого генетично модифікованого організму. Живий 6 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 генетично модифікований вірус, одержаний з інфекційного клону, може бути застосований у живій вірусній вакцині. Альтернативно, вакцини з інактивованим вірусом можуть бути одержані шляхом обробки живого вірусу, одержаного з інфекційного клону, інактивуючими агентами, такими як формалін або гідрофобні розчинники, кислоти, тощо., опроміненням ультрафіолетом або X-променями, нагріванням, тощо. Всі наявні на даний час комбіновані вакцини M.hyo та M.hyo одержані з вбитих цільноклітинних препаратів mycoplasma (бактерини). Навпаки, даний винахід застосовує розчинну частину цільноклітинного препарату Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) для комбінування з антигенами PCV2 та PRRS, де розчинна частина препарату M.hyo по суті є вільною від як (i) IgG, так і (ii) імунокомплексів, що складаються з антигену, приєднаного до імуноглобуліну. M.hyo має абсолютні вимоги до екзогенних стеринів та жирних кислот. Ці вимоги зазвичай є необхідними для росту M.hyo у середовищі, що містить сироватку, таку як свиняча сироватка. Відділення нерозчинного матеріалу від розчинної частини цільноклітинного препарату M.hyo (наприклад, центрифугуванням, фільтрацією або осадженням) не видаляє свинячий IgG або імунні комплекси. У одному варіанті втілення даного винаходу, розчинна частина M. hyo обробляється протеїном-A або протеїном-G для значного видалення IgG та імунних комплексів, що містяться у культуральному супернатанті. У цьому варіанті втілення, зрозуміло, що обробка протеїном A здійснюється після ферментації M.hyo. Вона у даному документі альтернативно називається даунстрім обробка протеїном A. У іншому варіанті втілення, може бути застосована апстрім обробка ростового середовища протеїном A (тобто, перед ферментацією M.hyo). Протеїн A зв'язується з Fc частиною IgG. Протеїн G зв'язується переважно з Fc частиною IgG, проте також може зв'язуватись з Fab ділянкою. Способи очистки/видалення загального IgG з неочищеної суміші протеїнів, такої культуральний супернатант тканини, сироватка та вільна рідина черевинної порожнини, відомі у галузі. У деяких варіантах втілення, розчинна частина препарату M. hyo включає щонайменше один антиген протеїну M.hyo. У іншим варіантах втілення, розчинна частина препарату M. hyo включає два або більше антигени протеїну M.hyos. У одному варіанті втілення, фракція супернатанту M.hyo включає один або більше наступних специфічних антигенних протеїнів M. hyo: протеїни M.hyo приблизно молекулярної маси 46 кД (p46), 64 кД (p64) та 97 кД (p97). У іншому варіанті втілення, фракція супернатанту включає щонайменше p46, p64 та p97 антигенні протеїни M.hyos. Протеїн M.hyo приблизно 64 кД (p64) альтернативно називається у даному документі p65 поверхневий антиген M.hyo, описаний Kim et al. [Infect. Immun. 58(8):2637-2643 (1990)], а також у патенті США № 5,788,962. Futo et al. описали клонування та характеристику поверхневого протеїну M.hyo з масою 46 кД, який може бути застосований у композиціях цього винаходу [J. Bact 177: 1915-1917 (1995)]. У одному варіанті втілення, M.hyo культуральний супернатант включає p46, чиї відповідні нуклеотидні та амінокислотні послідовності з штаму P-5722 показані у SEQ ID NO: 1 та 2, відповідно. Також вважається, що варіанти таких послідовностей p46 можуть бути застосовані у композиціях даного винаходу, як описано нижче. Zhang et al. описали та охарактеризували адгезин протеїн p97 з M. hyo [Infect. Immun. 63: 1013-1019, 1995]. Окрім цього, King et al. описали протеїн масою 124 кД, що називається Mhp1 з штаму P-5722 M. hyo, та представлені дані передбачають, що Mhp1 та p97 є однаковими протеїнами [Vaccine 15:25-35 (1997)]. Такі протеїни p97 можуть бути застосовані у композиціях цього винаходу. У одному варіанті втілення, культуральний супернатант M.hyo включає p97, чиї відповідні нуклеотидні та амінокислотні послідовності з штаму P-5722 показані у SEQ ID NO: 3 та 4, відповідно. Також вважається, що варіанти таких послідовностей можуть бути застосовані у композиціях даного винаходу, як описано нижче. M.hyo культуральний супернатант також може включати специфічні антигенні протеїни M. hyo такі як, проте не обмежуються протеїнами приблизно 41 кД (p41), 42 кД (p42), 89 кД (p89) та 65 кД (p65). Дивитись, Okada et al., 2000, J. Vet. Med. B 47:527-533 and Kim et al., 1990, Infect. Immun. 58(8):2637-2643. Окрім цього, M.hyo культуральний супернатант може містити специфічні антигенні протеїни M. hyo приблизно 102 кД (p102) та 216 кД (p216). Дивитись патенти США № 6,162,435 та 7,419,806 Minnion et al. Будь-який штам M.hyo може бути використаний як вихідний матеріал для одержання розчинної частини препарату композицій M.hyo даного винаходу. Прийнятні штами M. hyo можуть бути одержані з комерційних або академічних джерел, включаючи депозитарії, такі як Культуральна Колекція Американського Типу (ATCC) (Manassas, Va.) та Культуральна Колекція NRRL (Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Ill.). Тільки ATCC наводить шість наступних штамів M. hyo для продажі: M. hyo ATCC 25095, M. hyo ATCC 25617, 7 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 M. hyo ATCC 25934, M.hyo ATCC 27714, M. hyo ATCC 27715, та M. hyo ATCC 25934D. Бажаний штам M. hyo для застосування у варіантах втілення цього винаходу ідентифіковано як штам P5722-3, ATCC #55052, депонований 30.05.1990 у відповідності до правил доступності патентного відомства США. З огляду на широку розповсюдженість хвороби, штами також можуть бути одержані шляхом відновлення M.hyo з секретів легень або тканини свиней, інфікованих відомими штамами, що викликають атипічну пневмонію у свиней. Фахівець у галузі розуміє, що варіанти послідовностей M.hyo можуть бути застосовані у композиціях даного винаходу. Такі варіанти можуть різнитись десь на 10-20 % ідентичності послідовності та все ще зберігати антигенні характеристики, що роблять їх придатними для імуногенних композицій. Бажано, варіанти M.hyo мають щонайменше 80 %, бажано щонайменше 85 %, більш бажано щонайменше 90 %, ще більш бажано щонайменше 95 % ідентичності послідовності з повнодовжинною геномною послідовністю штаму дикого типу M.hyo. Антигенні характеристики імунологічної композиції можуть бути, наприклад, оцінені у експериментах зараження як наведено у Прикладах. Більш того, антигенна характеристика модифікованого антигену M.hyo ще зберігається, коли модифікований антиген надає щонайменше 70 %, бажано 80 %, більш бажано 90 % захисного імунітету, у порівнянні з протеїном дикого типу M.hyo. У одному варіанті втілення, розчинний p46 антиген M.hyo є включеним у композиціях винаходу у кінцевій концентрації від приблизно 1,5 мкг/мл до приблизно 10 мкг/мл, бажано від приблизно 2 мкг/мл до приблизно 6 мкг/мл. Вказано, що p46 є протеїном, використаним для тесту на активність M.hyo (дивитись секцію Приклади нижче). У іншому варіанті втілення, M. hyo антиген може бути включеним у композиціях у кінцевій концентрації від приблизно 5,5 % до приблизно 35 % супернатанту оброленої протеном-А культури M.hyo. Розчинний препарат M.hyo даного винаходу є як безпечним, так і ефективним проти M. hyo та є придатним для одноразового ввдення. Окрім цього, заявники неочікувано виявили, що розчинний препарат M. hyo може бути ефективно комбінований з антигенами інших патогенів, включаючи PCV2, без імунологічної інтерференції антигенів. Це робить розчинний препарат M.hyo ефективною платформою для полівалентних вакцин, включаючи комбіновану вакцину PCV2/M.hyo/PRRS цього винаходу. PCV2 та PRRS антигени можуть бути введені одночасно з композицією M.hyo (тобто, як три окремі одиночні вакцини), проте бажано розчинний препарат M.hyo об'єднують з антигеном PCV2 у готову до використання рідку композицію. Ця готова до використання рідка композиція може бути об'єднана з антигеном вірусу PRRS, так що всі три антигени можуть бути введені одночасно свині. У деяких варіантах втілення, антиген вірусу PRRS знаходиться у ліофілізованому стані, та рідка композиція PCV2/M.hyo може бути використана для регідратації антигену ліофілізованого вірусу PRRS, таким чином утворюючи тривалентну композицію. У одному варіанті втілення, імуногенні композиції PCV2/M. hyo/PRRS даного винаходу включають щонайменше один додатковий антиген. У одному варіанті втілення, щонайменше один додатковий антиген захищає від мікроорганізму, що може викликати захворювання у свиней. У деяких варіантах втілення, щонайменше один додатковий антиген захищає від бактерій, вірусів або найпростіших, що можуть викликати захворювання у свиней. Приклади таких мікроорганізмів включають, проте не обмежуються наступними: вірус репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (PRRSV), парвовірус свиней (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, лептоспіри, Lawsonia intracellularis, вірус свинячого грипу (SIV), антиген Escherichia coli, Brachyspira hyodysenteriae, респіраторний коронавірус свиней, вірус епізоотичної діареї свиней (PED), ротавірус, вірус гепатиту (TTV), цитомегаловірус свиней, ентеровіруси свиней, вірус енцефаломіокардиту, патоген, що викликає хворобу Ауески, класична свиняча лихоманка (CSF) та патоген, що викликає трансмісивний гастроентерит свиней, або їх комбінації. У одному варіанті втілення, компонент PCV2/M.hyo тривалетної вакцини даного винаходу забезпечується як готова до використання у одному флаконі рідка композиція. Така готова до використання композиція не потребують змішування окремих PCV2 та M. hyo моновалентних вакцин, таким чином не має ризику забруднення або додаткових робочих витрат, пов'язаних із змішуванням, та не має потреби у використанні суміші протягом декількох годин. Також, компонент PCV2/M.hyo у одному флаконі зменшує витрати та місце для зберігання у рефрижераторі на половину. 8 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах втілення, антигенний компонент PCV2 комбінованої вакцини PCV2/M. hyo/PRRS знаходиться у формі цирковірусу гібридного типу-1-типу 2. Гібридний вірус включає інактивований рекомбінантний цирковірус свиней типу 1, що експресує ORF2 протеїн цирковірусу свиней типу 2. Гібридні цирковіруси свиней та способи їх одеражання описані у WO 03/049703 A2, а також у патентах США 7,279,166 та 7,575,752, що включені у даний документ за допомогою посилань. У одному варіанті втілення, повнодовжинна послідовність ДНК геному гібридного вірусу PCV1-2 відповідає SEQ ID NO: 5 або її варіантам, як описано нижче. У іншому варіанті втілення, імуногенний ORF2 капсидний ген гібридного вірусу PCV1-2 відповідає SEQ ID NO: 6. У наступному варіанті втілення, амінокислотна послідовність імуногенного ORF2 протеїну, що експресується гібридним вірусом PCV1-2, відповідає SEQ ID NO: 7. У одному варіанті втілення, повнодовжинна послідовність ДНК геному гібридного вірусу PCV1-2 відповідає SEQ ID NO: 8. У одному варіанті втілення, імуногенний ORF2 капсидний ген гібридного вірусу PCV1-2 відповідає SEQ ID NO: 9. У наступному варіанті втілення, амінокислотна послідовність імуногенного ORF2 протеїну, що експресується гібридним вірусом PCV1-2 відповідає SEQ ID NO: 10. Однак, ДНК ORF2 PCV2 та протеїн гібридного вірусу PCV1-2 не обмежені вищеописаними послідовностями, з огляду на те, що ДНК ORF2 PCV2 та протеїн є високо консервативним доменом ізолятів PCV2. У деяких варіантах втілення, антигенний компонент PCV2 комбінованої вакцини M. hyo/PCV2/PRRS знаходиться у формі рекомбінантного протеїну ORF2. У одному варіанті втілення, рекомбінантний протеїн ORF2 експресується бакуловірусним вектором. Альтернативно, можуть бути використані інші відомі вектори експресії, такі як, проте не обмежуючись парапокс векторами. У одному варіанті втілення, рекомбінантний протеїн ORF2 PCV2 має послідовність SEQ ID NO: 11, що кодується SEQ ID NO: 12 (номер доступу у банку генів AF086834). У іншому варіанті втілення, рекомбінантний протеїн ORF2 має послідовність SEQ ID NO: 13, що кодується SEQ ID NO: 14. У іншому варіанті втілення, рекомбінантний протеїн ORF2 відповідає SEQ ID NO: 15. У іншому варіанті втілення, рекомбінантний протеїн PCV2 ORF2 відповідає SEQ ID NO: 7. У наступному варіанті втілення, рекомбінантний протеїн PCV2 ORF2 відповідає SEQ ID NO: 10. Однак, даний винахід не обмежено певною ДНК ORF2 та вищеописаними послідовностями протеїну. З огляду на те, що ДНК ORF2 PCV2 та протеїн є високо консервативним доменом ізолятів PCV2, будь-який ORF2 PCV2 має високу вирогідність бути ефективним як джерело ДНК ORF2 PCV2 та/або поліпептиду, використаних у гібридному вірусі PCV1-2 або у рекомбінантному протеїні PCV2. Прикладом придатного PCV2 ізоляту, з якого може походити ДНК ORF2 PCV2 та послідовності протеїну, є PCV2 ізолят номер 40895 (депонований у ATCC 07,12,2001 та має ATCC позначення патентного депозиту PTA-3914). Геномна (нуклеотидна) послідовність язоляту PCV2 номер 40895 є доступною під номером доступу у банку генів AF264042. Інші приклади придатних PCV2 ізолятів, з яких можуть походити ДНК ORF2 PCV2 та послідовності протеїну, включають, проте не обмежуються наступними: Imp.999, Imp.1010-Stoon, Imp.101148121, та Imp.1011-48285. Номери доступу у банку генів геномних послідовностей, що відповідають цим PCV2 ізолятам є AF055391, AF055392, AF055393 та AF055394, відповідно. У деяких формах, імуногенні частини протеїну ORF2 PCV2 використані як антигенний компонент у композиції. Наприклад, усічені та/або заміщені форми або фрагменти протеїну ORF2 PCV2 можуть бути застосовані у композиціях даного винаходу. Фахівець у галузі розуміє, що варіанти послідовностей PCV2 можуть бути застосовані у композиціях даного винаходу. Такі варіанти можуть різнитись на приблизно 10-20 % ідентичності послідовності та все ж зберігати антигенні характеристики, що роблять їх придатними для імуногенних композицій. Бажано, PCV2 варіанти мають щонайменше 80 %, бажано щонайменше 85 %, більш бажано щонайменше 90 %, ще більш бажано щонайменше 95 % ідентичності послідовності з повнодовжинною геномною послідовністю дикого типу ізоляту PCV2. Антигенні характеристики імунологічної композиції можуть бути, наприклад, оцінені за експериментом зараження, наведеному у секції Приклади. Більш того, антигенна характеристика модифікованого антигену PCV2 все ще зберігається, коли модифікований антиген викликає щонайменше 70 %, бажано 80 %, більш бажано 90 % захисного імунітету порівняно з дикими типом протеїну ORF2 PCV2. Антигенний компонент PCV2 забезпечується у імуногенній композиції на рівні включення антигену, ефективному для викликання бажаної імунної відповіді, а саме, зниження захворюваності або зменшення тяжкості кліничних ознак, після інфекції PCV2. 9 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У одному варіанті втілення, гібридний вірус PCV1-2 включено у композиціях винаходу на рівні щонайменше 1,0≤RP≤5,0, де RP є одиницею відносної активності, визначеною за допомогою кількісного аналізу антигену ELISA (тест на активність in vitro) у порівнянні з контрольною вакциною. У іншому варіанті втілення, гібридний вірус PCV1-2 включено у композиціях винаходу у кінцевій концентрації від приблизно 0,5 % до приблизно 5 % 20-раз (20X) концентрованої маси PCV1-2 антигену. У іншому варіанті втілення, рекомбінантний протеїн ORF2 PCV2 включено у композиціях винаходу на рівні щонайменше 0,2 мкг антиген/мл кінцевої імуногенної композиції (мкг/мл). У наступному варіанті втілення, рівень включення рекомбінантного протеїну ORF2 PCV2 становить від приблизно 0,2 до приблизно 400 мкг/мл. У іншому варіанті втілення, рівень включення рекомбінантного протеїну ORF2 PCV2 становить від приблизно 0,3 до приблизно 200 мкг/мл. У наступному варіанті втілення, рівень включення рекомбінантного протеїну ORF2 PCV2 становить від приблизно 0,35 до приблизно 100 мкг/мл. У іншому варіанті втілення, рівень включення рекомбінантного протеїну ORF2 PCV2 становить від приблизно 0,4 до приблизно 50 мкг/мл. У одному варіанті втілення, тривалентна імуногенна композиція даного винаходу включає комбінацію щонайменше одного розчинного антигену M.hyo (наприклад, два або більше) та антигену цирковірусу свиней типу 2 (PCV2), а також антигену вірусу PRRS винаходу. У іншому варіанті втілення, композиція викликає захисну імунну відповідь у свині проти M.hyo, PCV2 та вірусу PRRS. У одному варіанті втілення, комбінована вакцина PCV2/M. hyo/PRRS забезпечується як однодозова вакцина у 2-х флаконах. Наприклад, у деяких варіантах втілення, комбінація PCV2/M. hyo забезпечується як стабільна рідка композиція у першому флаконі та вірус PRRS забезпечується у ліофілізованому стані у другому флаконі. У деяких варіантах втілення, додаткові свинячі антигени можуть бути додані як до першого, так і до другого флакону. У одному варіанті втілення, вірусний компонент PRRS забезпечується як ліофілізований, генетично модифікований живий вірус. Перед введенням, рідина PCV2/M.hyo з першого флакону може бути використана для регідратації вірусу PRRS у другому флаконі, так що всі три антигени можуть бути введені тварині у одній дозі. Звертаємо увагу нате, що хоча комбіновані вакцини PCV2/M. hyo/PRRS існують на даний час, вони забезпечуються як однодозова вакцина у 3-х флаконах, що потребує одночасного введення трьох окремих вакцин (наприклад, Ingelvac CircoFLEX®, Ingelvac MycoFLEX® та Ingelvac®PRRS MLV). Етіологічний агент PRRS вперше ізолювали у Нідерландах, та назвали вірусом Lelystad. Цей вірус описано у WO 92/21375 (Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut). Ізолят Європейського вірусу PRRS депоновано у інституті Пастера в Парижі, під номером I-1102. Північноамериканський тип ізольовано практично одночасно з європейським вірусом, та описано у WO-93/03760 (Collins et al.) Ізолят північноамериканського типу вірусу депоновано у колекції культур американського типу (ATCC), під номером VR-2332. Були ізольовані різні штами як з європейського, так і з північноамериканського типу вірусу. WO 93/07898 (Akzo) описує європейський штам та вакцини, що походять від нього, депонований у CNCM (інститут Пастера), під номером I-1140. Також, WO 93/14196 (Rhone-Merieux) описує новий штам, ізольований у Франції, депонований у CNCM (інститут Пастера), під номером I1153. Більш того, EP0595436 B1(Solvay) описує новий північноамериканський тип штаму, більш вірулентний, ніж той що був описаний спочатку, та його вакцини. Цей штам депоновано у ATCC, проте номер депонування не вказано у патентній заявці. Окрім цього, ES2074950 BA (Cyanamid Iberica) та його еквівалент GB2282811 B2 описують так званий "Іспанський штам", що відрізняється від європейського та північноамериканського штамів. Цей "Іспанський штам" депоновано у європейській колекції культур клітин тварин (EACCC), під номером V93070108. Придатні антигени вірусу PRRS для застосування у композиціях PCV2/M. hyo/PRRS даного винаходу включають ізоляти північноамериканського вірусу PRRS, штами китайського вірусу PRRS, та штами європейського вірусу PRRS, а також генетично модифіковані версії таких ізолятів/штамів. У одному варіанті втілення, антигенний компонент вірусу PRRS, застосований у композиціях даного винаходу, є північноамериканським вірусом PRRS. У деяких варіантах втілення, антигенний компонент вірусу PRRS, застосований у композиціях цього винаходу, є ізолятом північноамериканського вірусу PRRS, позначеним як P129 або його живою генетично модифікованою версією. Бажано, генетично модифікований вірус PRRS не здатен продукувати патогенну інфекцію, проте здатен викликати імунозахисну відповідь проти інфекції, викликаної диким типом вірусу PRRS. Генетично модифікований вірус PRRS для застосування у композиціях винаходу може бути одержаний з інфекційного клону. Одержання інфекційного кДНК клону ізоляту 10 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 північноамериканського вірусу PRRS, позначеного P129, описано у патенті США 6,500,662, який включено за допомогою посилань. Послідовність кДНК P129 описана у банку генів під номером доступу AF494042 та у патенті США № 6,500,662. У одному варіанті втілення, нуклеотидна послідовність невірулентної форми P129 для застосування у композиціях даного винаходу представлена SEQ ID NO: 16. Однак, даний винахід не обмежено цією послідовністю. Ця послідовність та послідовності інших невірулентних форм P129 описані у міжнародній заявці PCT/IB2011/055003, поданій 09,11,2011, вміст якої (включаючи будь-які національні заявки, подані у США, на основі цієї міжнародної заявки) включено у даний документ за допомогою посилань. Бажано, вірус PRRS є модифікованим для запобігання даун-регулювання інтерферон-опосередкованої функції. У іншим варіантах втілення, антигенний компонент вірусу PRRS, застосований у композиціях винаходу, є вірусним ізолятом PRRS позначеним як ISU-55. Ізолят ISU-55 депоновано у колекції культур американського типу (ATCC), під номером доступу VR2430. Нуклеотидна послідовність генів ORF2-ORF5 ізоляту ISU-55 представлена SEQ ID NO:17. Нуклеотидна послідовність генів ORF6 та ORF7 ізоляту ISU-55 представлена SEQ ID NO: 18. Іншим придатним ізолятом північноамериканського вірусу PRRS, який можна використати у композиціях, є ISU-12, який депоновано у ATCC під номерами доступу VR2385 [3 x очищений від тромбоцитів] та VR2386 [неочищений від тромбоцитів]. Інші придатні північноамериканські віруси PRRS, які можуть бути застосовані у композиціях цього винаходу, представлені: ISU-51, ISU-3927, ISU-1894, ISU-22 та ISU-79, депоновані у ATCC під номерами доступу VR2498, VR2431, VR2475, VR2429 та VR2474, відповідно. Генетично модифіковані версії будь-якого з цих ізолятів ISU можуть бути застосовані у композиціях цього винаходу. Ці ISU ізоляти та ізолят ISU-55 детально описані у патентах США Paul, et al.: US 5,695,766, 6,110,467, 6,251,397, 6,251,404, 6,380,376, 6,592,873, 6,773,908, 6,977,078, 7,223,854, 7,264,802, 7,264,957 та 7,517,976, всі включені у даний документ за допомогою посилань. У інших варіантах втілення, антигенним компонентом вірусу PRRS застосований у композиціях даного винаходу є північноамериканський тип, депонований у колекції культрур американського типу (ATCC) під номером VR-2332, або його генетично модифікована версія. Наприклад, вірус PRRS може бути модифікованим живим вірусом на основі ізоляту, ідентифікованого як ATCC VR2332, який застосовують у INGELVAC® PRRS ATP та INGELVAC® PRRS MLV, виробництва Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. У інших варіантах втілення, антигенний компонент вірусу PRRS застосований у композиціях даного винаходу є ізолятом Європейського вірусу PRRS або вірусом Lelystad або його генетично модифікованою версією. Приклад придатного штаму вірусу PRRS ідентифіковано як депонований під номером № I-1102, описаний вище. Нуклеотидні та амінокислотні послідовності що відповідають депозитному номеру I-1102 описані у патенті США № 5,620,691 Wensvoort et al., включеному у даний документ за допомогою посилань. Одержання інфекційного клону ізоляту Європейського вірусу PRRS або вірусу Lelystad описано у патенті США № 6,268,199, включеному у даний документ за допомогою посилань. Інші приклади придатних ізолятів вірусу PRRS включають, проте не обмежуються описаними вище. Також, живі генетично модифіковані версії ізолятів вірусу PRRS можуть бути застосовані у композиціях даного винаходу. Інфекційний клон може бути використаний для відновлення таких живих генетично модифікованих організмів. Фахівець у галузі розуміє, що варіанти послідовності вірусу PRRS можуть бути застосовані у композиціях даного винаходу. Такі варіанти можуть різнитись практично на 10-20 % ідентичності послідовності, та все ж зберігати антигенні характеристики, що роблять їх придатними для імуногенних композицій. Бажано, вірус PRRS варіанти мають щонайменше 80 %, бажано щонайменше 85 %, більш бажано щонайменше 90 %, ще більш бажано щонайменше 95 % ідентичності послідовності з повнодовжинною геномною послідовністю ізоляту дикого типу вірусу PPRS. Антигенні характеристики імунологічної композиції можуть бути, наприклад, оцінені експериментами зараження. Більш того, антигенна характеристика модифікованого антигену вірусу PRRS все ще зберігається, коли модифікований антиген викликає щонайменше 70 %, бажано 80 %, більш бажано 90 % захисного імунітету порівняно з диким типом антигену вірусу PRRS. У одному варіанті втілення, антигенний компонент вірусу PRRS є генетично модифікованим живим вірусом, який включено у композиціях винаходу на рівні щонайменше 2,1≤TCID 50≤5,2, де TCID50 є 50 % інфекційної дози культури тканин, визначеною підрахуванням кількості антигену (тест на активність in vitro). Антигенний компонент PCV2 композиції винаходу PCV2/M. hyo/PRRS може знаходитись у формі гібридного типу-1-типу 2 цирковірусу, гібридного вірусу, включаючи інактивований 11 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рекомбінантний цирковірус свиней типу 1, що експресує ORF2 протеїн цирковірусу свиней типу 2. У іншому варіанті втілення, антигенний компонент PCV2 композиції винаходу PCV2/M.hyo/PRRS знаходиться у формі рекомбінантного протеїну ORF2. Придатні PCV2 антигени для застосування у композиції PCV2/M.hyo/PRRS можуть походити від будь-якого ізоляту PCV2 описаного вище, а також інших PCV2 ізолятів. Придатні PCV2 антигеном для застосування у композиціях винаходу включають, проте не обмежуються наступними: описані вище PCV2 послідовності та їх варіанти. Вакцини даного винаходу можуть бути формульовані за прийнятою конвенцією з включенням прийнятних носіїв для тварин, включаючи людей (у разі потреби), таких як стандартні буфери, стабілізатори, розбавники, консерванти та/або солюбілізатори, а також можуть бути формульовані для сприяння постійному вивільненню. Розбавники включають воду, сольовий розчин, декстрозу, етанол, гліцерин, тощо. Добавки для ізотонічності включають хлорид натрію, декстрозу, манітол, сорбітол та лактозу, серед інших. Стабілізатори включають альбумін, серед інших. Інші придатні наповнювачі вакцин та добавки, включаючи прийнятні для модифікованих живих вакцин, є відомими та очевидними для фахівця у галузі. Дивитись, наприклад, Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing, включену у даний документ за допомогою посилань. Вакцини даного винаходу можуть також містити один або більше додаткових імуномодуляторів таких як, наприклад, ад'ювант або цитокін, серед інших. Види придатних ад'ювантів для застосування у композиціях даного винаходу включають наступні: ад'ювант олія у воді, полімерний та водний ад'ювант, ад'ювант вода у олія, ад'ювант гідроксид алюмінію, ад'ювант вітамін Е та їх комбінації. Деякі конкретні приклади ад'ювантів включають, проте не обмежуються наступними: повний ад'ювант Фройнда, неповний ад'ювант Фройнда, Corynebacterium parvum, Bacillus Calmette Guerin, гель гідроксиду алюмінію, глюкан, декстрин сульфат, оксид заліза, альгінат натрію, бакто-ад'ювант, певні синтетичні полімери, такі як поліамінокислоти та співполімери амінокислот, блок-співполімери (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), AMPHIGEN® ад'ювант, сапонін, Quil A або інші фракції сапоніну, монофосфорил ліпід A, та Avridine ліпід-амін ад'ювант (N,N-діоктадецил-N',N'--біс(2-гідроксиетил)-пропандіамін), "REGRESSIN" (Vetrepharm, Athens, Ga.), керосин, система ад'ювантів RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), мураміл дипептид тощо. Не обмежувальні приклади емульсії олія у воді, придатні для вакцини винаходу, включають модифіковані композиції SEAM62 та SEAM 1/2. Модифікована SEAM62 є емульсією олія у воді, що містить 5 % (о./о.) сквалену (Sigma), 1 % (о./о.) SPAN® 85 детергенту (ICI поверхнево активні речовини), 0,7 % (о./о.) TWEEN® 80 детергенту (ICI поверхнево активні речовини), 2,5 % (о./о.) етанолу, 200 мкг/мл Quil A, 100 мкг/мл холестерину, та 0,5 % (о./о.) лецитину. Модифікована SEAM 1/2 є емульсією олія у воді, що містить 5 % (о./о.) сквалену, 1 % (о./о.) SPAN® 85 детергенту, 0,7 % (о./о.) Tween 80 детергенту, 2,5 % (о./о.) етанолу, 100 мкг/мл Quil A та 50 мкг/мл холестерину. Інший приклад ад'юванту, придатного у композиціях винаходу є SP-олія. У описі та формулі використання, термін "SP олія" означає олійну емульсію, щ містить блок-співполімер поліоксиетилен-поліоксипропілен, сквалан, поліоксиетилен сорбітан моноолеат та забуферений сольовий розчин. Блок-співполімери поліоксиетилен-поліоксипропілен є поверхнево-активними речовинами, що допомагають суспендувати тверді речовини та рідкі компоненти. Ці поверхнево-активні речовини є наявними на ринку як полімери під торговою маркою Pluronic®. Бажаними поверхнево-активними речовинами є полоксамер 401, що є наявним на ринку під торговою маркою Pluronic® L-121. В цілому, емульсія SP олія є імуностимулюючою сумішшю ад'ювантів, що містить приблизно 1-3 % о./о. блок-співполімеру, приблизно 2-6 % о./о. сквалану, більш зокрема приблизно 3-6 % сквалану, та приблизно 0,1-0,5 % о./о. поліоксиетилен сорбітан моноолеату, із залишком представленим забуференим сольовим розчином. У одному варіанті втілення, емульсія SP-олія наявна у кінцевій композиції у о./о кількості приблизно 1 % - 25 %, бажано приблизно 2 % - 15 %, більш бажано приблизно 5 % - 12 % о./о. У іншому прикладі придатним ад'ювантом для застосування у композиціях винаходу є AMPHIGEN™ад'ювант, що складається зі знежиреного лецитину розчиненого у олії, зазвичай легке рідке вазелінове масло. Інші приклади ад'ювантів, придатних у композиціях винаходу, включають наступні пропіретарні ад'юванти: Microsol Diluvac Forte® duel система емульсія ад'ювант, Emunade ад'ювант, та Xsolve ад'ювант. Як Emunade так і Xsolve ад'юванти є емульсіями легкої мінеральної олії у воді, проте Emunade також містить альгідрогель, та d,l-α-токоферіл ацетат є частиною XSolve ад'юванту. Ще один приклад придатного ад'юванту для застосування у 12 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 композиціях винаходу включає ImpranFLEX™ ад'ювант (ад'ювант вода у олії). Ще один приклад придатного ад'юванту включає ад'ювант на основі Carbomer (Carbopol®). Бажані Carbopol® ад'юванти включають полімер Carbopol® 934 та полімер Carbopol®941. У одному варіанті втілення, ад'ювант або суміш ад'ювантів додають у кількості приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу. У іншому варіанті втілення, ад'ювант/суміш ад'ювантів додають у кількості приблизно 200 мкг до приблизно 5 мг на дозу. У одному варіанті втілення, ад'ювант/суміш ад'ювантів додають у кількості приблизно 300 мкг до приблизно 1 мг/дозу. Ад'ювант або суміш ад'ювантів зазвичай присутні у композиції вакцини винаходу у о./о кількості приблизно 1 % - 25 %, бажано приблизно 2 % - 15 %, більш бажано приблизно 5 % 12 % о./о. Інші "імуномодулятори" що можуть бути включені у вакцину включають, наприклад, один або більше інтерлейкінів, інтерферонів або інших відомих цитокінів. У одному варіанті втілення, ад'ювант може означати похідну циклодекстрину або поліаніонний полімер, такі як ті, що описані у патентах США 6,165,995 та 6,610,310, відповідно. Наступний аспект стосується способу одержання імуногенної композиції даного винаходу. Цей спосіб містить i) культивування M.hyo у придатному середовищі протягом періоду в діапазоні 18-144 години; ii) потім інактивацію культури M.hyo; iii) збирання рідини інактивованої культури, де рідина інактивованої культури містить цільноклітинний препарат M.hyo, який включає як розчинну рідку фракцію, так і нерозчинний клітинний матеріал; iv) відділення розчинну рідкої фракції від нерозчинного клітинного матеріалу; v) суттєве видалення як IgG, так і імунокомплексів антиген/імуноглобулін з відділеної розчинної рідкої фракції з утворенням розчинної частини цільноклітинного препарату M. hyo; та vi) наступне об'єднання розчинної частини цільноклітинного препарату M.hyo з антигеном PCV2 та антигеном вірусу PRRS. У деяких варіантах втілення, стадія vi) включає об'єднання готової до використання рідкої композиції, що містить як антиген PCV2, так і розчинну частину M.hyo, з ліофілізованим антигеном вірусу PRRS. Прикладом придатного середовища для культивування M.hyo є PPLO бульйон (Mycoplasma бульйонна основа), який при доповненні поживними елементами, використовують для видалення та культивування Mycoplasma. У деяких варіантах втілення, культуру M. hyo вирощують до пізньої логарифмічної фази росту, після чого культуру інактивують. У деяких інших варіантах втілення, культуру інактивують збільшенням pH (наприклад, до приблизно 7,8). Це здійснюють шляхом піддавання культури інактивуючому агенту, такому як бінарний етиленімін (BEI). BEI одержують in situ протягом інкубації L-брометиламін гідроброміду (BEA) у культурі. Потім, pH інактивованої культури нейтралізують, наприклад, додаванням еквівалентної кількості агента, що нейтралізує агент інактивації в розчині. У деяких варіантах втілення, агентом інактивації є BEI та нейтралізуючим агентом є тіосульфат натрію. У одному варіанті втілення, pH інактивованої культури доводили до приблизно 7,4 додаванням тіосульфату натрію. У деяких варіантах втілення, розчинну рідку фракцію цільноклітинного препарату M.hyo відділяли від нерозчинного клітинного матеріалу, використовуючи звичайні способи. У одному варіанті втілення, це розділення здійснювали фільтрацією. У іншому варіанті втілення, це розділення здійснювали центрифугуванням. У іншому варіанті втілення, це розділення здійснювали осадженням. У одному варіанті втілення, розчинну рідку фракцію інактивованого, нейтралізованого M.hyo цільноклітинного препарату обробляли Протеїн A смолою для значного видалення як IgG, так і імунокомплексів антиген/імуноглобулін. У іншим варіантах втілення, Протеїн G смола може бути використана для значного видалення як IgG, так і імунокомплексів антиген/імуноглобулін, що містяться у розчинній рідкій фракції. Способи видалення як IgG, так і імунокомплексів антиген/імуноглобулін Протеїн A або Протеїн G смолами є добре відомими у галузі. Згідно з наступним аспектом, спосіб одержання полівалентної імуногенної композиції даного винаходу включає приготування розчинного M.hyo антигену як описано вище, та його змішування з PCV2 антигеном, придатним ад'ювантом, та один або більше фармацевтично прийнятні носії. Цей спосіб необов'язково включає додавання щонайменше одного додаткового свинячого антигену, такого як, про не обмежуючись, антигеном вірусу PRRS, як описано вище. Наступний аспект даного винаходу стосується набору. "Набір" стосується багатьох компонентів, згрупованих разом. У одному варіанті втілення, набір даного винаходу включає флакон (або іншу придатну тару), який містить імуногенну композицію. Ця імуногенна композиція включає як антиген PCV2, так і розчинну частину цільноклітинного препарату Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), де розчинна частина препарату M.hyo по суті є вільною від 13 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 як (i) IgG, так і (ii) імунокомплексів антиген/імуноглобулін. Необов'язково, набір може додатково включати інструкцію. Інструкція включає інформацію по введенню імуногенної композиції. У деяких варіантах втілення, комбінація PCV2/M.hyo у флаконі набору забезпечується як готова до використання рідка композиція. У іншим варіантах втілення, набір включає другий флакон, що містить антиген вірусу PRRS. У деяких варіантах втілення, антиген вірусу PRRS знаходиться у формі генетично модифікованого живого вірусу, який забезпечується у ліофілізованому стані. У таких випадках, інструкція включає способи регідратації вірусного компоненту PRRS рідким вмістом з флакону, що містить комбінацію PCV2/M.hyo. інструкція також включає інформацію по введенню одержаної тривалентної композиції(й) PCV2/M.hyo/PRRS. У деяких варіантах втілення, імуногенну композицію цього винаходу вводять свиням, що мають материнські антитіла, проти щонайменше однoго M.hyo, PCV2 та вірусу PRRS. У іншим варіантах втілення, імуногенну композицію даного винаходу вводять свиням, що мають материнські антитіла, проти M.hyo, PCV2, та вірусу PRRS. У деяких варіантах втілення, полівалентну імуногенну композицію даного винаходу вводять порося віком 3 тижні або старшим. Однак, передбачається, що полівалентна вакцинна композиція винаходу також може бути використана для повторної вакцинації молодих свиней до розмноження. У галузі також відомо, що молода свиня є свинею жіночого роду, що не була супоросною. Вакциновані молоді свині будуть пропускати материнські антитіла їх новонародженим поросям за допомогою молозива. Також передбачається, що полівалентна вакцина винаходу може бути використана для щорічної повторної вакцинації стада, що розмножується. Бажано, полівалентну вакцину даного винаходу вводять свиням (наприклад, поросям або молодим свиням) у одній дозі. У одному варіанті втілення, полівалентна вакцина даного винаходу не потребує змішування окремої моновалентної вакцини перед введенням, тобто, вона забезпечується як готова до використання композиція PCV2/M.hyo, що міститься у одному флаконі. У іншому варіанті втілення, полівалентна композиція потребує змішування бівалентної вакцини даного винаходу, що міститься у першому флаконі, з моновалентною вакциною, що міститься у другому флаконі. У одному варіанті втілення, моновалентна вакцина, що міститься у другому флаконі включає антиген вірусу PRRS. Необов'язково, додаткові антигени можуть бути додані до будь-якого з цих флаконів. У деяких варіантах втілення, імунітет починає проявлятись через 2-3 тижні після вакцинації полівалентною композицією вакцини даного винаходу. У іншим варіантах втілення, тривалість імунітету становить приблизно 17-23 тижні після вакцинації полівалентною композицією вакцини даного винаходу. Наступні приклади наводять переважні матеріали та способи даного винаходу. Однак, потрібно розуміти, що ці приклади наведені тільки з метою ілюстрації, та не обмежують об'єм прав винаходу. Приклади Приклад 1: Способи одержання Mycoplasma hyopneumoniae для PCV2, здатного для об'єднання з антигеном M.hyo Ферментація та інактивація M.hyo Середовище для розведень вихідного вірусу та антигену готували наступним чином. Бульйон плевропневмоніє-подібного організму, що походить від серця свиней (PPLO) (BD Biosciences каталог No. 21498), одержували за інструкцією виробників (тобто, 21 г/л), та розчин екстракту дріжджів одержували з концентрацією 21 г/л у USP. Розчин дріжджового екстракту потім додавали до PPLO при 6,25 %, та суміш стерилізували нагріваючи до 121 °C протягом > 30 хвилин. Гідрохлорид цистеїну одержували з концентрацією 90 г/л та стерилізували фільтруванням. Розчин декстрози одержували додаванням 450 г декстрози на літр USP води, після чого стерилізували нагріванням. Для одержання кінцевого середовища, свинячу сироватку додавали до основного середовища з концентрацією 10 %, після чого цистеїн з концентрацією 0,01 % та декстрозу з концентрацією 1,0 %. Середовище інокулювали 10 % о.:о. культури M. hyopeumoniae (штам P-5722-3) у логарифмічній фазі росту. Культуру витримували при 37 °C, та pH та dO підтримували на рівні 7,0 та 25 %, відповідно. У логарифмічній фазі росту, культуру інактивували бінарним етиленіміном (BEI), азирідином, одержаним з 2-брометиламін гідроброміду. Зокрема, інактивацію здійснювали шляхом підвищення pH дo 7,8 додаванням 2брометиламінгідроброміду (BEA) до кінцевої концентрації 4 мM та інкубуванням протягом 24 годин. BEI нейтралізували додаванням тіосульфату натрію у молярному співвідношенні 1:1, після чого інкубували протягом ще 24 годин. Рідину інактивованої культури витримували при 28 °C до подальшої обробки. 14 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Приклад 2: Способи одержання гібридного цирковірусу свиней (cPCV)1-2 cPCV1-2 конструювали шляхом клонування імуногенного капсидного гену патогенного цирковірусу свиней типу 2 (PCV2) у геномний скелет непатогенного цирковірусу свиней типу 1 (PCV1). Процедура конструювання клону гібридної ДНК описана, наприклад, у патенті США № 7,279,166, який включено у даний документ за допомогою посилань. Інфекційний матеріал гібридного вірусу одержували від доктора X. J. Meng, університет Virginia Polytechnic Institute and State University, Блексбург, Вірджінія, та використовували для інфікування клітин нирок свиней (PK)-15, вирощених у мінімальному підтримуючому середовищі (MEM), збагаченому 0,05 % гідролізатом лактальбуміну (LAH), 30 мкг/мл гентаміцин сульфату, та 5 % фетальної бичачої сироватки. Отримані cPCV1-2 інфековані PK-15 клітини розмножували серійними пасажами ще чотири рази, використовуючи таке ж середовище, за виключенням того, що використовували 2-3 % фетальну бичачу сироватку. П'ятий пасаж заморожували, розморожували та фільтрували, та одержані лізати використовували для приготування попереднього вакцинного вірусу та потім вихідного вакцинного вірусу. Середовище, що використовували для приготування вірусного інокуляту, було таким же як використовували для приготування вірусного посівного матеріалу. Як ростове середовище MEM, OptiMEM, або еквівалентом є базальне середовище, яке можна використати для висадження клітинної лінії PK-15 для розростання. Ростове середовище може бути доповнене до 10 % бичачою сироваткою, до 0,5 % гідролізатом лактальбуміну, до 0,5 % бичачою сироваткою альбуміну, та до 30 мкг/мл гентаміцином. Як середовище розмноження вірусу використовують MEM, Optimem або еквівалентне. Середовище розмноження вірусу може бути доповнене до 0,5 % гідролізатом лактальбуміну, до 2 % бичачою сироваткою, до 0,5 % бичачою сироваткою альбуміну, та до 30 мкг/мл гентаміцином. До 5 г/л глюкози та до 5 ммоль/л L-глуматіну можуть бути додані до ростового середовища та/або середовища розмноження вірусу, що потрібно для підтримки клітин. cPCV1-2 вихідний вакцинний вірус додавали до суспензії клітин PK-15 та адсорбували до 3 годин. Вірусний інокулят розводили у ростовому базальному середовищі для забезпечення багато чисельності інфекції (MOI) 0,1-0,0001. Культури клітин PK-15 спочатку інокулювали робочим вірусним інокулятом під час висаджування клітин, або коли клітини досягалиприблизно 20 % - 50 % конфлюенції. Цей перший пасаж може називатись "одно стадійний спосіб інфікування" для одержання пулу антигену, або може бути використаний у подальшому для серійних пасажів. Для серійних пасажів, cPCV1-2 інфіковані клітини PK-15 далі розмножували до 7 пасажів серійними розділенням у співвідношенні 1:5-20 для розмноження вірусу. Культуральне середовище що містить суспензію інфікованих клітин з попереднього пасажу слугує посівним матеріалом для наступного пасажу. cPCV1-2 інфіковані клітини інкубували протягом 3-14 діб для кожного пасажу при 36±2 °C, до досягнення клітинами  90 % конфлюенції. Вірус cPCV1-2 викликає видимі цитопатичні зміни протягом реплікації вірусу. При зборі культури клітин, спостерігали округлення клітин та значні плавучі шматки. Культури також спостерігали на візуальну присутність бактеріального або грибкового ураження. Час інкубування між збиранням для cPCV антигенів наведено у Таблиці 1 нижче: Таблиця 1 Мінімальний та максимальний час для збору cPCV антигену Спосіб Мінімальний та максимальний час 5-16 діб Одностадійне інфікування Серійні пасажі MSV+7) 45 (MSV+3 Діапазон температур 36±2 °C 16-36 діб 36±2 °C Культуральні рідини cPCV1-2 збирали у стерильні пробірки та відбирали зразки на дослідження мікоплазми, використовуючи відомі способи. Чисельні збирання можна здійснювати з ролер-флаконів, біореакторів та перфузійних колб. Перед інактивацією зібраного вірусу cPCV1-2, один або більше серій антигенів концентрували (наприклад, до 60X) шляхом ультрaфільтрації. Концентрати промивали сбалансованим сольовим розчином для видалення протеїнів сироватки. 15 UA 114504 C2 5 10 Спосіб інактивації, атенуації або детоксифікації вірусу cPCV1-2 описано далі. Після концентрування cPCV антигену, бета-пропіолактон (BPL) додавали до об'єднаного вірусного матеріалу cPCV1-2 з одержанням приблизної концентрації 0,2 % о./о. Об'єднані вірусні рідини потім перемішували протягом мінімум 15 хв. та потім інактивований об'єм рідин антигену переносили до другої стерильної колби. Перенесені рідини антигену витримували при 2-7 °C, з постійним збовтуванням, протягом мінімум 24 годин. Після мінімум 24 годин, друге додавання 0,2 % о./о BPL додавали до об'єднаної суспензії. Вміст потім збовтували, переносили до третьої колби, та витримували при 2-7 °C, з постійним збовтуванням, протягом додаткового часу не менше ніж 84 годин. В цілому, час повної інактивації є не меншим ніж 108 годин, та не більшим ніж 120 годин. Спосіб інактивації підсумований у Таблиці 2 нижче. Таблиця 2 Спосіб інактивації Інактивант бета-пропіолактон (BPL) 15 20 25 30 35 40 45 50 Фінальна концентрація Температурний режим Час-години (мін./макс.) 0,4 % о./о (2×0,2 % о./о додавання) 2 - 7C (w/збовтування) 108-120 Інактивацію продовжували додаванням фінальної концентрації не більшим ніж 0,1 M розчин тіосульфату натрію. pH інактивованого пулу антигену доводили до приблизно 6,8, використовуючи NaOH або HCl. Після інактивації, типовий зразок брали з пулу та тестували на завершення інактивації. Інактивований продукт cPCV1-2 антигену стандартизували більше ніж 1,0 RP, як виміряно за допомогою ELISA. Приклад 3: Даунстрім обробка M.hyo антигенів та аналітичне тестування цих оброблених антигенів Даунстрім обробка M.hyo антигенів: Інактивовану ферментаційну рідину (одержану як описано вище у Прикладі 1) обробляли наступним чином для кожної вказаної групи. Ці оброблені M.hyo антигени застосовували у Прикладі 4 нижче. T02: (вся маса) не оброблені. T03: (10 X УФ концентровані) Концентрували за допомогою фільтрації з тангенціальним потоком за допомогою мембрани з відсічкою за молекулярною масою 100 KДa (пористе волокно). Зменшення кінцевого об'єму становило 10X. T04 та T05: (10X УФ концентровані та центрифуговані) Концентровані клітини мікоплазми (з T03) збирали та промивали один раз PBS за допомогою центрифугування при ~20,000xg (модель Sorvall RC5B). T06 та T07: (10X центрифуговані) Інактивовану ферментаційну рідину центрифугували при ~20,000xg (Sorvall RC5B) та промивали один раз шляхом ресуспендування клітин у PBS, після чого додатковим центрифугуванням. Зменшення кінцевого об'єму дорівнювало 10X. T08: (10X центрифуговані та нагріті) Клітини Mycoplasma концентрували та промивали на T06 та нагрівали до 65 °C протягом 10 хвилин. T09: (супернатант без клітин) Супернатант, зібраний з першого центрифугування як описано для T06, стерилізували фільтруванням крізь фільтр 0,2 мікрон (Nalgene). T10: (супернатант без клітин, оброблений протеїном-A) Стерильний супернатант (приготовлений для T09) змішували з смолою протеїн A (Протеїн A Сефароза, Pharmacia Inc) при об'ємному співвідношенні 10:1 протягом 4 годин. Смолу видаляли стерильною фільтрацією, та фільтровану рідину зберігали при 2-8 °C. Цей спосіб використовує після ферментаційну обробку "даунстрім" протеїном A для видалення антитіл та імунокомплексів. Хоча даний винахід не виключає апстрім обробки протеїном A, винахідники з'ясували, що у випадку M.hyo, апстрім обробка протеїном A ростового середовища приводить до p46 результатів, що є нижчим та невідповідним у порівнянні з необробленим середовищем (дані не наведені). Аналітичне тестування антигенів M.hyo, оброблених даунстрім Оброблені даунстрім препарати антигенів M.hyo (одержані як описано вище) тестували на відновлення M.hyo специфічного p46 антигену, та присутність PCV2 антитіла. Окрім цього, ці препарати M.hyo антигенів тестували на присутність вірусу гепатиту (TTV), включаючи генотип 1 (g1TTV) та генотип 2 (g2TTV). Результати представлені нижче у Таблиці 3. 16 UA 114504 C2 Таблиця 3 Характеристика даунстрім оброблених антигенів M.hyo Маса M.Hyo Обробка PCV2 ab кПЛР ДНК p46 RU/мл g1TTV g2TTV 1,00E+03 1,78E+03 Повний об'єм 10x УФ концентровані 10 15 20 25 30 6666 0,819 1,00E+03 9,94E+03 10x УФ конц.+центрифуговані 10x центрифуговані 10x центрифуговані + нагріті Безклітинний супернатант Безклітинний супернатант (протеїн A) 5 809 Співвідношення S/P 0,248 614 0,019 0 0 763 -0,015 1,90E+02 1,91E+02 690 -0,012 0 2,07E+02 719 0,242 4,20E+02 3,23E+03 826 -0,014 0 2,06E+03 З посиланням на Таблицю 3 вище, відновлення M.hyo-специфічного p46 антигену демонстрували для кожного з M.hyo даунстрім обробленого антигенного препарату. Окрім цього, наступні обробки успішно видалили PCV2 антитіло: 10X УФ концентровані та центрифуговані, 10x центрифуговані, 10X центрифуговані та нагріті, та супернатант без клітин (оброблені протеїном A). Відносно TTV, наступні обробки успішно видалили g1TTV: 10X УФ концентровані та центрифуговані, 10x центрифуговані та нагріті, та супернатант без клітин (оброблені протеїном A). Тільки обробка, позначена 10X УФ концентровані та центрифуговані, видаляла g2TTV. Ізоляти вірусу гепатиту, включаючи генотипи 1 та 2, описані у US20110150913, який включено у даний документ за допомогою посилань. З огляду на те, що у галузі відомо, що протеїн A зв'язує IgG, фахівцю у галузі зрозуміло, що не тільки PCV2 антитіло, але й інші свинячі антитіла, включаючи PRRS антитіло, HPS антитіло та SIV антитіло, можно ефективно видаляти обробкою протеїном A. Це робить безклітинний оброблений протеїном А супернатант M.hyo цього винаходу сумісним не тільки з PCV2 антигеном, а також з іншими свинячими антигенами, внаслідок відсутності імунологічної інтерференції між антигенами. Окрім цього, очікується, що видалення остатків незахисних клітин та видалення імуноглобуліну та комплексів антиген/імуноглобулін зробить вакцину більш безпечною. Приклад 4: Одержання композицій експериментальних вакцин M.hyo Всі експериментальні вакцини M.hyo формулювали з кінцевою концентрацією ад'юванту 5 %. Окрім цього, всі вакцини стандартизували за допомогою p46 ELISA та фіксували тимеросолом. Композиції експериментальної вакцини одержували з M.hyo антигенами, обробленими згідно з обробками T02-T10 вище. Окрім цього, Обробка T01 відповідала плацебо (не містила M.hyo антигену, тільки 5 % Amphigen ад'юванту), у той час як Обробка T11 означала позитивний контроль, що відповідав вакцині M.hyo на основі бактерину, де закінчився термін дії (RespiSure-ONE®, Pfizer Animal Health). Ці композиції описані у Таблиці 4 нижче. Таблиця 4 Композиції експериментальної вакцини M.hyo 17 UA 114504 C2 Мішень p46 одиниці/ds Обробка T01 (ДВП) Серійний* 123639 (плацебо) T02 L100211A T03 T04 T05 T06 T07 T08 T09 L100211B L100211C L100211D L100211E L100211F L100211G L100211H 5% Amphigen 452 452 816 452 816 452 452 T10 L100211J 452 T11 A827870 M.Hyo Ад'ювант антиген (мл) (мл) 10 % SP олія Об'єм композиції (мл) 279,36 250 1000 6,78 73,62 132,90 59,24 106,95 65,51 62,87 50 50 50 50 50 50 50 200 200 200 200 200 200 200 54,72 50 200 Вакцина "RespiSure", де закінчився строк дії *Досліджуваний Ветеринарний Продукт (ДВП) Серійний 5 10 Приклад 5: Оцінка in vivo ефективності вакцини M.hyo з M.hyo антигенами від різних обробок даунстрім Це дослідження проводили для оцінки in vivo ефективності вакцин Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) з M.hyo антигенами від різних даунстрім обробок (DSP). Свиней віком 3 тижні внутрішньом'язово інокулювали однократною дозою різних композицій вакцин, описаних у Таблиці 4 вище. Шістнадцять тварин інокулювали у кожній з груп обробок. Тварин заражали через 21 добу після вакцинації вірулентним ізолятом M.hyo з досліджуваної станції. Трупи тварин розрізали через 28 діб після зараження та легені видаляли та підраховували згущення сумісні з інфекцією M.hyo. Первинним критерієм для захисту проти зараження M.hyo були оцінки згущень легень. Зазвичай прийнято, що існує взаємозв'язок між розміром уражень легень, викликаних ензоотичною пневмонією, та зворотнім ефектом на швидкість росту. Таблиця 5 нижче містить оцінки уражень легень для відповідних груп обробки. Статистичну значимість продемонстровано за допомогою аналізу змішаної моделі оцінок легень для кожної групи. 15 18 UA 114504 C2 Таблиця 5 Результати ураження легень Обробка Опис p46 RP мішень/ спостерігали діапазон % легень з ураженням Контраст pзнач. Значим. N/A % ураження легень зворотно трансф. LS значення 11,7 T01 Плацебо (5 % Amphigen) Повний об'єм 1,2-44,3 N/A N/A N/A 13/15,6 1,2 0,1-18,5 0 Так Повний об'єм UF 10x UF 10x + центрифуговані UF 10x + центрифуговані 10x центрифуговані 10x центрифуговані 10x центрифуговані+нагріті Супернатант (без клітин) 13/11,9 0,3 0,0-2,8 0 Так 13/28,1 5,9 0,0-40,5 T01 проти 02 T01 проти 03 T01 проти 04 0,1589 Ні 24/48,2 3,7 0,0-42,3 0,0309 Так 13/30,4 4,7 0,0-23,6 0,0388 Так 24/57,4 4,6 0,3-37,3 0,0323 Так 13/17,7 4,5 0,3-21,7 0,0137 Так 13/14,1 1,4 0,0-33,0 0,0004 Так T10 Супернатант + протеїн A 13/12,1 3,1 0,0-25,8 0,0094 Так T11 RSO закінченим строком дії 13/12,5 2,2 0,1-32,1 0,0009 Так T02 T03 T04 T05 T06 T07 T08 T09 з T01 проти T05 T01 проти 06 T01 проти T07 T01 проти T08 T01 проти T09 T01 проти T10 T01 проти T11 5 10 15 20 З посиланням на Таблицю 5 вище, результати з M.hyo антигенами від різних даунстрім обробок вказали на те, що всі експериментальні вакцини, окрім T04, значно відрізнялись від плацебо. Ці результати уражень M.hyo графічно зображені на Фігурі 1. Як показано на Фігурі 1, T04 дала неприйнятні результати. Всі інші обробки значно відрізнялись від плацебо (T01). Оцінка згущень легень вказала, що T02, T03 та T09-T11 надали найбільш ефективний захист проти зараження M.hyo. Відносну ефективність p46 експериментальних вакцин оцінювали, використовуючи подвійний антитіло сендвіч ферментний імуносорбентний аналіз (DAS ELISA). Результати p46 DAS ELISA, показані у Таблиці 5 вище, вказують на те, що всі експериментальні вакцини перевищили намічену ефективність. Окрім цього, p46 відносна ефективність підтримувалась або збільшувалась протягом зберігання вакцин протягом місяця (дані не наведені). Помітне збільшення активності з часом спостерігали у центрифугованих антигенів, за виключенням антигенів, що піддавались нагріванню. Не прив'язуючись до теорії, імовірно, що "каркаси" клітин з часом руйнуються та вивільнюють більше зв'язаного мембраною p46 антигену у випадку центрифугованих антигенів. Приклад 6: Оцінка сумісності експериментальних вакцин M.hyo з PCV2 антигеном Це дослідження здійснювали для оцінки сумісності експериментальних вакцин M.hyo з M.hyo антигенами від різних даунстрім обробок PCV2 антигеном. Композиції експериментальної 19 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 вакцини M.hyo описані у Таблицях 4 та 5 вище. Експериментальні p46 відносні ефективності цих вакцин описані у Таблиці 5 вище. Кожну з цих експериментальних вакцин M.hyo об'єднували з PCV2 антигеном. У цьому прикладі, антиген PCV2 представляє убитий гібридний вірус PCV тип 1-тип 2 (Fostera PCV), одержаний як описано вище у Прикладі 2. Гібридний вірус включали у композиції у початковій концентрації 1,6 ≤ RP, де RP є одиницею відносної ефективності, визначеною за допомогою кількісного аналізу антигену PCV2 ELISA (тест на активність in vitro) порівняно з ефективною вакциною. Композиції експериментальної комбінації M.hyo/PCV2 оцінювали за допомогою PCV2 ELISA. Результати представлені на Фігурі 2. Як показано на Фігурі 2, тільки препарати M.hyo антигену після наступних даунстрім обробок були сумісними з PCV2 антигеном: Ультрафільтрація та Центрифугування (T04 & T05), Центрифугування (T06 та T07), Центрифугування плюс нагрівання (T08) та Супернатант, оброблений протеїном А (T10). Серед них, Супернатант M.hyo, оброблений протеїном А, був найбільш сумісним з PCV2 антигеном, у порівнянні з плацебо контролем, що включав гібридний вірус та Amphigen ад'ювант, проте не містив M.hyo антиген. Рівень гібридного вірусу PCV у супернатанті, обробленому протеїном А, становив 1,5 RP, порівняно з 1,69 RP для плацебо. Таким чином, заключили, що не існує або є мінімальна імунологічна інтерференція між препаратом розчинного антигену M.hyo, обробленого протеїном А, та PCV2 антигеном гібридного вірусу. Ефективність in vivo Супернатанту M.hyo, обробленого протеїном А, продемонстрована у Прикладі 5 вище, разом з результатами описаними у цьому прикладі, вказує на Супернатант, оброблений протеїном А, є потенційно ефективною платформою для комбінацій M.hyo-PCV2. Приклад 7: Оцінка ефективності PCV2 комбінованої вакцини PCV2/M.hyo у одному флаконі у різних композиціях ад'юванту Це дослідження здійснювали для оцінки ефективності PCV2 у комбінованій вакцині PCV2/M.hyo у одному флаконі у різних композиціях ад'юванту. У цьому прикладі, антиген PCV2 представляв гібридний вірус PCV тип 1-тип 2 (Fostera PCV). Гібридний вірус об'єднували з препаратом розчинного антигену M.hyo, що по суті не містив IgG (тобто, супернатант, оброблений протеїном А). Обробка рідин: Ферментовану рідину з інактивованим M.hyo (описану вище у Прикладі 1), обробляли для кожної вказаної групи наступним чином. T02-T04: Повну ферментовану рідину, що містить живі клітини M. hyopneumoniae (описану вище) центрифугували при ~20,000xg (Sorvall RC5B) та збирали супернатант та стерилізували крізь фільтр 0,2 мкM. Протеїн A Сефароза (номер компоненту 17-5199-03, GE Healthcare) пакували у 1L хроматографічну колонку. Після видалення буферу для зберігання та обробки двома об'ємами колонки 1M оцтовою кислотою, смолу урівноважували 5-ма об'ємами колонки буферу 50 мM NaPO4/1M NaCl, pH 7,04. Приблизно 2 літри очищеної/профільтрованої рідини, що містить антиген M. Hyopneumoniae, пропускали крізь смолу Протеїн A зі швидкістю потоку 100 см/годину. Пропущену рідину збирали та стерилізували за допомогою фільтру 0,2 мкM. T05: це позитивний контроль, що відповідає Fostera PCV-подібній композиції (не містить M.hyo антигену). Вміст гібридного вірусу у цій Fostera PCV-подібній композиції становив приблизно рівень Мінімальної Імунізуючої Дози (MID) у композиції. Гібридний вірус включали у експериментальні вакцини PCV2/M.hyo у однаковій кількості. Всі експериментальні вакцини PCV2/M.hyo формулювали з різними композиціями ад'ювантів. Композиції експериментальної вакцини одержували з M.hyo антигенами, обробленими згідно обробок T02-T04 вище. Окрім цього, Обробка T01 відповідала плацебо (стерильний сольовий розчин). Всі вакцини стандартизували за допомогою p46 ELISA та фіксували тимеросолом. Ці експериментальні композиції описані у Таблиці 6 нижче, де символ * вказує на M.hyo антиген з супернатанту глобального посіву M.hyo, обробленого Протеїном A, та символ ** вказує на Досліджуваний Ветеринарний Продукт (ДВП) серійний. 20 UA 114504 C2 Таблиця 6 Експериментальні композиції вакцини PCV2/M.hyo використані для дослідження ефективності PCV2 5 Обробка ДВП серійний** T01 87-244-DK (Плацебо) T02 T03 L0611RK03 T05 L0611RK04 Антиген M.Hyo* Ад'ювант L0411RK08 L0411RK09 T04 Антиген PCV1-2 Немає даних 10 % SP олія 5 % Amphigen 7,5 RP 10 15 20 25 30 35 40 45 Інше Стерил. сол. розчин 1,6 RP Немає даних 5 % Amphigen + 5 % SLCD Немає даних 20 % SLCD Свиней віком 3 тижні внутрішньом'язово інокулювали однією дозою різних композицій вакцин, описаних у Таблиці 6 вище. Шістнадцять тварин включали у кожну з обролюваних груп. Тварин заражали через 21 добу після вакцинації вірулентним ізолятом PCV2 з досліджуваної станції. Фігура 3 є діаграмою, що показує результати віремії PCV2 (PCV2 кількісна ПЛР) одержані з різними платформами ад'ювантів. Зазначено, що віремію PCV2 використовували як первинну змінну ефективності. Результати віремії PCV2 представлені як ДНК копії/мл. Як показано на Фігурі 3, всі обробки мали значно менший рівень віремії порівняно з плацебо на 28, 35 та 42 (зараження на 21 добу) добу. 10 % SP-олія ад'ювант мав значно менший рівень віремії порівняно з 5 % Amphigen на 28 та 35 добу. 5 % Amphigen плюс 5 % SLCD ад'ювант мав значно менший рівень віремії порівняно з 5 % Amphigen на 28 та 35 добу. Платформа 20 % SLCD ад'юванту мав значно менший рівень віремії порівняно з 5 % Amphigen на 28, 35 та 42 добу. Серологія PCV2, PCV2 фекальних виділень, PCV2 назальних виділень, клітиноопосередкована імунна (КОІ) відповідь, виснаження лімфоїдної тканини та імуногістохімія (ІГХ) також моніторили як вторинні змінні ефективності. Ці результати будуть описані нижче. Фігура 4 є діаграмою, що показує результати PCV2 ELISA на 1, 20 та 42 добу дослідження (зараження здійснювали на 21 добу). Статус кожного зразка виражали як зразок до позитивного співвідношення (S/P). Як показано на Фігурі 4, 20 % SLCD було єдиною обробкою, що значно відрізнялась від плацебо (T01) як на 20-ту, так і на 42-гу добу. Також, 5 % Amphigen було єдиною обробкою, що значно не відрізнялась від плацебо на 20. Фігура 5 є діаграмою, що показує PCV2 фекальних виділень, одержаних у обробках T02-T04 проти плацебо (T01). Ці результати виражали як PCV2 ДНК копії/мл. Результати на Фігурі 5 вказують на те, що всі обробки мали значно менші фекальні виділення порівняно з плацебо на 42-гу добу. Окрім цього, 5 % Amphigen & 5 % SLCD (T04) мали значно менші фекальні виділення порівняно з 5 % Amphigen (T03) на 42-гу добу. Жодних інших різниць між обробками не зафіксовано. Фігура 6 є діаграмою, що показує PCV2 назальних виділень, одержаних у обробках T02-T04 проти плацебо (T01). Ці результати виражали як PCV2 ДНК копії/мл. Результати на Фігурі 6 вказують на те, що всі обробки мали значно менші назальні виділення порівняно з плацебо на 42-гу добу. Окрім цього, 20 % SLCD (T05) мала значно менші назальні виділення порівняно з 5 % Amphigen (T03) на 42-гу добу. Жодних інших різниць між обробками не зафіксовано. Фігури 7 (A та B) є двома графіками, що показують результати тесту інтерферон-гама (IFNγ), що вимірює PCV2-специфічну клітино-опосередковану імунну (КОІ) відповідь. Результати КОІ показані як після вакцинації/перед зараженням (Фігура 7A), та після вакцинації/після зараження 6 (Фігура 7B). На цих графіках, стимулювання 5×10 клітин вважали значимим (…). Всі експериментальні вакцини PCV2/M.hyo дали здатну до виявлення IFN- γ відповідь після вакцинації. 10 % SP-олія (T02) дала найсильнішу IFN- γ відповідь після вакцинації. 20 % SLCD (T05) викликала саму ранню відповідь, проте найнижчу відповідь на 20-ту добу. Спостерігали значну відповідь після зараження, особливо у групі плацебо. Окрім цього, відповідь після зараження була нижчою у групах з вакцинованими свинями, порівняно з групою плацебо. 21 UA 114504 C2 Таблиця 7 нижче показує виснаження лімфоїдної тканини, одержане експериментальними обробками на контрасті з плацебо. Таблиця 7 Гістопатологія PCV2 (виснаження лімфоїдної тканини) 5 Обробка Плацебо 10 % SPолія 5 % Amph. 5 % Amph. +5 % SLCD 20 % SLCD 10 Виснаження лімфоїдної тканини Позитивне Негативне % постійно поз. 9 7 56 % 1 15 6% Контраст з Плацебо P-значення Значимість Немає даних 0,0059 Немає даних Так 1 0 15 16 6% 0% 0,0059 0,0008 Так Так 1 15 6% 0,0059 Так Результати представлені у Таблиці 7 вище показують, що всі вакцини дали значний захист проти виснаження лімфоїдної тканини. Також, не спостерігали статистично значимих контрастів між обробками вакцин. Таблиця 8 нижче показує імуногістохімію, одержану від експериментальних обробок порівняно з плацебо. Таблиця 8 Гістопалогія PCV2 (імуногістохімія) Імуногістохімія Обробка Позитивне Негативне Плацебо 12 10 % SP-олія Контраст з Плацебо P-значення Значимість 4 % постійно поз. 75 % Немає даних Немає даних 0 16 0% 0,0001 Так 5% Amphigen 1 15 6% 0,0002 Так 5% Amph. +5 % SLCD 0 16 0% 0,0001 Так 20 % SLCD 0 16 6% 0,0001 Так 15 20 25 30 Результати представлені у Таблиці 8 вище показують, що всі вакцини дали значний захист проти PCV2 колонізації, що підтверджено імуногістохімією. Також, не спостерігали статистично значимих контрастів між обробками вакцин. У висновок, результати представлені у цьому прикладі демонструють, що розчинний препарат антигену M.hyo не заважає ефективності PCV2. Результати також демонструють, що всі експериментальні композиції вакцин PCV/M.hyo мають ефективність проти зараження PCV2. Окрім цього, результати вказують на те, що існують деякі статистичні та цифрові різниці, одержані з різними композиціями ад'юванту, де 10 % SP-олія дала найбільшу ефективність. Приклад 8: Оцінка ефективності M.hyo комбінованої вакцини PCV2/M.hyo у одному флаконі з різними композиціями ад'юванту Це дослідження проводили для оцінки ефективності M.hyo комбінованої вакцини PCV2/M.hyo у одному флаконі з різними композиціями ад'юванту. Антиген M.hyo комбінували з цирковірусом свиней (тип 1-тип 2 гібрид, або PCV1-2, вбитий вірус) у одному флаконі. Обробка рідин: Ферментовану рідину з інактивованим M.hyo (описану вище у Прикладі 1) обробляли для кожної групи наступним чином. T02-T04: Ці обробки були такими ж як описані для груп T02-T04 у Прикладі 7 вище. T05: формулювали з інактивованими клітинами M.hyo (M.hyo бактерин), як описано у Прикладі 1 вище, під назвою "Ферментація та інактивація". 22 UA 114504 C2 5 Всі експериментальні вакцини PCV2/M.hyo формулювали з різними композиціями ад'юванту. Композиції експериментальної вакцини одержували з антигенами M.hyo, обробленими згідно обробок T02-T04. Окрім цього, Обробка T01 відповідала плацебо (стерильний сольовий розчин). Обробка T05 є позитивним контролем що відповідає вакцині RespiSure® з закінченим терміном придатності, яка представляє собою вакцину на основі бактерину M.hyo (Pfizer Animal Health). Ці експериментальні композиції описані у Таблиці 9 нижче, де символ * означає супернатант M. hyo антигену з глобального посіву M.hyo, обробленого Протеїном A, та символ** означає Досліджуваний Ветеринарний Продукт (ДВП) серійний. 10 Таблиця 9 Композиції експериментальної вакцини PCV2/M.hyo використані для дослідження ефективності M.hyo з різними композиціями ад'юванту Обробка ДВП серійний** T01 T04 20 25 L0611RK03 T05 15 L0411RK09 A827870 ад'ювант L0411RK08 T03 Антиген M Hyo* 87-244-DK (Плацебо) T02 антиген PCV1-2 Немає даних Інше Стерил. сольовий розчин 10 % SP олія 1,6 RP 7,5 RP 5 % Amphigen Немає даних 5 % Amphigen + 5 % SLCD Вакцина "RespiSure" з закінченим терміном придатності Свиней віком 3 тижні внутрішньом'язово інокулювали однією дозою різних композицій вакцин, описаних у Таблиці 9 вище. Чотирнадцять тварин включали як в плацебо, так і в 10 % SP-олія групи, тринадцять тварин включали у групу позитивного контролю, та шістнадцять тварин включали як в групу 5 % Amphigen так і в 5 % Amphigen+5 % SLCD. Тварин заражали через 21 добу після вакцинації вірулентним ізолятом M.hyo з досліджуваної станції. Трупи тварин розрізали на 28-му добу після зараження та легені видаляли та оцінювали на вміст згущень сумісних з інфекцією M.hyo. Таблиця 10 нижче містить оцінки уражень легень для відповідних груп обробки. Статистична значимість визначалась за аналізом змішаної моделі оцінок легень у кожній групі. Таблиця 10 Ураження легень M.hyo Обробка Плацебо (T01) 14 LS середнє ураження легень 13,1 % 10 % SP-олія (T02) 14 4,3 % 0,0-50,8 5 % Amphigen (T03) 16 4,7 % 0,0-38,5 5 % Amphigen+5 % SLCD (T04) 16 12,0 % 0,1-55,8 RSO з закінченим строком дії (T05) 30 Кількість тварин діапазон % ураження легень 0,1-50,5 13 2,28 % 0,0-34,5 Як вказано у Таблиці 10 вище, група плацебо мала середню оцінку ураження легень 13,1 %, порівняно з групами 10 % SP-олія та 5 % Amphigen, які мали середню оцінку ураження легень 4,3 % та 4,7 %, відповідно. Як композиція 10 % SP-олія, так і 5 % Amphigen зменшували та/або запобігали ураження легень. Таким чином, експериментальні вакцини PCV/M.hyo формульовані 23 UA 114504 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з 10 % SP-олія або 5 % Amphigen вважаються ефективними. PCV2 антиген не перешкоджає ефективності M.hyo і цих композиціях. Навпаки, група 5 % Amphigen+5 % SLCD мала середня рівень ураження легень 12,0 %. Що було неприйнятним результатом, оскільки він не відрізнявся порівняно з плацебо. В результаті, експериментальна вакцина PCV/M.hyo формульована з 5 % Amphigen+5 % SLCD не вважається ефективною. Відмічено, що внаслідок зменшеній кількості тварин та значній варіабельності оцінки ураження легень, не можливо продемонструвати статистичний вплив обробки у цьому дослідженні. З цієї причини, вирішили, що інше дослідження розроблять для тестування ефективності M.hyo експериментальних композицій PCV/M.hyo у 10 % SP-олія. Це повторюване дослідження представлено у Прикладі 9 нижче. Приклад 9: Оцінка ефективності M.hyo комбінованої вакцини PCV2/M.hyo у одному флаконі у 10 % SP-олія Це дослідження розроблене для оцінки ефективності фракції M.hyo у чотирьох експериментальних вакцинах PCV2/M.hyo (серійні номери L0711RK11, L0711RK12, L0711RK13 та L0711RK14 у Таблиці 11 нижче), одержаних за різними способами одержання M.hyo, які використовують Протеїн A для видалення IgG порівняно з контрольними вакцинами, одержаними за стандартним способом одержання M.hyo. Кожна з цих чотирьох експериментальних вакцин PCV2/M.hyo включає 10 % SP-олія як ад'ювант. Обробка рідин: T02: Інактивований M. hyopneumoniae антиген як описано у "Ферментація та Інактивація" у Прикладі 1 вище. T03 та T04: Формульовані з інактивованими клітинами M. hyopneumoniae, як описано у "Ферментація та Інактивація" у Прикладі 1 вище. T05: Обробку середовища Протеїном A використовували для росту M. hyopneumoniae. PPLO (походження від свинячого серця) одержували за інструкцією виробників (тобто, 21 г/л) та розчин екстракту дріжджів готували з концентрацією 21 г/л у USP. Розчин дріжджового екстракту додавали до PPLO з концентрацією 6,25 %, та суміш стерилізували, нагріваючи до 121 °C протягом > 30 хвилин. Гідрохлорид цистеїну одержували з концентрацією 90 г/л та стерилізували фільтруванням. Розчин декстрози одержували додаванням 450 г декстрози на літр USP води, після чого стерилізували нагріванням. Для одержання кінцевого середовища, свинячу сироватку додавали до основного середовища з концентрацією 10 %, після чого цистеїн з концентрацією 0,01 % та декстрозу з концентрацією 1,0 %. Антитіла у повному середовищі PPLO видаляли обробкою протеїном A. Коротко, 1 л Протеїн A Сефароза (номер партії 17-5199-03 GE Healthcare) пакували у скляну колонку (10×11,5 см). Після видалення буферу для зберігання, колонку обробляли 2 об'ємами колонки 1M. Смолу урівноважували 5-ма об'ємами колонки буферу 50 мM NaPO4, 1M NaCl (pH 7,0). 15 л повного PPLO середовища завантажували на смолу при лінійній швидкості потоку 140 см/годину. Прогонку колонки збирали та стерилізували фільтруванням крізь фільтр 0,2 мікрони (Sartorius). Оброблене середовище використовували для розмноження клітин M. hyopneumoniae як описано у "Ферментація та Інактивація" вище. Повністю інактивовану культуру (включаючи клітини) формулювали у кінцеву вакцину. T06: Інактивовані клітини M. hyopneumoniae одержували як описано у "Ферментація та Інактивація" у Прикладі 1 вище. Інактивовану ферментаційну рідину центрифугували при ~20,000xg (Sorvall RC5B) протягом 30 хв. та супернатант стерилізували фільтрацією 0,2 мкM. 115 мл Протеїн A смоли (номер партії 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) пакували у хроматографічну колонку (5×6 см). Після видалення буферу для зберігання та обробки двома об'ємами колонки 1M, смолу урівноважували 5-ма об'ємами колонки буферу 50 мM NaPO4/1M NaCl, pH 7,01. Приблизно 1,2 літри очищеної/профільтрованої рідини, що містить антиген M. Hyopneumoniae, пропускали крізь смолу зі швидкістю потоку 120 см/годину. Пропущену рідину збирали та стерилізували за допомогою фільтру 0,2 мкM. T07: Інактивовані клітини M. hyopneumoniae одержували як описано у "Ферментація та Інактивація" у Прикладі 1 вище. Інактивовану ферментаційну рідину очищували фільтрацією тангенціальним потоком. Коротко, фільтр з поліптер сульфону (GE HealthCare, номер партії 564102-71) з номінальним розміром пор 0,2 мкM санували 0,5N розчином гідроксиду натрію, після чого ретельно промивали стерильною USP водою. Інактивовану культуральну рідину mycoplasma вводили у апарат зі швидкістю рециркуляції, що наближалась до 14,6 л/хв. та трансмембранним тиском 2-3,4 PSI. Очистку здійснювали при кімнатній температурі. Пермеат фільтру збирали та зберігали при 2-8C до подальшої обробки. 115 мл Протеїн A смола (номер партії 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) пакували у хроматографічну колонку (5×6 см). 24 UA 114504 C2 5 10 15 20 Після видалення буферу для зберігання та обробки двома об'ємами колонки 1M, смолу урівноважували 5-ма об'ємами колонки буферу 50 мM NaPO4/1M NaCl, pH 7,01. Приблизно 2,3 літри очищеної/профільтрованої рідини, що містить антиген M. Hyopneumoniae, пропускали крізь смолу зі швидкістю потоку 120 см/годину. Пропущену рідину збирали та стерилізували за допомогою фільтру 0,2 мкM. T08: Інактивовані клітини M. hyopneumoniae одержували як описано у "Ферментація та Інактивація" вище. Інактивовану ферментаційну рідину центрифугували при ~20,000xg (Sorvall RC5B) протягом 30 хв., та супернатант стерилізували фільтром 0,2 мкM. 115 мл Протеїн A Сефароза (номер партії 17-5199-03 GE Healthcare) пакували у хроматографічну колонку (5 × 6 ми). Після видалення буферу для зберігання та обробки двома об'ємами колонки 1M, смолу урівноважували 5-ма об'ємами колонки буферу 50 мM NaPO4/1M NaCl, pH 7,01. Приблизно 1,2 літри очищеної/профільтрованої рідини, що містить антиген M. Hyopneumoniae, пропускали крізь смолу зі швидкістю потоку 120 см/годину. Пропущену рідину збирали та стерилізували за допомогою фільтру 0,2 мкM. Композиції експериментальної вакцини одержували з антигенами M.hyo, обробленими згідно обробок T02-T08 вище. T02, T03 та T04 відповідають позитивним контролям. Окрім цього, Обробка T01 відповідала плацебо (стерильний сольовий розчин). Ці експериментальні композиції описані у Таблиці 11 нижче. M.hyo антиген відповідає M.hyo антигену з супернатанту глобального посіву M.hyo, обробленого Протеїном A. Інформація у розділі "Обробка Протеїном A" вказує чи супернатант M.hyo обробляли Протеїном A перед або після ферментації. Таблиця 11 Композиції експериментальної вакцини PCV2/M.hyo використані для дослідження ефективності M.hyo у ад'юванті SP-олія Обробка Серійний номер Т01 L0311AS11 PCV12 Ag M. Hyo Ag Обр.-ка пр. А Спосіб очистки суперту. Бренд пр. А Ад'ювант стерил. сольовий розчин Немає даних Т02 Т03 A828718 L0711RK09 Т04 L0711RK10 Т05 Т06 Т07 Т08 L0711RK11 L0711RK12 L0711RK13 L0711RK14 Нд 1,5 RP Нд 1,5 RP 13 7,5 RP Інше Amphigen M. Hyo PCV2 M. Hyo PCV2 перед після після після нд без обр.-ки пр. А та з 10 % SP олія без обр.-ки пр. А та без нд центрифуг. фільтр центрифуг. сефароза вибір Мab вибір Мab сефароза 25 30 35 40 Свиней віком 3 тижні внутрішньом'язово інокулювали однією дозою різних композицій вакцин, описаних у Таблиці 11 вище. У кожну групу обробки включали по 18 свиней. Тварин заражали через 21 добу після вакцинації вірулентним ізолятом M.hyo з досліджуваної станції. Трупи тварин розрізали на 28-добу після зараження та легені видаляли та оцінювали на вміст згущень сумісних з інфекцією M.hyo. Фігура 8 (A та B) показують оцінку ураження легень для відповідних груп обробки. Статистична значимість визначалась за аналізом змішаної моделі оцінок легень у кожній групі. Результати ураження легень, показані на Фігурах 8A та 8B вказують на те, що серед всіх обробок тільки дві (T07 та T08) мали 100 % свиней в категорії