Новий спосіб запобігання або лікування інфекції m. tuberculosis

Реферат: Винахід належить до способів запобігання реактивації активної або латентної інфекцій М. tuberculosis шляхом введення фармацевтичної композиції, що включає нуклеїнову кислоту, яка кодує Mtb72f злитий білок, або Mtb72f злитий білок, або його імуногенний фрагмент, наприклад, UA 98605 C2 (12) UA 98605 C2 разом з ад'ювантом. Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок можуть вводитися з одним або більше з хіміотерапевтичних агентів, ефективних проти інфекції М. tuberculosis. Способи також забезпечують скорочення часу курсу хіміотерапевтичного режиму проти інфекції М. tuberculosis. UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Даний винахід відноситься до способів запобігання або лікування реактивації інфекції М. tuberculosis у ссавця та до способів вкорочення тривалості курсу хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis. Передумови створення винаходу Туберкульоз представляє собою інфекційне захворювання, що спричинене інфекцією М. tuberculosis та іншими видами Mycobacterium. Він є основним захворюванням у країнах, що розвиваються, а також представляє собою проблему, що росте, у розвинутих областях світу, приблизно з 8 мільйонами нових випадків та 3 мільйонами смертей щорічно. Незважаючи на те, що інфекція може бути безсимптомною протягом значного періоду часу, захворювання найбільш часто проявляється як гостре запалення легень, що приводить до лихоманки та обструктивного кашлю. При відсутності лікування це, звичайно, призводить до ускладнень та смерті. Незважаючи на те, що туберкульоз може в загальному випадку піддаватися лікуванню при застосуванні тривалої антибіотикотерапії, таке лікування не є достатнім для запобігання поширення захворювання. Інфіковані індивідууми можуть бути безсимптомними, але контагіозними, протягом деякого часу. Крім того, незважаючи на те, що дотримання режиму є критичним, поведінку пацієнта важко піддавати спостереженню. Деякі пацієнти не додержуються курсу лікування, що може призводити до неефективного лікування та розвитку стійкості до лікарських засобів. Навіть тоді, коли закінчено повний курс лікування, інфекція М. tuberculosis не поширюється від інфікованого індивідуума, але залишається як латентна інфекція, яка може повторно активуватися. Для того, щоб контролювати поширення туберкульозу, є важливими ефективна вакцинація та точний ранній діагноз захворювання. На сьогоднішній день вакцинація живими бактеріями є найбільш ефективним способом для індукції протективного імунітету. Найбільш загальною мікобактерією, що використовується для цієї мети, є Bacillus Кальметта-Герена (BCG), авірулентний штам М. bovis. Проте безпечність та ефективність BCG є джерелом дискусій, а деякі країни, такі, як США, не вакцинують населення цим агентом. Діагностику туберкульозу, звичайно, проводять при використанні шкірного тесту, що передбачає інтрадермальне введення туберкулінової PPD (похідна на основі очищеного білка). Антиген-специфічні відповіді Т-клітин приводять до здатної до вимірювання індурації у місці ін'єкції через 48-72 години після введення, що свідчить про піддання дії мікобактеріальних антигенів. Проте чутливість та специфічність є проблемою у цьому аналізі, крім того, неможливо відрізнити індивідуумів, вакцинованих BCG, від інфікованих індивідуумів. Оскільки макрофаги, як було показано, діють як основні ефектори імунітету до Mycobacterium, Т-клітини є основними індукторами такого імунітету. Суттєва роль Т-клітин у захисті від інфекції Mycobacterium ілюструється частою появою інфекції Mycobacterium у + пацієнтів зі СНІДом, завдяки виснаженню CD4 Т-клітин, асоційованих з інфекцією, що + викликається вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ). Mycobacterium-реактивні CDA Т-клітини були продемонстровані як потужні продуценти -інтерферону (IFN-), який, у свою чергу, був показаний, як такий, що запускає антимікобактеріальні ефекти у мишей. У той час як роль IFN- у людей є менш зрозумілою, дослідження показали, що 1,25-дигідрокси-вітамін D3, або самостійно, або у комбінації з IFN- або фактором некрозу пухлин альфа, активує макрофаги людини для інгібування інфекції М. tuberculosis. Крім того, є відомим, що IFN- стимулює макрофаги людини з утворення 1,25-дигідрокси-вітаміну D3. Подібно до цього інтерлейкін-12 (IL12) був продемонстрований як такий, що грає роль у стимуляції стійкості до інфекції М. tuberculosis. Для огляду імунології інфекції М. tuberculosis, див. Chan & Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Bloom ред., 1994), Tuberculosis (2-е вид., Rom and Garay, ред., 2003), та Harrison's Principles of Internal Medicine, розділ 150, стор. 953-966 (16-е вид., Braunwald та ін., ред., 2005). Все ще існує потреба в ефективних стратегіях лікування для запобігання реактивації інфекцій Mycobacterium tuberculosis, як активної, так і латентної. Даний винахід вирішує цю задачу та інші потреби. Опис приведених послідовностей SEQ ID No: 1: Mtb72f з N-термінальною 6 His міткою (ДНК) SEQ ID No: 2: Mtb72f з N-термінальною 6 His міткою (білок) SEQ ID No: 3: M72 (варіант Mtb72f) з N-термінальною 2 His інсерцією (ДНК) SEQ ID No: 4: M72 (варіант Mtb72f) з N-термінальною 2-His інсерцією (білок) SEQ ID No: 5: Mtb72f без N-термінальної His інсерції (ДНК) SEQ ID No: 6: Mtb72f без N-термінальної His інсерції (білок) 1 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Короткий виклад суті винаходу Даний винахід забезпечує фармацевтичні композиції, що включають Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу, наприклад, разом з одним або більше ад'ювантами, включаючи AS01B та AS02A. Даний винахід частково базується на відкритті винахідниками того факту, що введення Mtb72f злитого білка або його імуногенного фрагменту, наприклад, разом з одним або більше ад'ювантами або нуклеїновою кислотою, що кодує Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент, може запобігати або лікувати реактивацію активної або неактивної інфекції М. tuberculosis. У бажаному втіленні Mtb72f злитий білок або нуклеїнова кислота вводиться з одним або більше хіміотерапевтичними агентами, ефективними проти інфекції М. tuberculosis. В одному аспекті у способах запобігання або лікування реактивації туберкульозу в особи використовуються композиції, при цьому спосіб включає етап введення ссавцю, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу та ад'ювант, де Mtb72f злитий білок індукує імунну відповідь проти М. tuberculosis, запобігаючи або лікуючи, таким чином, реактивацію туберкульозу. В іншому аспекті у способах запобігання або лікування реактивації туберкульозу в особи використовуються композиції, при цьому спосіб включає етап введення ссавцю, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає нуклеїнову кислоту, яка кодує Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу, де експресований Mtb72f злитий білок індукує імунну відповідь проти М. tuberculosis, запобігаючи або лікуючи, таким чином, реактивацію туберкульозу. В іншому аспекті у способах зменшення тривалості курсу лікування та хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis використовуються композиції, при цьому спосіб включає етап введення ссавцю, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, одного або більше хіміотерапевтичних агентів, ефективних проти інфекції М. tuberculosis, та імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу та ад'ювант, де Mtb72f злитий білок індукує імунну відповідь проти М. tuberculosis, дозволяючи, таким чином, зменшити тривалість курсу хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis. Завдяки зменшенню тривалості курсу хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis дані способи є також ефективними у поліпшенні прийнятності повного курсу лікування для індивідуума, який піддається лікуванню від інфекції М. tuberculosis. Короткий опис малюнків Фігура 1 графічно представляє модель реактивації М. tuberculosis у Swiss Webster мишей (SWR/J). Фігура показує моменти інфекції, хіміотерапевтичного лікування (50 мг рифампіну/85 мг ізоніазиду на літр води для пиття), імунізацій та підрахунку бактеріального навантаження/колонієутворювальних одиниць (КУО). Фігура 2 показує імунні відповіді lgG1 та lgG2a антитіл у SWR/J мишей, інфікованих М. tuberculosis, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. Мишей залишали без обробки, піддавали хіміотерапії (50 мг рифампіну/85 мг ізоніазиду на літр води для пиття) або три рази піддавали хіміотерапії та імунізації внутрішньом'язово за допомогою 8 мкг на дозу Mtb72f, рецептованого без ад'юванта. Через 10 днів після останньої імунізації у мишей забирали кров, та сироватку перевіряли на відповідь aHTH-Mtb72f антитіл ізотипів lgG1 (червоний) та lgG2a (чорний) за допомогою ELISA. Фігура 3 показує імунну відповідь lgG1 та lgG2a антитіл у SWR/J мишей, інфікованих М. tuberculosis, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. Мишей залишали без обробки, піддавали хіміотерапії (50 мг рифампіну/85 мг ізоніазиду на літр води для пиття) або три рази піддавали хіміотерапії та імунізації внутрішньом'язово за допомогою 8 мкг на дозу Mtb72f, рецептованого з ад'ювантом AS01B. Через 10 днів після останньої імунізації у мишей забирали кров, та сироватку перевіряли на відповідь aнти-Mtb72f антитіл ізотипів lgG1 (червоний) та lgG2a (чорний) за допомогою ELISA. Фігура 4 показує відповіді інтерферону-гамма (IFN-) у SWR/J мишей, інфікованих М. tuberculosis, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. З мишей одержували клітини селезінки у різні моменти часу та піддавали стимуляції in vitro протягом трьох днів за допомогою 10 мкг/мл або pMtb72f, або його компонентів (Mtb32 c та Mtb39), як зазначено. Як контролі, культури спленоцитів також стимулювали за допомогою або PPD (3 мкг/мл), або лізату BCG (10 мкг/мл), або соnА (3 мкг/мл), або тільки середовища. Послідовно вимірювали продукцію IFN- за допомогою ELISA. 2 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 5 показує відповіді IFN- у SWR/J мишей, інфікованих М. tuberculosis, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. З мишей одержували клітини селезінки у різні моменти часу та піддавали стимуляції in vitro протягом трьох днів за допомогою 10 мкг/мл або pMtb72f, або його компонентів (Mtb32c та Mtb39), як зазначено. Як контролі, культури спленоцитів також стимулювали за допомогою або PPD (3 мкг/мл), або лізату BCG (10 мкг/мл), або соnА (3 мкг/мл), або тільки середовища. Послідовно вимірювали продукцію IFN- за допомогою ELISA. Фігура 6 показує відповіді CD4+ Т-клітин та IFN- цитокінуу SWR/J мишей, інфікованих М. tuberculosis, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. З мишей одержували клітини селезінки у різні моменти часу та піддавали стимуляції in vitro протягом ночі за допомогою 10 мкг/мл pMtb72f. Ці клітини потім забарвлювали для виявлення CD4 та IFN-. Як контроль, культури спленоцитів також стимулювали тільки за допомогою середовища. Продукцію специфічного для CD4+ Т-клітин IFN-+ вимірювали після цього шляхом забарвлювання внутрішньоклітинного цитокіну (ICS). Фігура 7 показує табличне підсумовування значень продукції специфічного для CD4+ та CD8+ Т-клітин IFN-+ через 120 днів після інфекції Mtb. Клітини селезінки одержували з групи мишей, яких не піддавали обробці, піддавали обробці протягом 30, 60 або 90 днів шляхом комбінаційної терапії, або піддавали обробці при використанні комбінаційної терапії як допоміжного заходу до вакцинації Mtb72f. Спленоцити стимулювали протягом ночі за допомогою 10 мкг/мл pMtb72f. Потім клітини забарвлювали для виявлення CD4, CD8 або IFN-. Як контроль, культури спленоцитів також стимулювали тільки за допомогою середовища. Продукцію специфічного для CD4+ та CD8+ Т-клітин IFN-+ вимірювали після цього шляхом забарвлювання внутрішньоклітинного цитокіну. Фігура 8 показує виживання інфікованих М. tuberculosis SWR/J мишей, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. Мишей інфікували за допомогою аерозолю, що містить 50-100 КУО MtbH37Rv, а хіміотерапію (50 мг рифампіну/85 мг ізоніазиду на літр води для пиття) розпочинали у підмножині мишей через 30 днів. Хіміотерапію продовжували протягом 60 днів. Половину тих мишей, що одержували хіміотерапію, тричі піддавали імунізації внутрішньом'язово за допомогою 8 мкг на дозу Mtb72f, рецептованого з ад'ювантом AS01B. Фігура 9 виживання інфікованих М. tuberculosis SWR/J мишей, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. Мишей інфікували за допомогою аерозолю, що містить 50-100 КУО MtbH37Rv, а хіміотерапію (50 мг рифампіну/85 мг ізоніазиду на літр води для пиття) розпочинали у підмножині мишей через 30 днів. Хіміотерапію продовжували протягом 30, 60 або 90 днів у різних підмножині мишей. Половину тих мишей, що одержували хіміотерапію, тричі піддавали імунізації внутрішньом'язово за допомогою 8 мкг на дозу Mtb72f, рецептованого з ад'ювантом AS01B. Детальний опис специфічних втілень Даний винахід відноситься до композицій, що включають нуклеїнові кислоти Mtb72f або злиті білки та ад'ювант, корисних для лікування, запобігання або відстрочення реакцтивації активної або неактивної (тобто латентної) інфекції Mycobacterium, та способів їх застосування. Зокрема, композиції згідно з даним винаходом включають Mtb72f злиті поліпептиди або їх імуногенні фрагменти або нуклеїнові кислоти, що кодують Mtb72f злиті поліпептиди або їх імуногенні фрагменти, які містять компоненти з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу, наприклад, видів, таких, як М. tuberculosis, М. bovis або М. africanum, або видів Mycobacterium, що є присутніми у навколишньому середовищі або є опортуністичними, та таких, що викликають опортуністичні інфекції, такі, як інфекції легень у хазяїв з порушеним імунітетом (наприклад, у пацієнтів зі СНІДом), наприклад, BCG, M. avium, M. intraceliular, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, М. fortuitum та М. scrofulaceum (див., наприклад, Harrison's Principles of Internal Medicine, Розділ 150, стор. 953-966 (16-е вид., Braunwald, та ін., ред., 2005). Винахідники згідно з даним винаходом несподівано виявили, що композиції, які включають Mtb72f злиті поліпептиди або нуклеїнові кислоти, що кодують Mtb72f злиті поліпептиди, або їх імуногенні фрагменти, є корисними у лікуванні, запобіганні та відстроченні реактивації інфекції М. tuberulosis. У бажаному втіленні Mtb72f злитий поліпептид або нуклеїнова кислота вводяться з одним або більше хіміотерапевтичними агентами. Такі композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти, що їх кодують, є, таким чином, корисними для того, щоб викликати імунну відповідь у ссавців, що захищає проти реактивації симптомів захворювання. Mtb72f нуклеїнові кислоти та злиті поліпептиди даного винаходу можуть також включати інші компоненти, призначені для підсилення їх антигенності або для поліпшення цих антигенів в 3 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інших аспектах. Наприклад, поліпшена ізоляція злитих поліпептидних антигенів може бути удосконалена шляхом додання подовжувальних залишків гістидину до одного кінця антигену. Композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть включати додаткові копії антигенів або додаткові гетерологічні поліпептиди з Mycobacterium sp., такі, як МТВ8.4 антиген, МТВ9.8 антиген, МТВ9.9 антиген, МТВ40 антиген, МТВ41 антиген, ESAT-6 антиген, МТВ85 комплексний антиген, а-кристалічний антиген або NS1 антиген. Альтернативно або додатково, композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть включати додаткові копії інших антигенів з Mycobacterium sp., такі, як Ад85В або МТСС#2. Композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть також включати додаткові поліпептиди з інших джерел. Наприклад, композиції та злиті білки згідно з винаходом можуть включати поліпептиди або нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди, де поліпептид сприяє експресії антигену, наприклад, NS1, білок вірусу грипу (див., наприклад, WO99/40188 та WO93/04175). Нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть бути одержані на основі переважних кодонів у вибраних видів, наприклад, людей. Композиції на основі Mtb72f злитого білка, звичайно, включають один або більше ад'ювантів, наприклад, AS01B (монофосфорил ліпід A (MPL) та QS21 у складі ліпосом; див., патентна публікація США №2003/0143240); AS02A (3D-MPL та QS21 та емульсію масло-у-воді; див., Bojang, та ін., Lancet (2001) 358:1927); ENHANZYN (Detox); 3D-MPL; сапоніни, включаючи Quil А та його компоненти, наприклад, QS21, та міметики сапоніну; CWS; TDM; AGP; імуностимуляторні олігонуклеотиди, наприклад, CPG; Leif; та їх похідні. У бажаному втіленні Mtb72f злитий поліпептид вводиться разом з одним або більше ад'ювантами, вибраними з групи, що включає 3D-MPL та QS21 у складі ліпосом, наприклад, AS01B, MPL та QS21, а також у формі емульсії масло-у-воді (наприклад, AS02A). Ад'юванти AS01B та AS02A є також описаними у Pichyangkul, та ін., Vaccine (2004)22:383140. При доставці Mtb72f антигену у вигляді нуклеїнової кислоти, він може доставлятися, наприклад, у вірусному векторі (наприклад, у складі аденовірусного вектора), або у мутантній хазяйській бактеріальній клітині (тобто, мутантній, авірулентній Mycobacterium, Lactobacillus або Bacillus хазяйській клітині, включаючи Bacillus Кальметта-Герена (BCG) та Lactococcus lactis). В одному аспекті композиції використовуються в способах для запобігання або лікування реактивації туберкульозу в особи, при цьому спосіб включає етап введення ссавцеві, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу та ад'ювант, де Mtb72f злитий білок індукує імунну відповідь проти М. tuberculosis, запобігаючи, таким чином, реактивації туберкульозу. При використанні способів згідно з даним винаходом, реактивація інфекції М. tuberculosis може бути відстрочена (наприклад, на період кілька місяців, років або на невизначений період). В одному аспекті композиції використовуються у способах для запобігання або лікування реактивації туберкульозу в особи, при цьому спосіб включає етап введення ссавцеві, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає нуклеїнову кислоту, яка кодує Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу, де Mtb72f злитий білок індукує імунну відповідь проти М. tuberculosis, запобігаючи, таким чином, реактивації туберкульозу. В одному втіленні Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок вводиться індивідууму з активною інфекцією М. tuberculosis. В одному втіленні Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок вводиться індивідууму з неактивною або латентною інфекцією М. tuberculosis. В одному втіленні Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок вводиться індивідууму, інфікованому мультирезистентним штамом М. tuberculosis. В одному втіленні Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок вводиться індивідууму, якого раніше було імунізовано за допомогою Bacillus Кальметта-Герена (BCG). В деяких втіленнях Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок вводиться з одним або більше хіміотерапевтичних агентів, ефективних проти інфекції М. tuberculosis. Приклади таких хіміотерапевтичних агентів включають, але не обмежуються, амікацин, аміносаліцилову кислоту, капреоміцин, циклосерин, етамбутол, етіонамід, ізоніазид, канаміцин, піразинамід, рифаміцини (тобто, рифампін, рифапентин та рифабутин), стрептоміцин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитроміцин, азитроміцин та флуорохінолони. Така хіміотерапія визначається заключенням практикуючого лікаря при використанні бажаних комбінацій лікарських засобів. Хіміотерапевтичні агенти «першої черги», що використовуються для лікування інфекції М. tuberculosis, що не є мультирезистентною, включають ізоніазид, рифампін, етанбутол, стрептоміцин та піразинамід. Хіміотерапевтичні агенти «другої черги», що 4 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовуються для лікування інфекції М. tuberculosis, яка демонструє стійкість до одного або більше лікарських засобів «першої черги» включають офлоксацин, ципрофлоксацин, етіонамід, аміносаліцилову кислоту, циклосерин, амікацин канаміцин та капреоміцин. Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок можуть вводитися перед, одночасно або після введення одного або більше хіміотерапевтичних агентів, ефективних проти інфекції М. tuberculosis. В одному втіленні Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок вводиться приблизно через 2 тижні після початку введення одного або більше хіміотерапевтичних агентів. Один або більше хіміотерапевтичних агентів в загальному випадку вводяться протягом періоду часу, наприклад, приблизно 1, 2, 3 або 4 тижні, 2, 3, 4, 5, 6 або 8 місяців, 1 рік або довше. В окремих втіленнях ефект Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого білка посилюється шляхом введення Bacillus Кальмета - Герена (BCG). У деяких втіленнях після примування або першого введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду проводять одне або більше "бустерних" введень або подальше введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду (спосіб "примування (сенсибілізації) та бустеризації (стимулювання)"). Наприклад, після першого введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду проводять одне або більше введень Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого білка. В одному втіленні після першого введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду проводять одне або більше введень Mtb72f злитого поліпептиду. В одному втіленні після першого введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду проводять одне або більше введень Mtb72f нуклеїнової кислоти. Звичайно, перше або "примувальне" введення та друге або "бустерне" введення має інтервал 2-12 тижнів, або інтервал до 4-6 місяців. Подальші "бустерні" введення проводять з інтервалом приблизно 6 місяців або з інтервалом 1, 2, 3, 4 або 5 років. Традиційна бустерна обробка (наприклад, коли після примувального введення білка здійснюють бустерне введення) є також корисною у запобіганні або лікуванні реактивації М. tuberculosis. В іншому аспекті композиції використовуються у способах зниження або вкорочення курсу хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis, при цьому спосіб включає етап введення ссавцеві, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, одного або більше хіміотерапевтичних агентів, ефективних проти інфекції М. tuberculosis та імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає Mtb72f злитий поліпептид або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу та ад'ювант, де вказаний Mtb72f злитий поліпептид індукує імунну відповідь на М. tuberculosis, дозволяючи, таким чином, знизити або вкоротити курс хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis. Звичайно, введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду буде дозволяти проводити ефективне хіміотерапевтичне лікування інфекції М. tuberculosis протягом періоду 6 місяців, 5 місяців, 4 місяців, 3 місяців або менше. Композиції Mtb72f, звичайно, вводяться людям, але є ефективними для інших ссавців, включаючи домашніх ссавців (тобто, собак, котів, кролів, пацюків, мишей, морських свинок, хом'яків, шиншил) та сільськогосподарських ссавців (тобто, корів, свиней, овець, кіз, коней). У своїх загальних аспектах Mtb72f злитий білок згідно з винаходом являє собою білок, який включає, принаймні, імуногенний фрагмент кожного з трьох антигенів Ra12-TbH9-Ra35. Згідно з цією заявкою Ra35 відноситься до N-термінального кінця Mtb32A (Ra35FL), що включає, принаймні, приблизно перші 205 амінокислот Mtb32A з М. tuberculosis, нуклеотидна та амінокислотна послідовність якого розкрита на Фігурі 4 у патентній заявці США № 09/597,796, або відповідну ділянку інших видів Mycobacterium. Найбільш типово, Ra35 відноситься до частини послідовності SEQ ID No: 2, розкритій у даній заявці, що відповідає залишкам 535-729. Альтернативно, це поняття відноситься до варіанту Ra35, в якому амінокислота Ser, що відповідає положенню 710 у SEQ ID No: 2, замінена на Ala. Ra12 відноситься до С-термінального кінця Mtb32A (Ra35FL), що включає, принаймні, приблизно 132 амінокислоти з МТВ32А з М. tuberculosis, послідовність яких розкрита як SEQ ID NO: 4 (ДНК) та SEQ ID NO: 66 (передбачена амінокислотна послідовність) у патентній заявці США № 09/072,967, або відповідну ділянку інших видів Mycobacterium. Найбільш типово, Ra12 відноситься до частини послідовності SEQ ID No: 2, розкритій у даній заявці, що відповідає залишкам 8-139. Mtb39 (TbH9) відноситься до послідовності, що є суттєво такою, як розкрито у SEQ ID NO: 106 (кДНК повної довжини) та у SEQ ID NO: 107 (білкова послідовність повної довжини) у патентних заявках США № 08/658,800, № 08/659,683, № 08/818,112 та № 08/818,111 та в заявках WO97/09428 та WO97/09429. Послідовність є також розкритою як SEQ ID NO:33 (ДНК) та SEQ ID N0:91 (амінокислотна послідовність) у патентній заявці США № 09/056,559. Найбільш типово, ТbН9 відноситься до частини послідовності SEQ ID No: 2, розкритій у даній заявці, що відповідає залишкам 143-532. 5 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Зазначене нижче забезпечує послідовності деяких індивідуальних антигенів, що використовуються у композиції та злитих білках згідно з винаходом: Mtb32A (TbRa35FL або Ra35FL), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 17 (кДНК) та SEQ ID NO: 79 (білок) у патентних заявках США № 08/523,436, № 08/523,435, № 08/658,800, № 08/659,683, № 08/818,112, № 09/056,556 та № 08/818,111 та у заявках WO97/09428 та WO97/09429, див. також Skeiky та ін., Infection and Immunity 67:3998-4007(1999)/ Зазначене нижче забезпечує послідовності деяких злитих білків згідно з винаходом: TbH9Ra35 (Mtb59F), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO:23 (кДНК) та SEQ ID N0:24 (білок) у патентній заявці США № 09/287,849 та заявці PCT/US99/07717; Ra12-TbH9-Ra35 (Mtb72f), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO: 5 (ДНК) та SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 6 (білок) у даній заявці, а також у патентній заявці США № 09/223,040 та у PCT/US99/07717. Послідовність SEQ ID NO: 1 та SEQ ID NO: 2 включає His мітку 6 залишків His. М72, що представляє собою мутант Mtb72f, в якому залишок серину в амінокислотному положенні 710 у послідовності SEQ ID No: 2 є зміненим на Ala, (a також 4 залишки His є видаленими з His-мітки на N термінальному кінці), послідовність якого розкрита як SEQ ID No: 3 (ДНК) та SEQ ID No: 4 (білок) у даній заявці. Варіант цих послідовностей, в яких білок має His мітку 6 залишків His, є розкритим у патентній заявці США № 09/597,796 та в PCT/USO1/19959. Шляхом заміни Ser710 на Ala, M72 стає більш резистентним до аутолізу, ніж Mtb72f. Зазначене нижче забезпечує послідовності деяких додаткових антигенів, що використовуються у композиції та злитих білках згідно з винаходом: Mtb8.4 (DPV), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 101 (кДНК) та SEQ ID N0:102 (білок) у патентних заявках США № 08/658,800, № 08/659,683, № 08/818,112 та № 08/818,111, а також у заявках WO97/09428 та WO97/09429; Mtb9.8 (MSL), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 12 (ДНК), SEQ ID NO: 109 (передбачена амінокислотна послідовність) та від SEQ ID NO: 110 до 124 (пептиди) у патентних заявках США № 08/859,381, № 08/858,998, № 09/073,009 та № 09/073,010, а також у заявках PCT/US98/10407 та PCT/US98/10514; Mtb9.9A (MTI, що також є відомим як МТІ-А), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 3 та SEQ ID NO: 4 (ДНК) та SEQ ID NO: 29 та від SEQ ID N0:51 до 66 (ORF пептид для МТІ) у патентних заявках США № 08/859,381, № 08/858,998, № 09/073,009 та v09/073,010, а також у заявках PCT/US98/10407 та PCT/US98/10514. Існують два інші варіанти МТІ, що називаються МТІ-В та МТІ-С; Mtb40 (HTCC#1), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 137 (кДНК) та 138 (передбачена амінокислотна послідовність) у патентних заявках США № 09/073,009 та № 09/073,010, а також у заявках PCT/US98/10407 та PCT/US98/10514; Mtb41 (MTCC#2), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 140 (кДНК) та SEQ ID NO: 142 (передбачена амінокислотна послідовність) у патентних заявках США № 09/073,009 та № 09/073,010, а також у заявках PCT/US98/10407 та PCT/US98/10514; ESAT-6, послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 103 (ДНК) та SEQ ID NO: 104 (передбачена амінокислотна послідовність) у патентній заявці США № 09/072,967. Послідовність ESAT-6 є також розкритою у патенті США № 5,955,077; -кристалічний антиген, послідовність якого розкрита у Verbon та ін., J. Bad. 174:13521359(1992); 85 комплексний антиген, послідовність якого розкрита у Content та ін., Infect. & Immunol. 59:3205-3212 (1991). Кожна із зазначених послідовностей є розкритою у Cole та ін. Nature 393:537 (1998) та може бути знайдена, наприклад, за адресою http://www.sanger.ac.uk та http:/www. pasteur.fr/mycdb/. Кожна із зазначених вище послідовностей є розкритою у патентних заявках США №№ 08/523,435, 08/523,436, 08/658,800, 08/659,683, 08/818,111, 08/818,112, 08/942,341, 08/942,578, 08/858,998, 08/859,381, 09/056,556, 09/072,596, 09/072,967, 09/073,009, 09/073,010, 09/223,040, 09/287,849, а також у заявках РСТ PCT/US98/10407, PCT/US98/10514, PCT/US99/03265, PCT/US99/03268, PCT/US99/07717, WO97/09428 та WO97/09429, WO98/16645, WO98/16646, кожна з яких введена в дану заявку як посилання. Антигени, описані в даній заявці, включають поліморфні варіанти та консервативно модифіковані варіації, а також проміжні штами та міжвидові гомологи Mycobacterium. Крім того, антигени, описані в даній заявці, включають підпослідовності або вкорочені послідовності. Злиті білки можуть також містити додаткові поліпептиди, необов'язково гетерологічні пептиди з Mycobacterium або інших джерел. Ці антигени можуть бути модифіковані, наприклад, шляхом, 6 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 додання лінкерних пептидних послідовностей, як описано нижче. Ці лінкерні пептиди можуть бути вбудовані між одним або більше компонентами, які складають кожний зі злитих білків. Визначення Термін "реактивація туберкульозу" відноситься до більш пізнього виявлення симптомів захворювання у індивідууму, який виявляється як позитивний у туберкуліновій пробі, проте не має явних симптомів захворювання. Індивідуум є інфікованим М. tuberculosis та може мати або може не мати симптомів активного захворювання, які виявлялися раніше, та який в достатній мірі піддавався лікування для переведення туберкульозу у неактивний або латентний стан. Проте способи для запобігання або лікування реактивації туберкульозу можуть бути розпочаті також у індивідуума, який виявляє активні симптоми захворювання. "Первинний туберкульоз" відноситься до клінічного захворювання (прояв симптомів захворювання), що безпосередньо йде за інфекцією М. tuberculosis. Див., Harrison's Principles of Internal Medicine, Розділ 150, стор. 953-966 (16-е вид., Braunwald, та ін., ред., 2005). "Вторинний туберкульоз" або "постпервинний туберкульоз" відноситься до реактивації прихованої, неактивної або латентної інфекції М. tuberculosis. Див., Harrison's Principles of Internal Medicine, вище. "Активна інфекція М. tuberculosis" відноситься до інфекції М. tuberculosis з вираженими симптомами захворювання. "Прихована, неактивна або латентна інфекція М. tuberculosis" відноситься до інфекції М. tuberculosis без виражених симптомів захворювання. "Резистентна до лікарських засобів" інфекція М. tuberculosis відноситься до інфекції М. tuberculosis, в якій інфекційний штам не підтримується у статичному стані або не вбивається (є резистентним) одним або більше так званих хіміотерапевтичних агентів «першої черги», ефективних у лікуванні інфекції М. tuberculosis (наприклад, ізоніазидом, рифампіном, етамбутолом, стрептоміцином та піразинамідом). "Мультирезистентна" інфекції М. tuberculosis відноситься до інфекції М. tuberculosis, де інфекційний штам є стійким до двох або більше хіміотерапевтичних агентів «першої черги», ефективних у лікуванні інфекції М. tuberculosis . "Хіміотерапевтичний агент, ефективний у лікуванні інфекції М. tuberculosis" відноситься до фармакологічних агентів, що є відомими та використовуються в області техніки для лікування інфекцій М. tuberculosis. Приклади фармакологічних агентів, що використовуються для лікування інфекцій М. tuberculosis, включають, але без обмеження, амікацин, аміносаліцилову кислоту, капреоміцин, циклосерин, етамбутол, етіонамід, ізоніазид, канаміцин, піразинамід, рифаміцини (тобто, рифампін, рифапентин та рифабутин), стрептоміцин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитроміцин, азитроміцин та флуорохінолони. Хіміотерапевтичні агенти «першої черги», що використовуються для лікування інфекції М. tuberculosis, що не є резистентною до лікарських засобів, включають ізоніазид, рифампін, етанбутол, стрептоміцин та піразинамід. Хіміотерапевтичні агенти «другої черги», що використовуються для лікування інфекції М. tuberculosis, яка демонструє стійкість до одного або більше лікарських засобів «першої черги», включають офлоксацин, ципрофлоксацин, етіонамід, аміносаліцилову кислоту, циклосерин, амікацин канаміцин та капреоміцин. Такі фармакологічні агенти розглядаються у розділі 48 Goodman та Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman та Limbird ред., 2001. Скорочення "FL" відноситься до повної довжини, тобто поліпептиду, який має ту саму довжину, що й поліпептид дикого типу. "His мітка" відноситься до ланцюга His залишків, типово 6 залишків, що є вбудованими на Nтермінальному кінці, звичайно, безпосередньо після Met залишку ініціації або також на Стермінальному кінці. Вони звичайно є гетерологічними для нативної послідовності, але вбудовані тому, що вони сприяють ізоляції шляхом поліпшення зв'язування білка з імобілізованими смолами металоафінної хроматографії (ІМАС). Взагалі, присутність або відсутність His мітки не є важливою з точки зору індукції корисної імунної відповіді на антигенний білок. У випадку, коли виникає шкідлива імунна реакція на His мітку як таку, вважається кращим мінімізувати довжину His мітки, наприклад, до 4 або менше залишків, зокрема, до 2 залишків. Термін "його імуногенний фрагмент" відноситься до поліпептиду, який включає епітоп, який впізнається цитотоксичними Т-лімфоцитами, хелперними Т-лімфоцитами або В-клітинами. Типово, імуногенний фрагмент Mtb72f буде являти собою поліпептид, який містить 500 або більше амінокислот, наприклад, 600 або більше амінокислот, наприклад, 700 або більше амінокислот. Винахід також охоплює множину фрагментів, наприклад, фрагменти, які перекривають, що разом покривають усю або суттєво усю (наприклад, 500 або більше 7 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислот, наприклад, 600 або більше амінокислот, наприклад, 700 або більше амінокислот) послідовність Mtb72F злитого білка. Термін "види Mycobacterium комплексу туберкульозу" включає ті види, які традиційно вважаються такими, що викликають захворювання на туберкульоз, а також види Mycobacterium навколишнього середовища та опортуністичні види, що викликають туберкульоз та захворювання легень у пацієнтів з порушеним імунітетом, таких, як пацієнти зі СНІДом, наприклад, М. tuberculosis, М. bovis, або М. africanum, BCG, М. avium, M. intracellular, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, М. vaccae, M. fortuitum та М. scrofulaceum (див., наприклад, Harrison's Principles of Internal Medicine, розділ 150, стор. 953-966 (16-е вид., Braunwald, та ін., ред., 2005). Ад'ювант відноситься до компонентів у вакцині або терапевтичній композиції, що підвищують специфічну імунну відповідь на антиген (див., наприклад, Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411 (1992)). Ад'юванти індукують імунні відповіді Th1 типу та Th2 типу. Цитокіни Th1 типів (наприклад, IFN-, IL-2 та IL-12) мають тенденцію до індукції опосередкованої клітинами імунної відповіді на введений антиген, у той час, як цитокіни Th2 типу (наприклад, IL4, IL-5, IL-6, IL-10 та TNF-) мають тенденцію до індукції гуморальної імунної відповіді. Ад'юванти, здатні до переважної стимуляції опосередкованої Th1 клітинами імунної відповіді є описаними в WO 94/00153 та WO 95/17209. "Нуклеїнової кислоти" відноситься до дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів та їх полімерів або в одноланцюговій, або у дволанцюговій формі. Термін охоплює нуклеїнові кислоти, що містять відомі аналоги нуклеотидів або модифіковані залишки скелету або зв'язків, які є синтетичними, існуючі у природі або такі, що не існують у природі, які мають однакові зв'язувальні властивості зі стандартною нуклеїновою кислотою, та ті, що метаболізуються подібним до стандартних нуклеотидів чином. Приклади таких аналогів включають, але без обмеження, фосфортіоати, фосфорамідати, метил фосфонати, хіральні метилфосфонати, 2-Ометил рибонуклеотиди, пептид-нуклеїнові кислоти (PNA). Якщо не вказано інше, то специфічна послідовність нуклеїнової кислоти також охоплює її консервативно модифіковані варіанти (наприклад, заміни на основі вироджених кодонів) та комплементарні послідовності, а також послідовність, яка детально приведена. Зокрема, заміни на основі вироджених кодонів можуть бути здійснені за допомогою вироджених послідовностей, в яких третє положення одного або більше вибраних (або усіх) кодонів є заміщеним залишком змішаного типу та/або дезоксиінозиновим залишком (Batzer тa ін., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka та ін., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini та ін., Моl. Cell. Probes 8:9198 (1994)). Термін нуклеїнова кислота використовується почергово з терміном ген, кДНК, мРНК, олігонуклеотид та полінуклеотид. Терміни "поліпептид", "пептид" та "білок" в даній заявці використовуються почергово і відносяться до полімерів амінокислотних залишків. Терміни застосовуються до амінокислотних полімерів, в яких один або більше амінокислотних залишків являють собою штучні хімічні міметики відповідної існуючої у природі амінокислоти, а також до існуючих у природі амінокислотних полімерів та до неіснуючих у природі амінокислотних полімерів. Термін "амінокислота" відноситься до існуючих в природі та синтетичних амінокислот, а також до аналогів амінокислот та міметиків амінокислот, що функціонують подібним до існуючих у природі амінокислот чином. Існуючі у природі амінокислоти є такими, що кодуються генетичним кодом, а також ті амінокислоти, які є модифікованими після цього, наприклад, гідроксипролін, -карбоксиглутамат та О-фосфосерин. Аналоги амінокислот відносяться до сполук, що мають однакову основну структуру з існуючими в природі амінокислотами, тобто  вуглець, що є зв'язаним з воднем, карбоксильну групу, аміногрупу та R групу, наприклад, гомосерин, норлейцин, метіонін сульфоксид, метіонін метилсульфоній. Такі аналоги мають модифіковані R групи (наприклад, норлейцин) або модифіковані пептидні скелети, але залишаються при цьому тими ж основними структурами, що й існуючі в природі амінокислоти. Амінокислотні міметики відносяться до хімічних сполук, які мають структуру, яка відрізняється від загальної хімічної структури амінокислот, але такі, що функціонують подібним до існуючих в природі амінокислот чином. Амінокислоти можуть позначатися в даній заявці або за допомогою трьохбуквенного символу, або однобуквенного символаму, як рекомендовано IUPAC-IUB Комісією з біохімічної номенклатури. Нуклеотиди можуть позначатися за допомогою їх загальноприйнятого однобуквенного коду. Термін "консервативно модифіковані варіанти" застосовується як для амінокислотних послідовностей, так і для послідовностей нуклеїнових кислот. Стосовно певних послідовностей 8 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнової кислоти термін "консервативно модифіковані варіанти" відноситься до таких нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або суттєво ідентичні амінокислотні послідовності, або де нуклеїнова кислота не кодує амінокислотну послідовність, до суттєво ідентичних послідовностей. Завдяки виродженості генетичного коду будь-який даний білок кодує велика кількість функціонально ідентичних нуклеїнових кислот. Наприклад, кодони GCA, GCC, GCG та GCU усі кодують амінокислоту аланін. Таким чином, у кожному положенні, де аланін позначається кодоном, цей кодон може бути змінений на будь-який з відповідних описаних кодонів без зміни кодованого поліпептиду. Такі варіації нуклеїнової кислоти представляють собою "мовчазні варіації", які є одним з видів варіацій на основі консервативної модифікації. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти в даній заявці, яка кодує поліпептид, також описує кожну можливу мовчазну варіацію нуклеїнової кислоти. Будь-який спеціаліст в даній області техніки може визнати, що кожний кодон в нуклеїновій кислоті (за винятком AUG, який звичайно є єдиним кодоном для метіоніну, та TGG, який звичайно є єдиним кодоном для триптофану) може бути модифікований з одержанням функціонально ідентичної молекули. Згідно з цим кожна мовчазна мутація нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, мається на увазі для кожної описаної послідовності. Що стосується амінокислотних послідовностей, то спеціаліст в даній області має визнати, що індивідуальні заміни, делеції або доповнення до послідовності нуклеїнової кислоти, пептиду, поліпептиду або білка, що замінюють, додають або видаляють одну амінокислоту або невеликий процент амінокислот у кодованій послідовності, представляють собою "консервативно модифікований варіант", в якому зміна приводить до заміни амінокислоти хімічно подібною амінокислотою. Таблиці консервативних замін, що забезпечують функціонально подібні амінокислоти, є добре відомим в області техніки. Такі консервативно модифіковані варіанти представляють собою доповнення та не виключають поліморфних варіантів, міжвидових гомологів та алелей згідно з винаходом. Кожна з наведених нижче груп містить амінокислоти, які є консервативними замінами одна для одної: 1) Аланін (А), Гліцин (G); 2) Аспарагінова кислота (D), глутамінова кислота (Е); 3) Аспарагін (N), Глутамін (Q); 4) Аргінін (R), Лізин (К); 5) Ізолейцин (І), Лейцин (L), Метіонін (М), Валін (V); 6) Фенілаланін (F), Тирозин (Y), Триптофан (W); 7) Серин (S), Треонін (Т);та 8) Цистеїн (С), Метіонін (М) (див., наприклад, Creighton, Proteins (1984)). Термін "гетерологічний", коли використовується для позначення частин нуклеїнової кислоти, означає, що нуклеїнова кислота включає дві або більше субпослідовності, які не виявлено у такому зв'язку одна з одною у природі. Наприклад, нуклеїнова кислота, що є типово одержаною рекомбінантним шляхом, містить дві або більше послідовності з неспоріднених генів, що поєднані з утворенням нової функціональної нуклеїнової кислоти, наприклад, промотор, одержаний з одного джерела, та кодуюча ділянка з іншого джерела. Подібно до цього, гетерологічний білок означає, що білок включає дві або більше субпослідовності, що не виявлені у такому зв'язку одна з одною у природі, (наприклад, злитий білок). "Злитий поліпептид" або "злитий білок" відноситься до білка, що має, принаймні, два гетерологічні поліпептиди Mycobacterium sp., зв'язані ковалентно, або безпосередньо, або за допомогою амінокислотного лінкера. Поліпептиди, що утворюють злитий білок, є типово зв'язаними С-термінальним кінцем з N-термінальним кінцем, проте вони також можуть бути зв'язаними С-термінальним кінцем з С-термінальним кінцем, N-термінальним кінцем з Nтермінальним кінцем, або N- термінальним кінцем з С-термінальним кінцем. Поліпептиди злитого білка можуть розміщуватися у будь-якому порядку. Цей термін також відноситься до консервативно модифікованих варіантів, поліморфних варіантів, алелей, мутантів, субпослідовностей та міжвидових гомологів антигенів, що утворюють злитий білок. Антигени Mycobacterium tuberculosis описані у Cole та ін., Nature 393:537 (1998), де розкрито цільний геном Mycobacterium tuberculosis. Повна послідовність Mycobacterium tuberculosis може бути також знайдена на http://www.sanger.ac.uk та на http://www.pasteur.fr/mycdb/ (MycDB). Антигени з інших видів Mycobacterium, що відповідають антигенум М. tuberculosis, можуть бути ідентифіковані, наприклад, при використанні алгоритмів порівняння послідовностей, як описано в даній заявці, або за допомогою інших способів, відомих кваліфікованому спеціалісту в даній області, наприклад, шляхом гібридизаційних аналізів та аналізів зв'язування антитіла. 9 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Типові Mtb72f злиті білки для використання у даному винаході включають: Білки, що містять залишки 8-729 послідовності SEQ ID No: 2; Білки, що включають або складаються з послідовності SEQ ID No: 2 (=Mtb72f), необов'язково без His мітки, утвореної залишками 2-7 вказаної послідовності, або з His міткою різної довжини; Злиті білки, що включають послідовність SEQ ID No: 2, необов'язково без His мітки, утвореної залишками 2-7 вказаної послідовності, або з His міткою різної довжини (наприклад, білок, який включає залишки 8-729 послідовності SEQ ID No: 2) разом з одним або більше антигенуми М. tuberculosis, наприклад, одним або більше білками, приведеними вище в абзацах від [0045] до [0052], або імуногенним фрагментом будь-якого з них; Білки, що включають залишки 4-725 послідовності SEQ ID No: 4 (=М72); Білки, що включають або складаються з послідовності SEQ ID No: 4 (=М72) , необов'язково без His мітки, утвореної залишками 2-7 вказаної послідовності, або з His міткою різної довжини; та Злиті білки, що включають послідовність SEQ ID No: 4, необов'язково без His мітки, утвореної залишками 2-7 вказаної послідовності, або з His міткою різної довжини; (наприклада білок, що включає залишки 4-725 послідовності SEQ ID No: 4) разом з одним або більше антигенуми М. tuberculosis, наприклад, одним або більше білками, приведеними вище в абзацах від [0045] до [0052], або імуногенним фрагментом будь-якого з них; Типові імуногенні фрагменти Mtb72f злитого білка, що використовується у даному винаході, включають: Білки що включають послідовність або складаються з послідовності TbH9-Ra35 (Mtb59F); або ТbН9; або Ra35; або Ra12; та Злиті білки, що включають вказані послідовності разом з одним або більше антигенуми М. tuberculosis, наприклад, одним або більше білками, приведеними вище в абзацах від [0045] до [0052], або імуногенним фрагментом будь-якого з них; Додаткові типові імуногенні фрагменти Mtb72f злитих білків для застосування згідно з даним винаходом включають: Білки, що включають послідовність або складаються з послідовності TbH9-Ra35 (Mtb59F) або Ra35, в яких положення, що відповідає Ser710 в SEQ ID No: 2, є зміненим на Ala; та Злиті білки, які включають вказані послідовності разом з одним або більше антигенуми М. tuberculosis, наприклад, одним або більше білками, приведеними вище в абзацах від [0045] до [0052], або імуногенним фрагментом будь-якого з них; Зокрема, Mtb72f представляє собою: поліпептид, що включає залишки 8-729 SEQ ID NO: 2; або поліпептид, що складається з залишків 1 та 8-729 SEQ ID NO: 2, необов'язково з His міткою, вбудованою після початкового залишку Met; або поліпептид SEQ ID NO: 2; або поліпептид, що включає залишки 4-725 SEQ ID NO: 4; або поліпептид, що складається з залишків 1 та 4-725 SEQ ID NO: 4, необов'язково з His міткою, вбудованою після початкового залишку Met; або поліпептид SEQ ID NO: 4; або поліпептид SEQ ID NO: 6. Додаткові типові Mtb72f злиті білки та їх імуногенні фрагменти включають білки, згадані вище, в яких N- та/або С-термінальні кінці є вкороченими, наприклад, на 5 або 4 або 3 або 2 або 1 амінокислотний залишок. Додаткові типові Mtb72f злиті білки та їх імуногенні фрагменти включають білки, згадані вище, в яких до 10% амінокислот, наприклад, до 5% амінокислот (наприклад, до 10, наприклад, до 5), є заміненими консервативними замінами, як визначено в даній заявці. Типові Mtb72f нуклеїнові кислоти для застосування згідно з даним винаходом включають нуклеїнові кислоти (наприклад, молекули ДНК), що кодують згадані вище типові Mtb72f злиті білки та їх імуногенні фрагменти. Один набір специфічних молекул ДНК, що можуть бути згадані, включає нуклеотиди 63-2228 SEQ ID No: 1. Інший набір специфічних молекул ДНК, що можуть бути згадані, включає нуклеотиди 10-2175 SEQ ID No: 3. Специфічні молекул ДНК, що можуть бути згадані, включають або складаються з SEQ ID No: 1 або SEQ ID No: 3 або SEQ ID No: 5. Термін "злитий" відноситься до ковалентного зв'язку між двома поліпептидами у злитому білку. Поліпептиди типово зв'язуються за допомогою пептидного зв'язку, або безпосередньо один з одним, або через амінокислотний лінкер. Необов'язково, пептиди можуть з'єднуватися за допомогою непептидних ковалентних зв'язків, що є відомими спеціалісту в даній області. 10 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фраза "селективно (або специфічно) гібридизується з" відноситься до зв'язування, утворення дуплексів або гібридизації молекули тільки з певною нуклеотидною послідовністю при жорстких умовах гібридизації, коли ця послідовність є присутньою у складній суміші (наприклад, загальна клітинна або бібліотечна ДНК або РНК). Фраза "жорсткі умови гібридизації" відноситься до умов, при яких зразок буде гібридизуватися зі своєю цільовою послідовністю, типово, у складній суміші нуклеїнової кислоти, але не з іншими послідовностями. Жорсткі умови залежать від послідовності і будуть відрізнятися за різних обставин. Більш довгі послідовності специфічно гібридизуються при більш високих температурах. Детальне керівництво з гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти у Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization та the strategy of nucleic acid assays" (1993). В загальному випадку жорсткі умови вибирають з таких, що є приблизно на 5-10°С нижчими, ніж точка плавлення (Тm) для специфічної послідовності при визначеній іонній силі рН. Т m представляє собою температуру (при визначеній іонній силі, рН, та концентрації нуклеїнової кислоти), при якій 50% зразків, комплементарних до цільової послідовності, гібридизується з цільовою послідовністю при рівноважному стані (оскільки цільові послідовності є присутніми у надлишку при Тm, то 50% зразків при рівноважному стані є зайнятими). Жорсткі умови будуть такими, в яких концентрація солі є меншою, ніж приблизно 1,0 М іона натрію, типово приблизно від 0,01 до 1,0 М концентрації іона натрію (або інших солей) при значенні рН від 7,0 до 8,3, а температура складає, принаймні, приблизно 30°С для коротких зразків (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) та, принаймні, приблизно 60°С для довгих зразків (наприклад, таких, що мають довжину, більшу, ніж 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть також бути досягненні при доданні дестабілізувальних агентів, таких, як формамід. Для селективної або специфічної гібридизації позитивний сигнал складає, принаймні, двократний сигнал фону, необов'язково, десятикратний сигнал фону гібридизації. Типові умови жорсткої гібридизації можуть бути наступними: 50% формаміду, 5 х SSC, та 1% SDS, інкубація при 42°С, або 5 х SSC, 1% SDS, інкубація при 65°С, з промиванням у 0,2 х SSC та 0,1% SDS при 65°С. Нуклеїнові кислоти, що не гібридизуються одна з одною при жорстких умовах, все ще залишаються суттєво ідентичними, якщо поліпептиди, які вони кодують, є суттєво ідентичними. Це відбувається, наприклад, коли копію нуклеїнової кислоти створюють при використанні максимальної виродженості кодонів, що дозволяється генетичним кодом. У таких випадках нуклеїнові кислоти типово гібридизуються при помірно жорстких умовах гібридизації. Приклад "помірно жорстких умов гібридизації" включає гібридизацію у буфері 40% формаміду, 1 М NaCI, 1% SDS при 37°, та промивання у 1Х SSC при 45°С. Позитивна гібридизація складає, принаймні, двократний фон. Спеціаліст у даній області техніки добре знає, що альтернативна гібридизація та умови промивання можуть використовуватися для забезпечення умов подібної жорсткості. "Антитіло" відноситься до поліпептиду, який кодується ділянкою рамки зчитування гена імуноглобуліну або його фрагмента, що зв'язується та впізнає антиген. Відомі гени імуноглобулінів включають гени каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, епсілон та мю константних ділянок, а також міріади генів варіабельної ділянки імуноглобуліну. Легкі ланцюги класифікуються або як каппа, або лямбда. Важкі ланцюги класифікуються як гамма, мю, альфа, дельта або епсілон, що, у свою чергу, визначають класи імуноглобулінів IgG, IgM, IgA, IgD та IgE, відповідно. Структурна одиниця типового імуноглобуліну (антитіла) включає тетрамер. Кожний тетрамер складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, де кожна пара має один легкий (приблизно 25 кДа) та один важкий ланцюг (приблизно 50-70 кДа). N-термінальний кінець кожного ланцюга визначає варіабельну ділянку довжиною приблизно від 100 до 110 або більше амінокислот, що головним чином відповідає за впізнання антигену. Терміни варіабельний легкий ланцюг (VL) та варіабельний важкий ланцюг (VH) відносяться до цих легких та важких ланцюгів, відповідно. Антитіла існують, наприклад, як інтактні імуноглобуліни або як ряд добре охарактеризованих фрагментів, що одержані шляхом перетравлювання за допомогою різних пептидаз. Таким чином, наприклад, пепсин перетравлю антитіло нижче дисульфідних зв'язків у шарнірній ділянці з одержанням F(ab)'2, димера Fab, який сам по собі представляє собою легкий ланцюг, з'єднаний з VH-CH1 дисульфідним зв'язком. F(ab)'2 може розкладатися при м'яких умовах з розривом дисульфідного зв'язку у шарнірній ділянці, перетворюючи, таким чином, F(ab)'2 димер на Fab' мономер. Fab' мономер представляє собою суттєво Fab з частиною шарнірної ділянки (див. Fundamental Immunology (Paul ред., 3-є вид. 1993). Оскільки різні фрагменти антитіла визначаються у зв'язку з перетравлюванням інтактного антитіла, то спеціаліст в даній області 11 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буде знати, що такі фрагменти можуть бути синтезовані de novo або хімічним шляхом, або при використанні методики рекомбінантної ДНК. Таким чином, термін антитіло, як використовується в даній заявці, також включає фрагменти антитіла, одержані або шляхом модифікації цільних антитіл, або синтезовані de novo при використанні методики рекомбінантної ДНК (наприклад, один ланцюг Fv), або ті, що ідентифіковані за допомогою фагових бібліотек (див., наприклад, McCafferty та ін., Nature 348:552-554 (1990)). Для одержання моноклональних або поліклональних антитіл можна використовувати будьяку методику, відому з рівні техніки (див., наприклад, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor тa ін., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole та ін., стор.77-96 в Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Методики для одержання одноланцюгових антитіл (патент США №4,946,778) можуть бути адаптовані для одержання антитіл до поліпептидів згідно з даним винаходом. Крім того, трансгенні миші або інші організми, такі, як ссавці, можуть використовуватися для експресії гуманізованих антитіл. Альтернативно, бібліотеки фагового дісплею можна використовувати для ідентифікації антитіл та гетеромерних Fab фрагментів, що специфічно зв'язуються з вибраними антигенами (див., наприклад, McCafferty та ін., Nature 348:552-554 (1990); Marks та ін., Biotechnology 10:779-783 (1992)). Фраза "специфічно (або селективно) зв'язується" з антитілом або "є сцецифічно (або селективно) імунореактивним з", коли стосується білка або пептиду, відноситься до реакції зв'язування, що є визначальною для присутності білка в гетерологічній популяції білків та інших біологічних речовин. Таким чином, при визначених умовах імуноаналізу значення зв'язування специфічних антитіл з конкретним білком складає, принаймні, двократне значення фону, та ці антитіла суттєво не зв'язуються у значній кількості з іншими білками, що є присутніми у зразку. Специфічне зв'язування з антитілом при таких умовах може вимагати наявності антитіла, що є вибраним за його специфічністю до певного білка. Наприклад, поліклональні антитіла, утворення яких індуковане злитими білками, можуть бути вибраними для одержання тільки тих поліклональних антитіл, які є специфічно імунореактивними зі злитим білком, але не з індивідуальними компонентами злитих білків. Така селекція може бути досягнута шляхом видалення антитіл, які перехресно реагують з цими індивідуальними антигенами. Різноманітні методики імуноаналізу можуть використовуватися для відбору антитіл, які є специфічно імунореактивними з певним білком. Наприклад, твердофазні ELISA імуноаналізи, звичайно, використовуються для відбору антитіл, які є специфічно імунореактивними з білком (див., наприклад, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) and Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998), для опису методик імуноаналізу та умов, які можуть використовуватися для визначення специфічної імунореактивності). Типово, специфічна або селективна реакція буде мати, принаймні, двократний сигнал фону або шумів та більш типово буде мати сигнал у 10-100 разів більший за фон. Полінуклеотиди можуть включати нативну послідовність (тобто ендогенну послідовність, що кодує індивідуальний антиген або його частину) або можуть включати варіант такої послідовності. Полінуклеотидні варіанти можуть містити одну або більше замін, доповнень, делецій та/або інсерцій, таких, що біологічна активність кодованого злитого поліпептиду не знижується у порівнянні зі злитим поліпептидом, що включає нативні антигени. Варіанти переважно демонструють приблизно 70% ідентичності, більшпереважно, принаймні, приблизно 80% ідентичност та найбільш бажано, принаймні, приблизно 90% ідентичності до полінуклеотидної послідовності, що кодує нативний поліпептид або його частину. Терміни "ідентичний" або процент "ідентичності" у контексті двох або більше нуклеїнових кислот або поліпептидних послідовностей, відносяться до двох або більше послідовностей або субпослідовностей, що є однаковими або мають вказаний процент амінокислотних залишків або нуклеотидів, які є однаковими (тобто 70% ідентичності, необов'язково 75%, 80%, 85%, 90% або 95% ідентичності на вказаній ділянці) при порівнянні та вирівнюванні для максимальної відповідності у межах вікна порівняння або вказаної ділянки, як вимірюють при використанні одного з приведених алгоритмів порівняння послідовностей або ручного вирівнювання та візуальної перевірки. Такі послідовності потім називаються "суттєво ідентичними". Таке визначення також відноситься до комплементу досліджуваної послідовності. Необов'язково, ідентичність існує у межах ділянки, що складається, принаймні, з приблизно 25 - приблизно 50 амінокислот або нуклеотидів у довжину, або необов'язково у межах ділянки, що містить 75-100 амінокислот або нуклеотидів у довжину. Для порівняння послідовностей, типово, коли одна послідовність виконує роль стандарта для порівняння, з якою досліджувані послідовності порівнюються. Коли використовують алгоритм порівняння послідовностей, то досліджувана послідовність та послідовність, яка є стандартом для порівняння, вводять у комп'ютер, встановлюють координати субпослідовності, 12 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 якщо це необхідно, та задають параметри для програми алгоритму порівняння послідовностей. Алгоритм порівняння послідовностей підраховує процент ідентичності послідовностей для досліджуваних послідовностей стосовно стандартної послідовності на основі програмних параметрів. "Вікно порівняння", як використовується в даній заявці, включає посилання на сегмент будьякого одного з ряду суміжних положень, вибраних з групи, яка складається з 25 - 500, звичайно, від приблизно 50 до приблизно 200, більш часто від приблизно 100 до приблизно 150, де послідовність може порівнюватися зі стандартною послідовністю з тим самим числом суміжних положень після того, як дві послідовності є оптимально вирівняні. Способи вирівнювання послідовностей для порівняння є добре відомими в області техніки. Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведене, наприклад, при використанні алгоритму локальної гомології Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), алгоритму гомологічного вирівнювання Needleman & Wunsch, J. Моl. Biol. 48:443 (1970), методу пошуку на подібність Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), за допомогою комп'ютеризованих втілень цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA та TFASTA у Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), або шляхом ручного вирівнювання та візуальної перевірки (див., наприклад, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel та ін., ред.. 1995 додаток)). Один приклад корисного алгоритму представляє собою PILEUP. PILEUP створює множинне вирівнювання послідовностей з групи споріднених послідовностей при використанні прогресивних, попарних вирівнювань для демонстрації спорідненості та проценту ідентичності послідовностей. Це також забезпечує одержання дерева або дендрограмми, що показує розділені на кластери взаємні зв'язки, які використовуються для проведення вирівнювання. PILEUP використовує ампліфікацію способу прогресивного вирівнювання Feng & Doolittle, J. Моl. Evol. 35:351-360 (1987). Використовуваний при цьому спосіб є подібним до способу, описаного Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). Програма може порівняти до 300 послідовностей, кожна з яких має максимальну довжину 5000 нуклеотидів або амінокислот. Процедуру множинного вирівнювання починають з попарного вирівнювання двох найбільш подібних послідовностей, одержуючи, таким чином, кластер вирівняних послідовностей. Цей кластер потім порівнюють з наступною, найбільш близькою послідовністю або кластером вирівняних послідовностей. Два кластери послідовностей вирівнюють шляхом простого подовження попарного вирівнювання двох індивідуальних послідовностей. Заключне вирівнювання проводять при використанні серії прогресивних попарних вирівнювань. Програму виконують шляхом задання специфічних послідовностей та їх амінокислотних або нуклеотидних координат для ділянок послідовності порівняння та шляхом задання параметрів програми. При використанні PILEUP стандартна послідовність порівнюється з іншими досліджуваними послідовностями для визначення проценту ідентичності послідовностей при використанні наступних параметрів: значення пробілу по умовчанню (3,00), значення довжини пробілу по умовчанню (0,10) та значення кінців пробілів. PILEUP може бути одержаний з GCG програмного забезпечення аналізу послідовності, наприклад, версії 7.0 (Devereaux тa ін., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984). Інший приклад алгоритму, що є прийнятним для визначення проценту ідентичності послідовностей та подібності послідовностей, представляє собою алгоритми BLAST та BLAST 2.0, які є описаними у Altschul та ін., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) та Altschul та ін., J. Моl. ВіоІ. 215:403-410 (1990), відповідно. Програмне забезпечення для аналізів BLAST є доступним через Національний центр біотехнологічної інформації (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Цей алгоритм втягує першу ідентифікацію пар послідовності, які мають високий рахунок (HSP), шляхом ідентифікації коротких слів, які мають довжину W у послідовності запиту, що є або відповідним, або задовольняє певний позитивний показник порогового значення Т, коли порівнюється зі словом тієї самої довжини у базі даних послідовностей. Т розглядається як усідній пороговий показник (Altschul та ін., вище). Ці вихідні сусідні співпадання слова виступають як відправні точки для ініціації пошуків для знаходження більш довгих HSP, що містять їх. Співпадання слова подовжуються в обох напрямках вздовж кожної послідовності для того, щоб кумулятивний показник вирівнювання міг бути підвищений. Кумулятивні показники підраховують, використовуючи для нуклеотидних послідовностей параметри М (коефіцієнт винагороди для пари зі співпадаючими залишками; завжди > 0) та N (штрафний коефіцієнт для залишків, що не співпадають; завжди < 0). Для амінокислотних послідовностей використовуєтьтся матриця для визначення показників для підрахунку кумулятивного значення. Подовження співпадінь слова у кожному напрямку зупиняють, коли: кумулятивне значення вирівнювання зменшується на кількість X від свого максимально досягнутого значення; 13 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кумулятивне значення переходить у 0 або нижче завдяки акумуляції одного або більше негативних значень вирівнювання залишків; або досягнуто кінця будь-якої послідовності. Параметри алгоритму BLAST W, Т та X визначають чутливість та швидкість порівняння. Програма BLASTN (для нуклеотидних послідовностей) використовує як параметри по умовчанню довжину слова (W) 11, математичне очікування (Е) 10, М=5, N=-4 та порівняння обох ланцюгів. Для амінокислотних послідовностей програма BLASTP використовує як параметри по умовчанню довжину слова 3, математичне очікування (Е) 10 та BLOSUM62 матрицю для підрахунку (див. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10915 (1989)), вирівнювання (В) 50, математичне очікування (Е) 10, М=5, N=-4, та порівняння обох ланцюгів. BLAST алгоритм також проводить статистичний аналіз подібності між двома послідовностями (див., наприклад, Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Одна міра вимірювання подібності, що забезпечується алгоритмом BLAST, представляє собою найменшу суму ймовірності (P(N)), яка забезпечує зазначення ймовірності, з якою співставлення між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями буде проходити випадково. Наприклад, нуклеїнова кислота вважається подібною до стандартної послідовності, якщо найменша сума ймовірності у порівнянні досліджуваної нуклеїнової кислоти зі стандартною нуклеїнової кислотою буде менше, ніж приблизно 0,2, більш бажано менше, ніж приблизно 0,01, та найбільш бажано менше, ніж приблизно 0,001. Полінуклеотидні композиції Як використовується в даній заявці, терміни "сегмент ДНК" та "полінуклеотид" відносяться до молекули ДНК, що була ізольована окремо від загальної геномної ДНК певних видів. Таким чином, сегмент ДНК, що кодує поліпептид, відноситься до сегменту ДНК, який містить одну або більше кодуючих послідовностей, що є суттєво відокремленими або очищеними від загальної геномної ДНК видів, з яких було одержано цей сегмент ДНК. Включеними у вказаний термін є терміни "ДНК сегмент" та "полінуклеотид", що представляють собою сегменти ДНК та менші фрагменти таких сегментів, а також рекомбінантні вектори, включаючи, наприклад, плазміди, косміди, фагеміди, фаги, віруси тощо. Як буде зрозумілим спеціалісту в даній області, сегменти ДНК згідно з даним винаходом можуть включати геномні послідовності, екстрагеномні послідовності та послідовності, що кодуються плазмідою, а також менші сконструйовані генні сегменти, що експресують або можуть бути адаптованими для експресії, білків поліпептидів, пептидів тощо. Такі сегменти можуть бути ізольовані з природних джерел або можуть бути модифіковані штучним шляхом рукою людини. Термін "ізольований", як використовується в даній заявці, означає, що полінуклеотид є суттєво відокремленим від інших кодуючих послідовностей, та що сегмент ДНК не містить великих частин неспорідненої кодуючої ДНК, такої як великі хромосомні фрагменти або інші функціональні гени або ділянки, що кодують поліпептиди. Звичайно, це відноситься до сегменту ДНК, який первинно ізольовано, та не виключає генів або кодуючих ділянок, що потім додано до сегменту рукою людини. Як буде зрозуміло кваліфікованому спеціалісту в даній області, полінуклеотиди можуть бути одноланцюговими (кодуючими або антисмисловими) або дволанцюговими, та можуть представляти собою молекули ДНК (геномну, кДНК або синтетичну) або РНК. Молекули РНК включають НпРНК молекули, які містять інтрони та відповідають молекулі ДНК як ідентичні, та молекули мРНК, які не містять інтронів. Додаткові кодуючі або некодуючі послідовності можуть, але без необхідності, бути присутніми у полінуклеотиді згідно з даним винаходом, та полінуклеотид може, але без необхідності, бути зв'язаним з іншими молекулами та/або допоміжними матеріалами. Полінуклеотиди можуть включати нативну послідовність (тобто ендогенну послідовність, що кодує антиген Mycobacterium або його частину) або можуть включати варіант, або біологічний, або антигеннний функціональний еквівалент такої послідовності. Полінуклеотидні варіанти можуть містити одну або більше замін, доповнень, делецій та/або інсерцій, як додатково описано нижче, бажано такі, що імуногенність кодованого поліпептиду не зменшується у порівнянні з нативним пухлинним білком. Вплив на імуногенність кодованого поліпептиду може в загальному випадку бути оцінений так, як описано в даній заявці. Термін "варіанти" також охоплює гомологічні гени ксеногенного походження. У додаткових втіленнях даний винахід забезпечує ізольовані полінуклеотиди та поліпептиди, що мають різну довжину суміжних ділянок послідовності, ідентичних або комплементарних одній або більше послідовностям, розкритим в даній заявці. Наприклад, даним винаходом забезпечуються полінуклеотиди, що включають, принаймні, приблизно 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 або 1000, або більше суміжних нуклеотидів однієї або більше 14 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей, розкритих в даній заявці, а також усі проміжні довжини, що знаходяться між ними. Легко можна зрозуміти, що "проміжні довжини" у цьому контексті означають будь-яку довжину між зазначеними значеннями, таку, як 16, 17, 18, 19 тощо; 21, 22, 23 тощо; 30, 31, 32 тощо; 50, 51, 52, 53 тощо; 100, 101, 102, 103 тощо; 150, 151, 152, 153 тощо; включаючи усі цілі числа між 200-500; 500-1000, та подібні до них. Полінуклеотиди згідно з даним винаходом або їх фрагменти, незважаючи на довжину кодуючої послідовності саму по собі по собі, можуть бути поєднані з іншими ДНК послідовностями, такими, як промотори, сигнали поліаденілування, додаткові сайти для ферментів рестрикції, сайти множинного клонування, інші кодуючі сегменти та подібні до них, так, що їх загальна довжина може варіювати у значній мірі. Таким чином, передбачається, що може використовуватися фрагмент нуклеїнової кислоти майже будь-якої довжини, при цьому загальна довжина переважно є обмеженою легкістю приготування та використання у заданому прописі методики рекомбінантної ДНК. Наприклад, ілюстративні сегменти ДНК із загальними довжинами приблизно 10000, приблизно 5000, приблизно 3000, приблизно 2000, приблизно 1000, приблизно 500, приблизно 200, приблизно 100, приблизно 50 пар основ у довжину, та подібні до них (включаючи усі проміжні довжини) передбачаються як такі, що є корисними у багатьох застосуваннях згідно з даним винаходом. Крім того, як може бути оцінено спеціалістом у даній області техніки, існує багато нуклеотидних послідовностей, що кодують поліпептид, описаний у даній заявці як результат виродженості генетичного коду. Деякі з цих полінуклеотидів мають мінімальну гомологію з нуклеотидною послідовністю будь-якого нативного гена. Незважаючи на це, полінуклеотиди, які варіюють завдяки відмінностям у використанні кодона, зокрема, передбачаються у даному винаході, наприклад полінуклеотиди, які є оптимізованими для людини та/або приматів шляхом вибору кодона. Крім того, алелі генів, які включають полінуклеотидні послідовності, що забезпечуються в даній заявці, знаходяться у межах даного винаходу. Алелі представляють собою ендогенні гени, які є зміненими як результат однієї або більше мутацій, таких, як делеції, доповнення та/або заміни нуклеотидів. Одержані мРНК та білок можуть, але необов'язково, мати змінену структуру або функцію. Алелі можуть бути ідентифіковані при використанні стандартних методик (таких, як гібридизація, ампліфікація та/або порівняння з послідовностями бази даних). Ідентифікація та характеристика полінуклеотидів Полінуклеотиди можуть бути ідентифіковані, одержані та/або оброблені при використанні будь-якого з різноманітних добре відомих способів. Наприклад, полінуклеотид може бути ідентифікований так, як детально описано нижче, шляхом скринінгу мікрочіпа кДНК на експресію, асоційовану з пухлиною (тобто, на експресію, що є, принаймні, в два рази більшою у пухлинах, ніж у нормальній тканині, як визначено при використанні репрезентативного аналізу, що забезпечується в даній заявці). Такі скринінги можуть бути проведені, наприклад, при використанні мікрочіпу Синтені (Palo Alto, СА) згідно з інструкціями виробника (та суттєво так, як описано Schena та ін., Рrос. Natl. Acad. Sci USA 93:10614-10619 (1996) та Heller та ін., Ргос. Natl. Acad. Sci USA 94:2150-2155 (1997)). Альтернативно, полінуклеотиди можуть бути ампліфіковані з кДНК, одержаною з клітин, які експресують білки, описані в даній заявці, таких, як клітини М. tuberculosis. Такі полінуклеотиди можуть бути ампліфіковані при використанні полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для цього підходу праймери, специфічні для послідовності, можуть бути сконструйовані на основі послідовностей, які забезпечуються в даній заявці, або можуть бути закуплені або синтезовані. Ампліфікована частина полінуклеотиду згідно з даним винаходом може бути використана для ізоляції гена повної довжини з прийнятної бібліотеки (наприклад, бібліотеки кДНК М. tuberculosis) при використанні добре відомих методик. Зігдно з цими методиками бібліотеку (кДНК або геномну ДНК) піддають скринінгу при використанні одного або більше полінуклеотидних зондів або праймерів, прийнятних для ампліфікації. Бажано, коли бібліотека є відібраною за розміром для включення більших молекул. Випадково примовані бібліотеки можуть також бути бажаними для ідентифікації 5'ділянок генів та розміщених вище ділянок. Геномні бібліотеки є бажаними для одержання інтронів та подовження 5' послідовностей. Для методик гібридизації часткова послідовність може бути мічена (наприклад, за 32 допомогою "нік"-трансляції або мічення кінців Р) при використанні добре відомих способів. Бактеріальну бібліотеку або бібліотеку бактеріофагів потім в загальному випадку піддають скринінгу за допомогою фільтрів гібридизації, що містять денатуровані бактеріальні колонії (або поверхонь, що містять фагові бляшки) з міченим зондом (див. Sambrook та ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2000)). Відбирають гібридизуючі колонії або бляшки та піддають розмноженню, а ДНК ізолюють для подальших аналізів. Клони кДНК можна піддавати аналізу 15 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для визначення кількості додаткової послідовності за допомогою, наприклад, ПЛР при використанні праймера з часткової послідовності та праймера з вектора. Рестрикційні карти та часткові послідовності можуть одержані для ідентифікації одного або більше клонів, що перекриваються. Потім може бути визначена повна послідовність при використанні стандартних методик, що можуть втягувати одержання серій делеційних клонів. Одержані послідовності, що перекриваються, можуть бути потім поєднані в одну безперервну послідовність. Молекула кДНК повної довжини може бути одержана шляхом лігування прийнятних фрагментів при використанні добре відомих методик. Альтернативно, існують багаточисленні методики ампліфікації для одержання кодуючої послідовності повної довжини з часткової послідовності кДНК. Згідно з такими методиками ампліфікацію, звичайно, проводять шляхом ПЛР. Будь-який з різноманітності комерційно доступних наборів може використовуватися для проведення етапу ампліфікації. Праймери можуть бути сконструйовані при використанні, наприклад, програмного забезпечення, добре відомого з рівня техніки. Праймери переважно мають 22-30 нуклеотидів у довжину, мають вміст GC, принаймні, 50% та відпалюють до цільової послідовності при температурах приблизно від 68°С до 72°С. Ампліфікована ділянка може бути секвенована так, як описано вище, а послідовності, що перекриваються, поєднують у безперервну послідовність. Одна така методика ампліфікації представляє собою ПЛР (див. Triglia та ін., Nucl. Acids Res. 16:8186 (1988)), яка використовує рестрикційні ферменти для одержання фрагменту у відомій ділянці гена. Фрагмент потім піддають циркуляризації за допомогою внутрішньомолекулярного лігування та використовують як матрицю для ПЛР з дивергентними праймерами, що походять з відомої ділянки. Згідно з альтернативним підходом послідовності, суміжні з частковою послідовністю, можуть бути відтворені шляхом ампліфікації при використанні праймера до лінкерної послідовності та праймера, специфічного до відомої ділянки. Ампліфіковані послідовності типово піддають другому колу ампліфікації з тим самим лінкерним праймером та другим праймером, специфічним до відомої ділянки. Варіація цієї процедури, що використовує два праймери, які ініціюють подовження у протилежних напрямках від відомої послідовності, є описаною в WO 96/38591. Інша така методика є відомою як "швидка ампліфікація кінців кДНК" або RACE. Ця методика втягує використання внутрішнього праймера та зовнішнього праймера, який гібридизується з поліА ділянкою або векторною послідовністю, для ідентифікації послідовностей, які є 5'-та 3'-кінцями відомої послідовності. Додаткові методики включають ПЛР з захоплюванням (Lagerstrom та ін., PCR Methods Applic. 1:111-19 (1991)) та ПЛР "прогулянку" (Parker та ін., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60 (1991)). Інші способи, що використовують ампліфікацію, можуть також використовуватися для одержання послідовності кДНК повної довжини. В деяких випадках є можливим одержувати послідовність кДНК повної довжини шляхом аналізу послідовностей, що забезпечуються в базі даних експресованих послідовностей мітки (EST), таких, як ті, що є доступними з GenBank. Пошуки на EST, що перекриваються, можуть в загальному випадку проводитися при використанні добре відомих програм (наприклад, NCBI BLAST пошуки), а такі EST можуть використовуватися для одержання безперервних послідовностей повної довжини. Послідовності ДНК повної довжини можуть також бути одержані шляхом аналізу геномних фрагментів. Експресія полінуклеотидів у хазяйських клітинах В інших втіленнях згідно з винаходом полінуклеотидні послідовності або їх фрагменти, які кодують поліпептиди згідно з винаходом або злиті білки або їх функціональні еквіваленти, можуть використовуватися у рекомбінантних молекулах ДНК для безпосередньої експресії поліпептиду у прийнятних хазяйських клітинах. Завдяки вродженій виродженості генетичного коду можуть бути одержані інші послідовності ДНК, що кодують суттєво ту саму або функціонально еквівалентну амінокислотну послідовність, а ці послідовності можуть використовуватися для клонування та експресії даного поліпептиду. Як буде зрозумілим спеціалісту в даній області техніки, може бути бажаним в деяких випадках одержувати нуклеотидні послідовності, що кодують поліпептид, які включають кодони, які не існують у природі. Наприклад, кодони, які є переважними для певних прокаріотичних або еукаріотичних хазяїв, можуть бути відібрані для підвищення швидкості експресії білка або для одержання рекомбінантного РНК транскрипта, що володіє бажаними властивостями, такими, як період напіврозпаду, який є довшим, ніж такий для транскрипта, одержаного з послідовності, яка існує у природі. Крім того, полінуклеотидні послідовності згідно з даним винаходом можуть бути сконструйовані при використанні способів, які є відомими з рівня техніки, для того, щоб змінити кодуючі поліпептид послідовності з ряду причин, включаючи, але без обмеження, зміни, які 16 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модифікують клонування, процесинг та/або експресію генного продукту. Наприклад, перестановку ДНК шляхом випадкової фрагментації та повторну зборку генних фрагментів та синтетичних олігонуклеотидів за допомогою ПЛР можна використовувати для створення нуклеотидних послідовностей. На доповнення до цього, сайт-направлений мутагенез можна використовувати для вбудовування нових рестрикційних сайтів, зміни моделей глікозилювання, зміни переважності кодонів, одержання варіантів сплайсингу або введення мутацій тощо. В іншому втіленні згідно з винаходом природні, модифіковані або рекомбінантні послідовності нуклеїнових кислот можуть бути ліговані до гетерологічної послідовності для того, щоб кодувати злитий білок. Наприклад, для скринінгу пептидних бібліотек на інгібітори активності поліпептидів може бути корисним кодувати химерний білок, який може впізнаватися комерційно доступним антитілом. Злитий білок може також бути сконструйований для того, щоб містити сайти розщеплення, розміщені між послідовністю, що кодує поліпептид, та послідовністю гетерологічного білка так, що поліпептид може бути розщеплений та очищений від гетерологічних залишків. Послідовності, що кодують бажаний поліпептид, можуть бути синтезовані як цілі або частини при використанні хімічним способів, що є добре відомим в області техніки (див. Caruthers, М.Н. та ін., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. стор. 215-223 (1980), Horn та ін, Nucl. Acids Res. Symp. Ser. стор.225-232 (1980)). Альтернативно, білок сам по собі може бути одержаний при використанні хімічних способів для синтезу амінокислотної послідовності поліпептиду або його частини. Наприклад, пептидний синтез може бути проведений при використанні різноманітних твердофазних методик (Roberge та ін., Science 269:202-204 (1995)), а автоматичний синтез може бути проведений, наприклад, при використанні АВІ 431А пептидного синтезатора (Perkin Elmer, Palo Alto, CA). Синтезований пептид може бути суттєво очищений за допомогою препаративної високоефективної рідинної хроматографії (наприклад, Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles (1983)) або інших порівняних методик, які є доступними з рівня техніки. Склад синтетичних пептидів може бути підтверджений шляхом амінокислотного аналізу або секвенування (наприклад, за допомогою процедури деградації за Едманом). Крім того, амінокислотна послідовність поліпептиду або будь-якої його частини може бути змінена безпосередньо під час синтезу та/або може включати хімічні способи при використанні послідовностей з інших білків або будь-яких їх частин для одержання варіанта поліпептиду. Для того, щоб експресувати бажаний поліпептид, нуклеотидні послідовності, що кодують поліпептид або його функціональні еквіваленти, можуть бути вбудовані у прийнятний експресійний вектор, тобто вектор, який містить необхідні елементи для транскрипції та трансляції вбудованої кодуючої послідовності. Способи, які є добре відомим спеціалісту в даній області, можуть використовуватися для конструювання експресійних векторів, які містять послідовності, що кодують бажаний поліпептид, та прийнятні елементи контролю транскрипції та трансляції. Ці способи включають in vitro методики рекомбінантних ДНК, методики синтезу та генетичну рекомбінацію in vivo. Такі методики є описаними у Sambrook та ін., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000), та Ausubel та ін., Current Protocols in Molecular Biology (оновлюється щорічно). Різноманітність експресійних векторних/хазяйських систем може використовуватися для розміщення та експресії полінуклеотидних послідовностей. Такі включають, але не обмежені, мікроорганізми, трансформовані рекомбінантними бактеріофагами, плазмідні або космідні вектори для експресії ДНК; дріжджі, трансформовані дріжджовими експресійними векторами, клітинні системи комах, інфіковані вірусними експресійними векторами (наприклад, бакуловірусами); клітинні системи рослин, трансформовані вірусними експресійними векторами (наприклад, вірусом мозаїки цвітної капусти, CaMV; вірусом тютюнової мозаїки, TMV) або бактеріальними експресійними векторами (наприклад, Ті або pBR322 плазмідами); або клітинні системи тварин. "Контрольні елементи" або "регуляторні послідовності", присутні в експресійному векторі, є такими нетрансльованих ділянок вектора - енхансери, промотори, 5' та З' нетрансльовані ділянки, які взаємодіють з білками клітини хазяїна для здійснення транскрипції та трансляції. Такі елементи можуть варіювати за своєю силою та специфічністю. У залежності від векторної системи та використовуваного хазяїна може використовуватися будь-яка кількість прийнятних елементів транскрипції та трансляції, включаючи конститутивні та індуцибельні промотори. Наприклад, при клонуванні в бактеріальній системі можуть використовуватися індуцибельні промотори, такі, як гібридний lacZ промотор фагеміди PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) або плазміда PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) та подібні до них. У клітинних системах ссавців, звичайно, є бажаними промотори з генів ссавців або з вірусів ссавців. Якщо є 17 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 необхідним одержувати клітинну лінію, яка містить численні копії послідовності, що кодує поліпептид, то вектори на основі SV40 або EBV можуть переважно використовуватися з прийнятним селективним маркером. В бактеріальних системах в залежності від застосування, запланованого для експресованого поліпептиду може бути вибрано ряд векторів експресії. Наприклад, коли необхідні великі кількості, зокрема, для індукції антитіл, можуть використовуватися вектори, які направляють експресію високого рівня для злитих білків, що піддають легкій очистці. Такі вектори включають, але не обмежені, мультифункціональний клонуючий та експресійний вектори E. соlі, такі, як BLUESCRIPT (Stratagene), де послідовність, що кодує бажаний поліпептид може бути лігована у вектор у рамці з послідовностями для амінотермінального Met та подальших 7 залишків (3-галактозидази так, що одержують гібридний білок; pIN вектори (Van Heeke &Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989)); та подібні до них. pGEX вектори (Promega, Madison, Wis.) можуть також використовуватися для експресії чужорідних поліпептидів у вигляді злитих з глутатіон S-трансферазою білків (GST). В загальному випадку такі злиті білки є розчинними та легко можуть бути очищені від лізованих клітин за допомогою адсорбції з використанням глутатіон-агарозних кульок, після чого проводять елюювання у присутності вільного глутатіону. Білки, одержані в таких системах, можуть бути сконструйованими для включення гепарину, тромбіну або фактора ХА сайтів розщеплення протеазою так, що клонований поліпептид, що представляє інтерес, може вивільнятися із залишка GST по бажанню. У дріжджів Saccharomyces cerevisiae може використовуватися ряд векторів, що містять конститутивні або індуцибельні промотори, такі, як фактор альфа, алкогольоксидаза та PGH. Для огляду, див. Ausubel та ін. (вище) та Grant та ін., Methods Enzymol. 153:516-544(1987). У випадках, коли використовуються рослинні експресійні вектори, експресія послідовностей, що кодують поліпептиди, може направлятися будь-яким з ряду промоторів. Наприклад, вірусні промотори 35S та 19S CaMV можуть використовуватися окремо або у комбінації з омега лідерною послідовністю з TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). Альтернативно, можуть використовуватися рослинні промотори, такі, як мала субодиниця RUBISCO або промотори теплового шоку (Coruzzi та ін., EMBOJ. 3:1671-1680 (1984); Broglie та ін., Science 224:838-843 (1984); та Winter та ін., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Ці конструкції можуть вводитися в рослинні клітини за допомогою безпосередньої ДНК трансформації або за допомогою опосередкованої патогеном трансфекції. Такі методики є описаними у ряді загально доступних оглядів (див., наприклад, Hobbs в McGraw Hill Yearbook of Science та Technology стор.191-196 (1992)). Системи комах можуть також використовуватися для експресії поліпептиду, що представляє інтерес. Наприклад, в одній такій системі вірус ядерного поліедрозу Autographa californica (AcNPV) використовують як вектор для експресії чужорідних генів у клітинах Spodoptera frugiperda або Trichoplusia larvae. Послідовності, що кодують поліпептид, можуть бути клоновані у несуттєву ділянку вірусу, таку, як поліедриновий ген, та розміщені під контролем поліедринового промотора. Успішне вбудовування послідовності, що кодує поліпептид, буде забезпечувати інактивацію поліедринового гену та забезпечувати продукцію рекомбінантного вірусу, в якому відсутній білок оболонки. Рекомбінантні віруси можуть потім використовуватися для інфікування, наприклад, клітин S. frugiperda або Trichoplusia larvae, в яких поліпептид, що представляє інтерес, може бути експресований (Engelhard та ін., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 91 :3224-3227(1994)). Для хазяйських клітинах ссавців є загальнодоступним ряд експресійних систем на основі вірусів. Наприклад, у випадках, коли як експресійний вектор використовується аденовірус, послідовності, що кодують бажаний поліпептид, можуть бути ліговані в аденовірусний транскрипційний/транляційний комплекс, який складається з пізнього промотора та потрійної лідерної послідовності. Інсерція у несуттєву Е1 або Е3 ділянку вірусного генома може використовуватися для одержання життєздатного вірусу, який є здатним до експресії поліпептиду у інфікованих хазяйських клітинах (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)). Крім того, транскрипційні енхансери, такі, як енхансер вірусу саркоми Рауса (RSV), можуть використовуватися для підвищення експресії у хазяйських клітинах ссавців. Способи та прописи для роботи з векторами на основі аденовірусів розглядаються у Wold, Adenovirus Methods та Protocols, 1998. Додаткові посилання, які стосуються використання аденовірусних векторів, можуть бути знайдені в Adenovirus: A Medical Dictionary, Bibliography, та Annotated Research Guide to Internet References, 2004. Специфічні сигнали ініціації можуть також використовуватися для досягнення більш ефективної трансляції послідовностей, які кодують поліпептид, що представляє інтерес. Такі 18 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сигнали включають ATG кодон ініціації та суміжні послідовності. У випадках, коли послідовності, що кодують поліпептид, його кодон ініціації та розміщені вище послідовності, вбудовуються в прийнятний експресійний вектор, немає необхідності у додаткових сигналах контролю транскрипції або трансляції. Проте у випадках, коли вбудовується тільки кодуюча послідовність або її частина, повинні бути забезпечені екзогенні сигнали контролю трансляції, що включають ATG кодон ініціації. Крім того, кодон ініціації повинен знаходитися у правильній рамці зчитування для забезпечення трансляції повної вставки. Екзогенні елементи трансляції та кодони ініціації можуть мати різне походження, як природне, так і штучне. Ефективність експресії може бути підвищена шляхом включення енхансерів, які є прийнятними для конкретної клітинної системи, що використовується, такі, як ті, що описані у літературі (Scharf та ін., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)). На доповнення, штам хазяйських клітин може бути вибраний за його здатністю модулювати експресію вбудованих послідовностей або процесувати експресований білок бажаним способом. Такі модифікації поліпептиду включають, але не обмежені, ацетилування, карбоксилування, глікозилювання, фосфорилювання, ліпідизацію та ацилування. Посттрансляційне процесування, яке розщеплює форму попередника білка, може також використовуватися для поліпшення правильності інсерції, зборки та/або функції. Різноманітні хазяйські клітини, такі, як СНО, HeLa, MDCK, HEK293, та WI38, які мають специфічні клітинні механізми та характерні інструменти для таких посттрансляційних активностей, можуть бути вибрані для забезпечення правильної модифікації та процесингу чужорідного білка. Для довгострокової продукції рекомбінантних білків з високим виходом в загальному випадку є бажаною стабільна експресія. Наприклад, лінії клітин, які стабільно експресують полінуклеотид, що представляє інтерес, можуть бути трансформовані при використанні експресійних векторів, які можуть містити вірусне джерело реплікації та/або ендогенні експресійні елементи та селективний маркерний ген у тому самому або в окремому векторі. Після введення вектора клітини залишають для росту протягом 1-2 днів у збагаченому середовищі перед тим, як їх переносять на селективне середовище. Призначення селективного маркера полягає у підтвердженні стійкості до селекції, крім того, його присутність дозволяє рости забезпечувати ріст та відновлення клітин, які успішно експресують вбудовані послідовності. Стійкі клони стабільно трансформованих клітин можуть піддаватися розмноженню при використанні методик культур тканини, прийнятних для типу клітин. Може використовуватися будь-яка кількість систем селекції для відновлення трансформованих ліній клітин. Такі включають, але не обмежені, гени тимідинкінази вірусу простого герпесу (tk.) (Wigler та ін., Cell 11:223-32 (1977)) та аденін фосфорибозилтрансферази (aprt.) (Lowy та ін., Cell 22:817-23 (1990)), які можуть використовуватися у клітинах, які є tk. супресивними або aprt. супресивними, відповідно. Крім того, резистентність до антиметаболіту, антибіотику або гербіциду може використовуватися як основа для проведення селекції; наприклад, dhfr, який забезпечує резистентність до метотрексату (Wigler та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980)); npt, який надає стійкості до аміноглікозидів, неоміцин та G-418 (Colbere-Garapin та ін., J. Моl. ВіоІ. 150:1-14 (1981)); а також als або pat, які забезпечують резистентність до хлорсульфурону та фосфінотрицинацетилтрансферази, відповідно (Murry, вище). Додаткові селективні гени були описані і включають, наприклад, trpB, який дозволяє клітинах утилізувати індол замість триптофану, або hisD, який дозволяє клітинам утилізувати гістинол замість гістидину (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85:8047-51 (1988)). Нещодавно здобуло популярності застосування видимих маркерів з такими маркерами, як антоціаніни, -глюкуронідаза та її субстрат GUS, а також люцифераза та її субстрат люциферин, що широко використовуються не тільки для ідентифікації трансформантів, а також для кількісної оцінки кількості нестійкої або стабільної експресії білка, що є притаманною специфічним векторним системам (Rhodes та ін., Methods Моl. ВіоІ. 55:121-131 (1995)). Хоча присутність/відсутність експресії маркерного гена передбачає, що ген, який представляє інтерес, є також присутнім, його присутність та експресія потребують підтвердження. Наприклад, якщо послідовність, яка кодує поліпептид, є вбудованою у послідовність маркерного гена, рекомбінантні клітини, які містять послідовності, можуть бути ідентифіковані за відсутністю функції маркерного гена. Альтернативно, маркерний ген може бути розміщений у тандемі з послідовністю, що кодує поліпептид, під контролем одного й того ж промотора. Експресія маркерного гена у відповідь на індукцію або селекцію, звичайно, свідчить про експресію тандемного гена також. Альтернативно, хазяйські клітини, які містять та експресують бажану полінуклеотидну послідовність можуть бути ідентифіковані за допомогою різноманітних процедур, що є відомими спеціалісту в даній області. Такі процедури включають, але не обмежені, ДНК-ДНК або ДНК-РНК 19 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гібридизації та біотест на білок або методики імуноаналізу, які включають мембранні технології, методики на основі розчинів або чіпів для визначення та/або кількісної оцінки нуклеїнової кислоти або білка. В області техніки відомі різноманітні прописи для визначення та вимірювання експресії продуктів, які кодуються полінуклеотидом, при використанні або поліклональних, або моноклональних антитіл, специфічних для продукту. Такі приклади включають твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA), радіоімунологічний аналіз (RIA) та сортування клітин зі збудженням флуоресценції (FACS). Імуноаналіз для двох сайтів на основі моноклональних антитіл, що передбачає застосування моноклональних антитіл, реактивних до неінтерферуючих епітопів на даному поліпептиді, може бути бажаним для деяких застосувань, але також може використовуватися аналіз на основі конкурентного зв'язування. Ці та інші аналізи є описаними у багатьох джерелах, у Hampton та ін., Serological Methods, Laboratory Manual (1990) та Maddox та ін., J. Exp. Med. 158:1211-1216(1983). Широка різноманітність міток та методик кон'югації є відомими спеціалісту в області техніки та можуть використовуватися у різних амінокислотних аналізах та аналізах нуклеїнової кислоти. Засоби для одержання міченої гібридизації або ПЛР зондів для визначення послідовностей, які відносяться до полінуклеотидів, включають олігомічення, нік-трансляцію, мічення кінців або ПЛР ампліфікацію при використанні міченого нуклеотиду. Альтернативно, послідовності або їх частини можуть бути клоновані у вектор для одержання зонда мРНК. Такі вектори є відомим в області техніки, комерційно доступними та можуть використовуватися для синтезу РНК-зондів in vitro шляхом додання прийнятних РНК-полімерази, такої, як Т7, ТЗ або SP6, та мічених нуклеотидів. Ці процедури можуть бути проведені при використанні різноманітних комерційних наборів. Прийнятні репортерні молекули або мітки, які можуть використовуватися, включають радіонуклідні, ферментні, флуоресцентні, хемілюмінісцентні або хромогенні агенти, а також субстрати, кофактори, магнітні частинки тощо. Хазяйські клітини, трансформовані полінуклеотидною послідовністю, що представляє інтерес, можуть культивуватися в умовах, прийнятних для експресії та одержання білка з культури клітин. Білок, який продукується рекомбінантною клітиною, може секретуватися або міститися внутрішньоклітинно, в залежності від послідовності та/або використовуваного вектора. Як буде зрозуміло спеціалісту в даній області техніки, експресійні вектори, що містять полінуклеотиди згідно з винаходом, можуть бути сконструйовані для вміщення сигнальних послідовностей, які управляють секрецією кодованого поліпептиду через мембрану прокаріотичних або еукаріотичних клітин. Інші рекомбінантні конструкції можуть використовуватися для приєднання послідовностей, що кодують бажаний поліпептид, до нуклеотидної послідовності, що кодуює поліпептидний домен, який буде сприяти очистці розчинних білків. Такі домени, що сприяють очистці, включають, але не обмежені, хелатуючі метал пептиди, такі, як модулі гістидин-триптофан, що дозволяють проводити очистку на імобілізованих металах, домени білка А, які дозволяють здійснювати очистку на імобілізованому імуноглобуліні, та домени, які використовуються у FLAGS подовження/спорідненість системі очистки (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Включення послідовностей відщеплюваного лінкера, таких, як ті, що є специфічними для Фактора ХА або ентерокінази (Invitrogen. San Diego, Calif.), між доменом очистки та кодованим поліпептидом може використовуватися для поліпшення очистки. Один такий експресійний вектор забезпечує експресію злитого білка, що містить бажаний поліпептид, та нуклеїнової кислоти, що кодуює 6 залишків гістидину, які передують сайту розщеплення тіоредоксину або ентерокінази. Гістидинові залишки поліпшують очистку на ІМІАС (афінна хроматографія на основі імобілізованого іону металу), як описано у Porath та ін., Prot. Exp. Purif. 3:263-281 (1992), у той час, як сайт розщеплення ентерокінази забезпечує засіб для очистки бажаного поліпептиду від злитого білка. Обговорення векторів, які містять злиті білки, забезпечується у КгоІІ та ін., DNA Cell Biol. 12:441-453(1993)). На доповнення до способів рекомбінантного одержання, поліпептиди згідно з винаходом та їх фрагменти можуть бути одержані прямим пептидним синтезом при використанні твердофазних методик (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). Синтез білка може бути проведений при використанні ручних методик або автоматичним способом. Автоматичний синтез може бути досягнений при використанні, наприклад, Applied Biosystems 43 1А пептидного синтезатора (Perkin Elmer). Альтернативно, різні фрагменти можуть бути хімічно синтезовані та поєднані при використанні хімічних способів для одержання молекули повної довжини. IN VIVO методики для доставки полінуклеотидів У додаткових втіленнях генетичні конструкції, що включають один або більше полінуклеотидів згідно з винаходом, вводяться у клітини in vivo. Цього можна досягти при 20 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використанні будь-якого з різноманітності добре відомих підходів, деякі з яких приведені нижче з метою ілюстрації. 1. Аденовіруси Один з бажаних способів для in vivo доставки однієї або більше послідовностей нуклеїнової кислоти втягує застосування аденовірусного експресійного вектора. "Аденовірусний експресійний вектор" призначений для включення тих конструкцій, що містять аденовірусні послідовності, достатні для (а) підтримання упаковки конструкції та (b) для експресії полінуклеотиду, що був клонований у конструкції у смисловій або антисмисловій орієнтації. Звичайно, у контексті антисмислової конструкції експресія не вимагає того, щоб був синтезований генетичний продукт. Експресійні вектори включають генетично створену форму аденовірусу. Знання генетичної організації аденовірусу, що містить дволанцюгову лінійну вірусну ДНК розміром 36 кб, дозволяє проводити заміни великих ділянок аденовірусної ДНК чужорідними послідовностями розміром до 7 кб (Grunhaus & Horwitz, 1992). На противагу до ретровірусів, аденовірусна інфекція хазяйських клітин не приводить до хромосомної інтеграції, оскільки аденовірусна ДНК може реплікуватися як епісома без потенціальної генотоксичності. Крім того, аденовіруси структурно є стабільними та не мають виявленої геномної перестановки після екстенсивної ампліфікації. Аденовірус може інфікувати практично усі епітеліальні клітини, незважаючи на стадію їх клітинного циклу. На сьогоднішній момент інфекція виникає як така, що пов'язана тільки з помірною хворобою, такою, як респіраторне захворювання у людей. Аденовірус є особливо прийнятний для застосування як вектор для переносу генів завдяки своєму геному середнього розміру, легкості роботи з ним, високому титру, широкому діапазону цільових клітин та високій інфективності. Обидва кінці вірусного генома містять 100-200 пар основ інвертованих повторів (ITR), що представляють собою цис-елементи, необхідні для реплікації та пакування вірусної ДНК. Ранні (Е) та пізні (L) ділянки генома містять різні транскрипційні одиниці, які розділяються за початком реплікації ДНК. Е1 ділянка (Е1А та Е1В) кодує білки, які відповідають за регуляцію транскрипції вірусного генома та деяких клітинних генів. Експресія Е2 ділянки (Е2А та Е2В) приводить до синтезу білків для реплікації ДНК. Ці білки є втягнутими в реплікацію ДНК, експресію пізніх генів та у процес входу у клітину та виходу з клітини (Renan, 1990). Продукти пізніх генів, включаючи більшість вірусних капсидних білків, експресуються тільки після значного процесування одного первинного транскрипту, який виділяється під контролем основного пізнього промотора (MLP). MLP (що розміщений при 16,8 m.u.) є особливо ефективним під час пізньої фази інфекції, а усі мРНК, які продукуються під контролем цього промотора мають 5'-трироздільну лідерну (TPL) послідовність, яка робить ці мРНК переважними для трансляції. У сучасних системах рекомбінантний аденовірус одержують шляхом гомологічної рекомбінації між шуттель-вектором та провірусним вектором. Завдяки можливій рекомбінації двох провірусних векторів аденовірус дикого типу може бути одержаний в результаті цього процесу. Таким чином, є важливим ізолювати один клон вірусу з індивідуальної бляшки та перевірити його структуру. Одержання та розмноження сучасних аденовірусних векторів, які є дефектними на реплікацію, залежить від унікальної лінії хелперних клітин, що позначається як 293, яка була трансформована з клітин ембріональної нирки людини за допомогою Ad5 фрагментів ДНК та конститутивно експресує Е1 білки (Graham та ін., 1977). Оскільки Е3 ділянка є несуттєвою у геномі аденовірусу (Jones & Shenk, 1978), сучасні аденовірусні вектори завдяки клітинам 293 несуть чужорідну ДНК або у Е1, або у D3, або в обох ділянках (Graham & Prevec, 1991). У природі аденовірус може упаковувати приблизно 105% генома дикого типу (Ghosh-Choudhury та ін., 1987), забезпечуючи ємність для приблизно 2 кб додаткової ДНК. Поєднаний з приблизно 5,5 кб ДНК, що здатна до заміщення в Е1 та Е3 ділянках, максимальна ємність сучасного аденовірусного вектора складає більше 7,5 кб або приблизно 15% загальної довжини вектора. Більше 80% генома аденовірусу залишається у складі векторного скелета і є джерелом цитотоксичності, асоційованої з вектором. Крім того, дефектність по реплікації вірусу з делетованою Е1 ділянкою є неповною. Наприклад, розсіювання вірусної генної експресії спостерігали у наявних на даний момент векторах при високій множинності зараження (МОI) (Mulligan, 1993). Хелперні клітинні лінії можуть мати походження від клітин людини, таких, як клітини ембріональної нирки людини, м'язові клітини, гемопоетичні клітини або інші ембріональні мезенхимальні або епітеліальні клітини людини. Альтернативно, хелперні клітини можуть мати походження від клітин інших видів ссавців, що є пермісивними для людського аденовірусу. Такі клітини включають, наприклад, клітини Vero або інші ембріональні мезенхимальні або 21 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 епітеліальні клітини мавпи. Як вказано вище, на сьогоднішній момент бажаною є хелперна клітинна лінія 293. Нещодавно, Racher та ін. (1995) розкрили поліпшені спосіб для культивування клітин 293 та розмноження аденовірусу. В одному форматі способу природні агрегати клітин вирощують шляхом інокуляції індивідуальних клітин у силіконізовані колби, що обертаються, на 1 л (Techne, Cambridge, UK), які містять 100-200 мл середовища. Після перемішування при 40 об./хв., життєздатність клітин оцінюють при використанні трипанового блакитного. В іншому форматі способу Fibra-Cel мікрочіпи (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 г/л) використовували так, як описано нижче. Клітинний інокулюм, ресуспендований у 5 мл середовища, додавали до носія (50 мл) в колби Ерленмейера на 250 мл та залишали у стаціонарному стані протягом періоду часу від 1 до 4 годин при перемішуванні час від часу. Потім середовище замінювали 50 мл свіжого середовища та починали струшувати колби. Для продукції вірусу клітини вирощували до приблизно 80% конфуентності, після цього моменту часу замінювали середовище (до 25% заключного об'єму) та додавали аденовірус при МОІ 0,05. Культури залишали стояти протягом ночі, після чого збільшували об'єм до 100% та починали струшування протягом наступних 72 годин. Крім вимоги того, що аденовірусний вектор повинен бути дефектним щодо реплікації, або принаймні, умовно дефектним, природа аденовірусу не є важливою для успішної практики винаходу. Аденовірус може представляти собою такий будь-якого з 42 різних відомих серотипів або підгруп A-F. Аденовірусний тип 5 підгрупи С є бажаним як початковий матеріал для того, щоб одержати традиційний дефектний щодо реплікації аденовірусний вектор для застосування у даному винаході, оскільки аденовірус типу 5 представляє собою людський аденовірус, стосовно якого відома велика кількість біохімічної та генетичної інформації, і він історично застосовується для створення більшості конструкцій, що використовують аденовірус як вектор. Як вказано вище, типовий вектор згідно з даним винаходом є дефектний щодо реплікації та не має аденовірусної ділянки Е1. Таким чином, є найбільш прийнятним вбудовувати полінуклеотид, що визначає бажаний ген, у положенні, з якого було видалено якого послідовності, які кодують Е1. Проте положення вбудовування конструкції в аденовірусних послідовностях не є критичним для даного винаходу. Полінуклеотид, який визначає ген, що представляє інтерес, може також бути вбудований замість делетованої ділянки Е3 у векторах із заміщеннями Е3, як описано Karlsson та ін. (1986), або у ділянці Е4, якщо хелперна лінія клітин компенсує Е4 дефект. Аденовірус легко піддається вирощуванню та обробці та демонструє широкий спектр хазяїв 9 11 in vitro та in vivo. Ця група вірусів може бути одержана у високих титрах, наприклад, 10 -10 бляшкоутворювальних одиниць на мл, вони можуть бути високо інфективними. Життєвий цикл аденовірусу не вимагає інтеграції у геном хазяйської клітини. Чужорідні гени, які доставляються аденовірусними векторами, є епісомальними генами та, таким чином, мають низьку генотоксичність стосовно хазяйських клітин. Не було повідомлень про будь-які побічні ефекти у дослідженнях вакцинації за допомогою аденовірусу дикого типу (Couch та ін., 1963; Тор та ін., 1971), що демонструє їх безпечність та терапевтичний потенціал як in vivo векторів для переносу генів. Аденовірусні вектори використовувалися при експресії еукаріотичних генів (Levrero та ін., 1991; Gomez-Foix та ін., 1992) та при розробці вакцин (Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992). Нещодавно досліди на тваринах дали змогу запропонувати можливість застосування рекомбінантного аденовірусу для генної терапії (Stratford-Perricaudet & Pericaudet, 1991; Stratford-Perricaudet та ін., 1990; Rich та ін., 1993). Дослідження введення аденовірусу у різні тканини включало інстиляцію у трахеї (Rosenfeld та ін., 1991; Rosenfeld та ін., 1992), м'язові ін'єкції (Ragot та ін., 1993), внутрішньовенні ін'єкції у периферичну кровоносну систему (Herz & Gerard, 1993) та стереотаксичні інокуляції у мозок (Le Gal La Salle та ін., 1993). Аденовірусні вектори можуть мати походження від аденовірусу людини. Альтернативно, вони можуть мати походження від аденовірусів інших видів, наприклад, шимпанзе, які мають перевагу, яка полягає у тому, що вірусні вектори не нейтралізуються антитілами проти людського аденовірусу, який циркулює у багатьох людей (див. наприклад, Tatsis N та ін. (2005) Gene Ther. Dec 1; [готується до друку]). 2. Ретровіруси Ретровіруси представляють собою групу вірусів з одноланцюговою РНК, які характеризуються здатністю перетворювати свою РНК на дволанцюгову ДНК в інфікованих клітинах за допомогою процесу зворотної транскрипції (Coffin, 1990). Одержана ДНК потім стабільно інтегрує у клітинні хромосоми як провірус та направляє синтез вірусних білків. Інтеграція приводить до утримування генних послідовностей вірусу у реципієнтній клітині та її 22 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нащадках. Ретровірусний геном містить три гени, gag, роl та env, що кодують капсидні білки, фермент полімерази, та компоненти оболонки, відповідно. Послідовність, що знаходиться вище від гена gag, містить сигнал для пакування генома у віріони. Дві довгі послідовності термінальних повторів (LTR) є присутніми на 5' та 3' кінцях вірусного генома. Вони містять сильний промотор та енхансерні послідовності та є також необхідними для інтеграції у геном хазяйської клітини (Coffin, 1990). Для того, щоб сконструювати ретровірусний вектор, нуклеїнову кислоту, що кодує одну або більше олігонуклеотидіних або полінуклеотидних послідовностей, що представляють інтерес, вбудовували у вірусний геном у місце певних вірусних послідовностей для одержання вірусу, який є дефектним по реплікації. Для того, щоб одержати віріони, конструювали клітинну лінію для упаковки, що містить гени gag, рої та env, але не містить LTR та компонентів упаковки (Mann та ін., 1983). Якщо рекомбінантна плазміда містить кДНК разом з ретровірусними LTR та послідовностями пакування, вбудованими у клітинну лінію (за допомогою осадження при використанні фосфату кальцію, наприклад), пакувальна послідовність дозволяє РНКтранскрипту рекомбінантної плазміди упаковуватися у вірусні частинки, які потім секретуються у культуральне середовище (Nicolas & Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann та ін., 1983). Середовище, яке містить рекомбінантні ретровіруси потім збирали, необов'язково концентрували та використовували для переносу генів. Ретровірусні вектори є здатними інфікувати широку різноманітність типів клітин. Проте інтеграція та стабільна експресія вимагає ділення хазяйських клітин (Paskind та ін., 1975). Новий підхід, призначений для проведення специфічного мічення ретровірусних векторів, був нещодавно удосконалений на основі хімічної модифікації ретровірусу шляхом додання залишків лактози до вірусної оболонки. Модифікація може дозволити проводити специфічну інфекцію гепатоцитів за допомогою сіалоглікопротеїнових рецепторів. Були розроблені різні підходи до мічення рекомбінантних ретровірусів, в яких використовуються біотинильовані антитіла проти білка оболонки ретровірусу та проти специфічного рецептора клітин. Антитіла зливали з компонентами біотину при використанні стрептавідину (Roux та ін., 1989). При використанні антитіл проти антигенів класу І та класу II основного комплексу гістосумісності, було продемонструвано Інфекцію різноманітних клітин людини, що несуть поверхневі антигени, екотропним вірусом in vitro (Roux та ін., 1989). 3. Аденоасоційовані віруси AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat & Muzycska, 1984) представляють собою парвовірус, який було відкрито як контамінацію препаратів аденовірусу. Він представляє собою убіквітарний вірус (антитіла до нього є присутніми у 85% населення США), який не є пов'язаним з будь-яким захворюванням. Вони також класифіковані як депендовіруси, оскільки їх реплікація є залежною від присутності хелперного вірусу, такого, як аденовірус. Було ізольовано п'ять серотипів, з яких AAV-2 є найкраще охарактеризованим. AAV містить одноланцюгову лінійну ДНК, що заключена у капсидні білки VP1, VP2 та VP3 з утворення ікосаедричного віріону, що має розмір від 20 до 24 нм у діаметрі (Muzyczka & McLaughlin, 1988). ДНК AAV має розмір приблизно 4,7 кілобаз. Вона містить дві відкриті рамки зчитування та є фланкованою двома ITR. У геномі AAV міститься два основні гени: rep та cap. Ген rep кодує білки, які відповідають за вірусну реплікацію, у той час, як cap кодує капсидний білок VP1-3. Кожний ITR утворює Т-подібну шпилькову структуру. Ці термінальні повтори є єдиними цискомпонентами AAV для хромосомної інтеграції. Таким чином, AAV може використовуватися як вектор з усіма вірусними кодуючими послідовностями, які є видаленими та заміненими касетою генів для доставки. Було ідентифіковано три вірусні промотори, вони називаються р5, р19 та р40 згідно з їх картою положень. Транскрипція з р5 та р19 приводить до одержання rep білків, а транскрипція з р40 забезпечує одержання капсидних білків (Hermonat & Muzyczka, 1984). Існує декілька факторів, які підштовхують дослідників до вивчення здатності застосування pAAV як експресійного вектора. Один з них полягає у тому, що існує дивовижно мало вимог стосовно доставки гена для інтеграції у хазяйську хромосому. Необхідно мати ITR розміром 145 п.о., які складають тільки 6% генома AAV. Це залишає місце у векторі для здійснення інсерції ДНК розміром 4,5 кілобаз. Незважаючи на те, що така ємність вектора може перешкоджати AAV доставляти великі гени, це є достатньо прийнятним для доставки антисмислових конструкцій згідно з даним винаходом. AAV представляє собою також вдалий вибір векторів доставки завдяки своїй безпечності. Існує відносно складний механізм рятування вірусу: для мобілізації pAAV необхідний не тільки аденовірус дикого типу, але й також гени AAV. Крім того, AAV не є патогенним та не асоційований з будь-яким захворюванням. Видалення вірусних кодуючих послідовностей 23 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мінімізує імунні реакції на генну експресію вірусу, та, таким чином, pAAV не викликає запальної відповіді. 4. Інші вірусні вектори як конструкції для експресії Інші вірусні вектори можуть використовуватися як експресійні конструкції у даному винаході для доставки олігонуклеотидних або полінуклеотидних послідовностей до хазяйської клітини. Можуть використовуватися вектори, які мають походження від вірусів, таких, як вірус коров'ячої віспи (Ridgeway, 1988; Coupar та ін., 1988), лентівірус, поліовірус та віруси герпесу. Вони пропонують декілька привабливих характеристик для різних клітин ссавців (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar та ін., 1988; Horwich та ін., 1990). З нещодавнім відкриттям дефектних вірусів гепатиту В було досягнуто нового розуміння взаємозв'язку структура-функція для різних вірусних послідовностей. In vitro дослідження показали, що вірус може зберігати здатність до залежного від хелпера пакування та зворотної транскрипції, незважаючи на делецію до 80% свого генома (Horwich та ін., 1990). Це визначає той факт, що великі частини генома можуть бути заміщені чужорідним генетичним матеріалом. Гепатотропізм та персистенція (інтеграція) були особливо привабливими властивостями для направленого на печінку переносу генів. Chang та ін. (1991) вводили ген хлорамфенікол ацетитрансферази (CAT) у геном вірусу гепатиту В качки замість кодуючих послідовностей полімерази, поверхневих та попередників поверхневих послідовностей. Вказану генетичну конструкцію трансфікували разом з вірусом дикого типу у клітинну лінію гепатоми птахів. Культуральне середовище, яке містило високі титри рекомбінантного вірусу, використовували для інфікування первинних гепатоцитів качки. Стабільну експресію гена CAT визначали, принаймні, через 24 дні після трансфекції (Chang та ін., 1991). 5. Невірусні вектори Для того, щоб здійснити експресію олігонуклеотидних або полінуклеотидних послідовностей згідно з даним винаходом, експресійна конструкція повинна бути доставлена у клітину. Така доставка може бути проведена in vitro як лабораторні процедури з трансформації клітинних ліній, або in vivo, або ex vivo, як лікування деяких станів захворювання. Як описано вище, один бажаний механізм для доставки представляє собою такий шляхом вірусної інфекції, де експресійна конструкція є заключеною в інфективні вірусні частинки. Як тільки експресійна конструкція доставляється у клітину, нуклеїнова кислота, що визначає бажану олігонуклеотидну або полінуклеотидну послідовності, може розміщуватися та експресуватися у різних сайтах. У деяких втіленнях нуклеїнова кислота, що кодує конструкцію, може бути стабільно інтегрована у геном клітини. Така інтеграція може мати специфічне положення та орієнтацію за допомогою гомологічної рекомбінації (генне заміщення) або може бути інтегрована у випадковій, неспецифічній орієнтації (генний приріст). У додаткових втіленнях нуклеїнова кислота може стабільно підтримуватися у клітині як окремий епісомальний сегмент ДНК. Такі сегменти нуклеїнової кислоти або "епісоми" кодують послідовності, достатні для того, щоб забезпечити підтримання та реплікацію незалежно від або синхронно з циклом хазяйської клітини. Як експресійна конструкція доставляється до клітини та де у клітині залишається нуклеїнова кислота, залежить від типу використовуваної експресійної конструкції. У деяких втіленнях згідно з винаходом експресійна конструкція, що включає одну або більше олігонуклеотидних або полінуклеотидних послідовностей, може просто складатися з оголеної рекомбінантної ДНК або плазміди. Перенос конструкції може бути проведений за допомогою будь-якого зі способів, згаданих вище, при цьому конструкція фізичним або хімічним шляхом проникає через клітинну мембрану. Це є особливо прийнятним для переносу in vitro, але може також використовуватися in vivo. Dubensky та ін. (1984) успішно ввели ДНК поліомавірусу у формі преципітату фосфату кальцію у печінку та селезінку дорослих та новонароджених мишей, продемонструвавши при цьому активну реплікацію вірусу та гостру інфекцію. Benvenisty & Reshef (1986) також продемонстрували, що пряма інтраперитонеальна ін'єкція преципітованих фосфатом кальцію плазмід призводить до експресії трансфікованих генів. Передбачається, що ДНК, яка кодує бажаний ген, може також переноситися подібним чином in vivo та експресувати генний продукт. Інше втілення згідно з винаходом для переносу експресійної конструкції оголеної ДНК у клітини може втягувати бомбардування частинками. Цей спосіб залежить від здатності прискорювати вкриті ДНК мікрочастинки до високої швидкості, що дозволяє їм проривати клітинні мембрани та проникати у клітини без їх знищення (Klein та ін., 1987). Було розроблено кілька пристроїв для прискорення маленьких частинок. Один такий пристрій базується на високовольтному розряді для одержання електричного струму, який, у свою чергу, забезпечує рушійну силу (Yang та ін., 1990). Використовувані мікрочастинки складаються з біологічно інертних речовин, таких, як вольфрам або золоті кульки. 24 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вибрані органи, включаючи печінку, шкіру та м'язову тканину пацюків та мишей, бомбардували in vivo (Yang та ін., 1990; Zelenin та ін., 1991). Це може потребувати хірургічних заходів щодо тканин або клітин для видалення будь-якої проміжної тканини між гарматою та цільовим органом, тобто, обробки ex vivo. Крім того, ДНК, що кодують певний ген, можуть доставлятися за допомогою цього способу та є такими, що включені у даний винахід. Поліпептидні композиції Даний винахід в інших аспектах забезпечує поліпептидні композиції. В загальному випадку, поліпептид згідно з винаходом буде ізольованим поліпептидом (або епітопом, варіантом або його активним фрагментом), що має походження від різних видів ссавців. Бажано, коли поліпептид кодується полінуклеотидною послідовністю, розкритою в даній заявці, або послідовністю, яка гібридизується при умовах помірної жорсткості з полінуклеотидною послідовністю, розкритою в даній заявці. Альтернативно, поліпептид може визначатися як поліпептид, який включає суміжну амінокислотну послідовність з амінокислотною послідовністю, розкритою в даній заявці, або такий поліпептид включаює цільну амінокислотну послідовність, розкриту в даній заявці. Імуногенні частини можуть у загальному випадку бути ідентифіковані при використанні добре відомих методик, таких, як ті, що узагальнені у Paul, Fundamental Immunology, 3-є вид., 243-247 (1993) та посилання, які там цитуються. Такі методики включають скринінг поліпептидів на їх здатність реагувати з антиген-специфічними антитілами, антисироваткою та/або лініями або клонами Т-клітин. Як використовується в даній заявці, антисироватка та антитіла є "антигенспецифічними", якщо вони специфічно зв'язуються з антигеном (тобто, реагують з білком в аналізі ELISA або іншому імуноаналізі, та не реагують здатним до визначення чином з неспорідненими білками). Така антисироватка та антитіла можуть бути одержані так, як описано в даній заявці, та при використанні добре відомих методик. Імуногенна частина білка Mycobacterium sp. є частиною, що реагує з такою антисироваткою та/або Т-клітинами на рівні, що не є суттєво меншим, ніж реактивність поліпептиду повної довжини (наприклад, в аналізі ELISA та/або в аналізі Т-клітинної реактивності). Такі імуногенні частини можуть реагувати у цих методах на рівні, що є подібним або більшим, ніж реактивність поліпептиду повної довжини. Такі скринінги можуть бути у загальному випадку проведені при використанні способів, добре відомих середньому спеціалісту в даній області техніки, таких, як ті, що описані у Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988) та Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998). Наприклад, поліпептид може бути імобілізований на твердій основі та контактувати з сироваткою пацієнта для зв'язування антитіл, які знаходяться у сироватці з імобілізованим поліпептидом. Незв'язана сироватка може потім видалятися, а зв'язані антитіла визначають при 125 використанні, наприклад, міченого І білка А. Поліпептиди можуть бути одержані при використанні будь-якого з добре відомих способів. Рекомбінантні поліпептиди, що кодуються послідовністями ДНК, як описано вище, можуть бути легко одержані з послідовностей ДНК при використанні будь-якого з різноманітних експресійних векторів, відомих спеціалісту в даній області техніки. Експресія може бути досягнута у будь-якій прийнятній хазяйські клітині, що була трансформована або трансфікована за допомогою експресійного вектора, який містить молекулу ДНК, яка кодує рекомбінантний поліпептид. Прийнятні хазяйські клітини включають клітини прокаріот, дріжджів та вищих еукаріот, такі, як клітини ссавців та рослинні клітини. Переважно використовувані хазяйські клітини представляють собою Є. соlі, дріжджі або клітинну лінію ссавців, таку, як COS або СНО. Супернатанти з прийнятних систем хазяїн/вектор, які секретують рекомбінантний білок або поліпептид у культуральне середовище, можуть спочатку піддаватися концентруванню при використанні комерційно доступного фільтра. Після концентрації концентрат може піддаватися обробці при використанні прийнятної матриці для очистки, такої, як афінна матриця або іонообмінна смола. На завершення, можна використовувати одну або більше зворотних фаз ВЕРХ для подальшої очистки рекомбінантного поліпептиду. Поліпептиди згідно з винаходом, їх імуногенні фрагменти та інші варіанти, що містять менше, ніж приблизно 100 амінокислот, та в загальному випадку менше, ніж приблизно 50 амінокислот, можуть також бути одержані за допомогою синтетичних засобів при використанні методик, добре відомих середньому спеціалісту в області техніки. Наприклад, такі поліпептиди можуть бути синтезовані при використанні будь-якої комерційно доступної твердофазної методики, такої, як спосіб твердофазного синтезу Мерріфілда, де амінокислоти послідовно додають до амінокислотного ланцюга, що збільшується. Див. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146 (1963). Оснащення для автоматизованого синтезу поліпептидів є комерційно доступним від постачальників, таких, як Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), та може піддаватися керуванню згідно з інструкціями виробників. 25 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У деяких специфічних втіленнях поліпептид може бути злитим білком, що включає багаточисленні поліпептиди, як описано в даній заявці, таким, що включає, принаймні, один поліпептид, як описано в даній заявці, та неспоріднену з ним послідовність, таку, як відомий пухлинний білок. Злитий партнер може, наприклад, допомагати у забезпеченні Т-хелперних епітопів (імунологічний партнер злиття), переважно Т-хелперні епітопи впізнаються антитілами, або можуть допомагати в експресії білка (енхансер експресії) при більш високих виходах, ніж нативний рекомбінантний білок. Деякі бажані злиті партнери обидва представляють собою імунологічні партнери злиття та такі, що сприяють експресії. Інші партнери злиття можуть бути вибрані для того, щоб підвищувати розчинність білка або щоб дозволити білку бути націленим на бажані внутрішньоклітинні компартменти. Додаткові партнери злиття включають афінні мітки, які поліпшують очистку білка. Злиті білки можуть в загальному випадку бути одержані при використанні стандартних методик, включаючи хімічну кон'югацію. Переважно, злитий білок експресуеться як рекомбінантний білок, дозволяючи здійснювати одержання на високому рівні у порівнянні з незлитим білком в експресійній системі. Коротко, ДНК послідовності, що кодують поліпептидні компоненти, можуть бути поєднані окремо та ліговані у прийнятний експресійний вектор. 3'кінець послідовності ДНК, що кодує один поліпептидний компонент, лігують з використанням пептидного лінкера або без нього до 5'-кінця послідовності ДНК, що кодує другий поліпептидний компонент так, щоб рамки зчитування послідовностей були у фазі. Це дозволяє проводити трансляцію в один злитий білок, який зберігає біологічну активність обох поліпептидних компонентів. Послідовність пептидного лінкера може використовуватися для відокремлення першого та другого поліпептидних компонентів відстанню, достатньою для забезпечення того, щоб кожний поліпептид формувався у вторинну та третинну структури. Така послідовність пептидного лінкера вбудовується у злитий білок при використанні стандартних методик, добре відомих в області техніки. Прийнятні послідовності пептидного лінкера можуть бути вибрані на основі наступних факторів: (1) їх здатності набувати гнучкої витягнутої конформації; (2) їх здатності набувати вторинної структури, що може взаємодіяти з функціональними епітопами на першому та другому поліпептидах; та (3) відсутності гідрофобних або заряджених залишків, що можуть реагувати з поліпептидними функціональними епітопами. Бажані послідовності пептидного лінкера містять залишки Gly, Asn та Ser. Інші майже нейтральні амінокислоти, такі, як Thr та Ala, можуть також використовуватися у лінкерній послідовності. Амінокислотні послідовності, які можуть з успіхом використовуватися як лінкери, включають такі, розкриті в Maratea та ін., Gene 40:39-46 (1985); Murphy та ін., Рrос. Natl. Acad. Sci USA 83:8258-8262 (1986); патенті США №4,935,233 та патенті США №4,751,180. Лінкерна послідовність може в загальному випадку мати розмір від 1 до приблизно 50 амінокислот у довжину. Немає необхідності в лінкерних послідовностях, коли перший та другий поліпептиди містять ділянки неесенціальних Nтермінальних амінокислот, що можуть використовуватися для відокремлення функціональних доменів та для запобігання просторової взаємодії. Ліговані послідовності ДНК є оперативно зв'язаними з прийнятними елементами регуляції транскрипції або трансляції. Регуляторні елементи, що відповідають за експресію ДНК, розміщуються тільки 5' відносно ДНК послідовності, що кодуює перші поліпептиди. Подібно до цього, стоп-кодони, що є необхідними для завершення трансляції, та сигнали термінації транскрипції є присутніми тільки 3' відносно ДНК, що кодує другий поліпептид. Також забезпечуються злиті білки. Такі білки включають поліпептид, як описано в даній заявці з неспорідненим імуногенним білком. Бажано, коли імуногенний білок є здатним викликати відповідь на вже знайомий антиген. Приклади таких білків включають білки правцю, туберкульозу та гепатиту (див., наприклад, Stoute та ін., New Engl J. Med. 336:86-91 (1997)). У бажаних втіленнях імунологічний партнер злиття має походження від білка D, поверхневого білка грам-негативної бактерії Haemophilus influenza В (WO 91/18926). Бажано, коли похідна білка D включає приблизно одну третину білка (наприклад, перші N-термінальні 100-110 амінокислот), а похідна білка D може бути ліпідована. У певних бажаних втіленнях перші 109 залишків партнера злиття ліпопроотеїна D є включеними у N-термінальний кінець для забезпечення поліпептиду додатковими екзогенними епітопами Т-клітин та для підвищення рівня експресії в Е. соlі (функціонуючи, таким чином, як енхансер експресії). Ліпідний кінець забезпечує оптимальну презентацію антигену на клітинах, що презентують антиген. Інші партнери злиття включають неструктурний білок з вірусу грипу, NS1 (гемаглютинін). Типово, використовується 81 N-термінальна амінокислота, незважаючи на те, що можуть використовуватися різні фрагменти, які включають Т-хелперні епітопи. 26 UA 98605 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому втіленні імунологічний партнер злиття представляє собою білок, який є відомим як LYTA, або його частину (бажано С-термінальну частину). LYTA має походження від Streptococcus рnеumоnіае, що синтезує N-ацетил-і-аланін амідазу, відому як амідаза LYTA (кодується LytA геном; Gene 43:265-292 (1986)). LYTA представляє собою аутолізин, який специфічно розкладає певні зв'язки у пептидоглікановому скелеті. С-термінальний домен LYTA білка відповідає за афінність до холіну або деяких аналогів холіну таких, як DEAE. Ця властивість використовується для розробки C-LYTA експресійних плазмід Е. соlі, корисних для експресії злитих білків. Була описана очистка гібридних білків, які містять фрагмент C-LYTA на аміно-термінальному кінці (див. Biotechnology 10:795-798 (1992)). У бажаному втіленні повторювана частина LYTA можу бути вбудована у злитий білок. Повторювана частина знайдена у С-термінальній ділянці, починаючи із залишка 178. Особливо бажана частина повтору включає залишки 188-305. В загальному випадку, поліпептиди (включаючи злиті білки) та полінуклеотиди, як описано в даній заявці, є ізольованими. "Ізольований" поліпептид або полінуклеотид представляє собою такий, що є видаленим з його природного навколишнього середовища. Наприклад, існуючий у природі білок є ізольованим, якщо він відокремлений від деяких або усіх сумісно існуючих матеріалів у природній системі. Бажано, коли такі поліпептиди є, принаймні, приблизно на 90% чистими, більш переважно, принаймні, приблизно на 95% чистими та найбільш бажано, принаймні, приблизно на 99% чистими. Полінуклеотид вважається ізольованим, якщо, наприклад, він клонований у вектор, що не є частиною природного середовища. Т-клітини Імунотерапевтичні композиції можуть також або альтернативно включати Т-клітини, специфічні для антигену Mycobacterium. Такі клітини можуть в загальному випадку бути одержані in vitro або ex vivo при використанні стандартних процедур. Наприклад, Т-клітини можуть бути ізольовані з кісткового мозку, периферичної крові, або фракції кісткового мозку або периферичної крові пацієнта при використанні комерційно доступних систем для відокремлення клітин, таких, як система Isolex™, доступна від Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; див. також патент США №5,240,856; патент США №5,215,926; WO 89/06280; WO 91/16116 та WO 92/07243). Альтернативно, Т-клітини можуть мати походження від людей, пов'язаних або непов'язаних між собою родинними зв'язками, ссавців, відмінних від людини, культур або ліній клітин. Т-клітини можуть бути стимульовані за допомогою поліпептиду згідно з даним винаходом, полінуклеотиду, що кодує такий поліпептид, та/або клітини, що презентує антиген (АРС), яка експресує такий поліпептид. Таку стимуляцію проводять при умовах та протягом часу, достатніх для розмноження Т-клітин, що є специфічними для поліпептиду. Переважно поліпептид або полінуклеотид є присутнім у векторі для доставки, такому, як мікросфера, для сприяння одержанню специфічних Т-клітин. Т-клітини вважаються специфічними для поліпептиду згідно з винаходом, якщо Т-клітини специфічно розмножуються, секретують цитокіни або знищують цільові клітини, які вкриті поліпептидом або експресують ген, що кодує поліпептид. Т-клітинна специфічність може бути оцінена при використанні будь-якої з різноманітності стандартних методик. Наприклад, в аналізі вивільнення хрому або аналізі проліферації індекс стимуляції, що більше, ніж у 2 рази перевищує лізис та/або проліферацію у порівнянні з негативними контролями, свідчить про Тклітинну специфічність. Такі аналізи можуть бути проведені, наприклад, так, як описано у Chen та ін., Cancer Res. 54:1065-1070 (1994)). Альтернативно, визначення проліферації Т-клітин може бути проведене при використанні будь-якої з різноманітності стандартних методик. Наприклад, Т-клітинну проліферацію можна визначати шляхом вимірювання підвищення швидкості синтезу ДНК (наприклад, за допомогою імпульсного мічення культур Т-клітин тритійованим тимідином та вимірювання кількості тритійованого тимідину, вбудованого в ДНК). Контакт з поліпептидом згідно з винаходом (100 нг/мл -100 мкг/мл, бажано 200 нг/мл - 25 мкг/мл) протягом 3 - 7 днів буде приводити, принаймні, до двократного підвищення проліферації Т-клітин. Контакт, як описано вище, протягом 2-3 годин буде приводити до активації Т-клітин, як вимірюється при використанні стандартних цитокінових аналізів, в яких двократне підвищення рівня вивільнення цитокіну (наприклад, TNF або IFN-y) є показовим активації Т-клітин (див. Coligan та ін., Current Protocols in Immunology, том 1 (1998)). Т-клітини, що були активовані у відповідь на поліпептид, + + полінуклеотид або АРС, які експресують поліпептид, можуть бути CD4 та/або CD8 . Специфічні для білка Т-клітини можуть розмножені при використанні стандартних методик. У бажаних втіленнях Т-клітини одержують від пацієнта, зв'язаного з ним родинними зв'язками донора або незв'язаного з ним родинними зв'язками донора, та вводять пацієнтові після стимуляції та розмноження. 27 UA 98605 C2 + 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 + Для терапевтичних цілей можна підвищити кількість CD4 або CD8 Т-клітин, що проліферують у відповідь на поліпептид, полінуклеотид або АРС, або in vitro, або in vivo. Розмноження таких Т-клітин in vitro може проводитися різними шляхами. Наприклад, Т-клітини можуть повторно піддаватися впливу поліпептиду або короткого пептиду, що відповідає імуногенній частині такого поліпептиду, з або без додання факторів росту Т-клітин, таких, як інтерлейкін-2 та/або стимуляторних клітин, які синтезують поліпептид. Альтернативно, можна підвищити кількість однієї або більше Т-клітин, що проліферують у присутності білка, шляхом клонування. Способи клонування клітин є добре відомим в області техніки та включає метод серійних розведень. Фармацевтичні композиції У додаткових втіленнях даний винахід стосується композиції одного або більше полінуклеотидів, поліпептидів, Т-клітин, антитіл, та хіміотерапевтичних композицій, розкритих в даній заявці, у фармацевтично прийнятних розчинах для введення у клітину або у тварину, або окремо, або у комбінації з одним або більше інших терапевтичних модальностей. Також є зрозумілим, що, якщо це є бажаним, то сегмент нуклеїнової кислоти, (наприклад, РНК або ДНК), що експресує поліпептид, як розкрито в даній заявці, може також вводитися у комбінації з іншими агентами, такими, як наприклад, інші білки або поліпептиди або різноманітні фармацевтично активні агенти, включаючи хіміотерапевтичні агенти, ефективні проти інфекції М. tuberculosis. По суті не існує фактичного обмеження стосовно інших компонентів, які також можуть включатися, за умови, що додаткові агенти не спричинюють значного побічного ефекту на контакт з цільовими клітинами або тканинами хазяїна. Композиції можуть, таким чином, доставлятися разом з різними іншими агентами, як вимагається у конкретному випадку. Такі композиції можуть очищатися від хазяйських клітин або інших біологічних джерел або, альтернативно, можуть бути хімічно синтезовані так, як описано в даній заявці. Крім того, такі композиції можуть додатково включати композиції заміщених або дериватизованих РНК або ДЯК. Композиція фармацевтично прийнятних наповнювачів та розчинів носіїв є добре відомою спеціалісту в даній області техніки, оскільки є розробкою прийнятних режимів дозування та лікування для використання конкретних композицій, описаних в даній заявці, у різноманітних режимах лікування, включаючи, наприклад, оральні, парентеральні, внутрішньовенні, інтраназальні та внутрішньом'язові введення та композиції. Типово, композиції, що включають терапевтично ефективну кількість активної сполуки, доставляють приблизно від 2 мкг до приблизно 50 мкг Mtb72f поліпептиду на введення, більш типово, приблизно від 5 мкг до приблизно 40 мкг Mtb72f поліпептиду на введення. 1. Оральна доставка У деяких застосуваннях фармацевтичні композиції, розкриті в даній заявці, можуть доставлятися тварині шляхом орального введення. Як такі ці композиції можуть бути рецептовані з інертним розріджувачем або із здатним до засвоєння їстівним носієм, або вони можуть вводитися в тверді або у м'які желативанові капсули, або вони можуть ущільнюватися з утворенням таблеток, або вони можуть вводитися безпосередньо у харчові продукти раціону. Активні сполуки можуть навіть вводитися з наповнювачами та використовуватися у формі таблеток, які ковтаються, букальних таблеток, пілюль, капсул, еліксирів, суспензій, сиропів, пластинок та подібних до них (Mathiowitz та ін., 1997; Hwang та ін., 1998; патент США № 5,641,515; патент США № 5,580,579 та патент США № 5,792,451, кожне з яких специфічно введено в дану заявку як посилання у всій своїй цілісності). Таблетки, пілюлі, капсули та подібні їм можуть також містити наступні компоненти: зв'язувальний агент, такий, як трагакантова камедь, гуміарабік, кукурудзяний крохмаль або желатин; наповнювачі, такі, як фосфат дикальцію; агент для дезінтеграції, такий, як кукурудзяний крохмаль, картопляний крохмаль, альгінову кислоту тощо; лубрикант, такий, як стеарат магнію; та підсолоджувальний агент, такий, як цукроза, лактоза або сахарин, може додаватися також смаковий агент, такий, як м'ята, олія гаультерії або вишневий смаковий агент. Коли дозована форма формується у капсулу, то вона може містити у доповнення до матеріалів вказаного вище типу рідкий носій. Різноманітні інші матеріали можуть бути присутніми як покриття або можуть додаватися для того, щоб іншим чином модифікувати фізичну форму одиничної дози. Сироп або еліксир можуть містити активну сполуку, сахарозу як підсолоджувальний агент, метил- та пропілпарабени як консерванти, забарвлювальний агент та смаковий агент, такий, як смак вишні або апельсину. Звичайно, будь-який матеріал, що використовується для приготування будь-якої форми одиничної дози, повинен бути фармацевтично чистим та суттєво нетоксичним у використовуваних кількостях. У доповнення до цього, активні сполуки можуть бути введені у препарат та композиції уповільненого вивільнення. 28