Спосіб лікування або запобігання інфекції, яка викликається грибами роду aspergillus за допомогою тимозину альфа 1

1. Спосіб лікування або запобігання інфекції, яка викликається грибом роду Aspergillus, у ссавця, який полягає в тому, що ссавцю вводять фармацевтичну композицію, яка містить кількість тимозину альфа 1 (ТА1), що має ефективну протигрибкову дію. 2. Спосіб за п. 1, у якому ТА1 вводять у дозі, достатній для активації дендритних клітин для продукування цитокінів, які стимулюють Th1клітини. C2 2 (19) 1 3 Таким чином, у даній галузі існує необхідність у розробці способів лікування інфекції, яка викликається грибами p. Asperigillus. У даному винаході запропонований спосіб лікування або запобігання інфекції, яка викликається грибами p. Asperigillus у ссавців, який полягає в тому, що ссавцеві вводять фармацевтичну композицію, яка містить кількість тимозину альфа 1 (ТА1), що має ефективну протигрибкову дію. У клінічних й експериментальних дослідженнях встановлено, що для контролю ІА важлива реактивність Thl-клітин. Дендритні клітини (ДК) зумовлюють примування Thl-клітинами грибами in vivo й in vitro. Є дані про те, що на здатність легеневих ДК викликати відповідні Тклітинні відповіді на грибні антигени можуть впливати локальні імунорегуляторні каскади, у тому числі передача сигналу через Толл-подібні рецептори (ТПР). ДК можуть являти собою перспективні мішені для впливу при розробці імунотерапії й вакцин, і це зміщає основний напрямок фармацевтичних розробок в бік «ад'юванту». Переважним є ад'ювант, який має, як здатність стимулювати відповідний тип відповіді, найбільш придатний для боротьби з інфекцією, так й ефективність в умовах імуносупресії. Тимозин альфа 1 (ТА1) являє собою тимусний пептид, який зустрічається в природних умовах. ТА1 у формі синтетичного пептиду, що складається з 28 амінокислот, застосовують в усьому світі в клінічних умовах для лікування деяких вірусних інфекцій або як єдиний терапевтичний засіб, або в сполученні з інтерфероном альфа. ТА1 знаходить застосування також при лікуванні імунодефіцитних станів, злоякісних захворювань і ВІЛ/СНІДу. Механізм дії · синтетичного поліпептиду ТА1 у цей час не повністю вивчений, однак існує думка, що він зв'язаний із властивими поліпептиду імуномодуляторними активностями, спрямованими в основному на посилення функції Т-клітин. Внаслідок його імуномодуляторної дії на клітини природної імунної системи, включаючи здатність активувати активовані мітогеном протеїнкінази (МАРК) і експресію генів на макрофагах, автори винаходу розглядали ТА1 як ад'ювант, який має здатність активувати ДК для примування ТЫ-клітин відносно грибів р. Aspergillus. У даному винаході запропонований спосіб лікування інфекцій, що викликаються грибами^ р, Aspergillus, який полягає в тому, що ТА1 шляхом передачі сигналу через ТПР може активувати ДК для протигрибкового примування Тh1. У даному винаході запропонований спосіб лікування ссавця, інфікованого грибами p. Aspergillus, який полягає в тому, що такому ссавцеві вводять кількість тимозину альфа 1 (ТА1), що має ефективну протигрибкову дію. У переважному варіанті здійснення винаходу ТА1 має ефективність у відношенні інвазивного аспергільозу (ІА). Ефективна доза ТА1 є достатньою для активації дендритних клітин для продукування стимулюючих Тh1-клітини цитокінів. 80870 4 Переважна доза для лікування грибкової інфекції становить від 200 до 400мкг/кг ваги тіла на день. У переважному варіанті здійснення винаходу ссавець являє собою хазяїна з ослабленим імунітетом, насамперед людину. Спосіб застосовний, насамперед, для лікування пацієнтів з ослабленим імунітетом, насамперед пацієнтів, які є реципієнтами трансплантатів кісткового мозку. У даному винаході запропонований також спосіб запобігання інфекції, яка викликається грибами p. Aspergillus, у ссавця, який полягає в тому, що такому ссавцеві вводять кількість ТА1, що має ефективну протигрибкову дію. Винахід переважно застосовують для запобігання ІА в хазяїна з ослабленим імунітетом. У переважному варіанті здійснення винаходу спосіб запобігає таким інфекціям в пацієнтів з ослабленим імунітетом, насамперед у пацієнтів, які є реципієнтами трансплантатів кісткового мозку. Ефективна доза ТА1 є достатньою для активації дендритних клітин для продукування стимулюючих Тh1-клітини цитокінів. Переважна доза для запобігання грибкової інфекції становить від 200 до 400мкг/кг ваги тіла в день. Не вдаючись у яку-небудь конкретну теорію можна вважати, що даний винахід заснований на відкритті нової імунорегуляторної активності ТА1, яка дозволяє лікувати або запобігати інфекцію, що викликається грибами р. Aspergillus. Очевидно, ТА1 підсилює вироблення стимулюючих Тh1 цитокінів IL-12 р70, IL-10 й IFN-альфа різними типами ДК за допомогою залежного від MyD88 шляху. У трансфектованих ТПР клітинах ТА1, очевидно, безпосередньо активує сигнали, що прокуються ТLR9, але не TLR2, останній активується у відповідь на відповідні ліганди. Таким чином, ТА1, очевидно, активує продуковані TLR сигнали або безпосередньо, або непрямим способом. Наявні дані дозволяють припустити, що ТА1 може використовувати залежний від TLR2 каскад для вироблення IL-12 р70 на мієлоїдних дендритних клітинах (МДК) і залежний від TLR9 каскад для вироблення IFN-альфа й IL-10 на плазмацитоїдних дендритних клітинах (ПДК). Оскільки вироблення IL-10 дендритними клітинами (ДК) може являти собою компонент імунологічної пам'яті, що забезпечує захист від грибків, то баланс вироблення IL-12flL-10 на ДК й/або інших піднаборах ДК може зумовлювати дуже більшу роль ад'ювантності ТА1 при аспергільозі. На мишиній моделі ТКМ обробка ТА1 після зараження грибами р. Aspergillus приводила до збільшення кількості CD4+- і СО8+-клітин, а також до збільшення загальної кількості нейтрофілів. Після обробки ТАЇ кількість Тh1-клітин (які продукують IFN-гамма) збільшувалася, у той час як кількість Th2-клітин (які продукують IL-4) знижувалася. Важливо відзначити, що лікування мишей із ТКМ, інфікованих грибами р. Aspergillus, за допомогою ТА1 приводило до залежного від дози зменшення росту грибів у легенях, а при 5 використанні більш високих доз виявлялося можливим досягати повного вилікування інфекції. ТА1 мав також здатність підвищувати терапевтичну ефективність амфотерицину В. Впливи ТА1 на ДК узгоджуються з його антиапоптозною активністю. Оскільки ДК відіграють основну роль у забезпеченні балансу між імунопатологією, імунітетом й аутоімунітетом, і в тимусі має місце передача сигналу до ПДК через TLR9, то здатність ТА1 здійснювати модуляцію функції ДК є ендогенним регулятором природної й адаптивної імунних систем, які діють за допомогою використання ТПР. Це забезпечує раціональну основу для терапевтичного призначення ТА1 при деяких вірусних інфекціях, для яких вважається, що ПДК, які продукують IFN-альфа, відіграють основну роль. Для вироблення IFN-альфа в цих ПДК необхідним є присутність TLR9. Крім того, очевидно, ПДК беруть участь в імунних відповідях після трансплантації гематопоетичних клітин, що може пояснити серед іншого причину сприятливого впливу ТА1 на відновлення імунітету в ссавців, підданих ТКМ. ТПР, очевидно, активують природну імунну систему, не тільки допомагаючи адаптивній імунній системі, але й забезпечуючи безпосередню антимікробну ефекторну активність. Оскільки ТА1, очевидно, активують ДК для примування Тh1 відносно грибів p. Aspergillus і також протигрибковий статус ефекторних нейтрофілів, то це є додатковим доказом сприятливої дії ТА1 при лікуванні грибкових інфекцій. Гриб p. Aspergillus має унікальну природу, яка полягає в тому, що він являє собою сапрофітний гриб, який колонізує хазяїв з ослабленим імунітетом. У даному винаході запропонований цілеспрямований вплив на клітини й шляхи опосередковуваного клітинами імунітету, що дозволяє підвищувати стійкість до грибів p. Aspergillus, при якому ТА1 є ад'ювантом, який програмує відповідну реактивність Th1 відносно гриба за допомогою використання ТПР-шляху. Нижче винахід більш докладно проілюстрований на прикладі, який не обмежує його обсяг. Приклад 1 Тварини Самок мишей ліній BALB/c й C57BL6 віком 810 тижнів одержували від фірми Charles River. Мишей лінії NOD/SCID одержували від фірми The Jackson. З лінії C57BL6 виводили шляхом попарного схрещування гомозиготних мишей з дефіцитом TLR2, TLR9 й MyD88, а з лінії BALB/c виводили гомозиготних мишей з дефіцитом IFNгамма й IL-4, яких утримували у вільних від конкретного патогену умовах. Зараження мікроорганізмами й обробки Для зараження грибом p. A. fumigatus мишам протягом 3 послідовних днів вводили шляхом інтраназальної ін'єкції суспензію, яка містить 2 х 107 конідій/20мкл фізіологічного розчину. Для кількісної оцінки росту гриба в легенях застосовували аналіз хітину. Вміст хітину виражали в мікрограмах глюкозаміну на орган. Як 80870 6 негативний контроль використовували вміст глюкозаміну в легенях неінфікованих мишей, що, становив від 0,80 до 2,25мкг глюкозаміну/орган. Для гістологічного аналізу-легені вирізали й відразу ж фіксували у формаліні. Зрізи (товщиною 3-4 мікрони) тканин, занурених у парафін, фарбували методом Шифа з використанням перйодної кислоти. Тимозин альфа 1 (ТА1) і скремблер-поліпептид (модифікований поліпептид) являли собою очищені стерильні ліофілізовані ацетильовані поліпептиди з рівнями ендотоксину менше 0,03 пкг/мл за даними стандартного лимулус-аналізу лізату. Вони мали наступні послідовності: Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-AspThr-Ser-Ser-Glu-IIe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-GluLys-Lys-Glu-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-O (тимозин альфа 1) і Ас-А1а-Lys-Ser-Asp-Val-Lys-Ala-Glu-ThrSer-Ser-Glu-Ile-Asp-Thr-Thr-Glu-Leu-Asp-Glu-LysVal-Glu-Val-Lys-Ala-Asn-Glu-OH (sthmo3hh альфа 1). Їх ліофілізовані порошки відновлювали в стерильній воді. Обробки проводили в такий спосіб: підданим ТКМ мишам (ТКМ-мишам) вводили щодня, починаючи із дня здійснення інфузії KM, одночасно із зараженням, ТА1 у різних дозах, інтраперитонеально, тимозин альфа 1, 400мкг/кг, інтраперитонеально, або людський рекомбінантний G-CSF (гранулоцитарний колонієстимулювальний фактор), 250мкг/кг, внутрішньовенно, і продовжували вводити ще протягом 3 днів. Амфотерицин В вводили щодня протягом 3 днів одночасно із зараженням, у дозі 4000мкг/кг, інтраперитонеально. Ця доза призначалася для лікування ІА в оброблених циклофосфамідом мишей. Циклофосфамід, 150мг/кг, інтраперитонеально, вводили за день до здійснення зараження. Обробленим циклофосфамідом мишам протягом 5 послідовних днів, починаючи від дня зараження, вводили інтраперитонеально 400мкг/кг ТА1. Виснаження нейтрофілів одержували шляхом внутрішньовенного введення 1мг нейтралізуючого Gr-Ι антитіла RB6-8C5 за день до й через день після здійснення зараження. Обробка істотно знижувала кількість нейтрофілів у легені, але не знижувала кількість ДК (5-6 х 105 CD11с+, ГКГ класу ІІ +, Р480--клітин до й після обробки). Контрольним мишам вводили еквівалентну кількість очищеного щурячого IgG2b. FACS-аналіз (аналіз із використанням клітинного сортеру із збудженням флуоресценції) клітин легені через день після обробки циклофосфамідом дозволив виявити виражену й довгострокову (аж до 5 днів) лейкопенію. Обробка не впливала на відсоток F480+-клітин (приблизно 20%) і відсоток CD11с+, ГКГ класу ІІ +, F480--fДK (96%. Для одержання зрілих ПДК незрілі ДК культивували із тримерним лігандом людського CD40 відповідно до описаного вище методу в присутності 10нг/мл IL-3. FACS-аналіз дозволив встановити, що ПДК являли собою CD123bright, CD4+, CD45RA+ й CD11c- на відміну від МДК, що представляють собою CD1a+, CD11c+, CD11b+, CD4+, CD14low й CD8-. Рівень експресії головного комплексу гістосумісності людини (ЧГКГ) класу П, CD80 й CD86 був високим як у незрілих, так й у зрілих ДК. ДК лінії CD11c+ легені миші (від 5 до7% позитивних у відношенні CD8alpha і від 30 до 35% позитивних у відношенні Gr-1) виділяли за допомогою магнітного сортування клітин. Для дослідження фагоцитозу ДК піддавали попередній обробці 100нг/мл ТА1 протягом 60хв і потім інкубували протягом ще 60хв при 37°С з конідіями Aspergillus. Розраховували відсоток інтерналізації й робили фотознімки. Для оцінки функціонального дозрівання й визначення цитокінів очищені ДК ресуспендували в середовищі Ісков (що не містить сироватку, але з додаванням поліміксину В для запобігання неспецифічної активації компонентами сироватки й ендотоксином) і вводили шляхом впорскування 100нг/мл ТА1 протягом 24год або індивідуально, або в сполученні з лігандами ТПР або неопсонованими конідіями Aspergillus. Фенотипічний аналіз Фенотип клітинної поверхні оцінювали, піддаючи зразки взаємодії з кон'югованими з ФІТЦ (флуоресцеїн-ізотіоціанат) або ФЕ (фосфатидилетаноламін) щурячими антимишиними антитілами. Як контроль використовували антитіла, які відповідають неспорідненому людському ізотину. Протигрибкова ефекторна активність 80870 8 При оцінці фагоцитозу бронхоальвеолярні макрофаги й периферичні нейтрофіли піддавали попередній обробці 100нг/мл ТАЇ протягом 60хв й інкубували при 37°С з неопсонованими конідіями Aspergillus протягом 60хв. Крім того, оцінювали конідіоцидну активність шляхом визначення кількості колонієутворюючих одиниць й як міру конідіоцидної активності приймали відсоток інгібування колонієутворюючих одиниць (середнє значення ± С.К.В.). Аналіз із використанням трансфектрованих клітин лінії НЕК293 Людські ембріональні клітини нирки лінії НЕК293 дикого типу або стабільно трансфектовані людськими TLR2, TLR9 й TLR4/CD1427 культивували в модифікованому за Способом Дульбеко середовищі Ігла з низьким вмістом глюкози, доповненим 10% фетальної телячої сироватки (ФТС), HEPES (10нМ), L-глутаміном (2мкг/мл) і гентаміцином (50мкг/мл). Крім того, середовище для трансфектантів доповнювали пуроміцином (100мкг/мл). Для експериментів з стимуляції клітини культивували протягом ночі при щільності 3-5 х 105 клітин/лунку в 12-лункових планшетах для культур тканин. Клітини промивали й стимулювали 100нг/мл ТА1 або індивідуально, або разом з лігандами ТПР, за 5 год до здійснення оцінки вироблення IL-8 у супернатантах. Аналіз цитокінів і твердофазний імуноферментний спот-аналіз (ELISPOT) Рівні TNF-альфа, IL-10, IL-12 р70, IFN-альфа й IL-8 у супернатантах культур визначали за допомогою набору для ELISA. Межі виявлення (пг/мл) аналізу становили: для TNF-альфа: